I

l
frqłl hro we rnt bodĄ po nu ahr'w prod/łhtf. 14
'q,te_rr'9,f,ów fi.,orqąnt'X,rn
rc,nt'o,, rn
oynocla ,tu W tłń
_
c 6tłl.
Tod"a,ć,aI
,

-, cxevror-,u, - ńńb,'ohl|u' ,_hłc n.ó rkl , teltxPt'Ł

r^Łf\\tĄłfrpw,r : CfI nu m ąre^ąl9e n Ę

Garc.aa aaCo .ao oaa.c o o o a. J a a{' a c c f

lłoei"rlro;\e Kt,lrrąórrlłCIt,lp. łi t

!. Krll'Łr.,rą. _h,orrąóvkcwcł-- p.ot-vrŃ hMtłtrr honnńalłt' /frnĄ

th, D0 łrD"|11rOJnl{m''
brofern . ito.1,,ow]'e |łro,móvVw we

owt'ecLnr-lh kom
hom6rek, ^fi,
in vu}w r] nn.'rn €,tl tfuą
ź. t§,>Yt^ąowe nt'n hnĄowtt. hom_t< rlłr wu{qh l
-, \or.ho siłsbe_m m_O,d"g\0wt^ w xq_a(qwe orąpn\zm,!
{e tgWruc zn
JJgKSuc
^ąrnt'g,Ą" fiC(,
Zn o,rcr
ąth now tc twłl\rorłńt_h
:: twrffA§nlg tlĄ&neK _ " *
-" proglvLtk u',9" §i(Ul"ept.OnŁ \ł \'
--, vŁDLi hr&tl'O- i uu KL a r.łr-t tJw
::KUllM§l
;,py Kt{oJ{c,0L -t-"o.'p"ęuĘ*vń:
Bt

l"§.,
5. ?_rx.rłilr2lowr}n(g r' ł|r.rlĄ\.ł]6aul'u *,lq
,.#
.:->

wtlńt'-rŁ \ęAr vLoovtlrtrĆ g4,L1,'viulutu - eą

'P"OilsYąwo we SV'rOvCjLnt,K[ -
.l7.,\ł:twte qnie

U,Pm§d}ł:* l

e nO"

Mrn§rxłr,ą

{"
 \
-\
+
Ąf,
-:1
a I a\

#7
r/ź=J
.
_Ł_

rcLł(ąt'f,,tix
są oLD te t,t) łohstłt^n MJb Ąlert,4tnp§lrJ

0Wh\'0tĆ
6ręX L' ĄLerqth_g
Fłńtł kUasu; it ł.,t -Vzrnrc,
1
*r"ro_,** _"
ń ou L0
_.___ ___- _
br9"rcrt
ntKt W \^JX,
ńwrłłuł'tt0
:^L*uąPo:l,ruł n t'nł Ęm . NOd^LL
nŁ \ thgmr'uang w!Ąśu'wo{ui vne {yn . PV

ffi
..
ńU sO,JOLK&"
l{tttuer, htŁoLv
Lqd,roLia,c"Ł.q §Ot0
ńąn t'em-q§& (^ En t"D- t

ńq,łł>u\m r:MQ\r,loLn
ąb(\'ą t".li't,UsU ,

\"gt_!t@"
Pltyl(

F9rń, _d $9ęl_toviutm,

o
 BB" m&t20"
CWr§f €sLŁntw o,utŁvr rro§tl'l
rxgińowuw$niu Ńo"n tr,ł" i d,Usty 6 vUi( [t'n, tt
Komó rh0w§!h_: ńnłwt'§k'T9g_W_ r,v hł rn
wterą, vów nt]?d" rnórl^vt' n t'Uiln8,
.p \lr§ńLĄJ tlnl'e h rKł' Ą factłvw
W \No"rw\Ąl^,oń tnrŚ
n r"
- i^r' m Ó r |^ŃW_(_:^ O,,QWL& wr e)p-
Yvnw
r''

0"t L'e \^
pul^1
1

9J te uS be tc nt} co L' h\,f lL,

\{ ę V
of ,Al'
;[vn \'(9\^'P S { r'eVfr
ie , O.fuQ{
jŁĄa0he i Ą
* r |t [ 'l:O \;\ 0v ": t Fr,t l

fttu
tĄrr l
* t-Ktc" Dx.u§ O"nU.,
{o{ p"l l.Ł t
\, §.
§sx KoLąfrOnO,ile n a" \ł r OSP9
, PtLAc, rpwwir it - lJr|Cfrue
\§§ ,ąLQ, V\,t)rnÓr ą t-rłcn ntŁ
nnt Yn\'
qJ§-
innte \" pyzc
. rn
e ną ppt^,t
Ę_§
Ł t§Ąy
tf/,t
il^ró ttx)nn, wą_ĘfiłĄ}_)
Kplm$rhł n{e .rvtną hO, ?Oble
-J:--_L'V-!_:],-Y! VY t v- \
. _ _= ,^
= =_
\r{ Ąnę/O,LW(Y\, -

3
 0 YOd 'v /.{lrń óTl,r,ł-" rot
Ąt.Vt óCVrt
ffi
]

po\)v^tvuhĄ'.
, te oLńĄ
,i,J W,i}.n e
ńt/
,

/\Ll n,\k 'n [' nW6W t'Ł u P0

uhe rnr'k ąl,arn
;v y<romsrŁl
uBóne
o h^' eY]
erO,JG ,

,ffit"
\ f
e,
t^,o
'rn ł,n]UeirŁ€,Ln
ifffifrffifo,.l,rru_*
Oht'firn U,
,won r]g Lt'n [u
tfr lO
nt'rr Ln6t uJ vlw
lĄorrr ń rTh"\ |.wo,

rd"Łń en {^eą
Yy\ : t^lt' n0§6,
(t-nfę, [Intr"'
-pO
^8, rvt'łzt rn ń
rr 0W
- r\nu tcntrr\,nt'Ur W&n
tŁ nt ,_ ąpLen ou,tktłą
t/\^\),
ttu"r,_ Łkn n n o ulfł!Fz_:_
ń,nx fT;IuomTffin,olnergnbŁ
,rt'op ruĘJc Fu y^lt-a
Ą
J ,L-
o nat^nft@t'
Vrn Xu
kp ąlrruEqp]e]O§I
Trn
{vt l \ł ńtMo rtN \Ą(i?o
 wO|nrl no,ff
LLo- , X'U UO- lT
']_§
L'
\,! :UuxnOrtr i,,t'uĄ ne
* rnU W
]v drn t'f, Yntlr"th" na.
nnL,
-& rr"ł t ,{łJr. n
1,] ii, i ił t'Ł
t' q
[>

i'n le-ł;r rt i/.n r^rit ł-l L r;,n

1,t {,
rónne
n0. 0f,lĄ,ł,,

Y-^gDVĄ?

l'l[O, to ĘQ9:Ą
Tqnt, 1ni nć t,9h t nŁtĄ -
ft (yyl, lltt m§tkĄ

\l U{^n[,CL y-p rrą,L - r0r\d tŃ]

\n l0,\',p t' 9rut.
rn 5r
I

,Kr .,-\t \. t,,, viL}l\ v.iltCt trin,.1ilr-1.' Lt - $Ó

t tł YVuUut Yn0&
rJ
'źJC
Klcwttr rvu u

n(i,ł"nit o^ $qĘ
OLov rnL l)
t*/ n(}, Pr-c tt,
i

Dp,
ne tŁM& ĄL' Om Ov
$D
r,"t; \,ttrn t | - Tnte Ą,r§n/
^)U r\prn*ren,
vyó,
UX\^t^'\,t n"n e
 \

ł , Ń*i,p,rÓŁsłrl i, noipow:a9^1Ętrr'e!l*q
T9 iug, 't1.^ł^'u"5jb^łbĘ
biÓiŁ[ nryNp.rnbcnroyvrlry4ń ^.lqwooL
uióreU .rnl"p^crrbcnrowrl"+4ń ru' N! ł, ĄurrŁnnł.
olru'"^:l L.{}

Óo"w+.Ątnąo, \rrn e ,!o

\
Lo ,, b,,ce revl"łtw€, i\ĄĄg}fi4, Ął&UtŁ
cevz
.§o"WĘl1r^ą.o,.\v,''n,e !,
kłcnn6rtł*t,.honn,srV* .rryrtr"n , \rQn0Jtn!'wnę orq C-ntłTS
n,c"Leilq.,
-, nĄn,.ąrZr.0 6YY9 oSp,owted,fu ,.^l.^n4łrotOąr" uą n ?iL'
^fi ,
:, T\.rt'nCmo,Lt'ń,owąnłŁ rnaavyka ?,ą0n paT.pl^r,.t 0- rq/-ry Łv1,3,1),
., v,l t't k:ń.ą ^p oct{F r.r"rc tc n" Łr,ni k q'o n ą,Ln fi L / "

-l lĘ11i2[ WprowąłĄ ilrn\'ąn r^l bUąIXU

}. .l q^oko- . %^p rćł1'0-
^Ly\Lę,UloJuł \rłt- o,rr'9Q n t-f Ę.ł, ,
1 r,Yghftlł'inguJftM4 QŁrr. ńnAJ,,l,ąt' aławt'eneć włqłlt1
,

nttŃ!O,nŁ U&nlenLq ^/.'(

-, b..rotne ; 11 l neolrulĄUwM
QOL.
VwrnO|ov "a;etńe'lh^o{orIł
b*krłW urrt ru)O- ,EĄ u,OlĆń.lwrlrutcL 1 \)iT'
V,łcci]n6 Viyr-"ą | Ęrr,kSęr^,.e).; 9 Vł0 (kg"n6lkt ,Ao"ąt) ,
:? . bvĄolvl,rJ-rł. polvrr.C e nrłtlc',tl t' Ą,lą h,łpn i,t_ b' ,wl R tV R
awiflłĄib, Ąt\iĄtt|p+"" i ęRryyro"rt rnRx/n ,d/2 uatopLoa mg
:, WUilĄ,ra^Pw,Ą,ql,e (,łryw b' fu^,b 5'\JTą
-, 7ŃĄĄOĄóWCn,tC, Ą e n q t' Kl, 5 C L R" ccq U GG _l,
)

.d" Pu'|qnq n0, -} u qvranlhf W^ĄV-e, + q,

n L,e, nt/łwent1lt' l nlrp n 0w(-1 * {tĄdĄ

;y§&Kt _
|rrcrnol,orem
-, frrnfo'nw k/)dlon6w + R\(§ rno,. LĄl\4^oW uĄ^ąprf*lune
-, gLo,d.ĄrutŁ, qen§Ę) łt/.ęx,Vu n
{ ń
nlq, ayłrht Ę ą"rlVl*h
-, St,t^ip a,Ont,e .7 rrn,erke.'r'łŃ ,'se n,cinn.=' ke r,rortg ńWrn,
u:y

*^B$WtłU'T§l f, },b .
abu C;,t
łWń
! )ff
r,crn qJo

b.^'(Y"{rrnE{Ov"oulc\ n
y*?ł\r

,
,
ę'
d- f,p {rro rn ą v^n
u
b io|^|e w
qC
1rć
fy\oJ:lti p nĄrrn{ y oĄ,o\gn l Qry1 '
,
ił
*.
 Ę. ?vOoV,uK,,,\0., btmgl1 w "rrnu'\nyq2^rqlłni -&mo"ułr,
, roŃro nJrn,"rv-V.,v.eVl4iOryOryr" 6U,acw& t' rm tYl9.;OO\ńn,
_, rÓ;ńi oń uYtd1"Ąrn,C,nt0" \' łnrarVpvL0,rąlt',
-, bóręę,bUl'(L rnie,d.rrcor(dr a?ffiO,tĘVt'OIW r,
i
-, ha,\łbV,Ą"wr1roł& wv5łPl4p Wlą&ino;u ,
:, fq,Lwe. ńw iĘą-f,e nte ĄlłO,Li Ętod^ł lł ą't ) l .^
-, m,cł*...l n.il'Ó' "di;;ńiq{..,o, tuń rc*uĘ' da rn;7d?l"gy!
. ^

n ou,,"k o ,ujołn 0 : o|u,ltloro

5, .? r0 M OHC
"u !
^wqzrn^9,,łaa,\,Ł, 1n

Weh,#..,*
p W., d,r,l (n
il**, &r§firy ",1,i49t,
oq nłr, Ńr ffio§'ÓJ'''
1,
"att 1
e

Dńę
-r fit'f-
-'1\tł&n0,r
Ą\rvO,ńO..r t

xl\d.nrn t-ł
Ki\{thit,Łu'

_; b'1cń
tr5 Ouc e0w \ł PV
lą ^0..{0Ąńk
- l nO.nLprnoU..r"\Uią :
 u,' t,l'i -
rno e, |^nć
) Ę
Yę-V|vli rn On
,ht'"ru
'0, lnr-O-f( A'\,łtdkrt' t'('}
ns(,ą-
\'ęę'rĘrnQnCą
noqOn
j
l ółln^' r}"n§t,r n 3*ą9
T' Lłl ,. nn
Ł

4\
ńfch w \"y ^^'W-
fL-
)toe rO. C,^,
)n Cer ŁCLY )\, yan{Ą V\r c {Yitrl3{
ł-]
Y tb{ JOtĄł,
\)'
Uxn^ t^ł' -,
d-
atn(e
j
N, \nowńc;
oty^& fi ll,a-
ne beŁ
,łlt'O o-" ," |)l',
!

auvla
.hód.0-
14.?(OoW\Ątio, bttr!tr" pv-łe x. lro.n>Qtni tn
prod-tlkr,łO" \qutr" bio§t}d nkwąmp" TU\-Ńu}
d^,uł t,l 0.I€ ąi u, t* T"ł,.f|
9,{nct,;1:^!$4.',t,
illnłrr- \rud7'K,0' qrrbą\,colYYilCa rvO" poz.ł
^[1§

KóX. Jnng V0 ry,ruy{,.& \od" h.5!6'{

&Mff"ł#ffińV,.\ffi^§ffi
toŃ,c, ^łr,n,,nnt M,.'OII Ą' urq.,rfur,dŃu§
ilHily-"_s\t"mnnąĘBnh':ffi pT
ffiwww§ffsTffircul
M _cn \iń§Ortllpfit clplffi:{\,&
5c-tvl).)q,ne b;
r
,1ł^rcu,tLg,
e u wu,cl'., )ov!*y,,
,WffiffiSffi.łSrł,s:n\tronu
ń uhań*:o, dohnu,ńc.,Le utuu,otk e\,ouĄ prodlłKut,thoftŁ
-
:

rlrw\x" (.,Vt^lrt_li( \XIt ufoXtrut gtn0\łJ, \CylrK qeń5u)-

ĘoY!ront7y1ct,[Łs9..p*'ó^'1*)..^.^.,.t^.(n.>ł-
]rr.noc|rłS'lxłrr\?\lo|rąns tt2,_Lłłine - l^ło"vero\^\ĄĄ , b{ąi
,W9Y{§Ę wwn;nt, g*,knĄ4łąe' 6-glpćWs,& ^n 1qbj-
toepunr,ł"uł,.n [no§j , o"nirł tnnp1
tńptc, ^ryq ,9.ĄĘw nol
9 9- ) t_
prni^ńrrc u""O" \f,^l' \a0 ą t^UOLt ltC, t r l Ulru. cl,uh. }&O *tj{J<llt qń
ię I{U t\ł0, b\ł Ęt Ń\Ąhb.fiłł&ĄuŃt§( \xcrnUv'\rł ,wq.l^e
_, n^I^IꣳprŁn; u" - \-,,oworfu,r{'e \rońtrłnlt W'Or- i'ril{OW,|
,

-, h,OnĘ0,rrr,r'\nlO, Q'c. l

-?\)C[rĄK,LrWe -?-5-,
-, bttqr q0, yo ryt-oy'fiĄ btrytt k.',

tr"ui.il^t L Ąr- Oq\^Wu lc ,

rrbcr H ( S \pt1Ę
Ąlf nnm&, S' S Unerruńrłlr ;ń+ĄnkŁ"xCfc'rt
\ ĄtK\j-xn_{t obu \9,,fiwilWu L ńŃąwćrcvrł
§ s.p_pu&erqs}x VIó\ĄtD,r- c t\enenn

l
l]l
 =ąĄ

t
t
H htułwo fl\, - ,c,lłĘr;.1 t.O,Xnnt noq€ful,
' 7tXel<nX"taD 'quJmu: pLnaml'naperw

vCg1^/o-n^ł e tDq-
t^rOl-

hr'3 Cfi r
bonr b nnL'hlL
ć( h
V* hovtrnam t/\,,X. oft t- ę*r
K,O OLrr 4
, .(y&ĄĆe ł.J-KDą.
-r;rrąmł' TT, lPl-
,lnfe r{ęrcnL.{ - bt 71-rĄ

j e, Wi \rU \tnrt
n( t \ \"\\tV

\^)n(0., t\ł
^KP nL

óxyl (

lrnĄU
V"F i

^rn^j\,Y\[
l

tetą"
ŁnOrnu kn -
lw{r Ńru&\
Ll^d \
/YlĄ YnL LeLe }r-

W(elr,
|\-|J
Ą

-,
v\
^Ufiu
H. fn,t'nn nC-
Yn(L

źr,a-^/O

rYL'
l
ŁnO y^yl
L' - opt'e
'}

rd,eJ- 0n

luJ n[Ł lo(

m ttgĄ łl

- L^rnx/\do" J Ar4l CYP3n\^: J

Włffi !ffi ffi ffiiff ,ff{i:,??łn

-
l fu'Ł nOU,'ynorF,'^rl0
sos§ lc Y ,r'uPd(,Ąy, CLl PJD6-
- rn ŁYO..,,bO \^)
 t,
A

Eq','

u-

irte nl..J nFL

:ir
 ilWW,W ?

WY;ffi _ mruru.cu)ń |*fu^l, ń en," u e p rc*^łłct9 Ą 1 Lry r*u r\,

i
ł§M,S ?ł*WoW,!
iv[v\^/d, L' ,nli-
'y^ [e
rcrtndIrru, ,

*
ł_ńLTł*
/y\łO}rMc.l t*'
\
l
tfi tn na, py1 1' [rOb t,CWą v' a-
* 1rie ,,:-0!r(f-(fie
r t' i Y.l-t'c §vvt ĄpŁtŁ
v\§Ł_L_2kvŹBr_9_W_ Ą'tlźd.fiw( t\'Yt.\ (_,,iry,

L L,.! ry"'"d-.'r}ipg&-l4ѧl,
..
,'\,l' ]w Ą{ b"}l'fl,L5 t],y'1,1t.

i,i'. !, r\,-\- rl [i.t,\'l i', i' r& UJ ilAilr

ł, ( (Ji
1.,

ŁryWvt"yv3-
Y-UO" r\Ą ń[yt,5uJ ;
: ,r.
",;:.
.; i..

{_e Vr)ńirrrć U \1uŁroe

Liułd t{"'& FO uicu{ańru" ŃLlĄ r.-r f, { r! śry§u,ry,

ht Ąt t tr)YOv,, W\b;Łą Ąt "vl. nrt e.

Ąrn1 Li
(]

,1''1) N,'1.;,,)
}.'r,,,,i_' , ,. i,,,.,-i_, ) ,"\ |Y,,,,,r1.',1
,^,.,_l. (- .}.,
,v (t W S"d[\1Ł ł.ts,t'Y\łi Lr - \nn*łro ,d.,[ wrO
O$vłl u l.!u4r
u€K t'i,<.f
lĄ,ł}Clfl, cą i"ir J
t,tJ fię p\tĄ\tćt
,li
'[,r,'\"i\ \\
itt"'i.
")
nl p\ŁY]Ąt ruV - {x"ć ł
hrcCI
L_§en&i
rfu P_tQ"B:_ffit
\.Ł - u/ tłt rt] L€/Ke

VLt,lu.i-l \ ,1 ;ł'\./\,.i,lt\1 tł/ 7

t1

J \"\ L,'i.,l.j Płli 1" t tr

;T,
ffi )
'r';1_;i.,1 C,,\ ć t'!'\'r).t,|^,

m0n łT i ,/}\]
ół§t,,
NK:V)U§§ł
\e }-&l,ltilO\\ę W{\-ń>t i'Ą,
& .HapIen-, nlŁlĄ\ó rt t [ęrnŁrr,rt\
ł,llŃ,enłe Ąo,mg wrłl,Pt*ąJ
oiutnu rr/p, Sł-ru'lrcttn,lL
^/0-,
t-\^Ą4/łÓtłr\'v
Cf\Ą
,e,§Ą qeru ą *rd.powt'u1,{
t

b, lrnm'uń,pqeN
,Ł,,lrnm"unp,ąetv - qeru \,[
rń nruuy\,OtłJ Qł' t,r n0,
h,tpt'łO\r- wrrr ,}|Ą4qęnĄ w,r e:wQ NJ 7. 'yeLePtłrlĆĘ
§, Opl0n,l'il10.I,(a, WW- 0-nfu g el^L ^ (ezr a"lruyłćłoynĄl,
\0\,W \utĄ^}ło0}nP h;cĘndlh,L oto tq/q OW?7u4 ; '
tM(.ł H't§nd LaŁSł'
sĄ.|}*Ftę. wwrU o_nfu}gŁr^Iw
La f/iLL' Wu!,ustd O-r\flłJ0 Łr^fw ,W-b,; ?ncu'utł'oĄ
P+b; ?ncu'utł,cłĄ
fK.!ffiruffioncn oaó - \ Łryt ^arur*L' ńn rx,,sC, wnnó\"l^{
yrerc'Ąt,u ; .rn,Oi{e bulu' V,fly^ńrlĄnq{ł u/bfuLrywirg,fnP- ,,

6lcte niO' M4CIrnn^tŃ\^/ąrr0 ?raQd- 4,trnPw{rr4, (T-

}Ą,o nnÓ!l^Ó Wą ; Ib - hurn 0 r ilłrrą. ) " ahoqł' Ńń o-"rl^+ a rr,ĘFru
m,: TpłP,gąle"fl+l, Ps yY, u.yP?4k |WAtzjp
M
^[R_

Ł] PatVuXł- lv|,t'
ri.-ffi}
'd"
Y$r,' yofivl
ffi ń rw'{\If*
e\+Ł Y2v'ń,ąą'U",ut'n*,fąrtu' rtL_ ,ttorłt€-
\^cn6^rlxl pc^Ti!yt,t ,r,Ł l-p (t-,4ł-9rtl!/,:ę]
* óOń lr: iice"ru"ńd ; cr;j-,Ją dń-. ń##,}''#'J ;a;ić h -
F9yT,*,o,1FA "r ^

1rlCwc,l,v,ćtł' aQ 1;irBfr ri HC H HC |- - b§ulx4-r)*dt'c,

hfl,hjciŁtx,t.ł'r]uirt,ł,"vo''€},,uo1Yl,dvl,{,crvtl_C'HHcti
cJr.Ęłłł,,,uł"{IĘ 0,'C,c.,X.łt4vo u{' ! \'yl y lJ U 1 Vr,Ę) ls-ńrf-Ł
łń'e:t1tfi1,lr,ńĄ,61 \n1,' V ery w? T rŁq-- ręp,p|,lą, f
u iW(.^^ŁiĄf, rn ry1,ła\Ą/? Wo* u\Ę
"

CCLĘO L

t
. .ź\/
 _: ;,
!
ri
li+, J 1

il,ą-

;|

§#
 \-]--,-
._l

t i
§.
,,\

rrlt} n o 5

/\ń'a rT-I2
0 yY\c a,Ł ą\r&p u fń
d*CxW_ ,&_ t,R

-- F.}.'ir] $-
J,l );
ne wunćLtWLt yp

*rf HiT -

y{,tn f ; ,"trn
fi e uł'Lłt-ł'tJ"i]S ff\Ą'
^

§
-.
.M,t
V

t )]f ,,
]a/
 3
'rĄł,i,luł ŁUilł i,t,Y- .- {

Pl?: &rnpUtt'XnL{ a hr, {rcxwuĄ

-"l",_t
t_l,"ńfi/ L','d(W'u\u\ ryvwvlJą-i
ry\ńĄu?bwL e nL,;'Ud'u\ uoi-fi tł t |ur\n4ąr1
'
3Q,r"
Ę 1{rX l,\ e ĄĘa Hy łlp CI(.o rcfip ?łVjLł\Ę
L:
6 ,rtĄł,ćI,-łlłlfre ruj, , * C,nl_r)t/. fi lru:q
x,frullPDl Yui YwLl,c, r}łLtl Lr_, łul,v4-t u ę
Yi]'!l}J lil.Ś yyqfvł,+ i ly_f,-1t
łł.ąttłFe i1,) 1lf ivJ./ię,
,.]'}p
FxrąrqrvJ, ,WŃ
yłWóą
glffi"W'TW
ffiffiLtr
R y]ngl,{w#}a,rą ńł,
-;,+hffiqary{"rąłę. bNp
ur3lęffi ' Y\f,}., V&'\ł u'\I
[\8 ń. [Jlłt't_Uffi z\ W_l1@i],_
'YYSę U''Pru t

\ffi\*ffi,ffi*m'ł,
I {,ĄĄ YC 'vĄ'r,1,1

w{PŃ ytf
rV w{p,/e
(, '-

\j}.. " Cu,łń't ŁŁ ru , O[^ł

rltąc, ut't rr e.

iir\iłr J. \\..:^V\łjr\'\,\j IiljU\1,1-,

,l1r,t;
Ą t ,Ą )
'.- ,X ,u,r y, ^,-,.\ f ,,,_
'
'

Ł 5 tn 1;0Ą r t,łt r.ł0 fu*,fi.ffiH

I
Yn o-LLen c -
t,nŁ o{,0

Yn L),.i t t vL N] ŁĄee rh - te Ml-( (_,(.€

f
^
! ^

f'OL{ WtĄ,
' >,",{f,l}.tl,ęrl t |{/ tf l", LŁ l;:!fi
ń, r \łtPXj il,\, bi' O{O,,;ł- t' l llL
(ltl
l.- t,
/.' Utj{
.Ą.fuO t ŁL' ,[,\_
('- t i/),t,ł

i,l i w19-- i, e V'U|

^_,

e
r,,,

Y''] ujtr
tr,xr' 7y;P,l,'c,*

Ł,Lt,t'CI, /rn ł \3r.

iorrl "{,,Owa*fi e

"l
i,[,,o fi.Q
[],ł-(J. .

ł:Ta(" DC.

,,fu
 1. Sekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha

Metodę tę wynalazł w połowie lat 70 XX. wieku Frederick Sanger. Jest to dośćpracochłonna metoda,
jednak nadal wykorzystywana do np. sekwencjonowania małych cząsteczek DNA np, produktów po
PCR. Dziękitej metodzie poznano 8enom człowieka iHGP) i innych organizmów eukariotycznych.

Metoda ta polega na róznicach rozdziału jednoniciowych cząsteczek DNA różniących się długością
zaledwie o jeden nukleotyd, przez elektroforezę w zelu poliakrylamidowym. przeprowadzenie
elektroforezy w kapilarze o długości50-80 cm i średnicy 0,1 mm pozwala na rozdzielenie populacji
cząsteczek o długoŚci do 1500 nukleotydów, tak że poszczególne co raz większe cząsteczki wychodzą
na końcu kapilary,

Sekwencjonowanie przeprowadza się przy pomocy polimerazy DNA, która kopiuje sekwencjonowanie
cząsteczki. Pierwszym etapem jest przyłączenie krótkich nukieotydów do matrycowego DNA, które
słuŻą jako startery do syntezy nowej komplementarnej nici DNA. Reakcja syntezy wyrnaga 4
trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), które w zwykĘch warunkach
mogłYbY utworzyĆ zwykłą cząsteczkę DNA. Jednak w tej metodzie używane są trifosforany
dideoksYnukleotydów(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), które są wyznakowane róźnymiznacznikami
fluorescencyjnymi. Polimeraza nie odróżnia dNTP od ddNTP, ale ddNTp powoduje blokowanie
Powstawanie dalszego łańcucha, bo związki te mają H w 3', Tak więc powstają cząsteczki DNA,
zakończone różnymi ddNTP, Aby uzyskać informacje na temat sekwencji, nalezy zidentyfikować
ddNTP na końcach każdej cząsteczki. W tym celu, przeprowadza się elektroforezę w zelu
PoliakrYlamidowym w kapilarze. Cząsteczki przesuwają się przed detektorem fluorescencji, który
rozróżnia znaczniki dołączone do ddNTP.

Enzymy stosowane przy sekwencjonowaniu powinny:

- PosiadaĆ duźą Procesywnośćtzn. nie mogą się odłączać w wybranym fragmencie, tylko w takim, w
którym przyłączone są ddNTP,

- nieznaczna aktywnoŚĆ egzonukleaz 5' do 3' lub jej brak, aby nie odejmowaĘ nukleotydów z końca 5',
- nieznaczna aktywnośćegzonukleaz 3' do 5' lub jej brak, aby nie odejmowaĘ ddNTP,
Na Początku stosowano fragment Klenowa, czyli pochodną polimerazy DNA z E.coli z usuniętą
aktYwnoŚcią egzonukleazy 5' do 3'. Jednakźe enzyrn ten odznaczał się małą procesywnością, więc
uzYskiwane fragmenty miały długośćokoło 250 bp. Ponadto nici utworzone są naturalnie, a nie
włączone do nich ddNTP. Tak więc obecnie stosuje się polimerazę Taq, dzięki której uzyskuje się
fragmenty długości750 bp lub więcej,

W tej rnetodzie konieczne jest wykonanie doświadczenia z pięciokrotną głębokością

sekwencjonowania(pokryciem sekwencji) tzn, że każdy nukleotyd jest obecny w pięciu różnych
odczytach.

2. Sekwencjonowanie cykliczne

Sekwencjonowanie cykliczne jest to odmiana sekwencjonowania poprzez terminację łańcucha z

wYkorzYstaniem polimerazy Taq. Proces ten przeprowadza się jak PCR, tylko jest tylko jeden starter i
4 ddNTP. Syntezowana jest tylko jedna nić cząsteczki użytej w reakcji. Produkt reakcji kumuluje się
liniowo. W rezultacie otrzymuje się zestaw cząsteczek, w których zaszła losowa terminacja.

Sekwencjonowanie przeprowadza się na produktach PCR lub tez fragmentów wklonowanych do

wektora plazmidowego lub fagowego. Gdy matrycą jest PCR, można wykorzystać,ieden ze starterów:
sekwencja z lewej strony i z prawej strony, tak więc uzyskuje się sekwencje obu nici
kom plementarnych.

Starter uniwersalny stosuje się do sekwencjonowania sklonowanego DNA, który jest

komplementarny z miejscem przed wstawką,

3. Sekwencjonowanie metodą degradacji chemicznej

Dwuniciową cząsteczkę DNA poddawano działaniu związków chemicznych, które przecinają ją w

określonych miejscach. Następnie rozdzielano fragmenty w żelu poliakrylamidowym aby sprawdzić
ich długość.

4. Sekwencjonowanie metodami nowej generacji

Sekwencjonowanie metodami nowej generacji wykorzystuje szereg technik umożliwiających

jednoczesne sekwencjonowanie wielu tysięcy, milionów fragmentów w jednoczesnym czasie.
Wykorzystuje się w tym celu bibliotekido sekwencjonowania,

Pierwszym etapem jest przygotowanie bibliotek fragmentów DNA, które są unieruchomione na

podłożustałym w postaci macierzy masowo równoległej(100-500bp). Jedną z metod pozyskiwania
fragmentów losowych jest sonifikacja. Losowa fragmentacja jest ważna, gdyż sekwencjonowanie
odbywa się od końca łańcucha, a nie od jego środka,

W unieruchamianiu fragmentów w bibliotekach stosuje się 2 techniki, Pierwsza z nich to

zastosowanie szkła podstawowego pokrytego wieloma kopiami krótkich oligonukleotydów. Końce
fragmentów są ligowane z adaptorami, czyli krótkimi dwuniciowymi cząsteczkami DNA, których
sekwencje są komplementarne do nukleotydów związanych ze szkłem. Drugi sposób polega na
zastosowanie podłoza w postaci metalowych kulek pokrytych streptawidyną. Fragmenty ligowane są
z adaptorami, które mają przyłącżonena końcach 5' znaczniki biotyny. Biotyna wiąze się z
streptawidyną i w ten sposób fragmenty są umiejscowione na metalowych kulkach. Jeden fragment
wiąże się z jedną kulką. Następnie wstrząsa się to w mieszaninie wodno-olejowej i tworzą emulsję
złożonąz kropelek wody z zamkniętymi kulkami, Każdą z kropełek przenosi się do studzienki.
Ostatnim etapem jest namnożenie produktów w teściePCR, aby uzyskać poządaną ilośc kopii.

4.1 Sekwencjonowanie metodą odwracalnej terminacji= Sekwencjonowanie w technologii

lllumina

W tej metodzie, podobnie jak przy terminacji łańcucha, stosuje się oligonukleotydy, które zatrzymują
działanie polimerazy. Jednakże są odwracalne, bo po odczytaniu danych, tworzenie łańcucha
postępuje. Usunięcie grupy chernicznej z węgla 3', najczęściej znacznik fluorescencyjny, Mieszanina
nie zawiera nukleotydów, więc każdy krok syntezy nici związany jest z jej zatrzymaniem. Detektor
wykrywa znacznik, enzym usuwa znacznik i kolejny proces zachodzi. Proces sekwencjonowanła jest
inicjowany przez przyłączenie startera do sekwencji adaptorowych dodawanych do końców
fragmentów DNA w trakcie przygotowania bibliotek, Metoda daje odczyt 300 bp, ale jest masowo
równoległa, tak więc w jednym doświadczeniu można uzyskać sekwencję o długości2000 Mb.

4.2 Pi rosekwencjonowanie

W tej metodzie w mieszaninie reakcyjnej znajdują się tylko deoksynukleotydy, a kopiowanie matrycy
zachodzi bez wymuszania terminacji. Synteza jest śledzonawraz z rozkładem pirofosforanu przez
enzym sulfurylazę, który jest wykrywany za pomocą błysków chemiluminescencji i który jest
uwałniany za każdym razem, gdy nowy nukleotyd jest dodawany do końca 3'. Każdy dinukleotyd jest
dodawany osobno w określonej kolejnościwraz z nukleotydazą. Jeżeli nie jest włączany, to jest
degradowany przeż ten enzym.

4.3 Sekwencjonowanie 454

Pirosekwencjonowanie bibliotek fragmentów unieruchamianych na kulkach magnetycznych. Dzięki

tej metodzie możliwe jest odczytanie do 700 Mb.

4.4 lon torrent

Metoda ta połega na przepłukaniu roztworami nukleotydów unieruchomionych bibliotek

fragmentów, W tej metodzie jednak wykrywane są jony wodoru, uwalniane z końca 3' po dołączeniu,
Reakcje prowadzi się z fragmentami Dl\A unieruchomionymi na kulkach z akrylamidu, umieszczonymi
pojedynczo w studzienkach, na dnie których znajduje się wrażliwy na jon tranzystor polowy ISFET.
Gdy lSFET wykrywa jony wodoru, uwalniany jest sygnał elektryczny.

4.5 Sekwencjonowanie przez ligację i wykrywanie oligonukleotydów SOLiD

W tej rnetodzie sekwencja jest ustalana na podstawie sygnałów hybrydyzacji szeregu nukleotydów
komplementarnych do sekwencji matrycy, Najpierw przyłączany jest starter. Następnie dodaje się
mieszaninę 1024 oligonukleotydów, które reprezentują każdąz 5-nukleotydowych sekwencji.
Sekwencja jednego z nich jest komplementarna do odcinka matrycy bezpośrednio sąsiadującego ze
starterem. Oligonukleotyd wiąże się i ligaza łączy go ze starterem, Każdy oligonukleotyd jest
wyzna kowa ny 4 znaczni ka m i fl uorescencyj nym i.

5. Sekwencjonowanie trzeciej generacji=sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym

5.1 Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym=sekwencjonowanie
PacBio

Do śledzeniakopiowania pojedynczej matrycy DNA służysystem optyczny zwany falowodem

pracującym w modzie zerowym. Stosuje się znaczniki, ale system jest tak inteligentny, że nie ma
potrzeby stosowania blokowania syntezy. Znacznik jest usuwany natychmiast po wstawieniu
nukleotydu.

6. Sekwencjonowanie czwartej generacji

Opiera się ono na bezpośrednie odczytanie sekwencji bez kopiowania i syntezy

6,1 Sekwencjonowanie w nanoporach

Metoda ta wykorzystuje syntetyczną membranę z porami o wielkości,aby przechodziły przez nie

cząsteczki DNA. Przez membranę przepuszcza się prąd elektryczny, co umożliwia powstanie dodatniej
i ujemnej strony membrany i umożliwia to elektroforetyczne wprowadzenie cząsteczki do poru.
Wprowadzana jest cząsteczka dwuniciowa, jednak helikaza w membranie rozrywa nić i przez por
przechodzi cząsteczka jednoniciowa. Kazdy z nukleotydów ma inny ksztait i inaczej wpasowuje się w
pory, co zaburza przepływ jonów przez membranę. Jednakze metoda ta pozwala na odczyt do 50 kb.

nITTTTTnnTTnnnnTTTTnnTTnnITnTTTTnTTnTTnnTTnTTnnTTnnTTnnnTTnTTnTTnnTTTTnn
Aby odczytaĆ genom, naIezy wykonać po sekwencjonowaniu proces składania sekwencji. Najprostszą
techniką jest strategia shotgun, czyli ułożeniekrótkich fragmentów w takiej kolejnościi nakładanie
ich na siebie, jako pierwszy genom poznany w wyniku tej strategii był genom H. influenzae:

1. Fragmentacja genomu za pomocą sonifikacji.

2. Rozdzielenie fragmentów w żelu agarozowym.
3. Fragmenty 1,5-2,0 kb wyizolowano z żelu i połączono z plazmidem,
4, Wyizolowano 19687 klonów na których przeprowadzono 2843 reakcje sekwencjonowania.
5. Składanie sekwencji przez komputer.
6. Otrzymano 1,40 kontigów sekwencji odpowiadającej innej nachodzącej na siebie części
genomu,
7. Łączenie kontigów w pary/ dzięki uzyskaniu sekwencji wypełniającej przerwy.

Wiele genomów organizmów prokariotycznych uzyskano za pomocą sekwencjonowania de novo.

Sekwencje uzyskano poprzez znajdowanie wspólnych końców. Wykorzystuje się też
sekwencjonowanie ponowne, w celu sprawdzenia różnic w genomach a genomach odniesienia.

Sekwencjonowanie genomów eukariotycznych przy pomocy strategii shotgun jest większym

wyzwaniem. Nie Ęlko ze względu na ilośćgenomu, ale również ze względu na liczbę par odczytów,
gdyż aby sparować końce, nalezy porównać odczyty parami. Kolejnym problemem są sekwencje
powtarzalne.

Asemblery sekwencji to pro8ramy komputerowe przekształcające odczyty sekwencji w kontigi,

Pierwsze asemblery porównywały pary odczytów, tączyły te, które mają na końcach najdluższe części
wspólne i powtarzały procedurę do czasu, aż nie mogły więcej znaleźć.Wynik to wykres zachodzenia.
PodejŚcie to nazywane jest algorytmem zachłannym , czyli takim, który zapewnia najbardziej logiczny
wybór na każdym etapie procesu.

Sekwencje gatunków blisko spokrewnionych można ustaiić za pomocą sekwencjiodniesienia, w

której zakłada się, że badany genom będzie bardzo podobny do genomu odniesienia. W celu
zwiększenia specyficznoŚci, odczyty z badanej sekwencji łączone są w kontigi, a dopiero potem
porównywane z sekwencją odniesienia. Uwagę należy poświęcićczęściom genomu, w których zaszła
rekombinacja.

§ekwencjonowanie hierarchiczną strategią shotgun - genom fragmentuje się na duze odcinki do 300
kb i klonuje się do dużych wektorów np. BAC, Następnie identyfikuje się klony zawierające
zachodzące na siebie sekwencje i to pozwala utworzyć ciągi przylegających do siebie klonów - kontigi
klonów, Sekwencje wstawek składa się metodą shotgun. Sekwencję wyjściowąotrzymuje się łącząc
sekwencje wstawek połozonych po kolei,

Spacer wzdłużchromosomu - wstawka z pierwszego klonu jest wykorzystywana jako sonda do

przeszukania wszystkich klonów w bibliotece. Wykryte wstawki służąjako kolejne sondy itd.
Problemem jest występowanie powtarzających się sekwencji. Pominięciem problemu jest
zaprojektowanie starterów PCR amplifikujących tylko koniec sklonowanej wstawki, przeszukuje się
bibliotekę klonów i klon na matrycy którego otrzymano produkt o właściwejdługościma właściwą
wstawkę. Można uzyskać tylko 15-20 klonów.

Porównywanie klonów - dostarcza informacji na temat fizycznej budowy sklonowanego fragmentu

DNA; informacja czyli odcisk palca (fingerprint) daje mozliwośćznalezienia podobieństwa.
Wykorzystuje się następujące techniki:

r Analiza wzoru restrykcyjnego - klony trawi się odpowiednimi enzymami, rozdziela na żelu i
jeŚli wstawki dwóch klonów zachodzą na siebie to otrzvma się podobne prążki,
Określaniesekwencji aminokwasowej:

1, Peptyd hydrolizLlje się na określone długościprzy pomocy 6M HCl, Aminokwasy obecne w

hydrolizacie można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej. ldentyfikację
anrinokwasu określasię na podstawie pozycji wypływu, a ilośćna podstawie reakcji z
ninhydryną i poprzez pomiar spektrofotometryczny określasię zawartość.Fluoreskamina
wiąże się z.4rupą alfa aminową i mozna wykryć mniejsze ilości anłinokwasę
2. ldentyfikacja N-końcowej reszty aminokwasowej - metoda degradacji Edmana - kolejne
odszczepianie reszt aminokwasowych od końca N. Fenyloizotiocyjanian reaguje z wolną
grupą N peptydu tworząc pochodną. W środowisku kwaśnymuwalnia się ta pochodna
pozostawiając nietknięty peptyd skrócony o jedną re§żtę aminokwasową, Związek cykliczny
PTH mozna zidentyfikować metodą chromatografii. Do 50 reszt,

Białka można rozdzielać na sekwencje dzieląc na mniejsze łańcuchy ok 50 reszt w celu ułatwienia
sekwencjonowania. Specyficzne rozdzielanie łańcucha mozna przeprowadzić na podstawie np,
bromocyjanu, który rozdziela łańcuch w określonych miejscach(reszty metioninowe po
karboksylowych końcach) lub trypsyny(karboksylowe reszty lizyny i argininy). Peptydy po
rozcięciu poddaje się chromatografił, metodzie Edmana. Dodaje się kolejny enzym, który
rozszczepia polipeptyd w innych miejscach w celu uzyskania nakładających się
peptydów{chymotrypsyna- rozdziela wiązania peptydowe po karboksylowej stronie
aminokwasów aromatycznych i innych mających rozbudowany łańcuch
boczny).Chemotrypsynowe peptydy nakładają się na kilka trypsynowych i można określić
kolejność w białku.

Eiektroforeza diagonalna - izolacja peptydów z mostkami siarczkowyrni. Rozcina się białka na

peptydy nie uszkadzając przy tym tych wiązań, nakłada się na bibułę i prowadzi w jednym
kierunku elektroforezęiwzdłuz jednego boku), bibułę wsadza się do oparów kwasu rnrówkowego,
który rozrywa wiązania disulfonowe i peptydy zostają uwolnione o mają bardziej kwaśny
charakter, ponowna elektroforeza w prostopadłym kierunku i peptydy które nie zawierały
mostków będą się poruszały z tą samą prędkościąi znajdą się na przekątneja peptydy które
miały te wiązania będą poza przekątną.

Metody immunologiczne do badania białek;

Przeciwciała to białka syntezowane przez organizmy żywe w wyniku odpowiedzi na obcy antygen.
Przeciwciała składają się z łańcuchów lekkich i ciężkich połączonych wiązaniami disulfonowymi.
Znajdują się na nich miejsca wiązania antygenu domeny Fab oraz miejsca domeny Fc,
Przeciwciała rozpoznają określonąsekwencję aminokwasów na cząsteczce i to się nazywa
epitopem lub determinacją antygenową" Przeciwciała są swoiste. Antyserum czyli surowica
zawiera aktywne przeciwciała na wszystkie antygeny. Przeciwciała poliklonalne=heterogenne -
każde jest swoiste wobec innego epitoptl danego antygenu. Przeciwciała rnonoklonalne -
rozpoznają tylko jeden określony epitop danego antygenu,

lstnieją nieśmierteine linie komorkowe produkujące przeciwciała monoklonalne - komórki

szpiczaka mnogiego. Komórki dzielą się niezależnie dając klony. Dużo przeciwciał
monoklonalnych można uzyskać na podstawie fuzji komórek wytwarzających przeciwciała z
komórkami szpiczaka:
 1. Wstrzykuje się antygen do myszy i po kilku tygodniach pobiera się śledzionę,
2. Mieszaninę komórek ze śledzionypoddaje się fuzji z komórkami szpiczaka,
3. Każda zhybrydyzowana komórka wytwarza monoklonalne przeciwciała,
4. Komórki przeszukuje się na podstawie testu na antygen-przeciwciało,
5. Komórki wyizolowane namnaża się i ponownie testuje,
6. Proces powtarza się do uzyskania czystej linii komórkowej wytwarzającej przeciwciała o
okreśbnejswoistości,

Wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych: markery biochemiczne, chromatografia powinowactwa,

wykrywanie enzymów, których obecnośćw organizmie wskazuje na zawał serca, sprawdzenie
przeciwciał na AlDS, żoltaczkę, terapia rakowa.

Test immunoenzymatycznuy ELISA - enzym związany kowalencyjnie z przeciwciałem, które

rozpoznaje dany antygen, reaguje z bezbarwnym substratem, przekształcając go w barwny produkt.
0becnośćbarwnego produktu wskazuje na obecnośćantygenu.

ł Test poŚredni ELlSA - stosowany do wykrycia przeciwciała(HlV}: białkowy antygen wirusa jest
na podłożustałym w zagłębieniu, dodaje się przeciwciała od pacjenta, jedynie osoba
zarazona wirusem będzie miała przeciwciała przeciwko temu antygenowi, podaje się
przeciwciała związane z enzymem swoistym dla przeciwciał pacjenta, przemywa się i dodaje
się substrat, jeżeli zajdzie reakcja enzymatyczna to znaczy że pacjent jest zarażony bo ma
przeciwciała
Ł Test warstwowy EL|SA - stosowany do wykrycia przeciwciała, nie antygeny, przeciwciało
wiąŻe się do antygenu, podaje się antygen wiąże się z przeciwciałem, podaje się kolejne
przeciwciało z enzymem i-ll-
Technika Western białka poddaje się SDS-PAGE, przenosisię na filtr idodaje przeciwciało, komp|eks
-
antygen przeciwciało poddaje się przemywaniu innym przeciwciałem swoistym dia pierwszego
znakowanego radioaktywnie albo jak w przypadku testu ELISA. Zastosowanie: kłonowanie genów,
test na infekcję WZW C,

Markery fluorescencyjne - wykorzystywanie do znakowania białek w żywych komórkach, znakuje się

fluorescencyjne przeciwciała lub białka iogląda pod mikroskopem fluorescencyjnym. Największa
rozdzielczoŚĆ mikroskopu fluorescencyjnego to 200nm. Większą rozdzielczośćmozna uzyskać w
mikroskopie elektronowym znakując przeciwciała markerami gęstości elektronowej np. ferrytyna w
swoim Wnętrzu ma duzą gęstoŚĆ elektronową, przeciwciała z drobinkami złota mogą identyfikować te
rdzen ie - poniżej 10nm mikroskopia elektroimmunoelektronowa},
(

Spektrofotometria mas -
pozwala określićmasę cząsteczkową białek; Technika analizy zjonizowanych
cząsteczek w formie gazowej. Pomiaru masy dokonuje się papr?_ez wyznaczenie przyspieszenie jakie
mają jony w polu elektrycznym. Przyspieszenie jonu o mniejszej masie będzie mniejsze zgodnie z
F=ma, F będzie stałe, a pomiar przyspieszenia da nam masę. tsiałka nie są lotne więc powstały dwie
metody:

j- MALDl: białko współwytrąca się ze związkiem organicznym, który absorbuje światłofali

laserowej o danej długości,padające światłowybija z preparatu cząsteczki, te cząsteczki
wychwytują eiektrony i stają się ujemnie naładowanyrni jonami,
 *_ ESl: roztwgry przepuszcza się przez cienką metaiową rurkę do którejjest przyłączony
potencjał elektryczny, uwalniają się małe kropelki zawierające białko i rozpuszczalnik, jego
parowanie z kropelek większa stopień zagęszczenia ładunku, wzrasta odpychanie tych
samych naładowanych cząstek, jony się rozpraszają.

Po wytworzeniu jonów określasię masę:

ł TOF; czas przelotu:jonywędrujące w połu eiektrycznym w kierunku detektora poddaje

się przyspieszeniu( pikomole, femtomole)

Masa cząsteczkowa białka i masa cząsteczkowa jego fragmentów uzyskanych metodą specyficznego
trawienia umożliwia jego identyfikacje spośród wielu białek w komórce. Białka po elektroforezie
mozna poddać trawieniu proteazą i uzyskaną mieszaninę ana|izuje się przez MALDI-TOF i masy
peptydów porównuje się z masami białek zdeponowanych w bazach danych,

Por jądrowy komórek drożdży: wyizo|owany, oczyszczany i frakcjonowany HPLC i eiektroforezą

żelową, prążkiwymywane itrawione i badane MALD'-TOF" Uzyskane fragmenty analizowano i
porównywano z sekwencjami aminokwasów, Uzyskano 174 białka, z których 40 wchodziło w skład
poru jądrowego,

Krystalografia rentgenowska: pozwala uzyskać przestrzenny obraz atomów w białku, Promieniowanie

rentgenowskie jest do tego wykorzystywane bo ma długośćniemai taką samą jak wiązanie
kowaIencyjne, Potrzebny jest kryształek białka, wiązka promieniowania i detektor.

1". Najpierw otrzymuje się kryształ poprzez działanie na białko siarczanem Vll amonu lub innej
soli co sprzyja tworzeniu się uporządkowanych kryształów, ponieważ atomy w krysztale
białka muszą być skierowane w odpowiednią stronę.
7. Uzyskanie wiązki promieniowania rentgenowskiego o długości0,154 nm poprzez rozpędzenie
elektronów uderzających o miedzianą anodę, Np. synchotrony(uderzają w kryształ białka,
częśćprzechodzi przez kryształ a częśćsię rozprasza. czyii ułega dysfrakcji ico się mierzy na
detektorze lub na kliszy fotograficznej, której zaczerwienienie jest wprost proporcjonalne do
natęzenia wiązki promieni rentgenowskich).

Technika ta opiera się na zasadach: amplituda fal rozproszonych jest wprost proporcjonalna do liczby
elektronów w atomie, rozproszone fale nakładają się czyli ulegają interfencji i ten sposób zależy od
ułozenia atomów.

1. Kryształ białka ustawia się w odpowiedniej pozycji

i wprowadza w ruch rotacyjny

?. Wiązka promieniowania pada na kryształ z róznych stron

3, Uzyskuje się obraz plam zwanych refleksami
4. W wyniku pomiaru natęzenia i pozycji każdej plamki uzyskuje się wyniki do dałszej analizy
5. Rekonstrukcja obrazu na podstawie intensywności każdej z plamek wykorzystując
przekształcenie Fouriera
6. Uzyskuje się dla każdej plamki obraz gęstościelektronowej o amplitudzie proporcjonalnej do
pierwiastka kwadratowego z natężenia tej plamki"
7 - Określasię fazę każdej plamki, czyli maksimum i minimum skorygowane z innymi falami.
 8, Obraz gęstości elektronowej
9. Analiza mapy gęstości elektronowej zalezna od rozdzielczości
j_0, Ostateczna rozdzieiczośćodpowiada doskonałośćkryształu (białka 0,2nm).

NMR- spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego: pozwaIa wykryć atomową strukturę

makrocząsteczek w roztworze pod warunkiem, ze jest on bardzo stężony. Technika opiera się na tym,
że tylko niektore jądra posiadają magnetyzm i po przyłożeniuzewnętrznego pola magnetycznego
moze przyjąć odpowiedni spin. Różnica energii tych dwóch stanów jest wprost proporcjonalna do sity
przyłozonego pola magnetycznego. Stan a ma niższą energię, więc występuje częściej, Stan cr moze
przejśćw stan B po zadziałaniu fai elektromagnetycznych o różnicy energii między oba stanami,
Uzyskanie rezonansu, Widmo rezonansu otrzymuje się zachowując pole magnetyczne i zmieniając
częstotl iwośćpola magnetycznego,
;
*-? ,.' '

;7

l
i'.l.r1 Lą l)
 §,
{
I
/

O1,^r{ed^t' irn '. (^ q,

o"i y1,0 mn wnotap {Y\Ł
.v |0 -.*
\L Qk o j"ę}, \^I eK t i"t'l I
L /\P ŁL '[,4n e.

^ub
eutq- odłol^ńl
] tlrvr rytLŁy\,obo^' t ll A
V\ń/\
n
łt, owt} n
9
Ły^L^' t? m
J-=-iĄ c/n^l Korn^J
$CIo Ol§t rn nLL

l,u}a ( ą Wtw)r.n,L t,11

'y"l^ć

-r \.P ż
*)t k^"'r"a - ffi,O^i
,a Vf,
_-L
l ŁL' ,, rY,,alYJ"YWtn^r,
n rrcl;c' ry\Ę,
il Y0 ,t" the,rnr$ne ,}.\ł
ffi,a)ĄĄlu ył"Jłrułl
Ą 'ru
L,.
W
 ,"].i1

Ęr
-*
Ę

I- e!"l
&- UJ"' ng ela,bllh" ryn U-a
,J b - u[/, twt !J)€,
trrd,dC tł{ept&.' Ą'yn (ylĄLywuc
YO,
C- (r Li
t,Uttł'KJ, d- ? ł:.ul0
n ŁLĄlwłIalu
.1T d'\P 4Ą' mt
jńĘrłe "ęJk
rCI,\,u{O. &'e Vro,w,lo-Y1&
e^irYLU\, ne H erc vaJ rL
^^^,b Ul^ĄLd"nl'*v
ll\ żi
ńŁ(r m
ffińi-uw,łtnW .dp
r] 7, VrOn \r !+ \.o
ait\,'- nrćo- t-O,},o-
łt
l ll ,
\-

v-{Ł nO^nr

,," -§
a
},J
 i
,. .. .Łt

I
'"Atr
tr=
,rĘ*-
,,=Ęł
,
";Ęl

|LltrW ąy',c f-ł-LU'wu'oio

f ri"rm ęFt't*o eruL'
nł:aa
OL,O
":
$"ls? , NfAŁeryL oIfr ó-n{u ar}v enlł,u,r
' L'm m-tŁn/dĘ"L.ł,\, l+lv, 3V C,ITF
no\,oąt:ct y u{lĘyTn wJda ne
d'o r@ahlJ\'Ą rOuro-d łhL
f,mĄ ,,,B

) lTLó ftlĄ n3,

ooi,Tod,U -Ą dU+ ht/>p ry\L'(X @ !!L 3
ryry'€
r\t( T) ,B- ne
ńurL,
] ,

'() :h ńe cłWU| tyyu2 rLo H,c ląl_,ą-ł tą,t yc{/

thWw'e t |rt'łą le Nl ur ?a,R ttnl' l ' w ra ,Ł ł,ć
ftlł{tlĄłru'asv.WL1\L )Lt' 'e ,yLTLu l|t't;f nŁ
LulrLL'at-} j a, rYYe, rły f €narn1"
,ć{ł,(_^tt(|t' (t L'
'o,ne.p rvoUlt bdxltT(L l xle
'łl i
WW D,cu"w Lr^ ć^{e rn OrLO Lnę f} {, t (' ł.t.t; t ?.
,
ru"dv qen,,trW (j-- e n'e T&V\'
l,^.;€ rdLulult}'l,JO d,e
oo\} rd-,,LŁ

&
\

..łr
'-;-ł

ffi
jil.

i"'ffi:
_Ę i.
6,ł<nYJ)a,kĄv,n e ?fńeą'lruz.ta- -, ą 'ue r*e U'(ą, Lia('
ml"'a,rnł lĄUt&Ą'Ulłn urrruł) t 'Ou{,t ł 1v(I ur
ryDx'rĘ [}L LŁ) ^ro1at L',.YY| rnJLnp '(/L L}w
TA
ell',urw'Q)--O- 'd'0 Wvra-n € l,cL rrh,art
7O Lt fi'lc L.l,fit( DN Ą, R /YnĄ'(,ł,rt'nF
hru (d- eul,tu?^lalwu' rmor1,o k/.4
evt'Ul ly',,Qłał'
^,ov^
O"O:tką.l-, a,b cLc ó ru'a clp
CL (n;yul 'Cd4, +n-Wyat oW er)
T, ,,c,Lhrz I (V1) ffałQ , U)ad'
rlł'€ dO LąlOt t-; tSJ Ł
Łx rafutKłułar/w-euń4ńne ćLlfurtlfirtD ; t'1.14 m_,Lł no_
til Q,ću{wu'ą[ ie^t artt'ląnł'u b lNa
nf arnL' wanntr tfu rTe. X/ą,ł e l }łt
L' rakd,e lnć lŁ '0t"/,Ot-Cpcu€ tl € tt'Lt:lt.t't\'tQ ;
4,
J n e pńett"l,ąl LL'a)a, PoW'n rL4ł : 0 vl c' lĄ.O
fie ,' źL|,OLn€ ob r3rpm,owł*ntL t),t'rni'rlpuv,rya
'l/cxl, roow^ó WCI, fl ć t n a,4lrTT nĄ'Łl .rd, t_ rV e rną b
'uI ne OLlĄ- ą rn' rt ft,
5 I^
tJUu)
_l _
ne 'wln 6u.tóó re
oą
Cłu', X'rva_,
U. rd" &uill t-t'arJa- ?eX, Llo hn rrruru
]" ur tls ( ru 'X'fl 5T
{_tffi, )rfl,rONULrĄ vftrulzvu't .'nJ y,oYffi,'ffi?,fłł*
au,alYru' ,ra,ŁoL
raLl yLlawt'; W!'f xP *ir
i' .r%.rrrt hą'P e
kn mt rfr,t' o lro
L'n n
:'ulą, ftnry,l1rwto,9r,u q', Uerła^ryne Ę ffie'
uĄź
{ń@Ł9 yahO 7rwybeĘ ruX'fte ,dn
-; a|eL'ryry.c'
TqŻu@ry'?,
^ńĄlĆ:
,( ał!s'ąy'Y ryTrrtK y:?t"!!T"uU&,
,
Wiht!#ffi
''' ,'
?* *"óYl p'Ć
-vl YWńĄfu * ż n
p r
ffiy,,,y
i,
l sń c n{Tł' l r-l4u4Ą,p,ft ) #,'pr
Ir r,:,

nr"rnł nr:
7;
t kł*;;"
VÓO ^: ^ cŁ

ł1 ?o?okuńŁ'łń}fi,44ąĄ,ę
4I Kul/h,a. ł/arfi,W"rYĄ,ę Lę(tr)"
t

ąę
LQc,o", UĄ r,0 W ril1 y!,!
om, r!/rl.u_Ju
'
J;,)^t"', b!4 rrń n?llllllllllllll*',^HHł,ff
^łp tru1 w,'o:kl' r
L^rq)Ą/Ę

Wrfi^'l UWc uu.fŁrlYry* ,

a' y eP 1'g ph,L .',&, P,W,4Źr9'rył,'^W /&:^ & h,0 rn1f,ńą rnĄ',,
tąĘw,)*;,
^n,| u-ńlfua ąrłrĘ^'ą p&q b 4,@ i Óiń tły'"i, t ) kń
|,hne| (y).{)?vł ( QĄ,LOqŁru u)e). l fu9Ąnyant tż1 ęrn( aĄp t{k,
O,bLł' burr4 ,lT §-Po Xil,ctlrrąn e ,'i'd^n o b L,€ ,
,, 5#r,,#,b nl^,L', a |c +peulł cc
ąLl ą ęnłwe- ź.,ł,2tw'trp.l ę
.

anhĄQery4, 'tfl,Kcw€ ,
:; ąilft^;^?uYra,l'p6 e :nert'OI 9 e, ęry u cUzn Ę w
l, lvińPpi ńlnĄ*' ą. k, ,^, r!,4 żn)' oi e;nł{ rą t tł tut l iTu - lł,łmrrłcr,
J-e tr?,b?^W!' r y^ :! ślFTW:,*, *,'r Fo -y ł!, rll4ł ul ń;
wńolwru-One kŁrkfft,L UrrĄłuDLLłuć ę f@4ruąn€
W,rYWftflf! nlknw7rnł, ,no"rwwrw"e ł_ L,?}<łTl/t
u/"uM/& nł ^'
W: J?,? Z:I2ĘW, :

ć3
d.q
l
t-
ffi
'tłst łL*
t
;pĘc}L
W d.xl
na ltffi,t RturL?D
vĄ) ,ynL'ń, b nrbW ; 'W
,?niłl.,,w
xrwc.ż-&la & t'ann1,1łnuI{ ne
Xnn"nĄ-
{,Ur

ń
,,tŁC r1ŁctaŁ rwe Ynnd&L h,og podzłŁn lrl_,,t'Ł
" lnĄrrfud.an(t t'łv a ,hLŁ
rnmLMw L<pns hnnltrt,łJ-
WWnc_ , rvĄl,)<głłe vv'_ baąłe WinĄĄ n Ł /yn)
'bu'!rt'tL-
?d Ly
,

eu)wa rv(e
w /y)'(}L vTlĄeYL,|e t L-

df^Ovcd WWrJ,,
)w<}rv'e i[łniut}Wu ch-
rrvFovmeyfw

hn qt'r u"
rnOtU,
uthodfu'tv ^,Ue
t'hłź
tĄuyu ;m{ Fea, ,yn"cŁ'e
"y,LLt-D t-o
bt,.ałe/{ TuilWn€ ómł łnaĄ-e 9a!ry )

w{t"n|tl d il.'ońą nrla, l<,o rn wlłł

rv' p, rn+ e( i, ? *W ; ęW
{1tU'lt€ W'{,lb".ru'(*- Ą! fu 3, u!,_?:Y'ry
,Tva(ne łrutlar4l;
);;:Y*,F,
*?Pr łuq-.

t
,, rTy1"O&le
buć Ćp np, ,łru'C) ące
akc |iloolnra WL d,Un-Lf5
t€- L' L'nn m e
-bt
"Ł

W
twĘru
-> uJ" oy

ffiŁ *Hł
,l^iq.łolrł
Wr,Tń6
i.-gilu; :młtx,t,Wy{ru?,':
1ćdry*
B,
ff h9pĘ,oxet ern,
fr'ó rup, 6ęćItr sfó{dł ffim,Y:,ft
n tŁt ł'|óĄrv., U,WA
pVft -rH b,
ł, yvrlq3iiy1,.t pott,MthiyT\Ą ,^ PŁ&, PcLrt - PĘq, !
#*l P :łi-Yłi;kó,tr r?, W?,h,tr ffi
lWrum
ą-CCroJ-rp
u€ l
rsfu,
l
urw
;ł+r.^łu.diurępŃ
;$*;,^ł
rnńjlc ęffii
\-c!qunŁ]; ł
w'\,,",uJre
nruryąłórw;: uaiĄ,kru\
rruryąttłrw-
ólł:,
fi,ł*99* ą ffiif rrbJ1'eW
X.!.o"/- , klŃrlctą
u:rh+4,t nlixł.o,/-
;^
kCIŃ{lclą -
(ńnĆ uu8ln,t12ln\'ę .['U{,tt 4 J'tq,c
prp|t)<vt,Q ,ryyow
ó\ił'ii^rl"ńlpót*t \v ĘĄoJ-,./c n e t,r..j Ń:Ońr.,i,u ńłps:,nłko,)u
ń^b t?rłl._oiłrń;t Ł lr) , ń,cqp bqr-' tlarngLo rn€, h'ćJL^Pen0l)f

ffiffihlffi$ffi.m
,t"lii' t
t{;#,
e,,:ffilń"!*
/Y]-\^tl rru^l1)C ił\..,(,Ą!)t l tW? W,?,j, Ł
,'|VIlIl.| ),'\_ y\',rĘt\,/.v\l:1-1
, r,:y
^ru-,§hrydffi
lótQlłpł,"n pilrŃt'In e, Ę\Ą' r}Ql U,1 t t, ĘA'( |'mnrLu rppr Ę ne l
J lnnń,.di"ą- ,(ułl, ,- pdęĘtqffiyryW,
r

n l?rńćr,tllc!1

od /0 .,X,p0(o,Q' nrru ar4Ąwtą t § ?gv,ną.ue

uąi rWfiV t,łinl € m ry\^',\*)ó rt U rh 0 iU" W'a-ł'1
vk],rił,ąnlc l*,ll x, wńW{, ?o CuĄl}a1'/
 ;,

t ---- F,
\

luL'

'1ta6:
d

łleŁu\L.\ne NP- ,v+w-ora.o,tt. d., 0l^ {UĄ dotł

vJa,ne O1,0 bFoun n
r-ó,tlt',rvu'O\,5ń W ', t'tłt W ne 6,noLr\p,),u' pomąoyoq', u-r
it ł:, tuf,lJ{anL,U" ene ulwro 1 ułtUJąn x rą}<Em}, ua1
ą, do{x(Lulrula a hnAnwa7ąi
,n
e .ytrul^ł-u
ryil,'L e ; dO nrrL ił"t-a{L rr,l
PCJ- Pli |2tt n-O. łkłanLa.
ra,, Lł,tOt t, ń
adv>u' Ą dv 1,1łl- t n ru't łłąrłv,
tł,) tlfiltr & e rrv
rnĄ"7 a^,o €r>Of h t, YLY.,
,?
4flvl'W tąe{won0.- lW"Ła, t"rrlrrwl,wą ennoic- tx,ftln4T
ośrU\_pór.t!-u./a rw' O, t' b 0ol UlOJ.rwr:^t' i t e_łt, Toujp ---
'w deł NP uń CyWT1,o x.
e W I'rh
ńn kra QLłą,
*, kbrn,;,*rl, /yn a&'e lan e Ł ( (ź-a-rną'
ra§ lrvF 13, lLĄ^l18 aro H,OT)J,
'uŁ1 ob u& e ru'a )ruŁ ńts ra,r
- , kłs rn' {1^O4 '0t ł-(- ) Y)il,ł)-r2 '(€ t'
u,m &Duarn e 6|p, u u/a.ru,0- 0/p
rb
źe umx,ĄĄ i Ol f-l,'(fuV./ P
,^D,-
Bnn, 11Dnl
'rnUe N P i'Ł,r\t &, ru', lYtlwne ) rnorP PnelĄ1 , nia ISSS
x ?rubterną ;;

€nł,ą,rrrurw rvcl(px , lłCtł-oJ,a-lą_łĄ' 1,11 rwtll ,"2-1łraruvr, -

* Pt-7 - 'Q' V d!1 v,c, LłLfuW-5ą,a LĄ n t"ć f) eLŁh -
r0h'(ńl* U'Wtf ,ud't o{.O rLron enl'CL
0W) fi,('e g Ł DU7 W,O m orJx,o 7btfl lat fiL't}
ńe7, nt OU (ert*nĄ'e i''iytw6^-L,
/Yn o 'ną h'k"o,ła,(, I-arL
€ ted Uł,,a n e ft>aL/L - l12d/u'ę nła
,0n.0 Wt tV
,L-
?d
rc
(Vlahl', _ tr)dĄi,v da
'POrc rfYV't ^,Le

mf rlĄL, rvnńą't,
U nc l^V rh)f
v, A
-)
I

n{e (?WLl l l
ł Ihr,
l l

W
t frbbdr.tr't
,ĄO,bM
+
ą"Ęą Ąr.
n)od l l

Jł /
)

7|

cl

)t<
Jn
FR

oĘu
 .:.',
.;€?: a.. Ę
a

1
?
tl){Ynb(ut -

Y
l

W
fu'm@&'erYĄsL7Ł1 ],-j_
i
LtXtll,
---+rL-J---

ąr,

7^u

-T- I

-tf6,i Ę
,={ fr
, ,"#
Ęif,ńF

',&.\ **
^-, '=§
ii--l
\a, \,
a
u aj*"'t
lG
§l
tC
 'e ąSte-
_
)h'l
46Q l<bńl

tg

i8

'rłcŁt'

brrr-

{,
la Ę

Lll :
a

\
/
TŁvąpto ą"nor^n,
ŁJBro,rua, S enou,,o,- _p_ot u2vu, łuX, leglgnl]Ł*M
unłtlr0rąnuLł^V
::- / OtUł' rL7 L^JOfi^,O
ry
u. . \t,r& Pt W P- t,łraĘ& v\łiŁ ń,
'..}1ne ' Ov\XXJ tł)/ ó.tru.ł(łL.
- wpvQł"łrrCr,r:Clfi_t n t'e w Frl Ą^u'ąĄ-Ul-u
rult! rrnłłtlł/c t oą '\x,tru d_ urvryro:'ll, tł'L
w},lłNdq*W
oł,,o ą p e
ffi-;frlETvI
Qe D ?pi

oną,r:"rućłrrrłr . ńe ąf,i,u'e ChOv-o,b td;^ x^

ĄĄ,eną t,'n V\'V,c X Vt'yO }1/r" m,,,Yr1l,rOrt Łt_

WP r-7wo,o|Ńę,nl' t d,O YQ |)' t(Ą]|o,

-, łnvłvo-wrr"wu{uaeeł
np, \9nŁn{U her"nOh'LL'.j' l \pann+rn4'L' poIdtL pobr-a r\^b
vł\ Ł( /yfii V,,łl , rue
Łrwł P ńe z rrt łtYurt' rr;t i
1

Q von Ow n.9 .t1,1P

r-Dwtnl.Ąć_n t?
dD c§Y\Ą,&n rY\^) t,J."

: brąK _{łrrhg. :ln[4Ł^6łe

. y,
nr whe (''
.-XffiłltjiTrr,,{ r7 Łz 5 l'PN r\
h, Ot'moML- h' l^.,0 1^r&yv0, hrłrt-vnt'Ovr*Ąłv LneftOtt\
''nOf lr_ł NR
f*lĄ 1*
WŁ QLntł-
* ąlaułldntww'k bfWl- _

Łntu ry\) ,vuucrodłłląĄ P(Ęo

rtu,ł-ńV,tvrłt rc, Łl"vJ,,U hńĘut.ł ułt-ł.,sKnf

L

ti
M
ą
-7 Wprąrud.&e,Yw(L
yy\^,,tnn.ĄoOyLv\
-: V.l {) ,tI ilntnl phovl"W łuł.n,t}.l:
\rrofu[,t'[ę, \\n" Lt re,łąi'a,
2ro1,^n {Id"oYu ul-§lu de rnw L<D (w§yt-lĄ. r,a yń
|,t^ t OvO Lł/v py*t\r e1 \,l. c ł\,a. Lelr<L
r*|e tr1^/|,,)j sarnąbf| dn kl:ry,w
'eM-1Ł i |ua,(

'nlł\
tuc sr'RtVą ob Ę2uil,t
t e^,O Vł-ave Y o Lvę
:e aeftflw- t LCL
(

dn ooLNc U,Ą'eru
[l'L' rź. uŁ uhn rvb ł
)Drc- ((-

rtĄ'P {' dx^aL,av\,Će,

^łt llo
włv
rrna4'f W rwbĘ_ąWłvelq'f _a-ttbtrr*Ownp *
F,
.." \tu",.nc{,,}-ia.u
,l-'ułtńt,{ rL\ (' iŃILlliC
CP'.t',>lP, / uu"5 9 , TC,iU.liv,\,"r.,.it ,
1,lt,lig 14,1[l:tŁ Y II,*" \L-i}L"rv,(

fr -łń§ffi
w, p!,;t ci5
frtĘ;'.łił}frifu
,ftt tr'łfoft ffi *.Łr
{
e(l i,\Hł,'# §§ł!b'y.'
§.t\]"ti*{nŁ,
Yn
P!$u"b
ll*l )\, łt
,. 1t4.i ],q
I
;., i

t] \)i:[ t t
I i'lrr
t
\-t, q
lfitvnńs.tJl"Jt
epFńTlJ{"Jt Ft!łĘl,il".r
rUłĘl,tuvtr
V"tr Q!ł,l
Q!"J kc
ŁC tl)i:i
0tł{ KC i ..';-
..QiVC"
tflMfitrvĄi-i- V1,'"!
Y \trtĘłutt^łł*rfutl
lW ,^tn§J]-fnC"U!4!T
ffi-ffi,#ffiffi

.ffi 7i,,łł}".i ]r{r",jlą

zi{ł[l! i.,ł
YTl,e, ii ) .f
\.iii't"\ tlili, i\

musą#ffi',tĘi
n'
:,Ń'ł:J"WŁH"kk,Ł,,'!Ł+ęY
{
:

,]ffi:
T l .6lr,tj.r" }ti'' 3,§r'.j*th'fr iil'''
itli
ł
[[T ćn,llitł{DLDUtJr
ffill*t'l;*tl*;
.lFi-TP,1 (!t.-' u dffiffiŁD+Ł
ffil-\V,l ] ,i l ;
Vl lłłl\ifl-łl
:łti,*'li'tii
\Y, ;
9iĘ1.p\Ęu ćf
1

i 1{N'iFtJ"l,*])!t{ nl'tt
'i'i{l l,J fi\iN
'
}ll;iĘi
}lLn ik i ,-ł {ł nćvf
i;uu, rł
l; fluwtł [tt ć
l',ffi,].,fft 11ffi J,ii'\v. fr- łłJ",rj-
**i,
foiw
, }kĘI)i\i-,, r - ĘlJ,*F IiD,1',;tqt:L',4r,t
H|"J.$.§f
rT"Ń,[ilS ;"tft;r§N D -l,L, u5ę j,li,|r3łu ,,-
i--łl,rę ) ;t- ,{-łV n §tT rii )];"rP *l:"u"+ V,r:,"rP' L,-
t\ł
n^ c.J.,Łr-;", iń,{,-uj-r Dl,iirr,
rr hłrłtifiril
 $,*r-''i;c^Ąs" \,_i.,ł_ pseĘąu.
',4.ł l, ' "
,u7.]i..;" e f),". trta r€ł"; ii , N ijI ] \ *
,,

,Try"łU. ĘU,,,11tt,;Uy-uYń l rłDiti

^

w"L.rry ji ,'
rł. 1ó6
\uttll,ć- L',l*v,(l1t h-a
,,[ł;Ł:,,Ł.ń [ łl.ti.;
Ł.Ęu,jir,ł\1 tiit-, l !
1.1
.\,\i-i*,i.}lL l]]Pn',rlf f
,d],1,,,,

iŁ Ą',t ffii:; * iU,,Lt\L L(l *i Llt1 ;,,|jjf

, Ń iŁ]y."ffttfr[i{',§"'
Lt ) q)r tt.d l
"l,,.:ł#itt
\l.ćLl,t]-\fu ,xj ; ir l i't it l c
,

,l:vtTu$"i,i,iu,rr!r.q",' Xl:,,;.-!rL"Y:E t|.,q,, i.,łn -

łT,"t Ę ł,,ll* rł,"1
;;ńirLe *)i[łv. tłŁl-Li e
ą*ł }łłiT, * Ł W[$,,.Ę, -\'#, i[ ;i},
ii|tffi
W*PWhffiffi,ffiffi
,ffiffi
 { _ą
1.Ą
gd

MO#q ffi +,ą§§},ł

:
l-
t".{
u.l
b-
ź
L
i

I
H l/ \i li

t
, l,_,,t]
H
|

LH
-
1tatnnilOfirŁ
ółbul 6\(fi-
l

\_

Lbl g§ł$łJd"-Jl
]

t ffifrqWĘ
pH
t
L.

t
L

t
b

t
h

h
t
L.
t
ts
r
L_ s$4łl
k :ffi
|- H_\
l-
b
l!

D
E
;l,łi|if.

L -,,,---i .*
-
',
*,' - *
l
I

L l, t'
Ą,%,,
l,ł ,, 1.1
''t:, t \], ,l,,i,,i"
- '',l '*
l l | .' aj
i l '., i
- i, i l:
(J"rU
l
-(l,ł
lr
Li ., ]
,. !
,'ą] ! / ł
J - J_
J
7--

qĘ[ł! -1
]eMp4ł nŁ+lLĄ WĄEął
l
,d
-.{

-l
,J-

ffi
nl l l i
!łI{4
fi trr,ł l

ffi&
(n
0eP- _l
!l
f,sffi
-l
tO'Yłl
,łr0W ,I lt" l vl
&WtslnM ilrutlh \)o,łńĄ-oi] l_ą
$ł fitH:k u
-l
){}tryrnĄL l: 1-1
óMnfiyh^' nnLl :lt }n' ftd f, 1
j\rhh ! - l u tł1h
4J{
-l
nĘirQtĄąP irufl.

1
,J
*: rrqJ
,l W+.ł,{.LY]ln ł([t
ŁtŁnh t'rjcńnld ffi :1

ffi
mmT--F-h,
ri[R$W +, s# Ę
i \ Ft hrloĄ,dpr|d li'rilffi
Pclp|Eflr.n{tl rlq4tni/"4 T ll l -l
_I
-a
!-J
F+ryŁ-'$
_l
l,qĘ,ęi, i I

-a
-I
L-Ą

-, , ,t.
-,, ;-)',
iól[4€rtrĘĄs&
§$++tj+
rDJłu
ł"d€
-l
t ;l
_,l
=
ż--a
-.__l
,
l

l ,. i-'1-, i
jąderkowej, tworzy podjednostki rybosomu), fibrylarynaidojrzewanie prekursorowego rRNA},
rybocharyna(dojrzewanie duzych podjednostek rybosomów). Jąderko ma częśćwłóknistą, gęstego
składnika włóknistego i ziarnistego zawieszone w macierzy jąderkowej, Większość jąderek nie
posiada uporządkowanej struktury, a jezeli już taka zajdzie to to jest proces segregacji jąderkowej.

Aparat Golgiego - należy do układu wakularnego cytoplazmy. jest to struktura zbudowana z

pęcherzyków ułożonychna stosie * cystern rozdętych pęcherzykowato na końcach, Znajduje się w
pobliżu RER" Opisano 2 formy: siateczkowata(kręgowce z wyj.oocytów i plemników) i
łuskowata=diktiosornowa(rośliny, bezkręgowce}, Aparat pełni funkcję potranslacyjnej modyfikacji
białek i lipidów przeznaczonych do eksportu, szczególnie modyfikacji domen cukrowych w
cząsteczkach przyłączonych w RER, siarkowanie proteoglikanów(siarczan chondroityny), kondensacja
produktów syntezy na drodze odwodnienia, synteza skladników ścian komórkowych, sońowania i
pakowanie produktów eksportowych, formowanie nowej błony komórkowej, ładowanie endosomów
z hydrolazami.
Cysterny zlokalizowane w sąsiedztwie RER nazywa się strefą cis, a dalsze to strefa trans, a pomiędzy
to cysterny medialne. Błony cystern cis są podobne w budowie do RER, redukują czterot|enek osmu i

sole metali cięźkich i ma enzymy związane z glikolizacją białek: cr-mannozydazę, N-

acetylofosfotransferazę glukozy, W strefie trans zlokalizowano: pirofosforazę tiaminy, fosfatazę
kwaśną,ga ła ktylotra nsfe razę, sja lylotra nsfe ra zę, tra nsfe razę gl u kozy.

Potranslacyjna modyfikacja składowej cukrowej glikoprotein powstałych w RER - w aparacie zostaje

przyłączony do podstawowego rdzenia sacharydowego(drzewa) cukry terminalne, połączone N-
glikozydowo: wielomannozowe i złozone. Składowa cukrowa glikoprotein wielomannozowych
zawiera 2 N-acetylcglukozoaminy, 9 reszt mannozowych i 2 reszty glukozy dołączonych do reszty Asp
łańcucha polipeptydowego, ponadto moze zawierać reszty fruktozy, galaktozy i do 4 cz. kwasu
sjalowego, Prekursorem obu sacharydów jest z1,4reszt cukrowych: 2 n,9mannozy i3 glukozy.Cały
kompleks jest związany za pomocą reszty fosforanowej, z dolichoiem. Po usunięciu 2 reszt
mannozowych w RER, w cysternach cis dochodzi do usunięcia 4 reszt mannozowych za pomocą
mannozydazy, W sieci trans dołączane 5ą reszty 3 n, 3 galaktozy, 3 kwasy i 1 fruktoza za pomocą
tra nsferaz gl i kozydowych.

Sulfonowanie proteoglikanów - siarczan chondroityny/ siarczan heparany, keratanu, dermatanu,

chromogranina. Proces sulfonowania zachodzi przez związanie siarczanu z UDP, przeniesienie
siarczanu na cząsteczkę receptorową przez sulfotransferazę(białko integralne cystern gogliego).

Białka prekui"sorowe ze względu na budowę dzielimy na; prebiałka-na końcu N mają sekwencję
sygnałową, probiałka - aktywacja proteoiityczna, preprobiałka- w środku łańcucha mają sekwencje
sygnałowe.

Siateczka śródplazmatyczna - zbiór cystern i kanaiików zamkniętych błoną, jest szorstka pokryta
ziarnistościami rybosomów i gładka nie pokryta niczym i rnająca dłuzsze kanaiiki,

r siateczka śródplazmatyczna szorstka - długie błoniaste kanaliki, RER, pokryta ziarnistościami

od zewnątrz, pokrycie błoną nie jest stałe i występuje tylko wtedy gdy zachodzi modyfikacja
potranslacyjna białek i synteza białek przeznaczonych do transportu, a po procesie rybosomy
są cldszczepiane od siateczki, błona RER łączy się z otoczką jądrową. Znajdują się we
wszystkich komórkach eukariotycznych z wyjątkiem plemników i dojrzałych erytrocytów.
Najwięcejjest w komórkach eksportujących białka na zewnątrz: komórki trzustki, fibroblasty,
w wątrobie 5ą cysterny ułożonena sobie równolegle, lub kanaliki są owinięte wokół
mitochondriów. W roślinachwyższych, RER mogą się kontaktować między komórkami za
pomocą plazmodesm.
W skład błon siateczki RER wchodzą nienasycone kwasy tłuszczowe, co sprawia, ze siateczka
jest bardziej płynna. Ma ona więcej fosfatydylocholiny ifosfatydyloetanoioaminy, ale obie
błony są strukturalnie podobne do siebie.
W skład białek siateczki wchodzą białka integralne odpowiedzialne za modyfikacje
potranslacyjną i eksport białek: potranslacyjna modyfikacja białek eksportowych i
lizosomałnych, synteza Iipidów, utlenianiem i redukcją, transportem substancji do wnętrza
cystern siateczki. Są również białka przeprowadzające glikozylację białek i iipidów(transferazy
glikozydowe).
Proces syntezy białek - glikozylacja, formowanie połączeń dwusiarczkowych, fałdowanie
łańcucha, oligomeryzacja w podjednostki białkowe i za te procesy są odpowiedzialne białka
rezydujące w RER. Białka rezydujące nie są usuwane z siateczki i mają charakterystyczną
sekwencję HDEL, KDEL przy końcu C, Te końce są rozpoznawane w strefie ratunkowej przez
receptory na drodze między RER a aparatem Golgiego. Jeżeli białko jest nieprawidłowo
uformowane to nie zostaje transportowane do aparatu, zostaje wykryte przez białka
rezydujące i wraca do RER. Są białka syntezowane w cytozolu oraz przez rybosomy na RER:
sekrecyjne, integralne i lizosomowe. Białka sekrecyjne muszą przejśćprzez hydrofofobową
barienę błony RtR, aparatu i błony komórkowej i one mają specjaine sekwencje
aminokwasowe tzw. sygnał kierunkowy. Białka cytozoIowe są syntezowane na poiisomach,
czyli rybosomach niezwiązanych z RER, synteza białek lizosomalnych zawiera się w cytozolu a
potem jest kontynuowana w rybosomach osadzonych na kanaiikach siateczki - hipoteza
sygnałowa:

1. Rybosomy rozpoczynają translację od końca N zawierającą sekwencję sygnałową SS(20

aminokwasówi.
2. Do sekwencji SS dołącza się białko rozpoznające sekwencję SRP.
3. Translacja jest zatrzymana i cały kompleks: mRNA+rybosom+SRP+SS+sekwencja
sygnałowa jest przenoszona na powierzchnię RER.
4, Biatko SPR wiąże się ze swoistym receptorern SRP na błonie siateczki.
5, Rybosomy wiążą się z RER za pomocą białek ryboforyna l i ll,
6. Rybosomy osadzają się na ryboforynie, SS się odłącza i proces translacji się uruchamia,
łańcuch białkowy wnika do kanalika RtR.
7. SS się odłącza i rozpoczyna się proces glikozylacji peptydu.

SRP to duże białko składające się z 6 podjednostek i 75 RNA{300 nukleotydów), która

przypom ina sekwencję niektórych onkornawi rusów.

Glikozylacja białek - O-glikozylacja; proces rozpoczyna się przed zakończeniem translacji.

Transferazy glikozylowe wiążą do asparaginy reszty trl-acetyloglukozoaminy, mannozy i
glukozy i przyłączenie przebiega tylko w sekwencjach NXS lub SXT. W RER są przyłączane sam
komp|eks 14 cukrów. Cukry proste są syntezowane w cytoplazmie, podlegają procesom
fosforyiacji i tworzą komp|eksy z UDP. Kompleks jest dołączony do lipidu dolicholu(22C) -
alkohol poliprenoidowy z 15-17 podjednostek poliprednoidowych, wielokrotnie przecina
błonę siateczki, podłoze dla syntezy cukrów, Drugim lipidem, na którym przebiega synteza
oligosacharydów jest glikozylofosfatydyloinozytol. Po wprowadzeniu do RER kompleks
cukrowy jest odłączany od dolicholu i przez transferazę jest przenoszona na resztę
asparaginową i po zakończeniu glikozylacji peptydy są transportowane do aparatu gdzie są
zmieniane, Białka glikozylowane są umiejscawiane w jądrze i samym cytozolu"

Formowanie białek - cząsteczki białek powstające w RER stają się integralnymi błon siateczki
ite są fragmentami cystern siateczki, w formie pęcherzyków, które są odrywane od cystern i
idą do miejsc przeznaczenia-organella komórkowe, błona komórkowa. Białka rozpuszczalne
wchodzą w skład kanalików RER, a białka transbłonowe zostają zatrzymane w błonach