TỔNG QUAN VỀ PYRANOSE OXIDASE ( POx)

( Ngọc )

1. Định nghĩa
- Pyranose oxidase (POx) là một enzyme oxidoreductase thuộc siêu họ glucose-
methanol-choline (GMC) của các enzyme oxidoreductase. Nó oxy hóa D-glucose
cũng như các chất nền monosacarit khác ở vị trí C2 trong khi khử oxy phân tử thành
hydro peroxide. POx có khả năng oxy hóa đường pyranose bằng cách chuyển đổi sự
chuyển hóa khử-oxi trên cầu C1 của vòng pyranose. Enzyme này sử dụng một ion
FAD+ làm chất tạo xúc tác để tách khỏi một electron và proton từ các đường
pyranose, tạo thành một sản phẩm chuyển hóa. Trong quá trình này, POx sản xuất các
sản phẩm phụ như hydrogen peroxide (H2O2) và các chất quang hóa.
- POx là một enzyme đơn lẻ, gồm 554-556 amino axit và có khối lượng phân tử khoảng
62-64 kDa. POx thường được tìm thấy trong nấm phân hủy gỗ, nơi nó được liên kết
ngoại bào với các túi liên kết màng hoặc các cấu trúc màng khác trong không gian
periplasmic của sợi nấm

Hình 1. Hai tiểu đơn vị của tetrameric pyranose oxidase từ Trametes ochracea
2. Cấu trúc của pyranose oxidase
- POxPyranose oxidase (POx) có hai miền liên kết quan trọng, đó là miền liên kết
flavin và miền liên kết chất nền.
 + Miền liên kết flavin của POx bao gồm các amino acid trong vùng gần flavin. Flavin
là một loại hợp chất hữu cơ có khả năng tham gia vào các quá trình oxy hóa khác
nhau. Miền liên kết flavin của POx chủ yếu tương tác với phân tử FAD (Flavin
adenine dinucleotide) được gắn trực tiếp vào protein. FAD có chức năng tạo thành
một bộ phận quan trọng của trung gian oxy hóa-reduction trong quá trình oxy hóa
đường pyranose. Khi phân tử FAD được tái tổ hợp sau quá trình oxy hóa, các miền
liên kết flavin cũng chịu trách nhiệm đóng vai trò quan trọng trong việc giúp flavin tái
tổ hợp với POx.
+ Miền liên kết chất nền của POx là khu vực trên protein tương tác với chất tạo xúc
tác, giúp tăng hiệu quả của quá trình oxy hóa. Chất tạo xúc tác có thể được hấp thu
bởi miền này và được chuyển tới miền liên kết flavin để tạo thành trung gian oxy hóa-
reduction. Các miền liên kết chất nền của POx thường được tìm thấy ở các amino
acid với tính chất hóa học khác nhau, như miền hydrophobic, miền acid, miền base và
miền đẩy điện tử bao gồm hai miền, miền liên kết flavin và miền liên kết chất nền.
Miền liên kết flavin chứa nếp gấp Rossmann kinh điển hoặc b ab mô típ liên kết thủy
triều mononucleo, và được bảo tồn cao trong suốt flavoprotein. Miền liên kết chất nền
cho thấy nhiều biến thể trình tự hơn, phản ánh sự ưu tiên đối với các chất nền
electron-nhà tài trợ khác nhau. Một POx nấm được hình thành bởi bốn monome giống
hệt nhau, mỗi monome chứa một dinucleotide flavinadenine (FAD) ở vị trí hoạt động
được liên kết cộng hóa trị với dư lượng histidine
- Cấu trúc tứ phân của POx nấm cho thấy một khoảng trống trung tâm lớn được kết nối
với cả bốn vị trí hoạt động riêng lẻ. Thông qua khoảng trống trung tâm này, các chất
nền có thể đi vào các vị trí hoạt động thông qua các kênh nền hẹp. Do đó, các vị trí
hoạt động trong POx bị chôn sâu trong cấu trúc tứ phân và bị cô lập với môi trường
xung quanh, và sự truy cập hạn chế này của vị trí hoạt động thông qua kênh chất nền
và khoảng trống dường như hạn chế hoạt động của POx đối với monosacarit.
 Hình2. Cận cảnh lối vào kênh dẫn vào khoảng trống bên trong của pyranose oxidase
từ Trametes ochracea

-
3. Nguồn gốc
- Pyranose oxidase (POx) có thể được tìm thấy trong một số loài nấm, bao gồm nấm
Peniophora gigantea, nấm Trametes multicolor, nấm Phanerochaete chrysosporium và
nấm Coprinopsis cinerea. Trong tự nhiên, POx được sản xuất bởi các nấm này để
phân hủy chất bổ sung và tạo năng lượng cho sự phát triển của chúng.
- Ngoài nấm, POx cũng được tìm thấy trong các loài vi khuẩn actinobacteria,
proteobacteria và trực khuẩn. Tuy nhiên trình tự POx được tìm thấy ở vi khuẩn chỉ có
nhận dạng trình tự từ 39–24% so với Pox tìm thấy ở nấm
- Một trình tự actinobacteria có liên quan chặt chẽ với POx nấm đã được chứng minh là
từ Kitasatospora aureofaciens (trước đây là Streptomyces aureofaciens). So sánh
 trình tự của K. aureofaciens POx (Ka POx) và từ Trametes ochracea (To POx), mà h
là POx nấm đặc trưng nhất cho đến nay, cho thấy nhận dạng trình tự là 38,7% và kết
quả khớp truy vấn là 545 trong số 623 dư lượng POx.
4. Cơ chế phản ứng
- Cơ chế phản ứng của pyranose oxidase (POx) được chia thành hai giai đoạn: giai
đoạn oxi hóa và giai đoạn khử.
➢ Trong giai đoạn oxi hóa, POx oxy hóa đường pyranose trong vòng bán kính
của flavin adenine dinucleotide (FAD) tạo thành 1,2-diketone và tạo ra ion
hydroperoxyl (HO2-) và ion hydroxyl (OH-). Quá trình này tạo ra một phức
hợp giữa POx và đường pyranose, với POx giữ vai trò như một chất chuyển
tiếp.
* Nửa phản ứng đầu tiên:
1. Đường pyranose (R-CHOH)n (n là số lượng đơn vị đường) tương tác với
phân tử flavin adenine dinucleotide (FAD) trong trung tâm hoạt động của
pyranose oxidase. Trong quá trình này, hai electron của đường pyranose được
chuyển đổi thành hai electron trong FAD, tạo ra FADH2.
2. FADH2 tiếp tục tương tác với phân tử O2 để tạo ra ion hydroperoxyl
(HO2•) và ion hydroxyl (OH-):
FADH2 + O2 -> FAD + HO2• + OH-
Trong phản ứng này, một electron của FADH2 được chuyển cho O2 để tạo
ra HO2•, trong khi electron còn lại được chuyển đến OH- để tạo ra FAD.
* Nửa phản ứng thứ hai:
3. Ion hydroperoxyl và ion hydroxyl được tách ra khỏi POx và đường
pyranose, tạo ra sản phẩm oxi hoá của đường pyranose và phức hợp tái tạo
POx.
R-CHOH^n + HO2• + OH- -> R-COOH + H2O2
Trong phản ứng này, HO2• và OH- tấn công vào liên kết C-H của đường
pyranose, tạo ra một cấu trúc trung gian tạm thời. Cấu trúc trung gian này tiếp
tục chuyển đổi và tạo ra sản phẩm oxi hoá của đường pyranose và H2O2.
 POx cũng bị hư hại trong quá trình này, nhưng nó có thể được tái tạo bằng
cách tương tác với FAD, tạo ra phức hợp POx-FAD. Phức hợp này sau đó
tương tác với electron truyền đến từ đường pyranose để tái tạo POx.

➢ Trong giai đoạn khử, các chất khử như hydrochinon hoặc các đơn vị sugar
như D-glucal và D-galactal có thể chuyển hóa FAD oxi hóa thành FADH2.
Quá trình này cho phép POx tái sinh và chuẩn bị cho các chu kỳ oxi hóa tiếp
theo.Cơ chế oxi hóa đường pyranose bằng POx được cho là thực hiện thông
qua quá trình điện tử, trong đó electron được truyền từ đường pyranose đến
FAD. Ngoài ra, cơ chế phản ứng của POx còn phụ thuộc vào các yếu tố khác
như pH, nhiệt độ và hàm lượng chất khử có mặt trong môi trường phản ứng.
- Chất nền cho electron ưa thích của POx được đánh giá từ các hằng số xúc tác là D-
glucose, được oxy hóa ở cả dạng a- và b-anomeric tạo ra glucose 2-keto D (2-
dehydro-D-glucose, D-arabino-hexopyranos-2-ulose) làm sản phẩm.

KẾT LUẬN
1. Những cải tiến đề xuất
- POx, mặc dù nó là một enzyme nấm, có thể dễ dàng biểu hiện và sản xuất trong vật
chủ vi khuẩn Escherichia coli với năng suất cao. Sự dễ dàng sản xuất tái tổ hợp này
trong hệ thống biểu hiện E. coli làm cho enzyme có thể sửa đổi các kỹ thuật khác
nhau của sinh học phân tử và có thể đóng vai trò làcơ sở cho một số phương pháp tiếp
cận để thiết kế POx hướng tới các đặc tính mong muốn.
- POx cho thấy phản ứng tốt đối với quinone và các ion kim loại phức tạp như FC +
hiện đang được sử dụng làm chất trung gian. Thiết kế protein hợp lý và bán hợp lý có
thể được sử dụng để tạo ra các biến thể e POx có khả năng phản ứng cao đối với các
chất trung gian thường được sử dụng trong các ứng dụng điện hóa sinh học và các
chất nền đường khác nhau để cải thiện hiệu suất của cảm biến sinh học dựa trên POx
hoặc BFC
 - POx đã được thiết kế theo hướng cải thiện hoạt động với D-galactose và ba biến thể
của To POx trong đó bốn đến sáu vị trí axit amin quan trọng đã được sửa đổi cho thấy
hoạt động được cải thiện đáng kể với galactose.
➢ Mặc dù các biến thể này là chất xúc tác sinh học hấp dẫn dựa trên các đặc tính
được cải thiện của chúng, chúng chưa được đánh giá cho các ứng dụng điện hóa
sinh học. Tuy nhiên, chúng cho thấy rõ tính khả thi của các phương pháp kỹ thuật
để điều chỉnh POx theo hướng và ứng dụng chống đỡ mong muốn.
- Ngoài các tính chất động học của enzyme, tính ổn định của chúng được quan tâm
cao đối với các khía cạnh ứng dụng khác nhau. Tùy thuộc vào nguồn enzyme, POx
cho thấy độ ổn định nhiệt từ trung bình đến tốt như được chỉ ra bởirature tempe
nóng chảy T m. Tính khả thi của kỹ thuật enzy me một lần nữa được chứng minh là
cải thiện độ ổn định nhiệt của Pox
- Có lẽ tiềm năng đáng kể nhất cho các ứng dụng và cải tiến trong tương lai có thể
được tìm thấy trong sự đa dạng của các oxidase pyranose nấm và vi khuẩn khác
nhau. POx hiển thị một phân bố phân loại rộng rãi và nó cũng cho thấy một lev el
đặc biệt caocủa biến đổi trình tự khi so sánh với các oxidoreductase GMC khác
2. Những thành tựu nghiên cứu
1. Nghiên cứu "Pyranose oxidase from Trametes multicolor mediates selective C-2
or C-3 oxidation and ring-opening reactions" tập trung vào tính chọn lọc của POx
trong việc oxi hóa các đường đơn nguyên (monosaccharides) có cấu trúc khác nhau.
Nghiên cứu cho thấy POx từ Trametes multicolor có khả năng oxi hóa chọn lọc tại
vị trí C-2 hoặc C-3 trên nhóm hydroxyl của đường đơn nguyên và có thể gây ra các
phản ứng mở vòng (ring-opening reactions) trên một số đường đơn nguyên. Các tác
giả đề xuất rằng POx có thể được ứng dụng trong việc tổng hợp các sản phẩm hữu
cơ và trong công nghiệp thực phẩm.
2. Nghiên cứu "Influence of immobilization methods on pyranose oxidase
properties for lactose oxidation" tập trung vào tối ưu hóa điều kiện bền và hoạt
động của POx trong quá trình oxi hóa lactose. Nghiên cứu cho thấy POx có thể
được định vị bằng các phương pháp liên kết (immobilization) khác nhau để tăng
cường tính bền và hoạt động của enzyme trong quá trình oxi hóa lactose. Các tác
 giả đề xuất rằng POx có thể được sử dụng trong công nghiệp sữa và sản xuất các
sản phẩm chất lượng cao từ lactose.
3. Nghiên cứu "Characterization of a pyranose oxidase from the white-rot fungus
Pycnoporus sanguineus and application in lignocellulose bioconversion" tập trung
vào đặc tính và ứng dụng của POx từ nấm Pycnoporus sanguineus trong quá trình
chuyển đổi sinh học lignocellulose. Nghiên cứu cho thấy POx từ P. sanguineus có
tính năng oxi hóa cao và độ ổn định tốt ở nhiệt độ và pH cao. Các tác giả đã sử
dụng POx để cải thiện quá trình chuyển đổi sinh học lignocellulose và cho thấy
POx có tiềm năng trong ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm hóa
học từ lignocellulose.
- Bên cạnh đó còn có một số nghiên cứu đã được công bố khác như :
➢ Một nghiên cứu được công bố trong tạp chí ACS Catalysis vào năm 2017 đã sử
dụng pyranose oxidase để sản xuất các hợp chất sinh học có giá trị như đường nồng
độ cao và các chất đồng phân. Nghiên cứu này đã chứng minh tính khả thi của
phương pháp sử dụng pyranose oxidase để sản xuất các sản phẩm sinh học có giá trị
thay vì sử dụng các quy trình hóa học truyền thống.
➢ Một nghiên cứu được công bố trong tạp chí Food Chemistry vào năm 2019 đã sử
dụng pyranose oxidase để cải thiện chất lượng rượu vang. Nghiên cứu này đã
chứng minh rằng pyranose oxidase có thể được sử dụng để loại bỏ tạp chất trong
rượu vang và cải thiện hương vị và mùi vị của sản phẩm.
➢ Một nghiên cứu được công bố trong tạp chí Journal of Agricultural and Food
Chemistry vào năm 2020 đã sử dụng pyranose oxidase để sản xuất các sản phẩm từ
tinh bột như maltose, maltotriose và dextrin. Nghiên cứu này đã chứng minh tính
khả thi của phương pháp sử dụng pyranose oxidase để sản xuất các sản phẩm từ
tinh bột một cách hiệu quả và bền vững.