REPLICAREA SEMICONSERVATIVĂ

A ADN (sinteza ADN)

REPLICAREA SEMICONSERVATIVA A ADN
 Pentru ca informatia genetica sa fie transmisa de la parinti la descendenti, materialul genetic trebuie
copiat.

Procesul de sinteza a ADN se mai numeste si REPLICARE (to replicate = a copia).

 Are loc in interfaza ciclului celular cand se produce dublarea cantităţii de ADN (in faza de sinteza)
cantitate care apoi revine la normal în urma diviziunii celulare.

 Dublarea cantităţii de ADN se bazează pe complementaritatea structural-funcţională a celor două

catene ADN.

 In timpul acestui proces, numit “Replicarea ADN”, cele două catene ADN servesc fiecare drept model
sau matriţă pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte REPLICĂ.
 Moleculele de ADN nou formate vor avea fiecare o
catena veche, care a servit drept matrita, si o catena
nou sintetizata.

 ACEST MOD DE REPLICARE SE NUMESTE

REPLICARE SEMICONSERVATIVA - deoarece
fiecare dintre catenele originale rămâne intactă
(conservată).

 În final se formează două molecule identice de

ADN bicatenar. Astfel, molecula de ADN este
replicata in asa fel incat ambele copii contin
aceeasi informatie (aceleasi secvente de baze) ca
in molecula originala.
 Experimentul Meselson și Stahl
Caracterul semiconservativ al replicării ADN la bacterii a fost demonstrat de Meselson şi Stahl (1958).

Ei eu dezvoltat o metoda experimentala pentru a deosebi catenele fiice nou sintetizate de cele parentale cu
ajutorul tehnicilor de separare a moleculelor de ADN, în funcţie de densitatea lor (prin centrifugare în
gradient de clorură de cesiu).

• Initial, ei au cultivat bacteria E. coli pe un mediu de cultură în care sursa unică de azot, clorura de amoniu
(NH4Cl), NU conţine azotul normal 14N ci izotopul greu al acestuia 15N.

• Dupa mai multe generaţii de cultura pe un astfel de mediu a rezultat o populatie celulara in care toate
moleculele de ADN contineau incorporat 15N in bazele azotate.

• La fiecare generatie (incepand cu generatia “0”) bacteriile erau trecute pe mediu normal, cu 14N.

• Dupa multiplicare, bacteriile contineau pe langa molecule de ADN originale, cu 15N incorporat, si
molecule de ADN nou sintetizate, cu 14N.

• Analizand densitatea de ADN prin centrifugare in gradient de CsCl, s-a constatat ca ADN replicat avea o
densitate intermediara intre 14N si 15N.
Reprezentarea schematică a experimentului lui Meselson şi Stahl de demonstrare a modelului de replicare semiconservativa a ADN
• Prin ultracentrifugarea ADN izolat de la ambele tipuri de bacterii (de la cele cultivate pe mediu
cu 14N şi respectiv de la cele cultivate pe mediu cu 15N) s-a evidenţiat prezenţa a mai multor tipuri
de ADN care sedimentează (formează benzi compacte) în tubul de centrifugă la niveluri diferite sub
forma unor benzi:
 Daca ambele catene ADN contin 15N, apare o bandă “grea”, spre baza tubului de centrifugă
(densitate mare);
 Daca ambele catene ADN contin 14N, apare o bandă “uşoară”, dispusă mai spre vârful tubului
(densitate mica).
 Daca una dintre catenele ADN contine 14N iar cealalta 15N (densitate intermediara), apare o banda
intermediara.
• Celulele bacteriene care au desfăşurat un singur ciclu de diviziune prezintă un model de
bandare intermediar între cele ce au crescut pe mediu cu izotopul greu şi cele ce au crescut pe
mediu cu izotopul uşor al azotului.
• De aici s-a tras concluzia că acest ADN este un hibrid, având catena matriţă grea, iar replica
conţine izotopul uşor.
• Aceasta a fost prima dovadă experimentală la nivel molecular a modelului semiconservativ de
replicare a ADN
• La eucariote -prin aplicarea aceleiaşi metode de marcare a ADN - a permis evidenţierea
faptului că, după o rundă de replicare în prezenţa timidinei radioactive, fiecare moleculă de
ADN rezultată este alcătuită dintr-o catenă polinucleotidică radioactivă şi o alta neradioactivă.
• Dacă celulele eucariote sunt lăsate să realizeze încă o rundă de replicare în absenţa timidinei
marcate, celulele rezultate vor conţine două tipuri de molecule de ADN:
 unele molecule vor fi “hibride” (cu o catenă radioactivă şi cealaltă neradioactivă), iar
 alte molecule vor avea ambele catene neradioactive.
• Toate aceste rezultate experimentale indică faptul că, atât la procariote cât şi la eucariote,
replicare a ADN cromozomal este de tip semiconservativ.
Sinteza de noi molecule de ADN se realizează printr-un sistem de copiere unic în lumea macromoleculelor;
Replicarea este un proces caracteristic numai acizilor nucleici.
Structura acizilor nucleici este foarte potrivită pentru realizarea replicării lor: astfel dintr-o moleculă rezultă două
molecule fiice, identice între ele şi totodată, identice cu molecula iniţială.
Se asigură astfel:
reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor si
dublarea cantităţii de informaţie genetică (respectiv multiplicarea sistemelor biologice).
Cantitatea dublată de material genetic este repartizată în mod echilibrat, prin procesul diviziunii celulare, la cele
două celule fiice.
• Pentru ca procesul de replicare sa aiba loc sunt necesare cel putin trei grupuri majore de componente:
1. O matriţă de ADN monocatenar;
2. Nucleotide - sub forma de trifosfati (dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) care urmează să fie asamblate într-o nouă
catenă polinucleotidică;
3. Enzime și alte proteine care "citesc" catena matriţă și asamblează nucleotidele într-o moleculă nou sintetizată de
ADN.
In general, sinteza ADN dupa modelul semiconservativ se realizeaza astfel:
 Procesul este initiat la nivelul unei secvente specifice numita originea replicarii.
 intai are loc ruperea legaturilor de H2 dintre cele 2 lanturi polinucleotidice de catre helicaza
 ruperea se continua de-a lungul macromoleculei asemanator cu desfacerea unui fermoar;
 In acelasi timp are loc o derulare a catenelor polinucleotidice, fiecare catena rotindu-se in plan exterior in jurul
radicalilor fosforici;
 separarea si desfasurarea moleculei initiale determina formarea unei structuri asemanatoare literei Y numita furca de
replicare.
• Catenele noi sunt sintetizate concomitent in ambele directii (proces bidirectional).
ENZIME ASOCIATE PROCESULUI DE REPLICARE

• La procesul de replicare a ADN participă numeroase enzime care constituie un adevărat "aparat de replicare"
denumit replisom. O importanta deosebita in procesul de replicare il au ADN polimerazele:

•  La bacterii - ADN-polimerazele I, II si III (Pol I, Pol II si Pol III);

•  La eucariote - ADN polimeraza α.

• Aceste enzime polimerizeaza legarea nucleotidelor, iar cele mai multe dintre ele poseda si o activitate
nucleazica prin care taie legaturile fosfodiesterice dintre glucid- radical fosfat ale lantului polinucleotidic.
Enzimele Pol I si Pol III de la E.coli au activitate exonucleazica la capatul 3’.

• Alte ADN polimeraze au numai activitate nucleazica si sunt de 2 tipuri:

• 1. Exonucleaze – care pot numai sa indeparteze o nucleotida de la un capat al lantului polinucleotidic;

• 2. Endonucleaze- care rup legaturile dintre lanturile polinucleotidice.

• Cele mai bine studiate ADN polimeraze sunt cele de la E. coli, care are cel puțin cinci polimeraze ADN diferite.

• Două dintre acestea, ADN POLIMERAZA I ȘI ADN POLIMERAZA III, efectuează sinteza ADN asociată cu
replicarea; celelalte trei au funcții specializate în repararea ADN.

• TOATE ADN-POLIMERAZELE DE LA E. COLI AU URMATOARELE PROPRIETATI:

• 1. Sintetizeaza orice secvență de nucleotide specificată de catena matrita;

• 2. Sintetizează în direcția 5’→3’ prin adăugarea de nucleotide la o grupă 3-OH;

• 3. Utilizeaza nucleotide sub forma de trifosfati (dNTP-uri) pentru sinteza noii catene de ADN;

• 4. Necesită un PRIMER (un mic segment de ARN) pentru inițierea sintezei;

• 5. Catalizează, pe catena in creștere, formarea unei legături fosfodiesteice prin legarea grupului 5 fosfat al
unei nucleotidei cu grupa 3-OH a nucleotidei precedente;

• 6. Produc sinteza de catene noi care sunt complementare și antiparalerale față de catenele matrita; și

• 7. Sunt asociate cu un număr de alte proteine.

 Enzime Functii in replicarea ADN
Helicaza (1) Rupe legăturile de hidrogen dintre cele doua catene si
distorsionează moleculele de ADN la nivelul bifurcaţiei de
replicare (deschide dublul helix);
Giraza (2) Relaxează zonele suprahelicale (suprarăsucirile pozitive)
care se produc dupa ce se separa cele două catene de ADN
dublu-helical.
Proteine de legare la Stabilizează bifurcaţia de replicare prin asocierea la cele
ADN monocatenar două catene de ADN separate, prevenind reatasarea lor
(SSB) (2)
Secventa scurta de nucleotide care se ataseaza (prin
ARN primer (4) legaturi de hidrogen) la catena matriţă pentru a iniţia
replicarea ADN
Rcunoaşte secvenţa ori şi determină sinteza ARN primer
Primaza (5)
Este esenţială pentru replicare dar numai în prezenţa unui
ADN polimeraza III (6) primer ARN; poate adauga noile nucleotide numai la
capătul 3’ al catenei în creștere; sensul polimerizării este
5’→3’
ADN polimeraza II Umple golurile dintre fragmentele de ADN sintetizate
discontinuu.
ADN polimeraza I (7) Elimina ARN primer si umple golurilor rămase cu
nucleotide ADN corespunzatoare
Fragmente Okazaki (8) Fragmente nucleotidice intermediare scurte sintetizate
discontinuu pe catena in intarziere
Ligaza (9) Leaga fragmentele de ADN asigurând continuitatea
moleculei
Topoizomeraze (I si II) Determină suprarăsuciri sau relaxări ale moleculei de ADN;
• La eucariote - aparatul enzimatic necesar replicării ADN este şi mai complex, existând ADN polimeraze
nucleare, cloroplastice sau mitocondriale :
 ADN-polimeraza α se găseşte numai în nucleu şi este implicată în iniţierea procesului de sinteză a ADN;
 ADN-polimeraza β, localizată atât în nucleu cât şi în citoplasmă, la nivelul organitelor celulare, are funcţii
reparatorii;
 ADN-polimeraza δ este localizată în nucleu şi este implicată în sinteza catenei în avans la nivelul
bifurcaţiei de replicare. Enzima are şi activitate exonucleazică de tip 3'→ 5', participând astfel şi la
procesul reparator;
 ADN-polimeraza ε localizată tot în nucleu are funcţii multiple: realizează sinteza catenei în întârziere în
cursul replicării; are funcţii reparatorii, de recombinare şi poate exercita activitate exonucleazică de
tip 3’→5’.
• Ca şi polimerazele bacteriene, cele de la eucariote necesită ARN primer pentru a declanşa sinteza ADN,
sensul polimerizării fiind intotdeauna acelaşi: 5’→3’ - ceea ce înseamnă că noile nucleotide sunt adăugate
întotdeauna la capătul 3’ al catenei în creștere.
MECANISMUL MOLECULAR AL REPLICĂRII ADN

• Mecanismul de replicare a ADN a fost prezentat de Watson şi Crick în 1953:

 În procesul de replicare are loc despiralizarea dublului helix, urmată de separarea progresivă a celor două
catene complementare (după modelul de deschidere a unui fermoar).
 Acestea devin independente si servesc fiecare ca matrita pentru sinteza unui lant polinucleotidic complementar.

In citoplasma se afla nucleotide diferite care au fost sintetizate in celula si care contin cele 4 baze:
adenina, guanina, citozina si timina;

Tinandu-se seama de corespondenta care trebuie sa existe intre bazele purinice si pirimidinice, o
nucleotida care contine adenina se va lega prin punti de H2 cu o nucleotida ce contine timina, iar una
care contine guanina se va lega cu una ce contine citozina;

In felul acesta are loc replicarea macromoleculelor de ADN, fiecare molecula fiica fiind formata
dintr-o catena veche si una noua.
ETAPELE REPLICARII

Atat la procariote cat si la eucariote replicarea are loc în trei etape majore:

• iniţierea replicării,

• alungirea catenelor de ADN şi

• terminarea sintezei.
In 1963 Jacob, Brenner şi Cuzin au enunţat ideea funcţionării cromosomului bacterian ca unitate de
replicare pe care au denumit-o replicon.

Ulterior noţiunea de replicon, prin care se înţelege secvenţa de ADN la nivelul căreia se desfăşoară
un proces individual de replicare (cu cele trei etape distincte), s-a extins asupra tuturor elementelor
genetice capabile de replicare autonomă.
 1. Iniţierea procesului de replicare
• Replicarea începe la nivelul regiunii ori şi constă în recunoaşterea acesteia de către factorii de iniţiere.
• La procariote (bacterii) cromozomul prezintă o singură regiune de origine a replicării, oriC, deci un singur
replicon,
• La eucariote, unde cromozomii sunt reprezentaţi de molecule lineare de ADN numărul originilor de replicare
este mult mai mare.
La nivelul regiunii ori unde dublul helix de ADN suferă un proces local de denaturare şi despiralizare catalizat de
enzima helicază – care taie legaturile de hidrogen dintre cele 2 catene.
 Factorii de initiere (proteine inițiator) se leagă de oriC și provoacă o scurtă incizie in molecula de ADN in
care are loc un proces de derulare.
 Această derulare permite helicazei și altor proteine (proteine de legare la ADN monocatenar; SSB „single-
strand DNA-binding proteins”) să se atașeze la cele două catene de ADN.
• Proteinele de legare la ADN monocatenar (SSB) stabilizează bifurcaţia de replicare, obligatorie pentru realizarea
biosintezei ADN.
• In absenţa proteinelor SSB, cele două catene de ADN ar interacţiona între ele prin formarea de legături de
hidrogen între nucleotidele complementare intercatenare sau intracatenare.
• Despiralizarea ADN dintr-o regiune a macromoleculei circulare de ADN este obligatoriu urmată de un proces de
supraspiralizare într-o altă regiune a ADN.

• Pentru ca procesul de replicare să se desfăşoare normal, suprarăsucirile pozitive trebuie eliminate, fenomenul fiind
catalizat de giraze.
• O altă familie de enzime, topoizomerazele de tip I, relaxează constrângerile structurale printr-un mecanism diferit.
• După ce procesul de replicare a început procesul de despiralizare şi de formare a
unor suprarăsuciri negative a ADN continuă şi dincolo de regiunea ori, fenomenul
realizându-se în ambele direcţii (bidirecţional).
• Rezultatul procesului de despiralizare şi denaturare localizată este formarea unei
regiuni de ADN monocatenar, în care cele două catene vor servi drept matriţă pentru
replicare.

• Separarea celor două catene la nivelul originii replicării determină formarea unei
“bifurcaţii de replicare” (“replication fork”) sau punctul de creştere al ADN, zona de
înaintare a replicării pe cromozom
• Furca de replicare este o structura asimetrica din cauza ca cele 2 catene au
sensuri diferite datorită polarităţii diferite a celor două catene.
Natura lor antiparalelă face ca una din catene să aibă o extremitate 3'–OH, iar
cealaltă una 5'–P.
 La nivelul bifurcaţiei de replicare se găsesc şi enzimele ce declanşează sinteza noilor catene de ADN:

ARN polimeraza (primaza) şi ADN polimeraza III (în cazul E.coli)

• ADN polimeraza poate cataliza sinteza diferitelor tipuri de ADN celular dar trăsătura caracteristică a

bifurcaţiei de replicare, formată la nivelul regiunii ori, nu este ADN polimeraza ci un complex proteic

macromolecular denumit primosom.

• ARN polimeraza (primaza) recunoaşte secvenţa ori şi determină sinteza unei scurte secvenţe

oligonucleotidice ARN (ARN primer) în sensul 5’→3’.

Capătul 3’-OH al primerului este apoi recunoscut de ADN-polimerază care adaugă deoxiribonucleotidele

corespunzătoare în sensul 5’→3’.

 2. Creşterea (alungirea) moleculei de ADN

• ADN–polimeraza nu poate copia, în mod continuu, decât una din catene, pe cea care are orientarea 3'→5', care
a fost denumită catena în avans (“leading chain”), sinteza noii catene facandu-se in directia 5'→3' .

• Replicarea celeilalte catene trebuie făcută în sens invers faţă de direcţia de înaintare a bifurcaţiei de
replicare.

• De aceea, o altă moleculă de ADN polimerază trebuie să aştepte ca bifurcaţia de replicare să fie suficient de
lungă înainte de a-şi începe activitatea în sens opus (la nivelul unui nou primer sintetizat tot de primază).

• Sinteza noii catene, complementară catenei matriţă şi orientată în direcţia 5'→3' se face deci discontinuu şi
în întârziere faţă de catena “leading”, motiv pentru care ea se mai numeşte catenă în întârziere (“lagging
chain)”.

• In 1968, Okazaki şi colab. au demonstrat că sinteza catenei în întârziere se realizează discontinuu, sub forma
unor fragmente nucleotidice intermediare scurte, care au fost numite fragmente Okazaki
 3. Terminarea procesului de replicare

• Terminarea replicării se realizează, de obicei, la nivelul unui punct fix în replicarea bidirecţională.

Procesul de încheiere a replicării este însoţit de mai multe evenimente:

• eliminarea ARN primer sub acţiunea RN-azei H sau a unor exonucleaze (de exemplu, ADN-
polimeraza I care are funcţie exonucleazică 5’→3’ şi 3’→5’);

• “umplerea” breşelor rămase prin eliminarea ARN primer sub acţiunea unor ADN-polimeraze cu
funcţii reparatorii;

• fragmentele Okazaki sunt sudate de către ligază.

• ADN ligaza catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice dintre extremitatea 3’OH a unui fragment
Okazaki şi cea 5’ P a fragmentului următor, procesul realizându-se cu consum energetic.

La majoritatea procariotelor şi eucariotelor, energia este furnizată de ATP.

Controlul calității replicarii și repararea
•- secvențele complementare pot avea uneori o eroare în ele; polimeraza ADN I și polimeraza ADN III

acționează ca factori de control al calității; Ei corectează noile catene sintetizate

• - Când apare o greșeală, enzima funcționează ca o exonuclează,
• Enzimele elimină nucleotida asociata incorect, îl și adaugă una noua.