Codigo: PT-05 Revision 09 iN Vigencia: 28 - 03 ~ 2021 Determinacién de coliformes totales y Escherichia colien AN ATURE aguas 1. OBJETIVOS Establecer un método cualitativo para la determinacién simulténea de bacterias coliformes totales y E. colien aguas, mediente filtracion por membrana, utilizando agar m-ColiBlue 24°, 2. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACION Se aplica a todas las muestras de agua potable recepcionadas en el servicio de laboratorio de alimentos, excepto aquellas aguas que presenten turbiedad superior a 10 NTU (unidades nefelometricas). 3. REFRERENCIAS 3.1. NCh 2972.0f2008. Aguas - Determinacién simultanea de bacterias coliformes totales y E. coli mediante método de filtracién por membrana con m-Coliblue 248. 3.2. NCh 409/1.02005. Agua potable - Parte 1 — Requisitos. 3.3 NCh 1620/2.0f84, Agua potable — Determinacién de bacterias coliformes totales ~ Parte 2: Método de fitracién por membrana. 4, PRINCIPIOS Asegurar que el agua potable cumple con los requisitos bacteriolégicos que aseguran su inocuidad para el consumo humane. 5. TERMINOS Y DEFINICIONES 5.1 Agua potable: agua que cumple los requisitos establecidos en NCh 409/1, que aseguran su inocuidad y aptitud para el consumo humano. 5.2 Coliformes totales: grupo de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativo, no formadoras de esporas, fermentadoras de la lactosa a 35°C con produccién de Acido y gas, que poseen actividad B-D-galactosidasa. 5.3 Escherichia coli (E. col): bacteria del grupo coliformes. Comprende aquellos microorganismos que en un medio adecuado, a una temperatura restrictiva de 44,5°C + 0,2°C, fermentan la lactosa produciendo dcido y gas, y poseen actividad 8-D- glucuronidasa y actividad triptofanasa, Son negativas a la actividad oxidasa y ureasa eS Rf SS renee Pagina 1 de7Cédigo: PT-05 7N Revision 08 i Vigerca:26-"03—2021 Determinacion de coliformes totales y Escherichia coli en reson narune aguas 6. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS + Estufa de incubacién regulada a 35°+0.5°C. - Equipo de filtracion por membrana estéril. - Monitor microbiolgico para 100 ml estériles de 47 mm con poro de 0,45 ym. - _ Sistema de filtracién, provisto de matraz Kitasato y trampa de agua, = Sistema de vacio o bomba de vacio. - Autoclave, regulable a 121°C # 2°C. - _Tubos de ensayo u otro envase adecuado (matraces, frascos), para preparar agua buffer. - Probeta de 100 ml estéril PROCEDIMIENTO 7.1 Determinacién de turbidez En primera instancia, debe determinarse la turbidez del agua, siguiendo las instrucciones del procedimiento INS-24 ‘Instructivo de uso de turbidimetro digital’. La determinacién de coliformes totales y E. coli en agua sélo debe realizarse si su turbidez es igual o inferior a 10 NTU. 7.2. Control de calidad del método de ensayo En forma paralela al andlisis de las muestras, se deben efectuar los siguientes controles: 7.2.1 Control de blanco reactivo: Para verificar que no existe contaminacién, al comenzar el ensayo se deben someter 100 ml de agua buffer estéril, antes de iniciar la fitracién de las muestras, lo que corresponde al Blanco reactivo. 7.2.2 Control de blanco de medio de cultivo: Se debe incubar en paralelo una placa del medio agar m-ColiBlue 24® sin muestra, lo que corresponde a Blanco de medio de cultivo. 7.2.3 Control de productividad y selectividad: Realizar por cada ensayo, cultivos paralelos con cepas patron. Las cepas a utilizar deben coresponder a los microorganismos siguientes: Cepa Control (+) | Control (-) E. coli | E.coli z E. aerogenes Coliformes | & coll Pseudomonas aeruginosa - Coliformes 7.3 Filtracion ‘Armar el equipo de filtraci6n, conectando al sistema de vacio y al matraz receptor del filtrado. Con guantes, tomar el monitor microbiolégico y ponerlo sobre el equipo de filtracién. Agregar aproximadamente 2 mi de solucién de agua buffer a la membrana para humedecerla, filtrando bajo vacio parcial. Agitar vigorosamente para homogeneizar el i Pagina 2 de7Cédigo: PT-05 | 3 np. Revision 08 A Vigencie: 29-03 - 2021 Determinacién de coliformes totales y Escherichia coli en sessivanarune aguas envase que contiene la muestra, destapario cuidadosamente evitando contaminar la boca de! frasco. Filtrar los 100 ml de muestra bajo vacio parcial. Lavar el embudo y el filtro de membrana, con tres porciones de 20 a 30 ml de agua buffer, aplicando vacio cada vez. 7.4 Siembra Agregar 2 ml de m-Coliblue 24®, aplicando vacio. Finalmente, retirar el embudo de filtracién y tapar la membrana. Se puede usar el mismo equipo para la filtracién sucesiva de un maximo de 30 muestras, siempre que el proceso no sea interrumpido. Se considera interrumpida si hay un intervalo de tiempo mayor a 30 minutos entre las filtraciones de cada muestra. 7.5 Incubacion Es recomendable que el tiempo transcurrido desde la filtracién hasta iniciar la incubacion no exceda de 20 minutos, Incubar las placas en posicién invertida, durante 24 h + 2 h a 35°C + 0,5°C en una estufa de incubacién, controlando la temperatura periédicamente, a lo menos dos veces al dia. 7.6 Interpretacin ‘Transcurrido el periodo de incubacién, observar a simple vista el crecimiento de colonias de los microorganismos en estudio. Las colonias se presentan con las siguientes caracteristicas: Microorganismo Resultado positive Resultado negativo Colonias claras 0 blancas Coliformes totales _| Colonias rojas, colonias azules E. coli Colonias azules Colonias no azules En algunas ocasiones sélo el centro de Ia colonia puede presentar coloracién. En tales casos, interpretar igualmente como colonia roja positiva o azul positiva, segtin corresponda Las colonias rojas pueden variar en la intensidad de su coloracién y las colonias azules pueden aparecer desde azul a azul-puirpura. Considerar todas las colonias rojas y azules como coliformes totales. Considerar todas las colonias azules como E. coli. 7.7 Verificacién de colonias 7.7.1 Coliformes totales: Se deben verificar al menos § colonias rojas desarrolladas en el medio de cultive. Aquelias colonias que se presuma corresponden a coliformes totales, deberén ser traspasadas a caldo LBVB con campanas Durham Posterior al traspaso, los tubos deben ser incubados a 36 + 0,5°C, durante 24 horas. Si en las campanas Durham no se observa produccién de gas, se deben re-incubar los tubos durante 24 horas adicionales. 7.7.2 E, coli: Se deben verificar al menos 5 colonias de color azul mediante la técnica de PCR, siguiendo las indicaciones de! procedimiento PT-07 “Amplificacion y semi- cuantificacion por PCR, y deteccién de productos de PCR para la pesquisa de patégenos humanos". Cee ear nnnIENIIININEEEE Ee aaaenmene-seaaaamel Pagina 3 de 7(Cédigo: PT-05 TA Revision 09 Vigencia: 29 - 03 ~ 2021 Determinacién de coliformes totales y Escherichia coli en sean nau aguas Se deben verificar todas las colonias si son menos de 5. 7.8 Confirmacion de las colonias de E. coli mediante PCR Las colonias seran confirmadas por PCR con partidores exclusivos para E. coli. Para ello, se deben ubicar los tubos eppendorf en gradilla y hervir en baiio termorreguiador durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y traspasar 50 j1l del sobrenadante a un tubo de 1,5 mi 7.9 Amplificacion de ADN Una vez realizada la extraccién de ADN y su adicién al mix de PCR especifico para la deteccién de E. coli, entregar los tubos al responsable del area de deteccién junto con una copia del registro para que los coloque en el termociclador. 7.40 Programa de Amplificacion Colocar los tubos dentro del termociclador y cerrar. El procedimiento esta optimizado para equipos de tiempo real con canal de deteccién FAM. Verificar que el programa de amplificacién es “NPLEX” y corresponde al siguiente. PCR ~Desnaturacién inicial: 95°C durante 10 minutos. ~ 40 ciclos de * Desnaturacién: 95°C durante 30 segundos, © Alineamiento: 63°C durante 30 segundos. * Elongacién: 68°C durante 30 segundos. Curva de melting Desnaturacién: 95°C durante 30 segundos. - Disociacién: © 72°C durante 30 segundos. * 98°C durante 30 segundos 7.14 Interferencias Algunas variedades de bacterias no coliformes presentan similitud fisiolégica con los cuatro géneros de coliformes tradicionales (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter) y cuando estén en altas concentraciones, pueden crecer en el medio m-ColiBlue 24 y formar colonias rojas produciendo resultados falsos positivos, pero estos géneros no se encuentran habitualmente en aguas, Por lo tanto y dado que la formacién de colonias azules es el resultado de reacciones enzimaticas muy especificas, el método muestra interferencias por resultados falsos positivos de E. coli del orden de 2.5% y por falsos negatives de 0%. 8. ANALISIS Y APROBACIONES DE RESULTADOS, 8.1 Analisis de resultados Se basa en la interpretacién de la curva de caida de fluorescencia, también llamada curva de “melting’, en la cual se espera ver un peak de caida maxima de fluorescencia a diferentes temperatura, que corresponden a un microorganismo en particular 0 al control interno. Neen nn nn anal Pagina 4 de 7TA A Cédigo: PT-05 Revision 08 Vigencia: 28 - 03 - 2021 Determinacion de coliformes totales y Escherichia coli en aguas Los resultados positives se deducen a partir de la distancia en grados Celsius (°C) que existe entre un peak de fiuorescencia cualquiera y el peak de fluorescencia correspondiente al control interno, que normalmente arroja una sefial a los 76 + 0,5 °C Las temperaturas e interpretacién del peak de ADN objetivo se muestra en la siguiente tabla: Wicroorganismo | Temperaturade Distancia desde el _ Umbral de positividad Blanco Melting (°C) control interno [(UFM muestra! UFM eC) C1C-) x 100] Control interno 76£05 - - Escherichia coli ~92 15205 > 50% 8.2 Aprobacién de resultados 8.2.41 8.2.2 Para una correcta interpretacién de los resultados, es importante incluir el control negativo en el andlisis, ya que la sefial de fluorescencia correspondiente al control interno en dicho tubo entrega las unidades de fluorescencia minimas (UFM) sobre las que se determina el umbral de positividad para las muestras en andlisis, es decir, establece la fluorescencia minima a la cual una sefial que cumple con los ctiterios de distancia en grados Celsius desde el control interno debe ser considerada como positiva, en términos de porcentaje, Para aprobar los resultados de las muestras a analizar es necesario verificar los controles afiadidos a la reaccién. En caso de que el control positivo 0 negativo presenten resultados que no cumplan con el criterio de interpretacién o que no presenten sefial alguna, los analisis deberan ser repetidos, 8.3 Software de interpretacion de resultados 8.3.1 8.3.2 8.3.3 Termociclador Chai: Una vez terminado el programa de PCR, indicar al programa mostrar los resultados en “Curva de Melting’, seleccionar todos los pocillos con muestras y controles. En opciones seleccionar “Export”, luego “Extraer’, se extraerd una carpeta de formato .zip. El archivo a utilizar es "Melt curve data’, que se encuentra en formato CSV. Termociclador Agilent: Una vez terminado el programa de PCR, indicar al programa mostrar los resultados en "Curva de Melting’, seleccionar todos los pocillos con muestras y controles. En opciones seleccionar “File”, Iuego “Export instrument data’, seleccionar “Export instrument data to text file’, opcion "Format 1 = Columnar’, Se extraerd un archivo que se encuentra en formato TXT. En ambos casos, ingresar al sitio web del kit nPLEX “httos://nplex-des.taag- genetics. com/algoritmosinplex’ En la secci6n “Select device used’ seleccionar el equipo utlizado, Chai-Bio 0 Strata, En la seccién “Select file” adjuntar el archivo CSV 0 .TXT (dependiendo del termociclador utilizado). Seleccionar el kit nPLEX Multiplex gPCR L. monocytogenes, Salmonella spp, S. aureus and E. coli. Finalmente hacer clic en ‘Analize’. El software entregara automaticamente el resultado de cada pocillo analizado. Verificar en la planilla de PCR @ que muestra corresponde cada ubicacién en el software.Codigo: PT-05 7 eviin 08 vy Vigencia: 28-03 - 2024 Determinacién de coliformes totales y Escherichia coli en sesonenarune aguas 9, EXPRESION DE RESULTADOS Si del total de colonias verificadas, solo en una se confirma la presencia de coliformes totales 0 E. coli, la muestra deberé ser informada como positiva, independiente del numero de colonias confirmadas. 10. INFORME Tal como lo indica la NCh2972.02008, el informe de resultados debe incluir el contenido de cloro residual de la muestra y la turbiedad expresada en NTU. Si bien, se requiere un valor < 10 NTU para la determinacion de coliformes totales y E. coli, este criterio de aceptacién no guarda relaci6n con los requisitos dispuestos en la NCh409/1.02005 para agua potable. 11. CONTROL DE CAMBIOS i Motivo de la Revision Cambios modificacion 47 = _ Creacién y cambios no especificados. No aplica > _ Se agrega referencia a NCh 1620/2, 0784. 5 1" inacién de turbidez" a Se agrega punto 7.1 "Determinacion de turbidez’ eee + Se agregan los puntos 4, 8, 9, 10 y 11, segun nuevo formato. > Se actualizan puntos 7.10 “Programa de 9 Amplificacién’ y 8 “Analisis y aprobaciones de] — Actualizacin resultados’ @ metodologia por RT-PCR. =. C// Elaborado Z = — q | Saeeeer oe Aprobado por: por: Encargado de Gestion y o ps UG Aseguramiento de Calidad Director Técnico 12, ANEXOS 12.4 Preparacién de agua butfer Las soluciones stock deben ser identificadas, guardadas en refrigeracién y revisadas regularmente para eliminarlas si se presume contaminaci6n. 12.4.1 Componente: = Solucién stock de buffer fosfato 0 fosfato monopotasico (KH2PO4) Disolver 34,0 g de fosfato diacido de potasio (KH2PO4) en 500 mi de agua para andlisis grado reactivo. Ajustar el pH a 7,2 + 0,5 con solucién normal de hidréxido de sodio 1 N (NaOH) y diluir a 1 L con agua para andlisis. - Solucién stock de cloruro de magnesio (MgCI2) a Pagina 6 de 7Codigo: PT-05 | 7 A Revista 08 nN Vigencia: 29-03 - 2021 Determinacién de coliformes totales y Escherichia coli en sone Te aguas Disolver 38,0 g de cloruro de magnesio (MgCi2) en 1 L de agua para andlisis grado reactivo. Alternativamente, se puede utilizar la solucién stock de MgSO4. = Solucién stock de sulfato de magnesio (MgSO4) Disolver 50,0 g de sulfato de magnesio (MgSO4) en 1 L de agua para anélisis grado reactivo, 12.4.2 Preparacién: Agregar 1,25 ml de solucién stock de buffer fosfato y 5,0 ml de solucién stock de cloruro de magnesio, o de sulfato de magnesio, a 1 L de agua para andlisis arado reactivo. Dispensar la cantidad requerida en matraces o frascos y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. 12.2Formularios RPT 05-01 Registro de Resultados — Determ. de coliformes totales y E. coli en aguas RPT 05-02 Registro de Turbiedad RPT 07-02 _ Preparacién y Resultados PCR Food Total E. coli genérica See EEE oe Pagina 7 de 7