Código: PT-22 1

Revisión 05
Vigencia: 07 – 05- 2021

Recuento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y

Streptococcus thermophilus
1. OBJETIVOS

1.1 Establecer las directrices para la realización de ensayos por la técnica de recuento en
placa para el recuento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus
thermophilus.

2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION

2.1 Este método establece una metodología para la enumeración de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus mediante recuento en placa.
2.2 Este método es aplicable a las muestras de alimentos de consumo humano sometidos a
procesos de fermentación, que han sido preparadas de acuerdo al IT-01.

3. REFERENCIAS

3.1 Downes, Frances Pouch; ITO, Keith. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods American Public Health Association.Washington, DC, 2001.
3.2 Ashraf, Rabia; Shah, Nagendra P. Selective and differential enumerations of Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp. in yoghurt—A review. International journal of
food microbiology, 2011, vol. 149, no 3, p. 194-208.
3.3 Tharmaraj, N.; Shah, N. P. Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria,
Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and propionibacteria. Journal of dairy
science, 2003, vol. 86, no 7, p. 2288-2296.
3.4 Dave, R. I.; Shah, N. P. Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and
bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 1996, vol. 79, no 9, p. 1529-1536.
3.5 IDF, 1981. Identification and enumeration of microorganisms in fermented milks. Joint
IDF/ISO/AOAC Group E44.

4 PRINCIPIOS

4.1 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus puede ser enumerado de forma selectiva
utilizando agar MRS con pH 5,2 bajo condiciones de anaerobiosis a 44°C por 72 hrs. Al
reducir el pH del agar MRS y aumentar la temperatura de incubación, solo pueden crecer
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (colonias fácilmente identificables, de forma
irregular, blancas, rugosas y de 1 mm de diámetro), Lb. rhamnosus (colonias blancas, lisas
y brillantes, de 2 mm de diámetro) y Lb. acidophilus (colonias marrón, rugosas y de borde
irregular, de 0.1 a 0.5 mm de diámetro).
4.2 Streptococcus thermophilus puede ser enumerado de forma selectiva utilizando agar M17.
Este contiene β-glicerofosfato que tiene efecto inhibitorio en el crecimiento de Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus, pero permite el crecimiento de Streptococcus thermophilus

5 TERMINOS Y DEFINICIONES

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Streptococcus thermophilus
5.1 Yogurt: Producto lácteo utilizado ampliamente por que contiene probióticos que tienen
potenciales beneficios para la salud humana. Para poder ser reconocido como yogurt debe
contener, o se recomiendan, ≥106 ufc de células viables por gramo de producto

6 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

6.1 Reactivos
6.1.1 Agar MRS modificado, pH 5.2
6.1.2 Agar M17
6.1.3 Agua peptonada tamponada al 0.1%
6.1.4 Solución de lactosa 10% p/v estéril.

6.2 Equipos
6.2.1 Incubadora a 35±1°C
6.2.2 Incubadora a 44±1°C
6.2.3 Baño termoregulado a 47±2°C
6.2.4 Vortex
6.2.5 Balanza

6.3 Materiales
6.3.1 Guantes sin talco
6.3.2 Micropipetas
6.3.3 Puntas con filtro
6.3.4 Placas Petri estériles de 90 mm
6.3.5 Gaspack de anaerobiosis
6.3.6 Jarras de anaerobiosis
6.3.7 Indicador de anaerobiosis

7 PROCEDIMIENTO

7.1 Preparación campana de bioseguridad

7.1.1 Limpiar con desinfectante y alcohol al 70%, encender la luz UV por 15 minutos.
Antes de trabajar apagar la luz UV.
7.2 Preparación de las muestras
7.2.1 Pesar y preparar las muestras de acuerdo al IT-01.
7.2.2 A partir de la muestra hidratada y homogenizada, o desde la muestra líquida
directa, preparar las diluciones decimales consecutivas necesarias para obtener
un recuento contable en placa. Para ello, transferir 1 ml a un tubo de 9 ml de APT
al 0.1%, agitar en vortex, y repetir para las siguientes diluciones.
7.2.3 De acuerdo a las características de los productos fermentados, el recuento
esperado de microorganismos es entre 106 y 107 ufc/g. Realizar por lo menos
diluciones hasta la -7
7.3 Siembra
7.3.1 Utilizar guantes sin talco y micropipetas con puntas con filtro
7.3.2 Identificar las placas de agar MRS pH 5.2 y M17 con el ID de la muestra y la
dilución sembrada.

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Streptococcus thermophilus
7.3.3 Transferir por medio de una punta estéril con filtro, 1 ml de la dilución a trabajar
en el centro de la placa petri. Repetir con las diluciones siguientes.
7.3.4 Para el recuento de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus:
7.3.4.1 Utilizar el agar MRS pH 5.2. Agregar 15 ml aproximado del agar, mantenido a
47±2°C, y dejar solidificar.
7.3.4.2 Aplicar una segunda capa del mismos agar cubriendo toda la superficie para
favorecer la anaerobiosis
7.3.5 Para el recuento de Streptococcus thermophilus:
7.3.5.1 Utilizar el agar M17. Agregar entre 15-20 ml aproximados de agar, mantenido a
47±2°C, y dejar solidificar.
7.4 Control de calidad del método de ensayo
Por cada set de análisis realizar en forma paralela a las muestras los siguientes
controles:
7.4.1 Control de esterilidad
Sembrar 0.1 ml del APT al 0.1% utilizada durante el proceso para cada uno de los
agares utilizados (agar M17 y en agar MRS pH 5.2).
7.4.2 Control de productividad
MRS pH 5.2: Sembrar 1 ml de un cultivo de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus a una concentración de102 ufc/ml.
M17: Sembrar 1 ml de un cultivo de Streptococcus thermophilus a una
concentración de 102 ufc/ml.
7.5 Incubación
7.5.1 MRS pH 5.2: Invertir las placas (para evitar contaminación) e incubarlas en jarras
de anaerobiosis, agregar uno o dos sachet generadores de anaerobiosis,
dependiendo de la jarra utilizada, un indicador de anaerobiosis y tapar
inmediatamente. Incubar por 72 hrs a 44±2°C.
7.5.2 M17: Invertir las placas (para evitar contaminación) e incubarlas por 48 hrs a
35±1°C.

8 ANÁLISIS Y APROBACIÓN DE RESULTADOS

8.1 Análisis de resultados

8.1.1 Seleccionar las placas con menos de 250 colonias
8.1.2 Contar colonias características de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus que
se desarrollen en el agar MRS pH 5.2; colonias de forma irregular, blancas,
rugosas y de 1 mm de diámetro.
8.1.3 Contar todas las colonias que se desarrollen en el agar M17.
8.2 Aprobación de resultados
8.2.1 Antes de evaluar los resultados en las muestras a analizar, es necesario verificar
los controles de esterilidad y productividad realizados en el proceso. En caso de
que los controles de productividad y/o esterilidad presenten señales que no
cumplan con el criterio de interpretación, los análisis deberán ser repetidos.

9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS

9.1 Muestras generales

Registrar el número de colonias por cada dilución.

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Streptococcus thermophilus
Si las placas no contienen colonias características, informar según lo siguiente:
• <10 ufc/g cuando se ha sembrado directo desde una muestra líquida
• <100 ufc/g en caso de productos sólidos, donde se ha sembrado 0.1 ml desde la
dilución 10-1.
• <10x ufc/g, considerando la dilución más baja utilizada

10 INFORME

El informe del análisis debe contener la información siguiente:

a) la identificación precisa de la muestra, incluyendo lugar, día y hora del muestreo y
tiempo de almacenamiento;
b) los resultados obtenidos según se indica en cláusula 8 de esta metodología
c) la referencia a este método de ensayo
d) cualquier modificación del procedimiento especificado

11 TABLA DE CONTROL DE CAMBIOS

Motivo de la
Revisión Cambios
modificación
- Creación y cambios no especificados
01-03 No aplica
- Se agrega punto 11, según nuevo formato.
04 Actualización

Elaborado
Aprobado por:
por:
Supervisor microbiología Jefe de Calidad

12 ANEXOS

Registro de resultados del recuento de

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y RPT-22-01
Streptococcus thermophilus

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