PEMBAHASAN

Karakterisasi Senyawa Aktif dan In Vitro Aktivitas Antikanker

Daun Psidium guajava dikeringkan pada suhu 45 °C selama 4 hari, dan dihitung tingkat kelembapannya
(57,8%). Daun kering diekstraksi dengan Soxhlet (1 tanaman: 5 pelarut) dengan diklorometana dan
etanol, masing-masing menghasilkan 8,44% ekstrak kasar diklorometana (DCE) dan 9,71% ekstrak kasar
etanol (ECE). Kedua ekstrak kasar, DCE dan ECE, dievaluasi secara in vitro untuk mengidentifikasi fraksi
dengan aktivitas antikanker yang paling baik .

DCE (Gbr. 1A) lebih kuat daripada ECE terkait aktivitas antiproliferatif. DCE kemudian difraksinasi,
dihasilkan PG.(F2-F3).(F6-F9).(F4) adalah fraksi yang paling aktif mengenai penghambatan pertumbuhan
garis sel (Gbr. 1B), dengan nilai TGI mulai dari 1 g/ mL untuk OVCAR-3 (ovarium) hingga 37 g/mL untuk
UACC62 (melanoma). Nilai TGI untuk fraksi paling aktif dirangkum dalam (Tabel 1), serta fluksogram
dengan semua langkah pemurnian (Gbr. S1)
Tabel 1 Nilai Penghambatan Pertumbuhan Total (TGI; g/mL), Seperti yang Ditentukan oleh Uji Sulforhodamine B (SRB), untuk
Ekstrak Kasar aktif (DCE) dan Fraksi Aktif P. guajava L.. Nilai TGI Mewakili Konsentrasi yang Diperlukan ( g/mL) untuk
Penghambatan Total Proliferasi Sel Kanker. Nilai Ditentukan Melalui Analisis Regresi Nonlinier Menggunakan ORIGIN 8.0®
(OriginLab Corporation)

Fraksi paling murni dan kuat, PG. (F2-F3).(F6-F9).(F4).(F7), dikarakterisasi melalui GC/MS yang
menunjukkan adanya 4 senyawa utama: Rt puncak 1 = 43,28 min (17,56%), Rt puncak 2 = 44,35 menit
(24,02%), Rt puncak 3 = 44,69 menit (45,46%) dan Rt puncak 4 = 45,41 menit (7,20%). Menurut analisis
fragmentogram (Gbr. S2, Informasi Pendukung), senyawa ini memiliki berat molekul yang sama (m/z
474) dan puncak dasar ion (m/z 271), menunjukkan campuran isomer senyawa dengan rumus molekul
C30H34O5. Analisis GC/MS, GC-Tof dan 1 H-NMR memungkinkan identifikasi senyawa ini sebagai
meroterpenoid guajadial, psidial A dan psiguadial A dan B (Gbr. 2), sesuai dengan yang dilaporkan oleh
[9]. Guajadial dan psidial A mewakili pasangan isomer mayor (63,02%; puncak 1+3) pada fraksi yang
diperkaya, sedangkan psiguadial A dan B mewakili pasangan minor senyawa isomer (31,22%; puncak
2+4) . Dari persentase tersebut dapat disimpulkan bahwa tanpa teknik pemurnian tambahan, kemurnian
fraksi meroterpenoid dalam ekstrak mendekati 95%. Meskipun keempat senyawa yang teridentifikasi
telah dijelaskan sebelumnya untuk P. guajava, dan meskipun aktivitas biologisnya telah
didokumentasikan secara in vitro, tidak ada penelitian in vivo dan in silico yang menunjukkan aktivitas
farmakologis, antitumor, dan mirip estrogennya.

Di Vivo Antikanker dan Properti mirip Estrogen

Untuk menyelidiki potensi aktivitas antikanker jambu biji secara in vivo, fraksi aktif PG.(F2-F3).(F6-F9)
dievaluasi terhadap model karsinoma payudara padat Ehrlich. Tumor padat ditetapkan pada tikus Balb /
C betina ( n = 7 per kelompok) oleh sc. inokulasi 2,5 x 106 sel tumor Ehrlich ke bagian belakang footpad
posterior kanan, pada H0 (hari inokulasi). Kelompok kontrol negatif diperlakukan i.p. dengan kendaraan
(saline 0,9%), kelompok kontrol positif dengan Doxorubicin (3 mg/kg, Europharma) dan tiga kelompok
lainnya diperlakukan dengan fraksi PG.(F2-F3) yang diperkaya.(F6-F9), pada tiga dosis: 10, 30 dan 50
mg/kg, setiap 3 hari (D3, D6, D9, D12, D15, D18), selama 21 hari

Volume tumor hewan yang dirawat dengan kendaraan terus meningkat dari waktu ke waktu (Gbr. 3A).
Pengobatan dengan PG.(F2-F3).(F6-F9) secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor, dan
kecenderungan ketergantungan dosis diamati untuk tiga dosis PG.(F2-F3).(F6-F9), 10, 30 dan 50 mg/kg;
perbedaannya, bagaimanapun, tidak signifikan secara statistik. Tiga dosis PG.(F2-F3).(F6-F9) sama
efektifnya dengan doxorubicin dalam menghambat pertumbuhan tumor, tetapi yang terpenting, secara
signifikan kurang toksik (Gambar 3B). Kelompok yang diobati dengan doxorubicin menunjukkan
penurunan berat badan terus menerus selama terapi. Hewan yang diobati dengan PG.(F2-F3).(F6-F9) 30
dan 50 mg/kg, di sisi lain, mulai mendapatkan kembali berat badan dari D12 dan seterusnya, dan hewan
yang diobati dengan PG.(F2-F3).(F6). -F9) 10 mg/kg sama sekali tidak menurunkan berat badan. Temuan
ini secara meyakinkan menunjukkan bahwa PG.(F2-F3).(F6-F9) sama efektifnya dengan doxorubicin, dan
pada saat yang sama, secara signifikan kurang toksik.

Bobot tumor relatif (berat tumor / berat total tubuh), pada D21, juga memvalidasi temuan ini. Sejalan
dengan hasil yang dilaporkan dalam (Gambar 3A), baik doxorubicin dan ekstrak jambu biji secara
signifikan mengurangi berat relatif tumor (Gambar 4A), menghambat 14.6, 36.2, 39.7 dan 50.3%, untuk
doxorubicin dan PG.(F2-F3 ).(F6-F9) masing-masing 10, 30 dan 50 mg/kg. Kecuali rahim, tidak ada organ
yang dikumpulkan (jantung, paru-paru, hati, ginjal, limpa, lambung, dan otak) pada D21 menunjukkan
tanda-tanda toksisitas makroskopis, atau perubahan berat badan. Uteri dari hewan yang diberi
perlakuan PG.(F2-F3).(F6-F9), bagaimanapun, meningkat baik dalam ukuran dan berat, efek yang diamati
untuk ketiga dosis jambu biji (Gbr. 4B). Pengaruh ekstrak jambu biji pada proliferasi rahim sangat
menunjukkan efek fitohormonal dan mirip estrogen. Pengamatan ini menunjukkan bahwa prinsip aktif
P. guajava mungkin memiliki mekanisme aksi yang mirip dengan tamoxifen, agen kemoterapi
antihormomal yang digunakan secara klinis untuk kanker payudara dan ovarium, yang juga berpotensi
merangsang proliferasi rahim 15. Aktivitas antagonis tamoxifen pada sel kanker, bersama dengan efek
agonisnya pada rahim, mencirikannya sebagai modulator reseptor estrogen selektif (SERM)

Kesamaan farmakologis antara tamoxifen dan PG.(F2-F3).(F6-F9) dikonfirmasi dalam studi in vivo kedua,
di mana aktivitas antitumor PG.(F2-F3).(F6-F9) dibandingkan dengan tamoksifen dan doksorubisin.
Kemanjuran serupa diamati untuk kelima intervensi (Gbr. S3, Informasi pendukung). Temuan ini sangat
menyarankan bahwa prinsip-prinsip aktif dalam PG.(F2-F3).(F6-F9), yaitu guajadial, psidial A dan
psiguadials A dan B, dapat bertindak sebagai fitoestrogen, dengan mekanisme aksi seperti tamoxifen,
menghadirkan spesifik jaringan aktivitas antagonis dan agonis.

In Silico Assessment of Guajadial dan Psidial A Affinity terhadap Reseptor Estrogen

Untuk mengkonfirmasi efek potensial aktif jambu biji untuk antikanker dan aktivitas hormonal, dan
untuk menganalisis kesamaan farmakologisnya dengan tamoxifen, percobaan docking molekul silico
dilakukan. Afinitas guajadial dan psidial A, yaitu isomer Psidium guajava yang paling terkenal dianalisis,
baik untuk ER-α maupun ER-β.

Struktur estradiol dan tamoxifen diperoleh dari Pusat Informasi Senyawa Hetero Uppsala dan mode
pengikatannya digunakan sebagai kontrol untuk studi in silico. Docker virtual Molegro digunakan untuk
simulasi docking molekul dan energi afinitas antara estradiol (ligan fisiologis) dan ER ditetapkan ke 1
sebagai referensi. Studi in silico dilakukan dengan membandingkan prinsip-prinsip aktif pose docking
dengan molekul kontrol (estradiol dan tamoxifen), mengenai mode pengikatan masing-masing ke
ER(α/β)

Situs pengikatan estrogen di ER ditandai dengan hidrofobisitas tinggi dengan residu polar di ujungnya,
yang bertanggung jawab untuk menambatkan ekor polar estradiol dan tamoxifen. Lingkungan kimia ini
cocok untuk interaksi dengan molekul apolar atau amphiphilic seperti estradiol, tamoxifen, guajadial dan
psidial A. Struktur kristalografi ER-kompleks dengan estradiol menunjukkan bahwa hormon berorientasi
oleh ikatan hidrogen di ujung dan kontak hidrofobik van der Waals sepanjang cincin-A fenolik dan cincin-
B dan C-hormon [16]. Studi docking dengan reseptor guajadial dan psidial A dan ER- dan ER-
menunjukkan bahwa ada sekitar 20 residu asam amino yang membuat kontak van der Waals (Gbr. 5).
Hebatnya, dalam kompleks guajadial/ER-15 van der Waals-menghubungkan residu (R394, L391, L387,
L346, F404, E353, A350, T347, L384, L428, M421, I424, G521, H524, L525) di kaitannya dengan
tamoxifen/ER-kompleks (Gbr. 6A). Untuk psidial A, kami mengamati 14 residu pengontak van der Waals
yang berinteraksi juga terdapat dalam kompleks tamoksifen/ER (G521, H524, R394, E353, A350, L387,
L384, L391, M421, I424, F404, T347, L346, L525; Penomoran ER manusia) (Gbr. 6B).

Residu polar (R394, E353, H524) memainkan peran kunci dalam pengenalan estradiol oleh ER, karena
kemampuannya mengikat gugus hidroksil pada ujung ligan ini [16]. Berlawanan dengan estradiol, baik
guajadial dan psidial A hanya menampilkan satu ekstremitas kutub, oleh karena itu interaksi ikatan
hidrogen hanya diamati pada satu ujung kompleks (Gbr. 6). Pose terbaik kedua untuk kedua ligan
berlabuh adalah ketika ligan diputar 180° di sekitar pusatnya, mempertahankan kontak van der Waals;
namun, ini memungkinkan serangkaian interaksi ikatan hidrogen yang berbeda di kedua reseptor. Hal ini
didukung oleh fakta bahwa situs pengikatan estrogen memiliki kedua ujung yang ditutupi dengan residu
polar seperti yang disebutkan di atas. (Tabel 2) menyajikan energi relatif dari interaksi antara guajadial
dan psidial A, dan ER- dan ER-, yang menegaskan afinitas ligan yang tinggi untuk kedua isoform reseptor,
yang selanjutnya menunjukkan kemungkinan aksinya sebagai fitoestrogen.

KESIMPULAN

Kami di sini menunjukkan bahwa ekstrak mentah diklorometana P. guajava, fraksi yang diperkaya, dan
prinsip aktif sangat menghambat panel sembilan sel kanker manusia secara in vitro. Proses pemurnian
fitokimia menghasilkan 4 isomer meroterpen: guajadial, psidial A dan psiguadial A dan B, semuanya
dengan massa molekul m/z 474, puncak basa ion m/z 271 dan rumus molekul C30H34O5. Eksperimen in
vivo menunjukkan bahwa fraksi PG.(F2-F3) yang sangat aktif.(F6-F9) sama efektifnya dengan doxorubicin
dalam menghambat pertumbuhan tumor Ehrlich padat, tetapi juga secara signifikan kurang beracun
sebagai obat kemoterapi yang digunakan secara klinis. Selain itu, studi in vivo menunjukkan bahwa PG.
(F2-F3).(F6-F9) merangsang pertumbuhan rahim, sehingga menyarankan mekanisme aksi SERM seperti
tamoxifen. Dalam studi docking molekul silico menegaskan bahwa guajadial dan psidial A, yaitu prinsip
aktif yang paling menonjol disajikan dalam ekstrak, sangat cocok dengan ER- dan -. Pengamatan ini
menunjukkan bahwa prinsip aktif P. guajava, guajadial dan psidial A - dan kemungkinan juga psiguadial A
dan B - mungkin merupakan fitoestrogen yang kuat, dengan mekanisme aksi yang mirip dengan
tamoxifen, juga menghadirkan aktivitas antitumor yang kuat, dan oleh karena itu, memiliki potensi yang
menarik untuk pengobatan antikanker