NASLJEDNE METABOLIČKE BOLESTI-

DRUGI DIO

KSENIJA FUMIĆ

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku

Kliničkog bolničkog centra Zagreb i
Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA
U DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI

-KORISNA METODA RAZDVAJANJA – moramo biti svjesni

njenih dometa ali i ograničenja!
RAZDVAJANJE GLIKOZAMINOGLIKANA-
-Iz 24 satnog urina izolirati glikozaminoglikane
Keratan
sulfat

Hondroitin 5
sulfat
4
3
Dermatan 2
sulfat
1
MPS tipa I, II, VI MPS tipa IV

1 2 3 4 5
 OLIGOSAHARIDI
URIN
porcija
 GM1-GANGLIOZIDOZA  GM2-
SANDHOFF
 M.POMPE  -FUKOZIDOZA
 -MANOZIDOZA   -MANOZIDOZA
 MPS IVB  SIJALIDOZA
 TANKOSLOJNA
(PLOŠNA)
KROMATOGRAFIJA
STACIONARNA
faza

10 X 10 cm
20 X 20 cm
 NANOŠENJE UZORKA

1 cm

CAMAG Linomat 5 uzorci se u formi

spreja nanose na tlc ploču. To se postiže uz
pomoć dušika i komprimiranog zraka.
AUTOMATSKI UREĐAJ
ZA NANOŠENJE UZORAKA

Linomat 5-
Ugrađeni mikroprocesor:
Mogućnost programiranja
Volumena i broja uzoraka
-pokretna mikropipeta i
Postolje
-brzina nanošenja 5-15
s/µL
-duljina vrpce 0-190 mm
-volumen uzorka 0,5-5 µL
DIJAGNOSTIČKI TESTOVI
 Urine Based Newborn
Screening
Project applying High
Resolution NMR-
Spectroscopy
Projekt: 12 bolnica

Referentni spektri: 600 metabolita u urinu

-neinvazivno testiranje
-bez derivatizacije, 12 minuta

-65 metabolita – 49 NMB

Problem: referentni profili- ovise o prehrani,
rasi i nizu drugih čimbenika
 The genomes of ill newborns
can be sequenced in less
than 24 hours to give
clinicians a rapid diagnosis.

2OCTOBER2014
| VO L 5 1 4 | N AT U R E | 1

Genome process is impressive, it is not clear whether

genomic sequencing of newborns will soon become
standard practice. Many questions remain about who will
pay for sequencing, who should have access to the data and
how far clinicians should go in extracting genome
information that is unrelated to the disease at hand. Then
there is the question of how informative the process is. “I
think it’s really important that we do these experiments so
that we start to see what that yield is,”
 WGS / WES
SCREENING

Assume $1000 per newborn for sequencing

Additional costs for data analysis…
Additional cost for family notification and follow-up…
Additional cost for confirmatory testing…

Estimates that 1% of WGS/WES will have positive findings..

 Genetics Professionals' Opinions of Whole-
Genome Sequencing in the Newborn Period

The purpose of this exploratory pilot study was to begin to

characterize genetics professionals' opinions of the use of whole-
genome sequencing (WGS) in NBS. We surveyed members of the
American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) via
an electronic survey distributed through email.

Overall, respondents foresee NBS as a future use of

WGS, but indicated that WGS should not occur within
the framework of traditional NBS. They agreed with the
current criteria for including a condition on the
recommended uniform screening panel (RUSP).
Further discussion about these criteria is needed in
order to better understand how they could be utilized if
WGS is incorporated into NBS
ORGANIZACIJA LABORATORIJSKE DIJAGNOSTIKE
NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI

NACIONALNI
PROGRAM LABORATORIJ ZA
SKRININGA NOVOROĐENAČKI PROBIR
2-3 000 000 stanovnika

KLINIČKA
SUMNJA
LABORATORIJ ZA
SELEKTIVNI PROBIR
SPECIJALISTIČKA
OBRADA
3-4 000 000 stanovnika
LABORATORIJ ZA DIJAGNOSTIKU NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI (SELEKTIVNI PROBIR)

 Racionalan pristup dijagnostici:

• osnovni testovi
• dijagnostičke pretrage
• testovi potvrde

Vanjska procjena kvalitete

 Dostupnost brze pošte
Timski rad – multidisciplinarnost

ORGANIČAVAJUĆI ČIMBENICI
oprema, educiranost osoblja,
materijalne mogućnosti
DIJAGNOSTIKA NASLJEDNIH METABOLIČKH BOLESTI-
intermedijarnog metabolizma – metabolička kriza

prvi dani života odrasla dob

V
 Osnovni laboratorijski parametri (krvna slika, CRP,
elektroliti, aminotransferaze, CK, ureja, kretinin, urati,
R
osnovne koagulacijske pretrage) I
J
 Metaboličke pretrage (acido-bazna ravnoteža, glukoza,
E
amonijak, reduktivne tvari, laktat i ketonski spojevi)
Upućuju na postojanje metaboličkog poremećaja M
E
---------------------------------------------------------------------------------------
 Specijalne metaboličke pretrage (aminokiseline,
organske kiseline, karnitin, profil acil-karnitina-MS-MS)
Pomažu u otkrivanju uzroka
 250 organskih kiselina i glicinskih konjugata
56 nasljednih metaboličkih poremećaja

GC-MS KROMATOGRAM ORGANSKIH

KISELINA
 200
220
240
260
280
300
320
340
3,633

0
6,266 Taurin
1 10,499

Pk #
2

Name
Urea
(Hydroxyprolin)Asparaginacid

10
3

570nm

Retention Time
23,399

19082004002.da t

20
Threonine

Suci c Ana ma r i j a
29,065

Tau
Pser
4

PEtN
31,Glutamicacid
265 SERIN
(Aminadipic Acid)
Asparagin
Ser

Gly

Gln
Asp
Asn

EtN
Hyp

35,931 5

30
38,231 6 Glutamin
40,297
Sarcosin
a-Aminobutric7 Acid
Cit

His
Ala
Sar

43,531
Thr

bAla

8
3MHis
1MHis

40
9
Citrulline10
48,764 Prolin
50,263 Glycin
(DL/Cystathionine) 51,863 Alanin
Glu
Asa

Ans
Car
Aad

Abu
Hcit

(DL/Cystathionine)
bAib

53,397 11
GABA

55,396 12

50
13
14 58,830
15 Valin
Lys
Pro

Cth
Cys
Arg

Orn
Hyp

Cystine
Allolle

62,929 Methionin 16
AMINOKISELINE u plazmi

60
66,596
Val

(aa-IsobutyricIsoleucine
Acid)17
Tyr
Hcy
Nva
Met

18

Minutes
(g-Aminobutyric
72,495 Acid)
(b-Alanine) 74,629 Leucine
Lle

Nle
Phe
Trp
Leu

75,895 Phenylalanin

70
Tyrosine 19
78,795 20
(Homocystine)
21
82,995
(Ethanolamin)22

80
(Hydroxylysin) 23
57 nasljednih metaboličkih poremećaja

Ammoniak
90 (1-Metylhisidin)95,294

Ornithine
101,993 24
3-metilhistidin
105,560
100

Histidin 25 Lysin
109,860
26
114,226
(anserin)
(karnozin) 27
110
45 AA

38 AA

28

125,859 Arginine
Biochrom
LC-MS/MS

120

128,158

29
30
 PROFIL ACIL KARNITINA IZ
SUHE KAPI KRVI NA FILTAR PAPIRU
MS-MS PROBIR iz urina

NALAZ
metabolita
upućuje na
......
......
.......

UPLC-MS-MS
 40 µ urina

DODATI INTERNE STANDARDE

DERIVATIZACIJA (butilirati)

ESI – MS-MS pozitivan mod (69 MRM)

ESI – MS-MS negativan mod (59 MRM)

Metaboliti - µmol/mmol kreatinina

KVALITATIVAN NALAZ

> 100 metabolita…

 MS MS
PROBIR IZ URINA

JJ Pitt
Melbourne
 RAZVOJ KVANTITATIVNIH METODA

Hibridni instrumenti:
kvadripol-Time of Flight
Kvadripol-ion-trap
SPECIJALNE
METABOLIČKE
PRETRAGE

Second-tier
DRUGOSTUPANJSKI
TESTOVI
A single method performed automatic positive and
negative ion switching for over 500 MRM transitions
in 18 minutes including re-equilibration, considerably
faster than separate positive and negative quantification
methods.
LABORATORIJ ZA DIJAGNOSTIKU NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI (SELEKTIVNI PROBIR)

•osnovni metabolički testovi

• dijagnostičke pretrage
• testovi potvrde
Enzymatic diagnosis of homocystinuria by
determination of cystathionine-ß-synthase
activity in plasma using LC-MS/MS
 PROFIL ACIL KARNITINA

d3-free carnitine d3-C16 carnitine

100

C2 carnitine
%
d3-C3 carnitine
C16 carnitine

d3-C8 carnitine

0 m/z
225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500
28
 METABOLOMIKA U DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI
Ciljana metabolomika Metabolomika pretraživanja

TIC
0 1.0 2.0 3.1 4.0 5.0 6.0
Quercetin (min) Hibridni - MS MS
Chlorogenic acid 301/151
353/191
Kaempferol 285/93
Caffeic acid
179/135 Hesperetin 301/164
m-Coumaric acid Naringenin
163/119 271/151

Gallic acid Phloretin 273/167

169/125
1H-NMR spektroskopija
Isorhamnetin 315/300
4-O-Methylgallic acid
183/124
Enterodiol
301/253
Taxifolin
Enterolactone
Identifikacija /kvantifikacija297/107
303/125

određenih
metabolita Usporedba s
Kontrolnim uzorcima
 186 Metabolita iz uzorka plazme, urina, likvora

CILJANA METABOLOMIKA AbsoluteIDQ® p180 Kit

Targeted Metabolite
• 10 uL plazme Identifi cation and Quantifi cation

• 186 metabolita
– Acilkarnitini
– Aminokiseline
– Biogeni amini
– Heksoze
– fosfatidilholini
– lizofosfatidilholini Biocrates kit IDQ p180
– sfingomijelini
• 53 metabolita moguće kvantificirati (obilježeni standardi)
 METABOLOMIKA PRETRAŽIVANJA U
DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI

Usporedba Identifikacija
20 kontrola DIJAGNOZA
1 bolesnik UHPLC-QTOF-MS spektara metabolita

glutamilfenilalanin
kaprioilglicin

Manjak acil-CoA dehidrogenaze

FENILKETONURIJA srednjih lanaca (MCADD)
> 62 000 MS-MS spektara
 DSQ Thermo Finnigan
AB Sciex QTrap 5500
Metabolomika pretraživanja
For the diagnosis of inherited metabolic diseases, this is a
great advantage compared with other techniques.
NMR spectroscopy of body fluids may be
considered as an alternative analytical approach for
diagnosing known, but also as yet unknown, inborn errors of
metabolism.
NMR-based urinalysis for beta-ketothiolase deficiency.

This case illustrated that NMR-based

urinalysis is complementary to organic acid
analysis for diagnosis of beta-ketothiolase
deficiency.
The operation of NMR is simple
and fast; sample preparation is a two-step
procedure while the NMR acquisition is
automatic and usually takes <15min.
We envisage that NMR analysis will become
more available in clinical laboratories and
will play an important role in
acute pediatric care.

Clin Chim Acta. 2014 Sep 4;438C:222-225

 LABORATORIJSKA
DIJAGNOSTIKA RIJETKIH BOLESTI
-DNA

Genetičko testiranje je dostupno za većinu uobičajenih

genetičkih bolesti u laboratorijima kliničkih bolnica ili
istraživačkih zavoda. Genetičko testiranje pokriva Hrvatski
zavod za zdravstveno osiguranje: u slučajevima kad
određena pretraga nije dostupna u Hrvatskoj, potrebno je
drugo medicinsko mišljenje dva do tri medicinska stručnjaka
prije nego se uzorak može poslati u inozemstvo.
Međutim, još uvijek postoje određeni problemi vezani za
ovakvu vrstu prekograničnih usluga.
Kao dostupne, u Hrvatskoj su registrirane pretrage za 28
gena te procijenjenih 37 bolesti iz baze podataka Orphanet.
 < 1 000 $

Clinical Genomics: When Whole

Genome Sequencing
Is like a Whole-body CT Scan

Clinical Chemistry 2014; v. 60, p.1390.

Published August 11, 2014
 GENOTIP - FENOTIP
MUTACIJE ……….PREOSTALA AKTIVNOST ENZIMA……KLINIČKA SLIKA

Osijek, 2013.
 TESTOVI POTVRDE- MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA

Klinički zavod za laboratorijsku

dijagnostiku KBC Zagreb

Predstojnik: prof.dr.sc.Jadranka Sertić

ZAVOD ZA SPECIJALNU I MOLEKULARNU BIOKEMIJU

Molekularna dijagnostika:
· Cistič a fi roza
· Prirođe a ilateral a age eza vas defere sa
· Gilbertov sindrom
· Wilsonova bolest
· Duchenne/Beckerova mišić a distrofija
· Mioto ič e distrofije
· Nasljedne neuropatije – CMT1a
· Friedreichova ataksija
· Huntingtonova bolest
· Kolorektalni karcinom
· Mioklona epilepsija i raščupa a rve a vlak a u ioptatu išića
· Mitohondrijska encefalopatija, laktacidoza i epizode nalik epilepsiji
· Nasljedna hemokromatoza
· Nasljedni karcinom dojke
· Nasljedni karcinom dojke i/ili ovarija
· Nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom
· Neurogena slabost mišića, ataksija i pig e toz i reti itis
· Spinalna mišić a atrofija
· Spinocerebelarne ataksije (tip: 1, 2, 3, 6,7)
Sindrom fragilnog X
 Vanjska procjena kvalitete
Osijek, 2013.
 HRVATSKA : LABORATORIJSKA
DIJAGNOSTIKA NA RAZINI DNA

Genetičko testiranje je dostupno za većinu uobičajenih

genetičkih bolesti u laboratorijima kliničkih bolnica ili
istraživačkih zavoda. Genetičko testiranje pokriva Hrvatski
zavod za zdravstveno osiguranje: u slučajevima kad
određena pretraga nije dostupna u Hrvatskoj, potrebno je
drugo medicinsko mišljenje dva do tri medicinska stručnjaka
prije nego se uzorak može poslati u inozemstvo.
Međutim, još uvijek postoje određeni problemi vezani za
ovakvu vrstu prekograničnih usluga.
Kao dostupne, u Hrvatskoj su registrirane pretrage za 28
gena te procijenjenih 37 bolesti iz baze podataka Orphanet.
Osijek, 2013.
10/01/2011

542 GeneRevie
ws

1156 Clinics
605 Laboratories
testing for

2443 DISEASES

Laboratory
Directory Gro

Podgorica, 28.02.2012.
  NE MOŽEMO I NISMO SAMI...

Mitochondrial Research
http://www.mitochondrial.net

ERNDIM

ERNDIM http://www.erndimqa.nl/
ERNDIM

Diagnostic Laboratories Database

Databases of Pediatric Neurotransmitter Disorders inc. PKU

http://www.biopku.org

MITOMAP: A mitochondrial DNA database

Mutation Database Homepage
http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/ http://infinity.gen.emory.edu/mitomap.html

Mutation Database for X-linked Adrenoleukodystrophy

http://www.x-ald.nl/

RIJETKE BOLESTI ZAHTIJEVAJU GLOBALNI PRISTUP

Osijek, 2013.
SPECIFIČNA ZNANJA
VOLJA ZA RJEŠAVANJE PROBLEMATIKE
RAZVOJ INFRASTRUKTURE
METABOLIČKI CENTRI IZVRSNOSTI

SELEKTIVNA
NOVOROĐENAČKI DIJAGNOSTIKA
PROBIR

PRAĆENJE TIJEKA
OBLIKOVANJE LIJEČENJA
SVIJESTI- REFERENTNI
udruge bolesnika CENTRI
mediji
NACIONALNI
PLAN-
REGISTAR…
 MS-MS PROBIR iz plazme

…metabolomic workflow capable of routinely

generating semi-quantitative z-score values for ~900
unique compounds, including ~500 named human
analytes, in a single analysis of human plasma.
LABORATORIJ ZA DIJAGNOSTIKU NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI (SELEKTIVNI PROBIR)

•osnovni metabolički testovi

• dijagnostičke pretrage
• testovi potvrde

> 15 000 metabolita

LIZOSOMSKE BOLESTI
NAKUPLJANJA
Preliminarni podaci prevalencija perGeneRev/OMMBID

Pompeova bolest 1:19 900 1:14 000 - 100 000

Fabryjeva bolest 1: 1 063 (m) 1:1 600 - 50 000
Gaucherova bolest 1: 28 333 1:57 000 - 86 000
MPS tipa I 1: 4 722 1:100 000
MPS tipa II 1: 3 838 (m) 1:100 000-170 000
MPS tipa VI 1: 85 000 1:840 000 – 1,3 mil.
MPS tipa III A 1: 21 250 1:73 000
Krabbeova bolest 1: 28 333 1:100 000
 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA LIZOSOMSKIH BOLESTI
urin stanice
krv

Digitalna mikrofluidna tehnika

DNA
MS-MS Mikrotitarske pločice
Skrining metabolita fluorimetrija/spektrofotometrija
Mjerenje aktivnosti enzima Mjerenje aktivnosti enzima/proteina

WGS /WES

BIOINFORMATIKA

SEKVENCIONIRANJE
DIJAGNOZA GENA
LyosPlex 2.0

12.786 human exons of

891 genes involved in
lysosomal function
endocytosis and
autophagy pathway

Based on Haloplex
technology (Agilent) and on
Next Generation Sequencing
 Ugljikohidrati Karnitin

Alanin Piruvat Laktat Stanična membrana Karnitinski nosač

Masne kiseline
PRIMARNE
MITOHONDRIOPATIJE Karnitin
Karnitinski
Aminokiseline ciklus
Piruvat MCT

PDH 
oksidacija
Citratni
Acetil-CoA
ciklus
POREMEĆAJI
Ketonska KETOGENEZE
NADH/H+ tijela ADP ATP

FADH2 Pi
1/2O2 H2O

Urea e- e- V
ciklus
I III IV
II
Q Cit c H+ H+
H+ H+
H+ H
Respiratorni lanac
+
ATP
 NOVI PRISTUP LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI
MITOHONDRIJSKIH POREMEĆAJA STVARANJA ENERGIJE

GDF15 (Growth Differentiation

Factor 15) Is the New Biomarker
for Muscle-Related Mitochondrial
Diseases
Koga Y . Neurology, 2015
 PEROKSISOMSKE BOLESTI

NEUROTRANSMITERI, PURINI I PIRIMIDINI, POREMEĆAJI

GLIKOZILACIJE, Žučne kiseline, Kreatin, pterini ...
 METABOLOMIKA U DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH
METABOLIČKIH BOLESTI

Ciljana metabolomika Metabolomika pretraživanja

TIC
0 1.0 2.0 3.1 4.0 5.0 6.0
Quercetin (min) Hibridni - MS MS
Chlorogenic acid 301/151
353/191
Kaempferol 285/93
Caffeic acid
179/135 Hesperetin 301/164
m-Coumaric acid Naringenin
163/119 271/151

Gallic acid Phloretin 273/167

169/125
1H-NMR spektroskopija
Isorhamnetin 315/300
4-O-Methylgallic acid
183/124
Enterodiol
301/253
Taxifolin
Enterolactone
Identifikacija /kvantifikacija297/107
303/125

određenih
metabolita Usporedba s
Kontrolnim uzorcima
 METABOLOMIKA PRETRAŽIVANJA U
DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI

Usporedba Identifikacija
20 kontrola DIJAGNOZA
1 bolesnik UHPLC-QTOF-MS spektara metabolita

glutamilfenilalanin
kaprioilglicin

Manjak acil-CoA dehidrogenaze

FENILKETONURIJA srednjih lanaca (MCADD)
Metabolomika pretraživanja
For the diagnosis of inherited metabolic diseases, this is a
great advantage compared with other techniques.
NMR spectroscopy of body fluids may be
considered as an alternative analytical approach for
diagnosing known, but also as yet unknown, inborn errors of
metabolism.
 LABORATORIJSKA
DIJAGNOSTIKA RIJETKIH BOLESTI
-DNA

Genetičko testiranje je dostupno za većinu uobičajenih

genetičkih bolesti u laboratorijima kliničkih bolnica ili
istraživačkih zavoda. Genetičko testiranje pokriva Hrvatski
zavod za zdravstveno osiguranje: u slučajevima kad
određena pretraga nije dostupna u Hrvatskoj, potrebno je
drugo medicinsko mišljenje dva do tri medicinska stručnjaka
prije nego se uzorak može poslati u inozemstvo.
Međutim, još uvijek postoje određeni problemi vezani za
ovakvu vrstu prekograničnih usluga.
Kao dostupne, u Hrvatskoj su registrirane pretrage za 28
gena te procijenjenih 37 bolesti iz baze podataka Orphanet.
Clinical Genomics: When Whole
Genome Sequencing
Is like a Whole-body CT Scan

Clinical Chemistry 2014; v. 60, p.1390. < 1 000 $

SUHA KAP KRVI NA FILTAR PAPIRU -
budućnost uzorkovanja…
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
NASLJEDNIH METABOLIČKIH
BOLESTI U HRVATSKOJ:
problemi i izazovi