Professional Documents
Culture Documents
Abstract
People tend to look for low calorie natural sweetener which is safe to be consumed. Stevia rebaudiana (Bert.)
is herb plants which contain natural glycoside compound that is stevioside. This compound has sweetness 100-
300 times to sucrose and this compound is safe to be consumed. Stevioside can be extracted and isolated both by
using organic solvent and water. Purposes of this research were to compare cristallization method of stevioside
from Stevia rebaudiana (Bert.) between organic solvent and water, to analyze qualitatively and quantitatively
stevioside content in crystall obtained with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and
spectroscopy methods, and to formulate crystall obtained with maltodextrine become natural sweetener. In this
research, crystallization methods developed have been done with following steps such as sample preparation,
defatization, extraction, clarification, electrocoagulation, pH adjusment, evaporation, and crystallization.
Stevioside content was determined by using HPLC and spectroscopy methods. Natural sweetener produced was
examined organolepticly with Hedonic test to determine the sweetness degree. The result showed that
crystallization method developed with water based was more effective and efficient with % yield, 6.25% than
organic solvent based with % yield, less than 1.00%. Stevioside content in crystall obtained with water based
crysltallization method was higher, that was 92.97% than in crystall obtained with organic solvent based, that
was 20.16%. Beside, crystall obtained with water based crysltallization was more dissolved in water than
crystall obtained with organic solvent based. Based on organoleptic assay, the sweetness degree of stevioside
natural sweetener was more than 100 times of sucrose (sugar).
dan air, melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif Selanjutnya, hasil dari pemekatan ditambahkan
kandungan steviosida dalam kristal yang diperoleh aquades dengan perbandingan 1:1 dan penambahan
secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan 1% garam (NaCl) dari total volumenya. Elektrolisis
spektroskopi, dan melakukan formulasi kristal yang dilakukan selama 2,5 jam dengan menggunakan plat
didapat dengan maltodekstrin menjadi produk pemanis alumunium (ukuran 3×15 cm) sebagai elektrode. Arus
alami. dan tegangan digunakan power supply adalah 0,9 A
HOH2C
dan 16,9-31,6 V secara berurutan. Filtratnya disaring
O
HO dan siap untuk perlakuan selanjutnya.
HO
HOH2C
O O
HO Redefatisasi
HO
OH O Larutan hasil deklorofilasi dipisahkan dari
CH3 CH2 pengotornya dengan corong pisah menggunakan
pelarut eter. Langkah ini digunakan untuk
H memisahkan fase air yang mengandung steviosida dan
fase organik sebagai pengotornya. Partisi dilakukan
HOH2C H
H3C O secara bertingkat dengan penambahan eter 2×100 mL.
O
HO
HO O Fase air hasil defatisasi diatur pH-nya menggunakan
OH
asam sitrat 50% hingga pH 3.
Gambar 1. Struktur kimia steviosida
Kristalisasi [8] (yang dimodifikasi)
Larutan sampel yang telah diklarifikasi diatur kembali
1. METODOLOGI
pH-nya menjadi pH 10,5 menggunakan larutan CaO
Bahan 50%. Filtrat hasil penyaringan diatur kembali pH-nya
Sampel yang digunakan adalah daun Stevia menjadi pH 7 dengan menggunakan asam sitrat 50%.
rebaudiana (Bert.) yang diperoleh dari Tawangmangu, Untuk menghilangkan sisa-sisa lemak, larutan
Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia didefatisasi kembali dengan pelarut eter (1×100 mL),
yang digunakan diantaranya adalah aquades, eter, kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat secara
etanol, heksan, kaolin, CaO (Merck), asam sitrat, bertingkat (5×100 mL). Fase organik diambil dan
asetonitril (J.T. Baker 9017-03), metanol (Merck dipekatkan dengan rotary evaporator. Setelah
1.06009.2500), standar steviosida (WAKO Jepang, dipekatkan maka akan terbentuk kristal putih. Untuk
kemurnian 99,8%). memaksimalkan pembentukan kristal, maka larutan
disimpan dalam lemari es semalam (0-5 °C).
Alat
Sedangkan alat yang digunakan antara lain B. Kristalisasi Steviosida Dengan Air
rotary evaporator (Buchi R114), sentrifuge (Swing
Type centrifuge Model C-40N Tomy seiko co, ltd), Defatisasi Sampel
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Smart Sebanyak 150 g sampel diekstrak dengan heksan
Line, Knauer Advanced Scientific Instruments), sebanyak 1 L menggunakan sokhlet selama 17,5 jam
spektrofotometer (Shimadzu, UVmini 1240), dan dan diambil residunya.
sokhlet.
Ekstraksi dan Kristalisasi Steviosida Berbasis Air
Metode 100 g residu sampel dimaserasi dengan aquades
Preparasi Sampel sebanyak 1,5 L pada suhu 500C selama 60 menit.
Sampel dibersihkan dari tanah, kemudian dikeringkan Larutan disaring dan maserasi diulang sebanyak 2 kali
dengan cabinet drying selama 24 jam dan dihaluskan dengan 1 L akuades, masing-masing selama 30 menit.
menggunakan grinder. Larutan disaring dan filtrate ditambahkan asam sitrat
50% hingga pH 4. Larutan disaring dan filtrate
A. Kristalisasi Steviosida Dengan Pelarut Organik ditambahkan CaCO3 hingga pH 10. Larutan disaring
dan ditambahkan asam sitrat 50% hingga pH 6,4.
Ektraksi Sampel Larutan diuapkan dengan rotary evaporator hingga
100 gram sampel dimaserasi dengan 4 L etanol secara pekat. Larutan pekat ditambahkan etanol sebanyak 30
bertingkat (8×500 mL selama 8 jam). Kemudian mL. Larutan ditambahkan 10 g bentonite/arang aktif
residu dan filtrat dipisahkan melalui penyaringan. lalu disaring, Langkah ini diulang sebanyak 3 kali.
Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga
Deklorofilasi dengan Metode Elektrokoagulasi [7] jenuh dan direkristalisasi dengan etanol.
(yang dimodifikasi)
Filtrat hasil metoda maserasi dan ekstraksi Formulasi Kristal Steviosida dengan Maltodekstrin
berkelanjutan dipekatkan dengan rotary evaporator Kristal steviosida diberi penutup (sealing)
hingga volume menjadi setengah dari volume awal. menggunakan Pharmacoat 606, selanjutnya adalah
tahap sub coating dan grossing. Pada tahap tersebut
digunakan larutan penyalut dengan maltodekstrin DE Pengkristalan dapat dilakukan melalui pemanasan
35-40. Kemudian dibuat berbagai perbandingan ekstrak yang kemudian didinginkan secara cepat pada
campuran kristal steviosida dengan maltodekstrin DE suhu rendah atau menghilangkan pelarutnya yang
35-40 seperti Tabel 1. sebelumnya dilakukan penyesuaian pH yang bersifat
asam [4].
Tabel 1. Formulasi Kristal Steviosida dengan Maltodekstrin Hasil penelitian [12] menunjukkan bahwa
No Kristal steviosida (gram) Maltodekstrin (gram) penggunaan pelarut etanol memberikan hasil yang
lebih jernih bila dibandingkan dengan menggunakan
1 0,0 0,8 air dan metanol, dan relatif aman bagi konsumsi
2 0,05 0,75 masyarakat. Dalam penelitian ini tahap penghilangan
pengotor juga dilakukan agar tidak menghambat
3 0,1 0,7 pembentukan kristal.
4 0,3 0,5 Langkah penting lain dalam penelitian ini adalah
menghilangkan pengaruh warna hijau pigmen daun
5 0,5 0,3 dengan cara deklorofilasi menggunakan metode
elektrokoagulasi selama 2,5 jam [7]. Hal ini
Pembanding: larutan sukrosa 5%
dimaksudkan supaya warna hijau dari pigmen
nantinya tidak mempengaruhi visualisasi kristal saat
Uji Organoleptik pemisahan [12]. Metode elektrokoagulasi yang
Penentuan tingkat kemanisan pemanis yang dikembangkan dapat mengahsilkan deklorofilasi
diformulasi dilakukan dengan uji hedonik pada dengan efektifitas hingga 98,80%.
berbagai perbandingan kristal steviosida dan Penyusutan intensitas warna diakibatkan dari
maltodekstrin terhadap 25 panelis. Uji hedonik pemecahan klorofil menjadi turunannya yaitu feofitin
dilakukan dengan 6 parameter penilaian yaitu 5 = yang dikarenakan kehilangan atom Mg. Hasil ini
sangat tidak manis, 4 = tidak manis, 3 = agak manis, 2 sesuai dengan hasil penelitian [7] dan [10] yang
= manis, 1 = sangat manis sekali. Masing-masing menyatakan bahwa deklorofilasi menghilangkan
campuran praformulasi dilarutkan dalam 100 ml air. pigmen dan memperbaiki visualisasi kristal. Setelah
deklorofilasi, proses klarifikasi dilakukan dengan
Analisis Sampel mengatur pH-nya menjadi 3 kemudian penambahan
Analisis Ekstrak Kromatografi Cair Kinerja kaolin untuk menghilangkan sisa klorofil. Klarifikasi
Tinggi merupakan langkah penting karena akan memberikan
Identifikasi steviosida dilakukan dengan kualitas visual produk yang lebih baik [12].
menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh
adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, perubahan pH larutan secara ekstrim [4]. Oleh karena
metanol, dan air dengan flow rate 1,5mL/menit. Elusi itu, pada penelitian ini, pH larutan steviosida dirubah
fase gerak dilakukan secara isokratik menggunakan secara ekstrim dari pH 3 menjadi pH 10,5. Pada
(aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan penelitian ini, pH larutan disesuaikan ke lingkungan
volume sampel yang diinjeksikan adalah 20µL. asam dengan menggunakan asam sitrat 50%.
Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Penggunaan asam sitrat ini berfungsi untuk mengikat
Line Knauer pada panjang gelombang 217nm. logam, protein, dan warna sebagai pengotor agar
diperoleh kristal yang lebih baik [8].
Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Analisa kuantitatif kadar steviosida secara KCKT
Spektroskopi juga dilakukan untuk setiap tahap kristalisasi. Pada
Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan setiap langkah dianalisa seberapa besar kadar
steviosida kemudian dilihat pola serapan cahayanya steviosida yang masih terkandung. Data analisanya
pada panjang gelombang 200-400 nm. dapat dilihat pada grafik pola steviosida yang
terkandung pada setiap tahap dapat dilihat pada
Analisis Data Gambar 2. Gambar kromatogram analisa kadar
Analisis data dibagi menjadi: data analisis % steviosida dengan KCKT dapat dilihat pada Gambar 3.
yield kristalisasi, identifikasi kandungan steviosida,
dan penentuan kadar steviosida secara deskriptif. Data
uji organoleptik hasil pra-formulasi secara statistik
dengan ANOVA menggunakan SPSS 18.
Gambar 2. Grafik Analisa KCKT Steviosida Setiap Tahap membentuk kristal steviosida.
Kristalisasi. Penggunaan air pada suhu 50 ⁰C ternyata
dapat mengestrak steviosida. Hal ini seiring dengan
penelitian [6] yang menggunakan akuades sebagai
pelarut untuk ekstraksi. Pelarut akuades yang
digunakan juga berkaitan dengan aplikasi kristal
steviol glikosida yang akan digunakan sebagai
pemanis alami dan peningkatan kelarutannya dalam
air.
[A] [B] Langkah penting lain dalam penelitian ini
adalah menghilangkan pengaruh warna pigmen pada
larutan dengan cara deklorofilasi menggunakan
bentonit sebagai adsorben. Hal ini dimaksudkan
supaya warna hijau dari pigmen nantinya tidak
mempengaruhi visualisasi dan pembentukan kristal
saat pemisahan [12]. Bentonit adalah lempung
montmorillonit yang mampu menyerap berbagai
logam dan kelompok protein. Adanya tiga lapisan
[C] [D] struktur kompleks pada montmorilonit memungkinkan
penyerapan ion ke dalam lembar antar permukaan
pada bentonit [15]. Hal ini berfungsi untuk
menghilangkan berbagai senyawa selain steviosida
pada daun stevia terutama klorofil.
Kristalisasi dapat dicapai dengan perubahan
pH larutan secara ekstrim [4]. Oleh karena itu, pada
optimasi ini, perubahan pH larutan dari 3 menjadi 10
[E] [F] tetap dipertahankan dengan menggunakan bahan yang
lebih ekonomis yaitu kalsium karbonat dan asam
sitrat. Dalam kristalisasi, hal tersebut dipengaruhi
oleh keseimbangan dan model pertumbuhan nukleasi
dari kristal seperti pada permodelan klasik Arrhenius
[9]. Dalam hal ini adalah senyawa glikosida steviol.
Dalam permodelan klasik Arrhenius
didasarkan pada persamaan (1), dengan asumsi bahwa
titik kritis (nukleasi) akan segera terbentuk, setelah
[G] [H] pembentukan kristal mulai tumbuh pada tingkat
pertumbuhan nukleasi secara optimum.
Gambar 3. Kromatogram Analisa KCKT Steviosida Setiap
Tahap Kristalisasi. Kromatogram [A]. Sebelum deklorofilasi Ra = R Vm dt (1)
(tR=11,933), [B]. Sesudah deklorofilasi (tR=12,150), [C].
Eter sebelum pH adj (tR=13,183), [D]. CaO (tR=13,567), Keterangan: Ra: rata-rata molar optimum larutan
[E]. pH 7 (tR=11,750), [F]. Eter setelah pH adj (tR=11,967), (dR/dt), R: molaritas penambahan reaktan dalam hal
[G]. Fase air (tR=12,517). [H]. Kristal steviosida hasil ini etanol 95% (mol), Vm: volume molar larutan yang
kristalisasi (tR = 11, 950). ditambahkan (cm3/mol)
Ketika reaktan ditambahkan terus-menerus,
B. Kristalisasi Steviosida Dengan Air akan terbentuk nukleasi baru. Selanjutnya, kecepatan
nukleasi akan berkurang seiring bertambah banyaknya
Pada optimasi lanjutan ini difokuskan pada kristalisasi titik-titik kristal yang terbentuk dan akhirnya nukleasi
berbasis air. Dasar perbaikan metode ini adalah akan sepenuhnya digantikan oleh pertumbuhan kristal
menghasilkan kristal yang larut air, meningkatkan % hanya sampai pertumbuhan kristal yang maksimum
yield, menghilangkan penggunaan eter. Metode yang Sehingga ketika nilai R terlalu besar (penambahan
dioptimalkan diharapkan lebih efisien dan efektif etanol terlalu banyak) atau tidak sesuai dengan
dalam pembentukan kristal. keseimbangan pembentukan nukleasi, maka nukleasi
Beberapa dasar ekstraksi-kristalisasi yang glikosida steviol akan berkurang (Vm berkurang) dan
dikembangkan adalah penyesuaian pH larutan dengan Ra tidak mencapai optimum. Selain itu, jika nilai Vm
bahan-bahan yang lebih efisien dan mudah dalam hal ini adalah molaritas dari larutan glikosida
didapatkan, penjernihan larutan dengan klarifikasi steviol pada kondisi supersaturated tidak berada pada
menggunakan arang aktif dan bentonit, serta keseimbangan nukleasi yang tepat serta penambahan
pencapaian keadaan larutan lewat jenuh yang dapat volume etanol yang ditambahkan kurang tepat, maka
kristal glikosida steviol tidak akan terbentuk. Tidak
[C] [D]
[A] [B]
sehingga dapat diartikan bahwa kristal samapel ini berpotensi menjadi pemanis alami dengan tingkat
mengandung steviosida. Sedangkan spektra sampel 3 kemanisan 100 kali lebih tinggi daripada sukrosa.
dan 4 berbeda dengan standar steviosida. Hal ini
dimungkinkan karena adanya pengotor yang
terkandung dalam kristal. Hasil identifikasi dengan 4. KESIMPULAN
spektroskopi ini menguatkan hasil identifikasi dengan
KCKT. Metode kristalisasi yang dikembangkan dengan
Pada Tabel 2 terlihat bahwa kadar steviosida pelarut air lebih efektif dan efisien dengan persen
tertinggi didapat pada sampel 1. Walaupun kadar yield 6,25% dibandingkan dengan pelarut organik
steviosida sampel 1 lebih tinggi dari sampel 2, tetapi yang menghasilkan persen yield < 1%. Kandungan
persen yield sampel 2 lebih tinggi dari sampel 1. steviosida dalam kristal yang dihasilkan dengan
Selain itu, kristal sampel 1 yang terbentuk memiliki metode kristalisasi berbasis air lebih tinggi, yaitu 92,
karakter fisik yang lebih menyerupai karamel 97% dibandingkan kristal yang dihasilkan dari metode
sehingga sangat lengket dan belum dapat digunakan pelarut organik, yaitu 20, 16%. Selain itu, kristal yang
untuk formulasi. Oleh karena itu, sampel 2 merupakan dihasilkan dari metode kristalisasi berbasis air lebih
kristal yang optimal yang diperoleh. Kristal sampel 2 terlarut dalam air. Berdasarkan uji organoleptik,
ini kemudian digunakan untuk formulasi dengan tingkat kemanisan pemanis alami steviosida lebih dari
maltodekstrin. 100 kali sukrosa (gula).
[11] Melis MS. Renal excretion of stevioside in rats. sweetener. In: T. H. Grenby (Ed.), Developments in
J Nat, Vol. 55, no. 5, 1992, hal.688-690. Sweeteners 3, Elsevier, New York, p. 1, 1987.
[12] Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, Nádia Regina [15] Trickova, M., L. Matlova, L. Dvorska, I. Pavlik.
Camargo Fernandes. Clarification of Stevia Kaolin, bentonite,and zeolites ad feed supplements for
rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in animals: health advantages and risks. Vet. Med. –
modified zeolites. Maringá, Vol. 23, no. 6, 2001, hal. Czech, Vol. 49, no. 10, 2004, hal 389-399
1375-1380.
[13] Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan
Tradisional. http://www.kompas.com/kompas-
cetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm.
[14] Phillips, K.C. Stevia: steps in developing a new