TP Nº 12

Técnicas de biología molecular son todas las técnicas de laboratorio que se utilizan para
caracterizar, aislar y manipular los componentes moleculares de las células y organismos.

Electroforesis
Método estándar de separación de partículas que involucra el movimiento de moléculas cargadas
en un campo eléctrico.
Principio fundamental

 Gel de Agarosa Gel de poliacrilamida

 ADN, ARN, y proteínas pueden ser separadas un campo eléctrico.
 La electroforesis de ADN puede ser con poliacrilamida (entre 5 y 500 pb) o agarosa
(entre 200 y 50.000 pb).
 El ADN tiene carga negativa, en un campo eléctrico y a pH neutro migran hacia el ánodo
(polo positivo).

 El ADN están cargados negativamente (-), y migra hacia el polo (+)

 Los fragmentos de ADN pueden ser visualizados con BrEt o SYBR bajo luz uv.
 Los fragmentos más largos tienen más nucleótidos (tienen peso molecular mayor,
tienen mayor tamaño, migran menos)
 Los fragmentos más cortos pueden migrar más lejos a lo largo del gel
 El tamaño de la muestra puede ser estimado con un marcador de peso molécula.
Factores que afectan la velocidad de migración de los ácidos
nucleicos:
 Presencia de agentes intercalantes (Bromuro de etidio).
 Peso molecular del fragmento.
 Concentración de agarosa.
 Conformación del ADN (circular, lineal, superenrrollado).
 Intensidad del voltaje aplicado en la corrida electroforética, composición del buffer de
electroforesis.

Extracción de DNA y RNA

Por regla general los protocolos para lograr la extracción de DNA genómico y/o RNA siguen el
siguiente esquema:
1. Rotura del tejido y de la pared celular (en plantas)
2. Homogenización de la muestra en presencia de agentes que faciliten la ruptura de la estructura
celular (por lo general detergentes como SDS, Tritón x-100, CTAB, etc.)
3. Separación de los restos celulares de DNA y polisacáridos con solventes orgánicos (fenol,
cloroformo) Cátedra de Genética Guía de Trabajos Prácticos 60
4. Precipitación del DNA en presencia de una sal y alcohol.
5. Elución del DNA en una solución acuosa (Agua o Buffer TE).
A la hora de extraer RNA de un material biológico hay que procurar eliminar rápidamente las
RNAsas que están presentes en el material de partida con soluciones desnaturalizantes en el
tampón de extracción y a partir de ese momento evitar que se introduzcan nuevas RNAsas
procedentes de nosotros mismos o presentes en las soluciones que empleemos.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR - Polymerase Chain Reaction) es utilizada para
amplificar DNA comprendido entre dos regiones de secuencias conocidas. Dos oligonucleótidos
son utilizados como cebadores o “primers” para una serie de reacciones de síntesis catalizadas
por una DNA polimerasa. Estos oligonucleótidos típicamente poseen secuencias diferentes y son
complementarias a la secuencia que se encuentra en las hebras antiparalelas del DNA y que
flanquean la región que será amplificada.
Pasos:
El templado de DNA (DNA molde) es primeramente desnaturalizado por calentamiento en
presencia de un exceso de cebadores y los cuatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Posteriormente esta mezcla se enfría a una temperatura que permite a los cebadores aparearse con
sus secuencias complementarias en el templado. Por último, se produce la extensión de los
cebadores mediante una DNA polimerasa.