Código: PT-01 1

Revisión 05
Vigencia: 14 – 03 – 2022

Recuento de aerobios mesófilos técnica Petrifilm

1. OBJETIVOS

Realizar recuento de unidades formadoras de colonias de aerobios mesófilos mediante la técnica

de petrifilm.

2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION

Se aplica a:
2.1 todos los alimentos recibidos por el laboratorio de Servicio de alimentos con excepción de los
productos fermentados o madurados tales como queso, ciertos tipos de embutidos, yogurt,
etc.
2.2 Superficies y utensilios utilizados en la industria alimentaria o que se encuentren en contacto
con productos alimenticios, con el fin de detectar o enumerar microorganismos viables.

3. REFERENCIAS

3.1 Instructivo 3M Petrifilm Aerobic Count Plate.

3.2 Método Oficial AOAC 990.12: Recuento de Microorganismos Aerobios Mesófilos en

alimentos, métodos del film seco rehidratable.

3.3 NCh 3057 Of.2007 Microbiología, de los alimentos de consumo humano y animal – Métodos
horizontales para técnicas de muestreo desde superficies usando placas de contacto y
tórulas.

3.4 AFNOR método validado 3M 01/1-09/89.

3.5 NCh 2659:2002 Productos hidrobiológicos - Determinación de microorganismos aerobios

mesófilos – Técnica de recuento en placa a 35°C.

4. PRINCIPIOS

Las Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios Totales (Aerobic Count, AC) son un medio de
cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes del Agar Standard Methods, un agente
gelificante soluble en agua fría y un tinte indicador de color rojo que facilita el recuento de las
colonias. Las Placas Petrifilm AC se utilizan para el recuento de la población total existente de
bacterias aerobias en productos, superficies, etc.

5. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

No aplica

6. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

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- Estufa de incubación regulada a 35°±1°C.
- Agitador de tubos
- Puntas estériles.
- Micropipetas
- Placas petrifilm recuento de aerobios mesófilos
- Difusor plástico para placas petrifilm
- Stomacher y bolsas para Stomacher estériles.
- Balanza.
- Etiquetas (identificación de muestras).
- Campana de flujo laminar.
- Contador de colonias o equivalente.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 DESCRIPCION DE LA ACTIVIDAD

7.1.1 Dilución: Pesar y preparar la muestra según lo indicado en el instructivo IT-01 de

preparación de muestras para análisis microbiológicos.
A partir de la muestra homogeneizada o de la muestra liquida directa, preparar diluciones
decimales 10-2, 10-3, etc.
Para ello trasferir 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptonada. Agitar y proceder de igual forma
para las diluciones siguientes.

7.1.2 Siembra: Identificar las placas petrifilm a utilizar con el número de muestra y dilución a
sembrar.
Colocar la placa petrifilm sobre una superficie plana y nivelada.
Levantar la lámina semitransparente superior y con la punta en posición perpendicular agregar
1ml de la dilución en el centro de la placa petrifilm.
Sembrar mínimo dos diluciones consecutivas.

Controles del proceso

Control Productividad: Sembrar 1 ml de un cultivo de E. coli ATCC 51446 a una
concentración de 1x102 ufc/ml.
Control Esterilidad: Sembrar 1 ml del agua peptonada 0,1% utilizada durante el ensayo.
Dejar caer la película superior sobre la muestra, evitando la formación de burbujas de aire.

7.1.3 Distribución de la muestra: Colocar el difusor plástico (30 cm2) con la cara lisa hacia
arriba, sobre la película superior de la placa, cubriendo totalmente la muestra.
Presione suavemente el difusor, para distribuir uniformemente la muestra, no gire ni deslice.
Retire el difusor y espere al menos 1 minuto para que se solidifique el gel.

7.1.4 Incubación: Incubar las placas en forma horizontal, cara arriba en grupos de no más de
20 placas, durante 48 ± 3 horas a 35°C ±1°C.

7.1.5 Recomendaciones: Tras la incubación, las placas pueden conservarse, para recuentos
posteriores, en congelación a temperaturas bajo o igual a los -15 ºC por un máximo de una
semana, para efectuar el conteo. Esto es sólo para casos de emergencia, no se debe
establecer como procedimiento rutinario.

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8. ANÁLISIS Y APROBACIONES DE RESULTADOS

8.1 Recuento de colonias: Seleccionar las placas que presenten un rango de conteo entre
25 – 250 colonias de color rojo sin importar tamaño o la intensidad del color rojo. El área de
2
crecimiento circular del Petrifilm es aproximadamente de 20 cm .

8.2 Casos especiales: Placa muy numerosas para contar (Fig.1 A). Altas concentraciones de
colonias en las placas ocasionarán que toda el área de crecimiento se vuelva roja o rosada
(Fig.1 B). Ocasionalmente, en placas demasiado cargadas, el centro de la placa puede
carecer de colonias visibles, pero pueden apreciarse muchas colonias pequeñas en los
bordes (Fig.1 C). Cuando esto ocurre, diluir más la muestra para obtener un recuento más
preciso.

Fig. 1

Cuando el número de colonias es mayor a 250 (Fig. 2), por su excesivo crecimiento, los
recuentos deben ser estimados. Determine el promedio de colonias en un cuadrado (1 cm2) y
multiplíquelo por 20 para obtener el recuento total por placa.

Fig. 2

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Algunos organismos pueden licuar el gel, pudiéndose producir una difusión que oculte la
presencia de otras colonias (Fig.3). Si la licuación del gel interfiere con el recuento, debe
realizarse un recuento estimado contando las áreas no afectadas.

Fig. 3

9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

• En caso de no obtener desarrollo en las placas se debe informar de acuerdo al límite de

detección de la técnica.
-1
Ejemplo: < 10 UFC / g (Muestras en dilución 10 )

• Para recuentos generales debe considerar la siguiente formula:

∑C = Suma de las colonias contadas en las dos placas escogidas de las dos diluciones
consecutivas, de las cuales al menos una de las placas contiene un mínimo de 10
colonias
V = Volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros
d = Dilución correspondiente a la primera dilución escogida

• Para recuentos luego de una confirmación, del total de colonias identificadas (A) se
seleccionan máximo 5 para confirmación y se realiza el siguiente calculo:

b = Número de colonias que cumplen los criterios de identificación dentro de las colonias
identificadas A
C = Número total de colonias sospechosas contadas en cada placa

El resultado calculado se redondea al número entero más próximo.

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• Para recuentos menores a 10 colonias y mínimo 4 colonias se debe realizar el siguiente
calculo:

Expresando el valor como número estimado de microorganismos por ml o gr.

• Para recuentos entre 1 y 3 colonias, la precisión del análisis es demasiado baja y el resultado
debe expresarse como:
“Hay microorganismos presentes, pero a un nivel inferior a 4/Vd por gramo o ml”

Donde

d = Factor de dilución de la suspensión inicial, o de la primera dilución inoculada o

escogida.
V = Volumen de inóculo utilizado en cada placa en ml

• Los recuentos se informarán con 2 dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad
al segundo dígito si éste es impar y mantener el segundo dígito si éste es par. Usar ceros
para los demás dígitos hacia la derecha.
• En caso de recuentos incontables se informará como Muy Numeroso Para Contar (MNPC).

10. INFORME

El informe del análisis debe contener la información siguiente:

a) la identificación precisa de la muestra, incluyendo lugar, día y hora del muestreo y tiempo
de almacenamiento;
b) los resultados obtenidos según se indica este procedimiento
c) la referencia a este método de ensayo
d) cualquier modificación del procedimiento especificado

11. TABLA DE CONTROL DE CAMBIOS

Motivo de la
Revisión Cambios
modificación
- Creación y cambios no especificados
01-03 No aplica
- Se agregan puntos 4, 7, 8, 9, 10 y 11, según
nuevo formato.

04 - Se actualiza información de puntos 4,8,9 y 10 Actualización

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- Se actualizan las referencias, apartados 3.4 y
05 3.5 Actualización

Elaborado
Aprobado por:
por: Líder de Microbiología Director técnico

12. ANEXOS

Registro de resultados determinación de Aerobios RPT-01-01

Mesófilos

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