ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT SẢN XUẤT

HỢP CHẤT THỨ CẤP

1. Hợp chất thứ cấp – Ngọc
1.1. Khái niệm
1.2. Phân loại
1.3. Vai trò
2. Tổng quan về Taxol – Duy
2.1. Lịch sử
2.2. Khái niệm
2.3. Cơ chế
3. Quy trình tạo và chiết xuất Taxol – Trang, Hải
4. Kết quả - Diệp
5. Kết luận
3.1. Nguyên liệu thực vật khử trùng
Các lá non khỏe mạnh (các đoạn từ 1-2 cm) được thu thập từ cây Taxus baccata
(thủy tùng Anh) được sử dụng làm mẫu cấy. Các mẫu được rửa kỹ bằng vòi nước chảy
trong 30 phút. Sau đó, chúng được khử trùng bề mặt bằng cách xử lý các phương pháp
biến đổi bao gồm 70 % ethanol trong 1 phút và 1,5 % (v/v) natri hypochlorite trong 15
phút. Các mẫu cuối cùng được rửa ba lần bằng nước cất hai lần vô trùng để loại bỏ bất
kỳ dấu vết nào của chất hoạt động bề mặt. Sau đó, chúng được nuôi cấy trên môi
trường cơ sở là MS trung bình và được giữ trong hai tuần ở 25 ± 2 0C trong chu kỳ
quang 16 giờ với cường độ ánh sáng 3000 lux. Sau đó tiến hành theo dõi mẫu cấy và
loại những mẫu nhiễm, mẫu còn sống và vô trùng được chuyển sang môi trường có
chứa chất kích thích để cảm ứng tạo callus.
3.2. Cảm ứng mô sẹo
Các mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường MS đặc được bổ sung 2 mg/L axit
2,4 - dichlorophenoxyacetic (2,4-D), 1 mg/L axit axetic naphthalene (NAA) và 2 g/L
than hoạt tính. Nuôi cấy được duy trì trong bóng tối ở 25 ± 2 °C. Tỷ lệ tạo mô sẹo,
trọng lượng tươi của mô sẹo (FW) và trọng lượng khô của mô sẹo (DW) được ghi
nhận 4 tuần sau khi nuôi cấy. Mô sẹo được tạo ra thành công được tách ra khỏi mẫu
cấy và nuôi cấy riêng biệt cho đến khi được sử dụng để thiết lập huyền phù tế bào.
3.3. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào được bắt đầu bằng cách áp dụng một phương pháp
cải tiến bao gồm chuyển mô sẹo từ môi trường cảm ứng mô sẹo được xử lý tốt nhất
(80 -100 mg) sang bình nón 50 mL chứa 15 mL môi trường MS lỏng được bổ sung 2
mg/L 2,4 -D, 1 mg/L NAA. Nuôi cấy huyền phù được ủ trên máy lắc quay ở tốc độ
120 vòng/phút và 25 ± 2 °C trong chu kỳ quang 16 -h với cường độ ánh sáng 3000
lux. Trước khi hấp khử trùng (121°C, 20 phút), tất cả môi trường được điều chỉnh về
pH = 5,6-5,8.
3.4. Kích thích nuôi cấy huyền phù tế bào
Hai chất kích thích bao gồm phức hợp axit amin (dạng lỏng, Công ty
INAGROSA, Tây Ban Nha) và chitosan (Sigma, 85 % deacetylate d) đã được sử dụng
để nghiên cứu tác dụng kích thích sản xuất Taxol bằng nuôi cấy huyền phù tế bào của
T. Baccata
 Sự khơi gợi (kích thích) được áp dụng vào ngày 21 sau khi cấy, khi các tế bào
nuôi cấy đang ở giữa giai đoạn tăng trưởng nhanh. Để xác định nồng độ elicitor hiệu
quả nhất để tạo ra Taxol, cả hai chất elicitor được thêm vào môi trường nuôi cấy ở
nồng độ 10 mg/L đối với chitosan và 0,1 và 2 ml/L đối với phức hợp axit amin riêng lẻ
và kết hợp.
Các mẫu được lấy sau 72 giờ sau khi thêm elicitor. Sinh khối tế bào được đông khô và
sử dụng để chiết xuất alkaloid.
Điều đáng nói là phức hợp acid amin bao gồm 19 acid amin tự do này với nồng
độ của chúng (w/w %) được đề cập dưới đây: glycine (1,8 %), valin (5,1 %), proline
(8,4 %), alanine (13,21 %), axit aspartic (4,5 %), arginine (8,4 %), axit glutamic (0,9
%), lysine (5,1 %), leucine (16,51 %), isoleucine (4,5 %), phenylalanine (5,1 %),
methionine (4,2 %), serine (3,9 %), threonine (3 %), histidine (3 % ), glycocoll (9,6
%), tyrosine (1,5 %), glutamine (0,9 %), cystein (0,3 %), khác (0,08%).