Conceptos de importancia en microbiologia oralCAPITULO 1 MICROORGANISMOS CARIOGENICOS Margarita Chaves Clavijo Claudia Valdiviesa Diaz Luis Fernando Gamboa Martinez En Ia actualidad, la caries dental es la enfermedad infecciosa mas recurrente en el mundo, ademas de ser una de las patologias mas frecuentes en cavidad oral. La aparicién de los hidratos de carbono refinados provocs un aumento en Ia incidencia de esta patologia tanto en los paises desarrollados como en los que estan en via de desarrollo. En el 2004, la Organizacién Mundial de la Salud (OMS), al anunciar las conclusiones del informe mundial sobre salud bucodental, declaré que alrededor de cinco mil millones de personas en el planeta han sufrido caries dental. Muchos autores han definido la caries como una enfermedad crénica, infeccio- sa, multifactorial, transmisible, que afecta a los tejidos duros del diente y que es producida por la destruccién localizada provocada por bacterias acidiiricas y aci- dogénicas, las cuales degradan los hidratos de carbono de los alimentos y producen acidos como resultado final de su metabolismo. Como consecuencia, el esmalte se desmineraliza iniciandose un proceso patolégico que va desde una disolucién de los cristales de hidroxiapatita, hasta generar una cavidad. Este proceso puede continuar indefinidamente hasta la pérdida total del diente. Las bacterias orales (alrededor de 500 especies) no forman colonias solitarias, sino que pertenecen a una comunidad compleja de numerosas especies, que cons- tituyen una masa de células unidas por una matriz pegajosa de glucosa. Entre los microorganismos que han sido involucrados con esta patologia se cuentan los estreptococos del grupo mutans, Lactobacillus spp y Actinomyces spp. Para que cualquiera de ellas sea patégena debe cumplir con algunos requisitos: 1. Adherirse a receptores especificos. 2. Obtener una cantidad suficiente de bacterias o masa critica. 3. Invadir o elaborar sustancias nocivas.MICROORGANISMOS CARIOGENICOS 25 GENERO ESTREPTOCOCOS ~ Son cocos Gram positivos, aerobios, aunque también pueden desarrollarse en con- diciones de anaerobiosis. No poseen catalasa. Presentan metabolismo fermentative y producen especialmente acide lactico. EsTREPTOCOCOS VIRIDANS El grupo viridans incluye varias especies de estreptococos que, principalmente, hacen parte de la flora normal del tracto respiratorio superior. Algunas veces se han encontrado en casos de endocarditis bacteriana subaguda produciendo bacteremias Persistentes, Muchas especies de estreptococos viridans que habitan la cavidad oral han sido considerados agentes patégenos, asociados con el inicio y la patogenia de Ja caries dental: Estreptococos del grupo mutans. Grupo Streptococcus mutans Pertenecen a este grupo las especies de Streptococcus mutans (S. mutans), Strep- tococeus sobrinus (S. sobrinus), Streptococcus ratius (S. ratius), Streptococcus cricetus (S. cricetus) Streptococcus ferus (8. ferus), Streptococcus macacae (S. macacae), Strepiococcus downei (S. downei) y 8 secotipos (a-h). §, mutans (serotipos c. ¢ y f) y &. sobrinus (serotipos dy g) son las especies. encontradas con mayor frecuencia en humanos, siendo las cepas del serotipo c las mas frecuentemente aisladas, seguidas por la dy la ¢. Las otras cepas son raramente encontradas. 8. wwtans y S. sobrinus son capaces de producir enzimas Iamadas glucosiltransferasas cuya funcién es romper los enlaces de la sacarosa (disacd- tido de glucosa y fructosa unidas por un enlace glicosidico) y une las residuos de glucosa entre si para formar glucanos insolubles, cuya funcién es servir de matriz Pegajosa para que se unan otras bacterias. La adherencia especifica e inespecifica de S. mutans y otros microorganismos a los glucanos adherentes ¢ insolubles y la posterior formacidn de dcidos es lo que conduce a la desmineralizacién del esmalte yal inicio de las lesiones cariosas. Solo una pequefia parte de la sacarosa es utilizada para la formacién de poli- saciridos extra ¢ intracelulares, la mayor parte se utiliza como fuente energética para el crecimiento bacteriano; asi mismo, hay generacién de acidos y productos intermedios. Lo anterior es muy importante en la cavidad oral, pues la mayoria de Jas bacterias cariogénicas toleran muy bien estos productos metabélicos. Cuando los microorganismos producen acidos se denominan acidégenos; aquellas que se multiplican a pH Acido son acidéfilas y las que siguen disminuyéndole el pH, a pesar de estar muy bajo, se Haman aeidtiricas.26 MARGARITA CHAYES, CLAUDIA WALDIVIESO ¥ LUIS FERNANDO GAMBOA Esta tolerancia a los acidos se debe en gran parte a: 1. Poseer una ATPasa que expulsa los protones. 2. Puerta del lactato, que se abre cuando necesita eliminar productos interme- dios y compuestos dcidos que sean t6xicos para la célula, tesis de proteinas de estrés, cuya funcién es suprimir o corregir el ple- gamiento incorrecto de proteinas a consecuencia del descenso del pH. 4, Corto efecto post-pH, que es la ripida capacidad de recuperar su fisiologia normal tras una brusca caida del pH. Streptococcus mutans Es considerada la especie mas frecuentemente aislada de las lesiones cariosas. En 1924, Clarke lo aislé de algunas lesiones de caries de seres humanos. Le dio el nombre de “mutans” porque a veces se abservaban como cocos en cadena y en ocasiones como cocobacilos, es decir, un comportamiento pleomérfica (modifi- caci6n de forma). La adhesién de este microorganismo est4 mediada por la interaccién entre una proteina PAc y algunas de la saliva que son adsorbidas por el esmalte dental; la capacidad de acumulacién en la placa ocurre cuando S. mutans produce glucanos solubles ¢ insolubles utilizando las enzimas glucosiltransferasas (GTFs), a partir de los azticares de la dieta, Cuando la unién se hace mas fuerte, las bacterias degradan la sacarosa a acidos, como el ldctico, que desmineralizan el diente, fermando la cavidad que se encuentra en la caries dental. Las glucosiltransferasas son tres enzimas -GTB B, GTB C y GTB D- que desdoblan la sacarosa, sintetizando glucanos insolubles que dan soporte a la placa bacteriana; también producen glucanos solubles que les sirven como fuente de nutricién. Se han realizado estudios que modifican genéticamente a los estreptococos para que no produzcan GTFs; asi, pierden su capacidad de adhesién y agregacién en la placa bacteriana. Al observar este microorganismo en cultivos en agar sangre, sus colonias pre- sentan alfa y gamma-hemolisis (destruccién de la hemoglobina en medios que contienen sangre: cuando no hay destruccién de la hemoglobina no hay formacién de ningtin halo y se lama gamma; si es incompleta se origina un pigmento llamado Biliverdina y aparece un halo verde alrededor de la colonia denominado alfa; si hay destruccién total se ve un halo transparente alrededor de la colonia el cual se denomina beta). Todas las cepas de $_ mutans fermentan el manitol, inulina, sorbitol, rafinosa y esculina; algunas cepas fermentan melobiosa; tienen pruebas negativas para ureasa, arginina, PYR, hidrélisis de hipurato.MICROORGANISMOS CARIOGENICOS. i0s previos han demostrado que S. mutans no se adhiere bien a las superfi- teliales, por lo que pareceria extrafio aislar cepas en muestras provenientes s edéntulos, ya que s6lo poseen superficies mucosas y expuestas permanen- al flujo salival. Sin embargo, se han encontrado cepas de S. mutans en bebés es, lo que hace pensar que estas cepas son transetintes y no establecidas ivamente, pues no se pueden mantener libres en la saliva sino que necesitan adheridas a una superficie dura como el diente, mismo, se puede considerar que la colonizacién temprana es un factor de adicional para posteriores experiencias de caries. En estudios longitudinales encontrado que nifios que tenian cepas de S. mutans a los 2 aos, el 89% llaba caries activa a los 4 afios, lo que se podria convertir en un predictor riesgo para el futuro. El mayor reservorio de estas cepas son las madres (transmisién vertical) teniendo a la magnitud del indculo, la frecuencia del contacto con pequefias dosis icroorganismos con un minimo de dosis para lograr la infeecién. También existe la transmisién horizontal, ya que en estudios recientes se ha ado que los nifios de un mismo jardin infantil comparten genatipos de mutans. Resultados similares se hallaron con los padres, parientes 0 personas anas que cuidan a los nifios. AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS fe porible utilizar diferentes estrategias para el aislamiento e identificacién de las sdel grupo mutans. Considerando los medios liquidos, es posible recomendar Caldo Todd Hewitt, que permite el desarrollo de la mayoria de los microor- ‘ganismos, especialmente Util para el cultivo de estreptococos fastidiosos. Con telacién a los medios sélidos, es recomendable el uso del Agar Mitis Salivarius, adicioniindole 20% de sacarosa, 0,2 U/ml de bacitracina y solucién de telurite de potasio al 1%; ademas, este medio contiene otras sustancias inhibidoras, como azul tripdn y cristal violeta Las colonias se observan de color azul oscuro, con margenes irregulares, es- trellados, bien adheridas al medio y a veces rodeadas de una zona como gotas de agua, debido a la produccién de polisacaridos extracelulares que eonforman el glicocélix. Lactobacillus spp En la actualidad se acepta que esta especie bacteriana no esta al inicio de la lesi pero si en su progresién en la profundidad del esmalte y la dentina. Son bacilos Gram positivos, pleomérficos, de forma alargada ¢ incluso cocoides; la mayoria de las especies son homofermentadoras, es decir, forman cid lactico a partir de la glucosa como producto final de la fermentacién. Tienen poder acidégeno y aciduirico28 MARGARITA CHAVES, CLAUDIA VALDIVIESO Y LUIS FERNANDO GAMBOA y una baja actividad proteolitica. No se adhieren bien a superficies lisas, por lo que prefieren fosas y fisuras u otras bacterias (coagregacién). Las especies mas encontradas en la cavidad oral son L. acidophilus, L. salivarius, L. fermentum, L. casei, L. plantarum Algunos factores relacionados con cariogenicidad de especies de Lactobaci- Hus son: presencia en niimero incrementado en la mayoria de caries cavitadas, afectando esmalte y superficies radiculares; numero en saliva correla: sitivamente con actividad de caries; unas pocas cepas producen caries en ratas gnotobidticas (libres de cualquier microorganismo); cepas capaces de in mantener su crecimiento a bajos niveles de pH (acidiricas); produccién de acido lactico en condiciones bajas de pH 5.0 (acidogénicas) y algunas cepas sintetizan polisacaridos extracelulares. El aislamiento de los microorganismos de este género se realiza mejor en Agar Rogosa y su crecimiento se ve favorecido por un ambiente anaerobio, pero también pueden crecer con 5% de CO, Las colonias se ven blancas, cremosas y de bordes regulares. En la cavidad oral se aislan principalmente del dorso de la lengua, s y de los dientes que presentan caries profundas, ya que por falta de poder adhesivo no se encuentran como iniciadores de estas lesiones, confirmando su papel como colonizador tardio. Actinomyces spp Son bacilos Gram positivos y hacen parte de la flora normal de la cavidad oral; las especies de Actinomyces spp han sido relacionadas con la caries radicular. Aunque el A. naeslundii se ha mostrado como el microorganismo predominantemente aislado, su papel en la iniciacién y desarrollo de la enfermedad ha sido incierto. También se encuentran otras especies, como A. viscosus y A. israeli. Entre los factores de virulencia, el hecho de poseer fimbrias le da una gran capacidad para adherirse y congregarse, mientras que los polisacaridos intra y extracelulares desempefian mejor la tarea de nutricién que la de adherencia. Estudios recientes han mostrado fuertes asociaciones entre caries radicular y S. mutans y Lactobacillus mas que con especies de Actinomyces. Veillonella spp Algunas evidencias sugieren que Veillonella spp, el cual esta presente en niimero significativo en la mayoria de muestras de placa supragingival, podria tener un efecto protector en caries dental. Veillonelia spp requiere lactato para su crecimien- to, pero es incapaz de metabolizar carbohidratos. Por tanto, los microorganismos utilizan el lactato y otros metabolitos intermediarios —formados por bacterias de la placa como fuente de energia, convirtiéndalas en dcidos orginicos mas débi- les y probablemente menos cariogénicos, con predominio del acido acético y del propinico. Este efecto protector ha sido demostrado in vitro y en experimentos en animales, pero no ha sido deserito clinicamente.MICROORGANISMOS CARIOGENICOS. 2 ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN LA VALORACION DE LA CARIES El método microbiolégico estandar es el recuenta del ntiimero de S. mutans y tobacillus spp en una muestra de saliva de pacientes. Una muestra de saliva wlada con parafina es recolectada y enviada al laboratorio de microbiologia, donde es mezelada, diluida y cultivada en medios selectivos para S. mutans ISB) y Lactobacillus spp (Rogosa). Se registra el nmero de colonias tipicas en una dilucién adecuada y se calcula el recuento por mililitro de saliva. Los recuentos e saliva por mililitro aceptados son los siguientes: * Valor alto >1 millon S. mutans >100.000 Lactobacillus spp. + Valor bajo <100.000 S. mutans <1.000 Lactobacillus spp. LECTURAS RECOMENDADAS Baca P, Baca A, Maestre J. Microbiologia de la Caries. Microbiologia Oral. Liébana J. (ed.). McGraw Hill Interamericana, 2002, Bagg, J., MacFarlane, T.W., Poxton, I. R., Miller, C.H., and Smith, A. Essentials of Microbiology for Dental Students. Oxford Medical Publications. 1999. Bowden GH, Hamilton IR. Survival of oral bacteria, Crit Rev Oral Med. 1998; 9(1). Hamada 8, Slade H. Biology, Inmunology and Cariogenicity of Streptococcus mutans. Microbiol Rev. 1980; 44(1). Kilian, M., Mikkelsen, L. and Henrich, J. Taxonomic Study of Viridans Streptococci: Description of Sireptoceccus gordonii sp. Nov. and Emended Descriptions of Streprococcus sanguis (White and Niven 1946), Streptococcus oralis (Bridge and Sneath 1982), and Streptococcus mitis (Andrewes and Horder 1906). International Journal of Systematic Bacteriology. 1989; 39(4). Koneman E, Allen 8, Janda W, Schreckenberger P, Winn W, Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott, Philadelphia, 1997. Ligbana J, Castillo A, Rodriguez —Avial C. Género Streptococcus. Microbiologia Oral. Ligbana J. (ed.). McGraw Hill Interamericana, 2002. Whiley, R., Beighton, D. Current classification of the oral streptococci. Oral Microbiol Inminrol, 1998; 13(1).CAPITULO 2 ESTRATEGIAS MICROBIOLOGICAS CON Streptococcus mutans Fredy Omar Gamboa Jaimes Para definir los procesos involucrados en las patologias infecciosas orales es nece- sario entender la ecologia de la cavidad oral ¢ identificar los factores responsables de la transicin de una relacién comensal a una patogénica en el huésped. La eco- logia no solo estudia las interrelaciones entre los organismos y su ambiente vivo y no vivo, sino también el papel y las contribuciones de estos organismos en la naturaleza y en los ciclos biolégicos y ecolégicos que mantienen en equilibrio los delicados eventos que ocurren en un ambiente determinado [1-2]. El desarrollo de la comunidad de microorganismos orales usualmente implica una sucesién de poblaciones; este proceso comienza con la colonizacién del habitat por grupos de microorganismos pioneros y continua con la diversidad y complejidad de la comunidad microbiana [1]. Los aspectos mis dificiles de estudiar han sido los factores que inciden en la alteracién del balance en el ecosistema oral. Gracias a las técnicas de biologia molecular, nuestros conocimientos sobre la microbiologia oral se han multiplicade en forma exponencial y en la actualidad se considera que la cavidad oral del ser humano es el nicho ecolégico con mayor biodiversidad conocido [1-2]. Se calcula que en la cavidad oral existen mas de 600 especies microbianas que colonizan ¢ interacttan entre si durante un largo periodo de tiempo. La mayor parte de la flora oral tiene la caracteristica de ser transitoria y solo quedarian como residentes 20 especies aproximadamente. Por si solas y en estado de equilibrio. la mayoria de las bacterias de la cavidad oral son inofensivas; sin embargo, cuando se conjugan condiciones especiales del ambiente oral, de los mecanismos de virulencia del microorganismo y de la respuesta del huésped, estas bacterias se convierten en actores principales, exhibiendo todo su potencial virulento que conduce al estado de enfermedad [1]. El establecimiento de la causa microbiana de las enfermedades odontogénicas, caries dental, patologias infecciosas pulpares y periapicales, gingivitis y enfermedad periodontal es compleja ¢ intimamente relacionada con los microbios de la zona.ESTRATEGIAS MICROMIOLOGICAS CON Sireptococcus Mistans a1 Ecologicamente, se estima que la caries dental es consecuencia de un desequili- en el ecosistema oral que lleva al predominio de una flora, antes considerada en la cavidad oral y ahora convertida en patégena [1-2]. Como se sabe, aries dental es un proceso patolégico infeccioso, multifactorial, localizado, pseruptivo y transmisible que destruye los tejidos duros dentales [3]. En orden cuencia, los principales microorganisms asociados a la produccion de caries Streptococcus mutans (principalmente el serotipo c) y en menor proporcién 5. inus y S. gordonii; y especies de Lactobacillus y Actinomyces (1-2, 4]. En general, en la comunidad cientifica hay consenso en sefialar.a 5. mutans como | microorganismo mas importante en caries dental; por tanto, las estrategias de aisla- “miento, identificacién, tipificacién, prevencién y control estan dirigidas hacia él. MIcrosio.ocia DE S. mutans _5. mufans, microorganismo Gram-positive, fue aislado e identificado por Clarke 924 a partir de lesiones cariosas en humanos. Lo denominé S. mutans por las mas mutantes en que se presenta: cocobacilo (forma ovalada) en un medio dcido coco (forma redonda) en un medio alcalino [5]. En cultivos de agar sangre, las as de este microorganismo son ficilmente diferenciadas; altas, convexas, nadas, mucoides, de 0.5 a Imm de didmetro, y opacas con un aspecto que Tecuerda al vidrio esmerilado [5). Esta bacteria es anaerdbica facultativa, es decir, puede utilizar el oxigeno para er, pero si este no estd presente también puede sobrevivir; sin embargo, su ecimiento Gptime ocurre en anaerobiosis. En forma concomitante can la sintesis dextrano a partir de la sacarosa, las colonias de este microorganismo emiten un _ exudado acuoso en la superficie del medio de cultive a menudo lo suficientemente ndante para que corra y forme un charco en torno a la colonia [5]. En medios de iv con sacarosa puede producir polisacaridos extracelulares, adquiriendo una _apariencia opaca, rugosa y blanca, no adherente al medio de cultivo y ocasional- ie rodeada de polimeros de glucano de aspecto himedo. Estos estreptococos o hidrolizan el almidén y fermentan la inulina, rafinosa, manitol y sorbitol [5]. 8. mutans produce polisacaridos extracelulares a partir de la sacarosa por la accién de dos enzimas, la glucosiltransferasa (GTF) y la fructosiltransferasa (FTF). La GTF es capaz de sintetizar glucano a partir de la glucasa; la FTF, fructano a partir de la fructosa. El medio mas comun para el aislamiento de 5S. mutans es el agar Mitis Salivarius con un suplemento de bacitracina y sacarosa al 20%, el cual hace la seleccidn de otros estreptocacas [5]. ADQUISICION DE S. mutans _ S. mutans se encuentra en forma permanente en la cavidad oral después de la emupcién dental, debido fundamentalmente a que requiere la presencia de tejido32 FREDY OMAR GAMBOA JAIMES duro no descamativo para su colonizacién [5]. La principal fuente de adquisicion y transmisi6n de S. mutans en los nifios es la saliva de sus madres. Estas evidencias provienen de diferentes estudios que han mostrado un idéntico patron de DNA cromosomal en las bacterias de los nifios y de sus madres. Se ha demostrado que el tiempo exacto de colonizacién de esta bacteria ¢s a los 26 meses de edad, periodo que ha sido denominado “ventana de infectividad” [6-7]. Por lo anterior, es importante recordar que S. zrutans forma parte de la floral oral microbiana, por lo que se puede encontrar tanto en pacientes con y sin caries [5-9]. Actualmente, los estudios no solo estan enfocados en la busqueda de S. mutans en saliva y placa dental, también en su cuantificacion. Algunos de ellos han mostrado una correlaci6n entre los recuentos de este microorganismo en la cavidad oral con la incidencia de la caries 5-9]; sin embargo, otros estudios no han encontrado correlacién entre la cantidad de S. mutans y la incidencia de caries [5-7]. Hoy en dia, el hallazgo de un recuento alto de S. mufans es un factor de riesgo atener en cuenta en la prevencidn y control de la caries dental AISLAMIENTO, RECUENTO E IDENTIFICACION DE S. mutans A PARTIR DE MUESTRAS DE PLACA DENTAL Y SALIVA. Con este fin, después de tomadas las muestras de placa y saliva (espontinea o estimulada) se diluyen en forma seriada —de 10 en 10—en tubos que contienen tam- p6n fosfato salino 0.05M. Después de mezclar las muestras con el tampon fosfato salino 0.05 M en vortex durante 30 segundos, se toman 1001 de cada dilucién y se siembran en cajas de petri con agar Mitis Salivarius Bacitracina (MSB; Difco Laboratories; Detroit, MI) con el fin de hacer el aislamiento selectivo y el recuento de S. mutans, ELagar MSB contiene caseina pancreatica digerida, peptona proteosa nimero 3, peptona proteosa, dextrosa, sacarosa 20%, fosfato dipotasico, azul tripan, cristal azul, agar, telurito de Chapman y bacitracina 0.2U/ml. Las cajas de petri con agar MSB se incuban en anaerobiosis (H,:CO,:N, 10:10:80) durante 2 dias a 37°C. Después del crecimiento se hace el recuento de colonias con morfologia caracteristiea de S. mutans y se hace el céleulo respectivo con el factor de dilucién de la caja en la que crecen. El recuento final se expresa en unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro de saliva o gramo de placa dental [10]. Después del recuento bacteriano, se examinan entre 5 y 20 colonias con caracte- risticas de S. mutans por medio de la tincién de Gram y se someten a las siguientes pruebas bioquimicas: fermentacién de rafinosa, manitol, melobiosa, trehalosa ¢ inulina; hidrdlisis de la esculina en presencia y ausencia de bilis, ureasa; hidrdlisis de la arginina, y resistencia a la bacitracina. El perfil bioquimico de S. mutans es: fermentacién positiva de rafinosa, manitol, melobiosa, trehalosa ¢ inulina; hidrdlisis negativa de la esculina en presencia de bilis ¢ hidrdlisis positiva de la esculina en ausencia de bilis; ureasa negativa; hidrdlisis negativa de la arginina y resistencia a 2U de bacitracina [10-11].ESTRATEGIAS MICROBIOLOGICAS CON Streplococcis Mutans B TiPiFICACION DES. mutans identificadas como 5. mutans son sometidas a tipificacién. La tipifi- cepas S. mutans permite establecer la clonalidad, asi como sus patrones ién y de transmisién. Los métodos de tipificacién genotipica, como la genética entre cepas S. mutans. Durante los tltimos afios la AP-PCR ha mente aplicada en la caracterizacién genotipica de diferentes especies entre las que se incluyen patogenos orales. Con la AP-PCR, segmentos del organismo objeto de estudio son amplificados con primers simples de arbitraria. La mayor ventaja de la AP-PCR es que no es necesario conocer dad la secuencia de DNA de la especie bacteriana a amplificar. mente se esta realizando la biotipificacién de S. mutans de acuerdo con enzimatico que poseen, utilizando el sistema comercial api-ZYM (bio- Marey-létoile, France) [11-12]. Este sistema de tipificacion ha permitido et diferencias en las cepas S. ymtans intra e interindividuo. BiotipiricaciOn be S. mutans api-ZYM es un micro-método semicuantitativo de investigacién que detectar ripida y simultineamente 19 actividades enzimaticas a partir de cantidades de indculo de la bacteria, El sistema consta de una tira con opozos 0 cuipulas (1 control y 19 pruebas), cuya base contiene los sustratos yel buffer. La base permite el contacto entre la enzima del microorga- y el sustrato generalmente insoluble. Los sustratos son inoculados con una densa de bacterias (turbidez 5-6 de McFarland) que rehidrata y ejerce enzimatica sobre los sustratos contenidos. Los productos finales generados, de un periodo de incubacidén de 4 horas, son detectados a través de reaccio- as producidas después de la adicién de reactivos. La biotipificacién se por duplicado, siguiendo las instrucciones de los fabricantes, y los biotipos gnan de acuerdo con la accién ejercida por las cepas de S. mutans sobre los ustratos del sistema [11-12]. DETECCION DE BACTERIOCINAS teriocinas son proteinas antibiéticas producidas por una amplia variedad s bacterianas. La supervivencia y proliferacién de un microorganismo dar si este logra eliminar o desplazar a un organismo competente en su ecolégico, en donde la competencia es muy intensa debido a la diversidad de 13]. Se ha sugerido que la funcién de las bacteriocinas es permitir el es- ento y permanencia de la cepa que la produce en el nicho que coloniza, mayoria de las cepas 5. »itans producen bacteriocinas, denominadas mutaci- son las que ejercen accién antagénica o inhibitoria sobre otros microorganismos34 FREDY OMAR GAMBOA JAIMES del medio oral [13-18]. Los estudios sobre antagonismo en caries dental empezaron en 1972 con ensayos realizados con S. wucans y Veillonetia alcalescens, En dicha investigacion se demostré que el crecimiento de V alcalescens en placa dental estuvo influenciado por el medio ambiente anaerdbico de la placa y por la cantidad de dcido lactice producido por los organismos formadores de placa [19]. Durante muchos afios ha habido continuidad en la busqueda de cepas 5. mutans con capacidad antagénica y su aplicacién en control microbiolégico para desplazar cepas nativas virulentas de S. muéans [13]. Diferentes investigaciones sefalan que la capacidad antagénica de S$. nutans se debe a la produccién de bacteriocinas, por parte de este, que podrian conferir una gran habilidad para desplazar a cepas nativas de la misma especie en la cavidad oral [13, 15], El ensayo en doble capa es cominmente utilizado para demostrar la accién de bacteriocinas producidas por las cepas productoras sobre las cepas indicadoras elegidas. DETERMINACION DEL EFECTO ANTAGONICO (PRODUCCION DE BACTERIOCINAS) EN LAS CEpas S. nrutans La determinacién del efecto antagonico se realiza con el ensayo de doble capa en Agar BHI (infusién cerebro coraz6n), en el que se siembran las cepas que actuan como productoras y las cepas que acttian como indicadoras. Existen otros agares con los que también se puede montar esta técnica, por ejemplo, agar tripticasa de soya, Proparacién de Las cepas productaras Las eepas productoras son aquellas que van a tener accion antagénica sobre las cepas indicadoras. Con este fin, 2 a 3 colonias de cada cepa de 8. mutans que crecen en el agar BHI se resuspenden en caldo BHI (infusién cerebro corazon) y posteriormente son incubadas a 37°C en anacrobiosis (H,:CO,:N, 10:10:80) durante 48 horas. A partir de esta suspensién se hacen siembras con micropipeta (2ul) en agar BHI (agar al 1.5% y extracto de levadura al 2%) y se incuban a 37°C en anaerobiosis (H,:CO,:N, 10:10:80) durante 48 horas. Después de este tiempo las cepas indicadoras se colocan sobre las cepas productoras. Preparacién de las cepas indicadoras Las cepas indicadoras son aquellas que van a sufrir la accidn de las cepas produc- toras; se cligen de acuerdo con Ia frecuencia de los biotipos, serotipos 0 ribotipos presentes, Con este fin, 2 a 3 colonias de cada cepa de S. mutans que crecen en el agar BHI se resuspenden en caldo BHI y se mantienen en incubacién a 37°C en. anaerobiosis (H,;CO,;N, 10:10:80) durante 48 horas. Posteriormente se toma 0.5m de esta suspensién, se mezcla con Sml de agar BHI (agar al 0.75% y extracto de levadura al 2%) y se agrega inmediatamente sobre cl agar BHI (agar al 1.5% yESTRATEGIAS MICROBIOLOGICAS CON Streptococcus Mutans 35 de levadura al 2%) en el que han crecido las cepas productoras preparadas o anterior. Estas cajas de petri con agar BHI en doble capa, en las que estan tanto las cepas productoras como las indicadoras, se llevan a incubacién C en anaerobiosis (H,:CO,:N, 10:10:80) durante 48 horas. Al cabo de este 0, la accién antagénica sec refleja en la presencia de un halo de inhibicién lo por la cepa productora sobre la cepa indicadora. Para establecer el efecto se tienen en cuenta los halos de inhibicién mayores de 4mm. SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA de la caries dental ¢ infecciones piogénicas relacionadas, S. mutans es un agente infeccioso muy importante en endocarditis [20]. La participacién ¢ microorganismo en infecciones orales y no orales ha generado un interés. conocimiento de su susceptibilidad a agentes antimicrobianos. Uno de los. ntos més adecuados para conocer la susceptibilidad antimicrobiana de S. mutans es la determinacién de la concentracién minima inhibitoria [). Los agentes antimicrobianos mas utilizados son: penicilina, amoxicilina, eritromicina, clindamicina, imipenem y vancomicina. La CMI se hace el método de dilucién en agar. A continuacién se describe brevemente colo: La CMI se hace con los antimicrobianos ya mencionades, en concentraciones entre 0.003 y 32jg/ml (10, 21]. 2. Con un replicador, sobre el agar Wilkins-Chalgren se aplican suspensiones estandarizadas de 10.000UFC/ml de la bacteria a evaluar. Después de 48 horas de incubacién a 35°C en atmésfera anaerébica (H,:CO,:N, 10:10:80), se determina la CMI de acuerdo con la concentracion _ mas baja del agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de la bacteria evaluada (10, 21]. Bibliografia ‘[1) Liébana J., editor. Microbiologia Oral. Segunda edicién. Madrid: MceGraw- Hill Interamericana; 2002. Mouton C. Bacteriologia bucodental. Versién espaiiola de la obra original en lengua francesa. Barcelona: Masson S.A.; 1995. Rodriguez A., Gonzalez OA. Fisiopatologia de la caries dental. Univers Odontol 2000; 20 (suppl 1): 21-27. [4] Crossner CG., Claesson R., Johansson T. Presence of mutans streptococci __ and various types of lactobacilli in interdental spaces related to development of proximal carious lesions. Scand J Dent Res 1989; 97: 307-315.36 FREDY OMAK GAMBOA JAIMES [5] Loesche W. Role of Strepiacoecus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50: 353-380. (6] Lang N., Hotz PR., Gusberti FA., Joss A. 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