5.

Ứng dụng của sắc ký

Sắc ký là phương pháp được dùng rất phổ biến để nghiên cứu tách và xác định
các thành phần trong một hỗn hợp, đặc biết là các đối tượng tự nhiên.

Sắc ký là nhóm kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích thực phẩm vì có rất
nhiều chỉ tiêu cần phân tích để đảm bảo chất lượng và ATTP, nhất là các chất ở hàm
lượng vết chỉ có sắc ký mới có thể phân tích được như dư lượng thuốc trừ sâu trong
thực phẩm

5.1.Định tính và thử độ tinh khiết

Định tinh

Sắc ký được sử dụng rộng rãi để xác nhận sự có mặt hay không có các thành phần
trong hôn hợp của các chất mà ta đã biết.

VD: có thể phát hiện được hơn 20 loại acid amine trên một sắc đồ phân tích dịch đạm
thủy phân

Trong sắc ký, việc định tính một chất dựa vào thời gian lưu ( vị trí của peak) tương
ứng trên sắc đồ, trùng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu. ( ). Trong nhiều
trường hợp sắc ký chỉ là khâu xử lý mẫu, giúp ta tách chiết các chất rồi đem phân tích
bằng các phương pháp khác như phương pháp quang phổ

5.2.Định lượng

Trong định lượng bằng sắc ký, người ta thường dùng các chất chuẩn đối chiếu hay lập
đường chuẩn. Tuy nhiên phương pháp chuẩn nội vẫm cho độ chính xác cao hơn.
Chuẩn nội phải cho peak không xen phủ với các peak khác với độ phân giải Rs>1,25.
Phương pháp này cho sai số khoảng 0,5-1%.

Định lượng trong phương pháp sắc ký sử dụng phương pháp đường chuẩn thực hiện
bằng cách:

 Xây dựng một dãy chuẩn chất phân tích ở những nồng độ khác nhau
  Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa tín hiệu phân tích ( chiều cao hay diện
tích peak) và nồng độ, viết phương trình đường chuẩn dạng y=ax+b.
 So sánh tín hiệu phân tích của mẫu với đường chuẩn ta suy ra được kết quả
định lượng

6.Các phương pháp phân tích sắc ký

6.1.Phương pháp sắc ký cổ điển

Dựa vào cách phân loại các phương pháp sắc ký, phương pháp sắc ký cổ điển
được chia làm hai loại: sắc ký cổ điển và sắc ký mặt phẳng ( sắc ký giấy và sắc ký bản
mỏng)

6.1.1.Sắc ký cột cổ điển

Nguyên tắc

Mẫu thử được nạp nên đâu cột chứa chất hấp phụ ( có thể chất phân cực VD: silicagel
hay Al2O3 hoặc là chất không phân cực VD: than hoạt tính). Cột chứa chất hấp phụ
này là một pha tĩnh, pha tĩnh được nhồi vào cột theo phương pháp nhồi khô hay nhồi
ướt. Thông thường, người ta hòa hỗn hợp chất phân tích vào một dung môi ( pha
động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột. Hỗn hợp dung dịch di chuyển dọc theo cột
nhờ tác dụng của trọng lực và ấp suất bên ngoài. Quá trình tách các chất đạt được nhờ
các tương tác giữa pha động, pha tĩnh và chất phân tích. Các chất được tách ra khỏi
nhau và đi ra cột. Các chất được hứng riêng dựa vào màu sắc của dung môi

6.1.2.Sắc ký bản mỏng

bình sắc ký bản mỏng

Sắc ký bản mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển
qua pha tĩnh đã chấm hỗn hợp các chất cần tách trên đó.

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải
thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại.
Pha động là một hệ thống dung dịch đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo
tỷ lệ phù hợp cho quá trình tách.

Trong quá trình di chuyển qua lại lớp hấp phụ, do có tương tác với pha tĩnh và pha
động, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử di chuyển trên bản mỏng với những vận tốc
khác nhau theo hướng pha động làm chúng tách ra khỏi nhau

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf
được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của
a
dung môi: Rf =
b

Trong đó:

a: k/c từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

b: k/c từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Cơ chế sắc ký bản mỏng: Pha tĩnh ở trạng thái rắn được trải thành lớp mỏng trên các
bản, nhỏ vài giọt dung dịch phân tích lên rìa bản cách 2-3 cm dưới tác dụng của lực
mao quản dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp chất hấp phụ kéo theo sự chuyển
động của các cấu tử trong mẫu với vận tốc khác nhau, tách cấu tử ra khỏi nhau.
 Hiệu sắc đồ

6.1.3. Sắc ký giấy

Sắc ký giấy làm từ cenlulose

1.Nắp hộp

2.Bản mỏng

3.Thang dung môi

4.Dung môi

Sắc ký giấy thuốc loại sắc ký phân bố. Chất hấp phụ là giấy cenlulose. Chấm
dung dịch phân tích lên các điểm cách bìa tờ giấy một khoảng, sau khi cho bay hơi
dung môi đặt giấy vào bình chạy sắc ký chứa pha động. Các cấu tử trong hỗn hợp sẽ
chuyển động theo những tốc độ khác nhau và được tách riêng. Khi phát hiện bằng
thuốc thử hoặc chiếu đèn sẽ xuất hiện các vết (vùng) chất phân tích tách khỏi nhau
trên sắc ký đồ.
 Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch
a
chuyển của dung môi: Rf =
b

Trong đó:

a: k/c từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

b: k/c từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Trong trường hợp sắc ký liện tục không còn xác định được giới tuyết của dung
môi, người ta dùng hệ số chuyển Rr, Rr là tỷ số giữa khiangr cách di chuyển của chất
phân tích và k/c di chuyển của chất dùng làm chuẩn so sánh. Giá trị của Rr có thể nhở
hoặc lớn hơn 1.

https://canhgiacduoc.org/danh-gia-duoc-lieu-bang-phuong-phap-sac-ky.html

http://dulieu.tailieuhoctap.vn/books/khoa-hoc-ky-thuat/cong-nghe-sinh-hoc/
file_goc_779730.pdf
Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các điểm
khác nhau.

(a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy
nằm trong dung môi.

(b) Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo
các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của phân
tử của nó và hòa tan của nó trong dung môi.

(c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành
một sắc ký đồ.

Sắc ký bản mỏng