Presentación Tema 3

Tema 3.
Mecanismos de catálisis enzimática
Catálisis enzimática
Cofactores (definición de grupo prostético, coenzima, apoenzima y

holoenzima)
Cómo se determina el mecanismo de catálisis de una

enzima
Mecanismos de catálisis más frecuentes
Ejemplos de mecanismos enzimáticos de enzimas

seleccionadas
S
Disciplina de la enzimología que estudia los mecanismos por los

cuales las enzimas favorecen la reacción de los sustratos hasta
productos y determina los eventos que ocurren en el centro
activo de una enzima
La catálisis enzimática está subordinada a las leyes generales de

la catálisis química
La presencia de una enzima no permite la aparición de nuevas

reacciones, ni va en contra de las leyes de la termodinámica
La catálisis enzimática utiliza un mecanismo particular de la

enzima que acelera y facilita la reacción
S
La catálisis enzimática se lleva a cabo principalmente por los aa
del centro activo de la enzima.
Los aa que forman parte

de las enzimas tienen
una serie de grupos
interesantes en sus
cadenas laterales
http://www.lourdes-
luengo.org/actividades/
3-3clasificacion_aminoacidos.h
S
tm
Cofactores en la catálisis enzimática
Aunque muchas enzimas son catalíticas por sí mismas, otras

necesitan la ayuda de un cofactor para ser activas
Los cofactores son moléculas de naturaleza no proteica,

termoestables y de bajo peso molecular
Los cofactores proporcionan nuevos residuos químicos a las

reacciones enzimáticas
S
Los cofactores pueden ser de naturaleza inorgánica y orgánica
Los cofactores orgánicos pueden a su vez ser grupos prostéticos o

coenzimas, dependiendo de su asociación con la enzima
Si la unión del cofactor con la enzima es débil y son liberados

después de la catálisis se consideran Coenzimas
Si la unión del cofactor con la enzima es fuerte (a través de

uniones covalentes) se consideran Grupos prostéticos
En el caso de enzimas que necesitan grupos prostéticos, a la

parte proteica se le denomina apoenzima y al conjunto
apoenzima-grupo prostético se le denomina holoenzima
S
Algunos cofactores que actúan como grupos prostéticos en unas

enzimas son coenzimas en otras.
Ej: la tiamina pirofosfato (TPP) se encuentra unida fuertemente a

la piruvato descarboxilasa pero ligeramente a la piruvato
deshidrogenasa.
TPP es grupo TPP es

prostético en coenzima
PDC en PDH
S
Cofactores inorgánicos
S
Tomado de “Biochemistry” de Garret y Grisham
Ej: Anhidrasa carbónica (4.2.1.1, carbonato hidroliasa)
Cataliza la reacción de descomposición

del ácido carbónico.
H2CO3 CO2 + H2O
Para la catálisis necesita iones Zn2+
La adición de EDTA impide la

actividad de la enzima
La activ idad de la enzima se

recupera con la adición de iones Zn2+
S
Ej: Luciferasa (1.13.12.7, Photinus-luciferin:oxigeno 4-
oxidoresuctasa)
Cataliza la oxidación de la luciferina (producción de luz)
Luciferina + O2 + ATP Luciferina + CO2 + AMP + PP + luz

oxidada
La luciferasa requiere Mg2+ como cofactor
S
Ej: Luciferasa (1.13.12.7, Photinus-luciferina:oxigeno 4-
oxidoresuctasa)
La coordinación del cofactor no se hace a través del centro activo

sino a través de la molécula de ATP
Mg2+ ATP
S
Cofactores Orgánicos
S
Tomado de “Biochemistry” de Garret y Grisham
Cofactores Orgánicos
Los Cof. orgánicos son comunes a muchas y diferentes enzimas. Ej:

se conocen más de 700 enzimas usan el NADH como Cof. orgánico.
Los Cof. orgánicos sufren una modificación química tras la acción

enzimática, por lo que deben ser regeneradas para que su
concentración se mantenga en la célula. Ej: el NADPH es regenerado
a través de la ruta de las pentosas fosfato.
Dado que los Cof. orgánicos sufren una modificación química tras la
acción enzimática, se pueden considerar como una clase especial de
sustratos
Algunas enzimas pueden tener más de un cofactor: Ej: piruvato

deshidrogenasa S
Ej: piruvato deshidrogenasa requiere de 5 cofactores
orgánicos y 1 metálico
1 Cofactor débilmente asociado:

TPP
2 Cofactores covalentemente unidos: Lipoamida y

FAD
S
Ej: piruvato deshidrogenasa requiere de 5 cofactores
orgánicos y 1 metálico
2 Coenzimas: NAD y CoA
S
y 1 metal : Mg2+
Mecanismos de catálisis enzimática
Definición de mecanismo catalítico: secuencia ordenada de eventos

que transcurren en la transformación de un sustrato en un producto
Un mecanismo se deduce reuniendo datos cinéticos y estructurales
Por qué se estudian los mecanismos de acción de las enzimas?
Cómo se estudia el mecanismo de acción de una enzima?
Ensayos de inhibición
Ensayos de cambio de pH
Detección de intermediarios
Estudios cristalográficos
Modificaciones químicas de las cadenas laterales de aa del
centro catalítico
Mutagénesis dirigida
S
Elucidación de mecanismos de catálisis enzimática
Ensayos de inhibición:
Son ensayos enzimáticos que se realizan en presencia de una

sustancia inhibidora (Tema 6).
Algunos tipos de inhibidores (los competitivos) poseen una

estructura similar al sustrato
Si comparamos la estructura del inhibidor y del sustrato

podemos definir aquellas características estructurales
comunes que pueden estar involucradas en la unión y
reacción con el centro activo de la enzima.
S
Ensayos de inhibición:
Ej: inhibidores de la acetilcolinesterasa
La acetilcolinesterasa es una enzima situada en el espacio

sináptico de las neuronas
Cataliza la reacción de descomposición de la acetilcolina

(neurotransmisor) hasta colina y acetato
Acetil colina Colina

S
Acetato
S
inhibidores de la acetilcolinesterasa
Acetil colina
Neostigmina Edrofonio Carbaril
Los mejores inhibidores son los análogos estructurales del estado de transición
S
Ensayos de cambio de pH:
La actividad catalítica de las enzimas frecuentemente es

dependiente del pH
La razón de tal dependencia es la ionización diferencial de

los grupos que forman parte del centro activo
Estudiando la dependencia de la actividad con el pH es

posible deducir los pKas de los aa involucrados en el
mecanismo de acción
S
S
Hay que hacer correcciones de los pKas observados ya que el

pKa de un aa libre puede variar hasta 4 unidades cuando el
ambiente no es acuoso, siendo el caso de los centro activos
A pesar de estas variaciones, el estudio de la dependencia del

pH da mucha información en el estudio del mecanismo de
acción de una enzima.
S
Detección de intermediarios:
Es una de las técnicas más directas para obtener información

sobre el mecanismo de acción de una enzima
Sustrato Producto
Mecanismo
de acción
Sustrato intermediario Producto
S
Detección de intermediarios:
En ocasiones el intermediario es suficientemente estable

para ser aislado y caracterizado
En otras ocasiones el intermediario no es suficientemente

estable para ser aislado y caracterizado, pero puede
detectarse su existencia por una técnica directa como la
espectroscopía.
En otros casos el intermediario es inestable pero se puede

“atrapar” mediante métodos químicos o físicos como las
bajas Tª.
S
Estudios cristalográficos:
Es una de las técnicas más potentes para la elucidación del

mecanismo
Permite “observar” los contactos entre el sustrato y los aa

del centro activo de la enzima
La principal limitación: el tiempo de análisis debe ser inferior

al tiempo de reacción
Cuando no ocurre lo anterior:

- se hacen cristalizaciones con sustratos análogos más
pobres a los sustratos naturales
- se hacen cristalizaciones en presencia de inhibidores

S
Estudios cristalográficos: otras soluciones
Hacer el análisis a muy bajas temperaturas
Utilizar tecnologías más rápidas como las radiaciones emitidas

por un sincrotrón
Con esta tecnología se pueden capturar patrones de

difracción de reacciones que ocurren en milisegundos.
S
Modificaciones químicas en las cadenas laterales de aa:
Principio: si la cadena lateral de un aa está involucrada en el

mecanismo de una reacción enzimática y la modificamos, la
actividad de la enzima debe cambiar.
La modificación se lleva a cabo con los llamados

derivatizantes
Los derivatizantes deben ser lo más específicos posible
Esta estrategia está basada en las características químicas de

cada aa
S
Ejemplos:
S
Principal limitación: NO siempre que se observe disminución

de la actividad significa que el aminoácido derivatizado esté
implicado en el centro catalítico de la enzima.
S
Mutagénesis dirigida:
Principio: si un aa que está involucrado en el mecanismo de

catálisis es sustituido (mutado) por otro, la actividad de la
enzima se perderá
Es el método de preferencia desde el desarrollo de la

tecnología del ADN recombinante
Cómo se obtienen los mutantes?
La técnica más frecuente es realizar mutantes por PCR
S
La mutagénesis dirigida no debe hacerse al azar, sino que se

necesita un diseño racional
Ej: Una proteína de 140 aa podrían hacerse 2660 mutaciones

diferentes (140x19)
Las sustituciones hay que hacerlas pensando qué aa cambiar

y por cuales hacer el cambio
S
Mutagénesis dirigida: Cómo decidir qué aa cambiar?

Proximidad al sitio de unión del sustrato
S
Mutagénesis dirigida: Cómo decidir qué aa cambiar?

Aquellos aa que estén conservados en otras especies
S
Qué aa usar para hacer el cambio:

Hay que realizar cambios interesantes dirigidos a
obtener información: ej: Asp ------> Asn
Aspártico Asparagina S
Qué aa usar para hacer el cambio:
S
Mecanismos de catálisis enzimática más frecuentes
1. Catálisis por estabilización del estado de transición
2. Catálisis intramolecular
3. Catálisis ácido-base
4. Catálisis covalente
5. Catálisis mediada por iones metálicos
Todos estos mecanismos de catálisis

NO son excluyentes
S
1. Catálisis por estabilización del estado de transición

Se produce por la unión de la E y el S a través de multitud de
fuerzas débiles
La unión de la E con el S provoca cambios conformacionales en S
El cambio conformacional crea tensiones en S hasta llevarlo al

estado de transición (S*)
La unión de la E con el S* es 1010-1015 veces más fuerte que la

unión de la E con su S
El mejor inhibidor de una E es un análogo al S*
S
2. Catálisis intramolecular
Se produce cuando la E establece una serie de uniones con el

S o sustratos que los hace estar muy próximos y en la
orientación adecuada.
+ =
S
Se produce por la participación de aa del centro activo de la

E que actúan como ácidos o bases
Los grupos cargados del centro activo alteran la distribución
de e- del sustrato
Al afectar la distribución de e- ayudan a desestabilizar
enlaces existentes y favorecen la formación de otros
Es el tipo de catálisis más frecuente
S
Ej de catálisis ácida: hidrólisis de un enlace peptídico
La reacción involucra la ruptura de un enlace N-C y

formación de un enlace O-C y un N-H
Las His poseen un átomo de N con carga + a pH neutro
Este N tiene tendencia a donar

protones, es decir actuar como
un ácido
S
Eventos que ocurren en catálisis ácida
Los e- del enlace N-H tienden a compensar la
His carga + del N (con cesión del H)
Existe una retirada de e- del doble enlace C=O
S hacia el O (se utiliza para formar enlace O-H)
Aparece una carga parcial + en el C del carbonilo
El O del H2O (muy electronegativo) tiende a

H2O compensar esa carga
Se forma un intermediario en estado de transición muy inestable que

evoluciona de forma que ocurre formación del enlace C-OH y ruptura
del C-N
S
Eventos que ocurren en catálisis básica
La carga – del Asp afecta a la distribución
electrónica del H2O (empuja los e- hacia el O)
S Al hacer más electronegativo al O, el H2O es más
propensa a donar e- al C carbonílico
H2O Los e- del enlace carbonilo se desplazan al O
La resolución de esta estructura acaba con la

Asp ruptura del enlace C-N y la formación del C-OH
Ambos mecanismos tienen el mismo efecto
S
Lo más frecuente es que exista un residuo ácido y uno básico
en la misma enzima, produciéndose los dos mecanismos al
mismo tiempo
His
S Esto trae como consecuencia que

las reacciones sean más rápidas
H2O
Asp
S
En este tipo de mecanismo el S se ve modificado
transitoriamente por la formación de un enlace covalente
temporal con un residuo del centro activo de la enzima.
La formación del enlace covalente produce un compuesto en

estado de transición muy reactivo
Dependiendo de cómo se inicie se puede clasificar en:
- Catálisis covalente nucleófila (grupo cargado -)
- Catálisis covalente electrófila (grupo cargado +)
S
- Catálisis covalente nucleófila (grupo cargado -):
Son grupos con pares de electrones libres que actúan

sobre grupos con dobles enlaces (C=O C=N)
S
- Catálisis covalente electrófila (grupo cargado +)

Son grupos con apetencia por pares de electrones
libres.
S
Grupos que pueden iniciar la catálisis covalente en las
enzimas
S
5. Catálisis mediada por iones metálicos
Muchas enzimas necesitan iones metálicos para realizar su
función (metaloenzimas)
Los metales pueden ser alcalinos (Na+, K+), alcalinotérreos (Mg2+)
o metales de transición (Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+)
Los metales pueden actuar a tres niveles en las reacciones

enzimáticas:
- Formando enlaces covalentes coordinados para fijar el
sustrato y orientarlo
- Polarizando el enlace que va a ser escindido o neutralizando

compuestos en estado de transición con cargas negativas
- Mediante reacciones de oxidación-reducción

S
Mecanismos de catálisis de enzimas seleccionadas
Vamos a estudiar 3 casos particulares de enzimas o familias de
enzimas
Estos mecanismos son muy representativos y comunes en muchas

enzimas.
- Mecanismo de la LISOZIMA (3.2.1.17)

(C. ácido-base)
- Mecanismo de acción de la SERÍN PROTEASAS (C. covalente)

- Mecanismo de acción de la Carboxipeptidasa (C. iones
metalicos)
S
Mecanismo de catálisis de la lisozima
La lisozima fue la 1ª enzima determinada por difracción de RX
David Phillips 1965
Ampliamente distribuida:
S
Cataliza la hidrólisis de enlaces glicosídicos que unen al NAM y la

NAG de la pared celular de las bacterias
Sustrato de la lisozima
S
La lisozima es una enzima pequeña
La lisozima de huevo tiene 129 aa

14600 Da
El centro activo está formado por 2
aa, la Glu35 y el Asp52
Los aa centro activo están situados en

S
una hendidura que puede acomodar 6
residuos de carbohidratos
Philips et al 1966 proponen este mecanismo para la lisozima:
1. Con la unión a la E, el S adopta una conformación tensionada.

El residuo D es distorsionado para acomodar el anillo D dentro del
centro activo de la enzima. La enzima fuerza al sustrato a adoptar
una conformación que se aproxima al estado de transición.
S
2. El Glu35 posee un H+ que es cedido al O del enlace glucosídico.

Esta cesión provoca una ruptura en el enlace CO del anillo D por lo
que el sustrato se escinde en dos partes
S
3. El anillo D del polisacárido posee una carga + neta (ión oxonio).

Este es un compuesto en estado de transición estabilizado de dos
formas: a) por la carga – del Asp52 y b) por la deformación del
anillo D, que permite que la carga + del oxoanión esté en
resonancia entre el C y el O del anillo.
S
4. Se libera el anillo E del Glu35, rindiendo un intermediario

Glicosil-Enzima (a través del anillo D)
S
5. El ión oxónio reacciona con una molécula de H2O del medio de

donde se extrae un grupo hidroxilo que va al anillo D y un H+ que
sirve para reprotonar el Glu35. Posteriormente el anillo D se
libera
S
Mecanismo de catálisis de las serín proteasas
Son un tipo de enzimas proteolíticas (hidrólisis de enlace
peptídico) por acción de un residuo de Ser del centro activo
Son una de las familias de enzimas mejor caracterizadas
Esta familia incluye enzimas tan importantes como:
Tripsina
Quimotripsina
Elastasa
Trombina
> Subtilina
Plasmina
S
Las serín proteasas digestivas (T, Q, E) poseen una secuencia
primaria muy similar entre sí (posiciones equivalentes de la triada
catalítica):
Chimotripsinogeno Tripsinógeno Elastasa
S
En el mecanismo de acción de las serín proteasa están implicados
3 aa conocidos como la triada catalítica:
Asp102
Ser195
His57
S
Las serín proteasas digestivas (T, Q, E) tienen un mecanismo muy
similar, aunque distintas especificidades:
Tripsina: rompe péptidos en el lado

carbonílico de aa básicos
Quimotripsina: rompe péptidos en el lado

carbonílico de aa aromáticos Arg Lys
Elastasa: rompe péptidos en el lado

carbonílico de aa neutros y pequeños
Phe Tyr
S
La distinta especificidad se debe a la composición y estructura del

centro catalítico:
Quimotripsina Tripsina
Interacción hidrofóbica Interacción iónica

S
Inmovilización del sustrato en el La His57 actúa como base retirando un

bolsillo hidrofóbico
El Asp102 posiciona a la His57
H de la Ser195, lo que facilita el ataque
nucleofílico al carbono carbonílico. Se
S
forma un compuesto de transición
El H+ de la His57 se transfiere,
creándose un intermediario unido Una molécula de H2O se une a la
covalentemente a la enzima por la
Ser y liberándose el extremo C
enzima por el N de la His57
S
terminal del péptido.
El H2O transfiere su H+ a la His57 El péptido unido se libera mediante

y su OH al sustrato restante,
formándose de nuevo un estado de
ruptura del enlace acilo y el protón es
transferido a la Ser a partir de la His,
S
transición retornando a su fase inicial
Mecanismo de catálisis de la carboxipeptidasa A
La carboxipeptidasa A es una enzima que hidroliza enlaces peptídicos
del extremo C terminal de las proteínas
Hidroliza cualquier
enlace peptídico del
extremo C terminal
excepto Arg, Lys o
Pro
Serín proteasas Carboxipeptidasa A
Es más eficiente eliminando residuos con cadenas

aromáticas (Phe, Tyr, Trp) o alifáticas voluminosas (Leu, Ile)
S
La estructura 3D de la carboxipeptidasa A fue elucidada por William
Lipscomb (U. Harvard 1967).
Proteína de 307 aa secretada por el
páncreas al intestino
Posee fuertemente unido un

átomo de Zn2+ (metaloenzima) S
El Zn2+ está situado en un bolsillo cerca de la superficie de la enzima
y coordinado por Glu 72, His 69 y His 196.
El centro activo está formado por los aa

Arg 145, Tyr 248 y Glu 270
S
1. Acomodo del sustrato en el centro

activo en un bolsillo apolar
2. Interacción electrostática del S con la

Arg 145
S
3. El carbonilo del enlace

peptídico se coordina con
el ión Zn2+ polarizándolo
4. El ión Zn2+ compensa

la carga (–) que aparece
en el O (catálisis
electrófila)
5. El gran dipolo formado hace que el 6. El Glu 270 elimina el H+ del H2O
grupo carbonilo sea más vulnerable al favoreciendo que el grupo OH del
ataque nucleófilico agua ataque al C carbonílico (catálisis
básica)
7. La Tyr 248 simultáneamente dona un H+ al grupo NH, produciéndose la

hidrólisis del enlace peptídico
S
8. El Glu 270 cede un H+ a la Tyr 248 recuperándose el estado original de la
enzima

Presentación Tema 3

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Presentación Tema 3

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Tema 3.

Mecanismos de catálisis enzimática

Cofactores (definición de grupo prostético, coenzima, apoenzima y

Cómo se determina el mecanismo de catálisis de una

Mecanismos de catálisis más frecuentes

Ejemplos de mecanismos enzimáticos de enzimas

Disciplina de la enzimología que estudia los mecanismos por los

La catálisis enzimática está subordinada a las leyes generales de

La presencia de una enzima no permite la aparición de nuevas

La catálisis enzimática utiliza un mecanismo particular de la

Los aa que forman parte

Aunque muchas enzimas son catalíticas por sí mismas, otras

Los cofactores son moléculas de naturaleza no proteica,

Los cofactores proporcionan nuevos residuos químicos a las

Los cofactores pueden ser de naturaleza inorgánica y orgánica

Los cofactores orgánicos pueden a su vez ser grupos prostéticos o

Si la unión del cofactor con la enzima es débil y son liberados

Si la unión del cofactor con la enzima es fuerte (a través de

En el caso de enzimas que necesitan grupos prostéticos, a la

Algunos cofactores que actúan como grupos prostéticos en unas

Ej: la tiamina pirofosfato (TPP) se encuentra unida fuertemente a

TPP es grupo TPP es

Cataliza la reacción de descomposición

H2CO3 CO2 + H2O

Para la catálisis necesita iones Zn2+

La adición de EDTA impide la

La activ idad de la enzima se

Cataliza la oxidación de la luciferina (producción de luz)

Luciferina + O2 + ATP Luciferina + CO2 + AMP + PP + luz

La luciferasa requiere Mg2+ como cofactor

La coordinación del cofactor no se hace a través del centro activo

Los Cof. orgánicos son comunes a muchas y diferentes enzimas. Ej:

Los Cof. orgánicos sufren una modificación química tras la acción

Algunas enzimas pueden tener más de un cofactor: Ej: piruvato

1 Cofactor débilmente asociado:

2 Cofactores covalentemente unidos: Lipoamida y

2 Coenzimas: NAD y CoA

Definición de mecanismo catalítico: secuencia ordenada de eventos

Un mecanismo se deduce reuniendo datos cinéticos y estructurales

Por qué se estudian los mecanismos de acción de las enzimas?

Cómo se estudia el mecanismo de acción de una enzima?

Son ensayos enzimáticos que se realizan en presencia de una

Algunos tipos de inhibidores (los competitivos) poseen una

Si comparamos la estructura del inhibidor y del sustrato

Ej: inhibidores de la acetilcolinesterasa

La acetilcolinesterasa es una enzima situada en el espacio

Cataliza la reacción de descomposición de la acetilcolina

Acetil colina Colina

Neostigmina Edrofonio Carbaril

Ensayos de cambio de pH:

La actividad catalítica de las enzimas frecuentemente es

La razón de tal dependencia es la ionización diferencial de

Estudiando la dependencia de la actividad con el pH es

Hay que hacer correcciones de los pKas observados ya que el

A pesar de estas variaciones, el estudio de la dependencia del

Es una de las técnicas más directas para obtener información

Sustrato intermediario Producto

En ocasiones el intermediario es suficientemente estable

En otras ocasiones el intermediario no es suficientemente

En otros casos el intermediario es inestable pero se puede

Es una de las técnicas más potentes para la elucidación del

Permite “observar” los contactos entre el sustrato y los aa

La principal limitación: el tiempo de análisis debe ser inferior