UNIDAD II: PRINCIPIOS DE LA TEORIA CELULAR 2.1.1, HISTORIA DEL MICROSCOPIO La historia del microscopic empieza con Ia invencién del microscoplo compuesto, es decir, con Ia idea de combinar més de una lente para observar objetos de forma aumentada. Acorde con esta definicién, la historia del microscopio empezaria a finales del siglo XVI, posiblemente con el disehio de Zacharias Janssen. Sin embargo, es importante tener en cuenta que antes de Ia invencién del microscopio ya era comin la utiizacién de lentes de aumento. también conocidas como lupas. Las lupas son también un tipo de micrascopio llamado microscopio simple. No obstante, cuando se habla del invento del microscopio se hace generalmente referencia a la idea del mictoscopio compuesto. 2.1.1.1 EL DESCUBRIMIENTO DE LAS LENTES DE AUMENTO Las primeras lentes de las cuales se tiene conocimiento fueron fabricadas por civilzaciones antiguas. A parte de permitir observar objetos de forma aumentada, estas lentes eran a menudo utlizadas para concentrar los rayos de luz en un punto y poder hacer fuego. Algunas también tenian funciones decorativas. Objeto Observador Lente —real Imagen virtual La lente mas antigua que se ha conservado es la lente de Nimrud, fabricada en el imperio asirio airededor del aio 750 a. C. BIOLOGIATambién las civilizaciones egipcias, griega y babilénica conocian las propiedades de las lentes. Una de las técnicas que se utiizaba en la antigua Roma era llenar esferas de vidrio con agua. Esto permitia observar objetos de forma aumentada al mirarlos a través de la esfera. Otra técnica parecida se desarrollé en China, donde se uiilizaban tubos que se podian rellenar con distintos niveles de agua para obtener distintos aumentos. Aunque el uso de estas primeras lentes estaba extendido, su poder de aumento era muy limitado. Esto hizo que el verdadero desarrolo en el campo de la éptica no empezara hasta finales de! siglo Xill, cuando en Italia se empiezan a fabricar las primeras lentes para ser utilzadas como gatas. A pariir de esta época, la mejora en las técnicas de fabricacion de lentes ocaba dando lugar c la invencién de instrumentos como él telescopio y el microscopio. 2.1.1.2 LA INVENCION DEL MICROSCOPIO COMPUESTO No es posible afirmar con absoluta certeza auién fue el verdadero inventor del microscopio. Existen bastantes fuentes que sefalan a Zacharias Janssen como legitimo inventor del microscopic compuesto en el aio 1590. Sin embargo. otros indiciosindican que el verdadero inventor poctia haber sido Hans Lippershey. Le re fii ee ne enfuim También Galileo Gailei presenté su microscopio éptico en 1609 utilzando un disefio basado en la combinacién de una lente céncava junto con una lente convexa. Galileo Galilei legé a este resultado modificando uno de sus telescopios y quizé sin tener conocimiento del instrument inventade por Zacharias Janssen. En 1619 Comeiius Drebbel presenté su disefio con dos lentes convexas. Esto hace pensar que también alguno de ellos dos podria haber inventado el microscopio antes que Zacharias Janssen. En cualquiera de los casos parece claro que el microscopic compuesto fue inventado en algun momento entre los aiios 1590 y 1620. En 1625 Giovanni Faber es a primera persona en referise a este nuevo invento como microscopio.2.1.1.3 EL MICROSCOPIO DE ZACHARIAS JANSSEN En 1590 Zacharias Janssen trabajaba junto con su padre. Hans Martens, como fabricante de anteojos. Durante sus trabajos en el taller tuvo en algén momento la idea de conectar dos lentes mediante un tubo. Con este simple montaje Zacharias Janssen se dio cuenta de que podia observar objetos con aumentos significativamente mayores que los que Conseguia con une sola lente. Seguin los documentos de Ia época el aumento obtenido con este microscopio variaba entre 3x y 9x segun cual fuera la cistancia entre los lentes. ocuar objetivo Aunque este tipo de microscopio es muy distinto a los que se usan actualmente, su estructura bésica es la misma, con una lente actuando como objetivo y Ia otra como ocular. Lente objetivo, situada muy cerca del objeto. Lente ocular, al otro, extremo del tubo, esté situada mas cerca del ojo y hace Ia funcién de lupa sobre Ia imagen que produce el lente objetivo. Este instrumento demostré que Ia imagen aumentada con una sola lente puede ser ala vez aumentada con una segunda lente. 2.1.1.4 LAS OBSERVACIONES MICROSCOPICAS DE ROBERT HOOKE Es posible que ni Zacharias Janssen ni su padre Hans Martens furan conscientes del potencial cientifico del microscopio. Uno de los primeros cientificos en utiizar ‘con fines cientificos fue Robert Hooke, quien en 1665 publicé unaEI libro Mictographia presenté ilusraciones de las observaciones reaizadas por Robert Hooke mediante un microscopio compuesto, incluyendo insectos, plantas, etc. que por primera vez se pucieron ver a gran escala. Una de las aportaciones mas importantes de Robert Hooke fue introducir la palabra célula para describir las estructuras que observé en una muestra de corcho. Algunas de las ilustraciones incluidas en Mictographia alcanzaban un aumento de hasta 50x. También es importante destacar que Hooke inirodyjo la iluminacién de las muestras mediante una vela. Esto permitié observar los muestras con mejor claridad y es equivalente al sistema utilzado actualmente mediante un foco y un condensador de uz. 2.1.1.5 EL MICROSCOPIO DE ANTONIE VAN LEEUWENHOEK Antonie Van Leeuwenhoek (1632-1723) hizo un paso importante en el campo de la microscopia al descubrir una nueva técnica de fabricacién de lentes que le permitio alcanzor aumentos de hasta 200x. Antonie van Leeuwenhoek trabajaba inicialmente como comerciante de telas. Su interés por la microscopia empez6 con el objetivo de fabricar mejores lentes para analizar la calidad de las telas con las que comerciaba. Los microscopios construides por Antonie van Leeuwenhoek eran microscopios simples, es decr, de una sola lente. Su avanzada técnica de fabricacién le permitia obtener lentes de gran aumento a la vez que evitaba las aberaciones de la luz que tenian todos los microscopios compuestos del momento. Esto lo permitié observar el mundo a un nivel de aumento inalcanzado hasta el momento. Microscopio de Leeuwenhoek _ Botén de Enfoque Para mover tone Lamuestra Colocacion la muestra Antonie van Leeuwenhoek mantuvo en secreto sus técnicas de fabricacién de lentes, pero no sus descubrimientos. Durante afos publicé los resultados de sus observaciones que incluyeron todo tivo de fenémenos microscépicos. Algunas de las observaciones mas importantes que documenté incluyen las fibras musculares, distintos tipos de bacterias y los gldbulos rojos de Ia sangre. Su contribucién a la ciencia hizo que todavia hoy se le conozca como el padre de la microbiclogia.2.1.1.6 EL DESARROLLO MODERNO DEL MICROSCOPIO A medida que el microscopio fue ganando popularidad, el numero de empresas dedicadas a Ia fabricacién de microscopios fue cumentando. La mayoria de ellas estaban en un principio establecidas en Ingiatera y Alemania, fue alli donde se produjeron las innovaciones mas importantes en el campo de los microscopios durante las siglos XVIII y XIX. En 1776 el briténico Jeremiah Sisson construyé el primer revolver para microscopios que permitia cambiar el objetivo con el que se observaba la muestra. Este elemento fue introducido en seguida por los fabricantes més importantes de microscopios. Entre ellos destacaron la empresa Leitz, fundada por el empresario Emst Leitz, que acobaria dando lugar a la empresa hoy en dia llamada Leica y que también es conocida por sus cdmaras fotogréficas. Una de las innovaciones més importantes de Leica fue construir un microscopio binocular en 1913 que Igualaba en téminos de calidad de imagen los microscopios monoculcres de! momento. La ota gran empresa fabricante de microscopios, también en Alemania, es conocida como Carl Zeiss AG y fue fundada en 1846 por el dptico Carl Zeiss. La empresa Carl Zeiss fue capaz de revolucionar el campo de Ia microscopia gracias @ los avances de uno de sus investigadores, el fisico Ernst Abbe. Emst Abbe sento las bases para la teoria de la optica moderna. Esto permitio sistematizar la construccion de microscopios que hasta el momento habion sido siempre construides mediante ensayo y error. La teoria de Abbe permitid también mejorar la calidad de los objetivos de inmersi6n. Otro factor clave de esta época fue Ia invencién de nuevos tipos de vidrio por parte de Oto Schott. Estos nuevos vidios permitieron fabricar lentes para llevar a la practica algunos de los conceptos tedricos desarrollados por Ernst Abbe. En 1884, Otto Schott junto con Carl Zeiss. Rodrich Zeiss y Emst Abbe fundaron la empresa Schott AG para producir lentes de alta calidad que sirvieron para mejorar los microscopios de Carl Zeiss. El desarolo durante el siglo XX se centré en nuevas técnicas de microscopia basadas en iuminar la muestra con otras técnicas en lugar de con luz visible, 2.1.1.7 NUEVAS FORMAS DE MICROSCOPIA. Uno de los descubrimientos mas importantes de Emst Abbe tue demostrar que Ia resolucion del microscopio éptico es inversamente proporcional a la longitud de onda de [a luz, es decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolucion. Gracias a este descubrimiento Emst Abbe pudo caicular que la minima distancia que puede distinauirse en un microscopio éptico es aproximadamente 0.25 micrémetrosPor este motivo si quiere constuirse un menores a 0.25 micrémetros es necesario iluminar la muestra con sefiales de baja longitud de onda (esto incluye rayos UV, rayos Xe incluso electrones).. En 1904 la empresa Carl Zeiss empez6 a comerciaizar el primer microscopio de rayos ultravioleta capaz de doblar la resolucion de los microscopios épticos. El interés por el microscopio de rayos X empezé después de la segunda guerra mundial. No fue hasta 1951 que los fisicos Ellis Coslett y William Nixon pudieron constuir un microscopio de este tipo que ofrecia mejor resolucién que el microscopio éptico. Sin embargo, ol mejor avance en el campo de Ia microscopia durante el siglo XX fue el microscopic electrénico. En este microscopio la muesira es iluminada con un haz de electrones en lugar de con luz visible. El primer prototipo de microscopio electrénico tue construido en 1931 por el fisico Ernst Ruska y el ingeniero eléctrico Max Knoll. Dos afos mas tarde fueron capaces de construir el primer microscopio electrénico que superaba en resoiucién al microscopio optico. Dado que Ia longitud de onda de un electron puede llegar a ser 100 000 més pequefia que la de Ia luz, el microscopio electrénico es capaz de alcanzar una resolucién increiblemente superior ala del microscopio éptico. 2.1.2. MICROSCOPIO OPTICO Y ELECTRONICO 2.1.2.1 MICROSCOPIO OPTICO EI microscopio es un insirumento que permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Esto se logra mediante un sistema optico compuesto por lentes, que, al ser atravesadas por la imagen del objeto, la ampifican. El término, surge en el siglo XVII y deriva de las palabras griegas mikrés (pequefio) y skopéoo (observar). Segun el numero y Ia posicién de las lentes se distinguen dos tipos de microscopios: > Microscopio simple: cominmente llamado lupa. Esté constituide por una lente, o un sistema de lentes que actéan como si fuera una lente simple. > Microscopio compuesto: esta constituido por la combinacion de dos sistemas Ge lentes convergentes: uno, proximo al ojo de! observader, el ocular, y otto préximo al objeto, denominado objetivo. Se distinguen las siguientes partes. Sistema mecdnico Dentro del sistema mecdnico se incluyen todos los elementos estructurales que dan estabilidad al microscopio y mantienen los elementos opticos corectamente alineados.Base o pie: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del microscopio y sobre la cual se montan el resto de los elementos. Acostumbra a ser la Parte mas pesante para proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al microscopio. Es habitucl que incluya algunos topes de goma para evitar que el microscopio se desice sobre la superficie donde se encuentra. > Brazo: El brazo corstituye el esqueleto del microscopio. Es la piezo intermedia del microscopio que conecta todas sus partes. Principalmente conecta la superficie donde se coloca la muestra, con el ocular por donde ésta se puede observar. Tanto las lentes del objetivo como del ocular se encuentran también conectadas al brazo del microscopio. > Platina: Esta es Ia superficie donde se coloca la muestra que se quiere observar. Su posicién vertical con respecto a las lentes del objetivo se puede regular mediante dos tomillos para generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero en el centro a través del cual se ilumina la muestra. Generalmente hay dos pinzas unidas a la platina que permiten mantener la muestra en posicion fija. > Pinzas: Las pinzas tienen Ia funcién de mantener fija la preparacién una vez esta se ha colocadd sobre la platina. > Tornillo macrométrico: Este tornillo permite ajustar la posicién vertical de la muestra respecto el objetivo de forma rapida. Se utiliza para obtener un primer enfoque que es ajustado posteriormente mediante el tomillo micrométrico > Torillo micrométrico: EI tomillo micrométrico se utiliza para conseguir un enfoque més preciso de la muesira. Mediante este tomillo se cjusta de forma lenta y con gran precisién el desplazamiento vertical de la platina. > Revélver: El revélver es una pieza giratoria donde se montan los objetivos. Cada objetivo tiene proporciona un aumento distinto, el revélver permite. seleccionar el més adecuado a cada aplicacién. Habiluaimente el revolver permite escoger entre tres 0 cuatro objetivos distintos. > Tubo: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del telescopio o microscopio que conecta el ocular con los objetivs. Es un elemento esencial para mantener una corecta alineacion entre los elementos Opticos. Sistema éptico E sistema Sptico incluye todos los elementos necesarlos para generar y desviar la luz en las direcciones necesarias y asi acabar generando una imagen cumentada de la muestra. > Foco 0 fuente de luz: Este es un elemento esencial que genera un haz de luz ditigido hacia la muestra. En algunos casos el haz de luz es primero Girigido hacia un espejo que a su vez lo desvia hacia la muestra. La Posicién del foco en el microscopio depende de si se trata de un microscopio de luz transmitida 0 de luz reflejada.v v y v v Condensador: El condensador es el elemento encargado de concentrar los rayos de luz provenientes del foco a la muestra. En general, los rayos de luz provenientes del foco son divergentes. El condensador consiste en un seguido de lentes que cambian Ia direccién de estos rayos de modo que pasen a ser paralelos 0 incluso convergentes. Diafragma: El diafragma es una pieza que permite regular la cantidad de luz incidenie a ja muestra. Normaimente se encuentra situado justo debajo Ia platina, Regulando Ia luz incidente es posible varior el contraste con el que se observa la muestra. El punto dptimo del diafragma depende del tipo de muesira observada y de su transparencia. Objetivo: E| objetivo es el corjunto de lentes que se encuentran més cerca de la muestra y que producen la primera etapa de aumento. Bi objetivo suele tener una distancia focal muy corta. En los microscopios modernos dstintos objetivos estan montados en el revdlver. Este permite seleccionar el objetivo adecuado para el aumento deseado. El aumento del objetivo junto con su apertura numérica suele estar escrito en su parte lateral. Ocular: Este es el elemento dptico que proporciona la segunda etapa de ampliacién de imagen. El ocular amplia la imagen que ha sido Previamente aumentada mediante el objetivo. En general, el aumento aportado por el ocular es inferior al del objetivo. Es a través del ocular que el usuario observa Ia muestra. En funcién del numero de oculares se puede dstinguir entre microscopios monocuiares, binoculares e incluso trinoculares. La combinacion ce objetivo y ocular determina el aumento total del microscopio. Prisma éptico: Algunos microscopios incluyen también prismas en su interior para coregirla direcci6n de la uz. Por ejemplo. esto es imprescindible en el aso de los microscopios binoculares, donde un prisma divide el haz de luz proveniente del objetivo para dirigilo hacia dos oculares distintos. Tubo Revolver = Objetivo ebraro Platina Diafragma condensador zas Tornillo macrométrico Tomillo micrométrico Fi Base2.1.2.2 MICROSCOPIO ELECTRONICO EI microscopio electronico es un instrumento de gran utlidad en Ia investigacién cientifica gracias a su gran poder de aumento. Mediante este tipo de microscopic es posible aumentar imagenes de muestras hasta niveles muy supetiores alos del microscopio éptico. El principio de funcionamiento de un microscopio electrénico se basa en utilizar electrones en lugar de luz visible. La longitud de onda con la que se mueve un election es inversamente proporcional a su velocidad. Esto significa que si los electrones son acelerados a altas velocidades pueden obtenerse longitudes de onda muy cortas. Los microscopios épticos pueden clasificarse entre microscopios de luz transmitida y microscopios de luz reflejada. De un modo similar, dependiendo de la técnica utilzada en los microscopios electrénices, puede distinguirse enire microscopios electrénicos de transmisién y microscopios electrénicos de barrido. La ventaja principal de este tipo de microscopio es que puede obtenerse un nivel de aumento muy superior al del resto de microscopios. Sin embargo, es necesario preparar la muestra y colocarla en una camara de vacio de modo que no es posible observar muestras biolégicas vivas. 2.1.2.2.1 PARTES DEL MICROSCOPIO ELECTRONICO, Las partes principales de un microscopio electrénico inciuyen aquellos elementos utilzados para generar electrones y dirigirlos hacia la muestra. Esto incluye: > FUENTE DE ELECTRONES. Es equivalente a la fuente de luz en un microscopio éptico. En este caso es necesario disponer de un emisor de electrones. En general s@ utiliza un filamento de tungsteno. Este filamento es calentado de modo que la energia de sus dtomos y electrones aumenta. A partir de un cierto nivel energético los electrones poseen suficiente energia para escapar de sus Gtomos. Estos electrones libres son a continuacién dirigides hacia la muesira. > LENTES ELECTROMAGNETICAS Los microscopios épticos utilizan lentes convergentes y divergentes para desviar los rayos de luz y aumentar asila imagen de la muestra. Este mismo procedimiento no puede ser aplicado para desviar la trayectoria de los electrones. En lugar de utilzar lentes de vidrio, 10s microscopios electrénicos_ufilizan _ lentes electomagnéticas. Estas lentes generan campos eléctricos y magnéticos de modo que su interacci6n con los elecirones hace que sus trayectorios diverjan 0 converjan en un punto.> CAMARA DE VACIO. El procedimiento expuesto antetiomente debe llevarse a cabo dentro de una camara de vacio. De lo contrario, los electrones interactuarian con las moléculas del aire y no seria posible determinar sus trayectorias odecuadamente. La muesira que se observa debe colocarse también dentro de la cémara de vacio. Este es uno de los mofivos por el cual no es posiole observar muestras vivas con un microscopio electrénico. > DETECTOR (PANTALLA FLUORESCENTE) Una vez los electrones han impactado contra la muestra es necesario medir algun tipo de informacion para poder teconstruir la imagen de la muestra. Una opcion consiste en utiizar una pantalla fiuorescente. Esta pantalla reacciona de modo distinto segun cual sea el numero de electrones que impactan en ella. De este modo es posible detectar las zonas donde impactan mds © menos electrones y deducir asi la imagen de la muestra. A continuacién, la informacion capturada por la pantalla fiuorescente es fransmitida a un ordenador que puede asignar colores artificiales a la imagen obienida. En los microscopios épticos estos Componentes no son necesarios porque la luz proveniente de la muestra es directamente observada con el ojo humano. Dado que nuestros ojos no estan preparados para detectar electrones debemos incorporar este elemento detector en un microscopio elecirénico. eecmameccas Micres plo clectrémleo de transmasiin (MET) Microscopie ekectrénico de barrie (MEB)