o- Universitat de Barcelona Bases moleculares de las alteraciones del tejido adiposo y cambios metabdlicos asociados al sindrome lipodistréfico en pacientes infectados por HIV-1 José Miguel Gallego Escuredo ADVERTIMENT. La consuita ¢'aqueste tesi quede condicionada e racceptacé de las ceguents condicions d's: La ctusio aquest tes per mté del servei TOX (www.tdx.cat) ha estat autorizade pes ftlars des drets de propietat intellectual Gricament per a uses prvats emmarcais en acivitats dinvestoscio | docéncia. No sautorize la seve reproduccié amb Tialtals de lucre ni seva citusé | posada a cisposicié des @'un loc alle al servei TOX. No s aulortza la preseniaco cel ‘seu coningul en Una finest o mare ali @ TDX (aming) Aquesta reserva de dets afeca tant alresum de presen Ge a esi com als seus continguls. En la utltzacb 0 ca de pats de ia esl s oblgat indica el nom de fz persona autora ADVERTENCIA. La consulta do esta tosic quoda conéicionada a la aceptacin do les siguiontas condiciones do uso: La Gucion de asta tls por medio del servcio TDR (wava.tdx.cat) ha cido autoriada poros tiares do los dorocnos do propieded inelectual Unicamerte pare usos privados enmarcados en actividades de invesiigacén y docencia No se utoiza su regreduccion con fnaidades de lucto ni su difusén y oueste a dspesicion desde un sito aleno el servicio ‘TDR No se autotza la preseniacion de su contenido en une venigna o metco aleno a TOR raming). Este ceserva de cerecnos afecia tanto al resumen de presentacin dela less como a sus conienidos. En i ullzacin 0 cla Ge pares 2 Ta tests es oblgado indicat el nompre de fa persona autora WARNING. On having concuited this thesis you're accepting tho following uso conditions: Spreading tic thasis by tho “TDX (wrwactdx.cat] sence hes been sutnorzed bythe ila ofthe intelectual property ight only for private uses placed in fvestigaton and eeching activites. 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Inthe using or claton of parts of he hess I's obliged fo cate Ihe name of he authorUNIVERSFIAL DE BARCELONA Bases moleculares de las alteraciones del tejido adiposo y cambios metabdlicos asociados al sindrome lipodistrofico en pacientes infectados por HIV-1 JOSE MIGUEL GALLEGO ESCUREDO, 2012UNIVERSIDAD DE BARCELONA Departamento de Bioquimica i Biologia Molecular Facultad de Biologia Programa de doctorado de Biomedicina Bases moleculares de las alteraciones del tejido adiposo y cambios metabdlicos asociados al sindrome lipodistrofico en pacientes infectados por HIV-1 MEMORIA PRESENTADA POR JOSE MIGUEL GALLEGO ESCUREDO PARA OPTAR AL TITULO DE DOCTOR POR LA UNIVERSIDAD DE BARCELONA FIRMA DE LOS DIRECTORES Francesc Villarroya Gombau Marta Giralt OmsPara mis padres y Veronique. Gracias por estar siempre ahi.El tiempo ha pasado volando (y desgraciadamente parece que se confirma lo ue dicen los que van por delante, ya que tengo le sensacién de que cada vez va mas répido), Parece que fue hace unas pocas semanas 0 pocos meses cuando llegué a este laboratorio siendo un pardillo (por decirlo de alguna manera), sin ninguna idea muy clara y con ese tufillo que atin desprende la adolescencia que no acaba de terminar, que imaginariamente te sitéa més al centro y mas alto de lo que realmente estés. Parece que no fue hace tanto cuando era el mas nuevo de todos y hoy, dos rodillas menos ,unas largas obras, una boda y algtin viaje después entre otras cosas, soy de los ‘que més tiempo lleva en el laboratorio. Durante este tiempo he aprendido muchas cosas, tanto dentro como fuera, no quiero ser muy pesado con los agradecimientos ividualizéndolos para hacerlos mas graciosos, creo que ya nos hemos reido bastante en todos estos aftos, y ademas es mejor que nos quedemos con todo eso como recuerdo, mas que con una hoja escrita deprisa-y-corriendo para poder llevar la tesis a imprimir y poder depositarla a tiempo. Seria como cuando te dicen que cuentes el chiste ese de nosequé, y todo el mundo clava la mirada en ti y notas las expectativas tocando el limite més alto, y en ese preciso momento sabes que el chiste ya no va a hacer gracia y se ve @ producir un incomodisimo silencio cuando acabes, pues més o menos eso es lo que no quiero que pase con los agradecimientos. Simplemente quiero aprovechar estas breves lineas para daros las gracias a todos, los que estais y los que habéis estado porque todos me habéis ayudado de una manera u otra, sobre todo los que més tiempo hemos pasado juntos, y espero haberos servido de ayuda o lo que sea en alin momento. Gracias a todos, de verdad. Pero sobre todo, quiero agradeceros @ Marta y Francesc, que me dierais la oportunidad de venir a este grupo, que me hayéis ayudado tanto en estos afios. Muches gracias!CONTENIDO10Este tesis doctoral se estructura segiin la normativa vigente para les tesis con formeto “por articulos” establecido por la Facultad de Biologia de la Universidad de Barcelona y por lo tanto consta de la siguiente estructura: 1. Introduccién general 2. Objetivos 3. Resumen global y discusién general 4. Conelusiones 5. Bibliografie 6. Publicaciones - Differential effects of Efavirenz and Lopinavir/Ritonavir on human adipocyte differentiation, gene expression and release of adipokines and pro-inflammatory cytokines - Effects of nevi pine and efavirenz on human adipocyte differentiation, gene expression, and release of adipokines and cytokines ifferential molecular signature of visceral adipose tissue alterations in HIV-L-associated lipodystrophy ferential gene expression indicates that “buffalo hump” is a distinct adipose tissue disturbance in HIV-1-associated lipadystrophy - Hypertrophied facial fat in an HIV-L-infected patient after autologous transplantation from “buffalo hump” retains a partial brown fat-like molecular signature - Reduced levels of serum FGF19 and impaired expression of receptors for hormonals FGFS in adipose tissue from HIV-1 infected patients. - Serum FGF21 levels are elevated in association with lipodystrophy, insulin resistance and biomarkers of liver injury in HIV-1-infected patients "7. Informe del director de tesis sobre los articulos publicados 8. Index 9. Apendix - A study of fatty acid binding protein 4 in HlV-1 infection and in combination antiretroviral therapy-related metabolic disturbances and lipodystrophy - Adipogenic/Lipid, Inflammatory, and Mitochondrial Parameters in Subcutaneous Adipose Tissue of Untreated HiV-1-Infected Long-Term Nonprogressors: Significant Alterations Despite Low Viral Burden = Genetic and Functional Mitochondrial Assessment of HIV-infected Patients Developing HAART-Related Hyperlactatemia - Histological and molecular features of lipomatous and nonlipomatous adipose tissue in familial partial lipodystrophy caused by LMNA mutations - Lipotoxicity on the Basis of Metabolic Syndrome and Lipodystrophy in HIV-1- Infected Patients Under Antiretroviral Treatment ~ Nadir CD4 T Cell Count as Predictor and High CD4 T Cell Intrinsic Apoptosis as Final Mechanism of Poor CD4 T Cell Recovery in Virologically Suppressed HIV-Infected Patients: Clinical Implications, - Uridine Metabolism in HIV-1-Infected Patients: Effect of Infection, of Antiretroviral Therapy and of HIV-1/ARTAssociated Lipodystrophy Syndrome 2INTRODUCCION GENERAL“VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV) Y SIDA 1. A. INTRODUCCION Y PANDEMIA El virus HIV (Virus de la Inmunodeticiencia Humana) es un retrovirus que fue cia iden Adquirida (SIDA) que a su vez se habia descrito dos afios antes **. La infeccion, que cado en 1983 como el agente causal del Sindrome de la Inmunodefi ‘almente se da por via sexual o parenteral, de este virus, se ha ido propagando a iento, hasta el dia de hoy sin que los esfuerzos que prin nivel mundial desde su descubri se han realizado hayan servido para obtener una vacuna 0 una cura. A pesar de ello, dichos esfuerzos no han sido en vano, ya que parte de ellos han derivado en un tratamiento conocido como HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy) gracias al cual se ha logrado convertir la infeccién en una enfermedad crénica en vez de una mortal §, al menos en los paises desarrollados en los que los infectados tienen acceso completo a los madicamentos que forman parte de esta terapia. Actualmente se calcula que la poblacién mundial de afectados por el virus, asciende aproximademente a 35 millones de los cuales el 50% son hombres. Esta cifra parece haberse estabilizado tras dos décadas de alarmante ascenso. (Figura 1) El continente africano, lugar de origen del virus, presenta una altisima incidencia de la infeccién con casi 25 millones de infectados, superando el 70% del total. £1 34% de los infectados totales son habitantes de paises de la zona sudafricana, indicando que la zona sur del continente africano soporta gran parte de la carga de la pandemia (datos obtenidos del informe de UNAIDS en su Global Report 2010). Se considera la epidemia del HIV como la mas mortifera con mas de 25 millones de muertos haste nuestros dias 5 Figura 1. Numero total de personas infectadas por el virus por allo. Adaptado de UNAIDS 2010 Global Revert, A pesar de esto, las mismas fuentes, recogen un esperanzador descenso de un 19% a nivel global en la incidencia de infeccién por HIV desde 1999 (aito que marcé el pico méximo de incidencia) y 2009 (figura 2). Esta significativa reduccion superé el 25% en 32 paises, 22 de los cuales eran subsaherianos con altas tasas de infecciones. En contraste con estos optimistas datos aparecen los datos de algunos paises de la regiénde Europe del este y Asia central, que en el mismo periodo de tiempo han sufrido incrementos globales de incidencia de infeccién por el virus de mas del 25%. En estos paises el uso parenteral de drogas sin acceso @ aguias estériles parece ser una de las principales razones del aumento. Figura 2. Numero de nuevos infactades por el virus por afio. Adaptado de UNAIDS 2010 Global Report. Del mismo modo las muertes provocades por la infeccién par el HIV presenten una clara tendencia al descenso en todas las regiones menos en las ya comentadas Asia central y Europa del este. (UNAIDS 2010 Global Report) 1. B. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV) 1. B. 1. ORIGEN Y ESTRUCTURA DEL VIRUS El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) es un retrovirus del género Lentivirus de la familia Retroviridae. Se han descrito dos especies capaces de infectar humanos: HIV-1 y HIV-2, que a su vez se dividen en varias subespecies. El HIV-1 se divide en 4 subespecies: M, N, Oy P. Y por su parte el HIV-2 se divide en & subespecies cuya nomenclatura abarca desde la A hasta la H *. La subespecie culpable de la pandemia global con una mayoritaria distribucién mundial es la subespecie HIV-1 M*. El HIV-2 es menos infectivo y presenta una progresién més lenta que la especie 1, y su distribucién se limita a la zona del este del continente africano **. Por esto la cepa HIV- 1. Mes la que se asocia comtinmente al desarrollo del SIDA. Ambas especies de virus no parecen compartir un antecesor comin, ya que filogenéticamente las subespecies M,N y O del HIV-1 esté altamente relacionado con el SIV (Simian Immunodeficiency Virus) que infecta chimpancés (SIVep2) *, y por su parte la subespecie P, descubierta en 2009 y solo presente en personas con origen camerunés * parece proceder del SIV que aparece en algunos gorilas (SIVgor) de la zona de Camertin ". Por otro lado, la especie HIV-2 estd relacionada con el SIV que 1infecta al simio mangabeye gris (SIVsm)**"*. El hecho de que el virus SIV no provoque SIDA en estos simios, hace pensar en une zoonosis como explicacién en la cual estos simios sirvan de reservorio para el virus **. Este hecho se ve reforzado por la presencia de un SIV que infecta macacos (especie de simios asidticos) en cautividad y que, en estos simios, si provoca SIDA **"*. Se ha descrito que el SIV que infecta estos macacos procede del mangabeye gris, hecho que sugiere que la infeccién inter-especie si es 18 capaz de provocar SIDA, reforrando la idea de le zoonosis No existen muchas evidencias sobre cémo y cuando el virus logré una infeccién inter-especie. Todo parece indicar que cada una de las subespecies proviene de nes a humanos independientes ©. La distribucién original de las subespecies del HIV coincide con Ia distribucién de sus antecesores filogenéticos que infectan los simios (SIV). Teniendo en cuenta esto y que la caza de estos simios es y ha sido una costumbre comin en Africa, la teoria mas aceptada afirma que las mordeduras y contactos entre los simios y los cazadores, han podido ser el origen de las transmisiones transmi La estructura de los HIV ha sido bien descrita (figura 3) y es importante para comprender su patogénesis. Como todos los Lentivirus son retrovirus que se caracterizan por poseer genomas complejos y una c4pside con forma cénica. Un virién maduro de HIV-1 presenta un diémetro aproximado de 100nm y su bicapa lipidica es obtenida por gemacién de la célula huésped. Esta bicepa lipidica presenta las glicoproteinas viricas gp120 en su superficie (SU) que aparecen acompafiadas por proteinas de membrana de Ie célula huésped como proteinas HLA de clase | y Il 0 proteinas de adhesién como ICAM-1, que pueden facilitar la entrada del virién a otras células diana”. Las gp120 aparecen unidas a unas proteinas transmembrana (TM) conocidas como gp41. La parte interior de la bicapa lipidica aparece cubierta por la proteina p17 que forma una matriz (MA) icosaédrica **. Protegiendo el mater genético del virus aparece la cépside (CA) cénica, compuesta por unas 2000 copias de la proteina p24. Dentro de le cépside encontramos dos copies de RNA unido a unas 2000 copias de Ia proteina de nucleocépside (NC) 57 ***. Encapsuladas junto al material genético en la cépside, encontramos 3 enzimas esenciales codificados por el virus, como son la Proteasa (PR) p11, la transcriptasa reversa (RT) p66/p55°"™" y la integrasa (IN) p32*°, ademds de algunas proteinas accesorias como Nef, Vif o Vpr. Otras proteinas accesorias como Rev, Tat 0 Vpv no son empaquetadas en la cépside 1920 oaFigura 3. Estructura de un virién maduro y esqueme de sus principales componentes. En cuanto al genoma del virus HIV-1, se puede encontrar de dos maneras: encapsulado en Ia cépside del virién de forma que, como se he comentado anteriormente, aparecen dos copias en forma de RNA dimerizado casi idénticas ** o integrado en el DNA de la célula huésped en forma de doble cadena de DNA en lo que se conoce como provirus. Este DNA aparece protegido en ambos extremos S’y 3° por secuencias repetitivas LTR (Long Terminal Repeats) y codifica para 9 genes. Tres de ellos son las proteinas estructurales Gag, Pol y Env que son comunes en todas los retrovirus. Hay 2 genes que codifican para proteinas reguladoras como son Tat y Rev; y los 4 restantes codifican para proteinas accesorias Vpu, Vpr, Vif y Nef. La dnica diferencia con el genoma del HIV-2 es que el gen Vpu es sustituido por uno equivalente denominado Vpx. 1. B. I CICLO Y PATOGENESIS El ciclo del HIV-1 es complejo y el virus pasa por diferentes fases que conllevan diversas modificaciones estructurales. €l primer paso del proceso es el reconocimiento y le unién a la célula diana, que debe ser una célula CD44. Una vez el virus se ha unido a la future célula huésped se de la fusién y la liberacién de la cépside al citosol de la célula infectada. Una vez dentro, se dan la retrotranscripcién y la integracién, tras las cuales se produce la sintesis virica, la encapsidacién y la extrusion de los nuevos viriones con capacidad para infectar nuevas células diana. Las dos moléculas principales implicadas en la unién del viridn a la célula huésped son la glicoproteina de membrana gp120 y la transmembrana gp41™,que 8asociadas no covalentemente forman un complejo trimérico conocido como Env”. La 20120 es la encargada de unirse al receptor CD4 (cluster of differentiation 4) lo que induce cambios conformacionales que provocan la exposicién de una regién de gp120 que permanecia oculta, capaz de interactuar con los correceptores CCRS 0 CXCR4, hecho que marca el inicio del proceso de fusién™*”*, n La fusién es el proceso mediante el cual la membrana plesmatica de la célula huésped y el envoltorio lipidico del virus se unifican permitiendo la entrada de la c4pside virica al plasma celular. Los cambios conformacionales provocadas durante la unién en gp120 y gp41, son los responsables de la fusién de las membranas”?** Especialmente parece ser gp41 la encargada de funcionar @ modo de ancla para permitir la aproximacién de las bicapas lipidicas, permitiendo la entrada de la cépside al plasma de la célula huésped! igura 4, Esqueme del ciclo del virus HIV en el que se detellan todas las fases desde la union virién a la oélula, hasta la formacién de nuevas viriones, S.Utlizende ta maqsinarie cular se Wanscribe e matensl virieo — Tras la fusién se da la liberacién de la capside al citoplasma de la célula huésped. La cdpside debe ser desmantelada para que el material genético del virién pueda ser retrotranscrito. No esté atin claro el mecanismo que regula el desacople de las proteinas de la cépside, pero parece que la ciclofilina A (Cyp-A) esté relacionada 33 con el desensamblaje de la caps 16Una vez el material genético es liberado de la cépside al citoplasma celular comienze la retrotranseripcién. Le Transcriptase reverse (RT) asociada @ otras proteinas viricas en un complejo conocido como Reverse Transcription Complex (RTC)*, lleva a cabo Ia retrotranscripcién convirtiendo las dos cadenas de RNA a una de DNA de doble cadena (dsDNA)"*. Cabe mencionar que este punto es diana de los. férmacos pertenecientes a la terapia HAART conacidos como Inhibidores de Transcriptasa Reversa (RTI), que juegen un papel muy importante en esta terapia, tal y como se expondré més adelante, EI siguiente paso es la Integracién del dsDNA en el ONA de le célula huésped. Para ello es necesario la formacién del Complejo de Preintegracién (PIC), que esta constituido por proteinas viricas nucleofilicas como las proteinas de nucleocépside (NC), las de la Matriz (MA)o la Vpr, la RT que también forma parte de este complejo, la integrasa virica (IN) y enzimas de reparacién del DNA del huésped que acompafian al dsDNA**’. Este complejo es transportado hasta el nucleo y una vez alli la integrasa virica cataliza cortes en ambos extremos 3° LTR de la dsDNA virica para preparar su integracién en el DNA de la célula huesped™. Tras esto el dsDNA virico es integrado en el DNA de la célula huésped por medio de la integrasa virica. Este hecho viene facilitado por una integrase de la célula huésped llamada LEDGF/075 (Lens Epithelium- Derived Growth Factor) que uniéndose a la IN estimula la integracion™ Una ver el material génico virico se encuentra integrado en el DNA de la célula huésped, es conocido como provirus. Desde ese momento comienza la sintesis virica de nuevos viriones. EI DNA virico es transcrito a RNA viral del tamafio completo y a MRNA de diferentes tamafios que se traducirdn en el citoplasma celular para dar las diferentes proteinas viricas necesarias para obtener nuevos viriones. La transcripcién y la traduccién son Ilevadas a cabo por la maquinaria de la célula huésped proteinas viricas que se traducen en este proceso son: el precursor poliproteico Gag que posee 4 dominios que son MA, CA, NC y p6; el precursor poliproteico Gag-Pol del cual se obtienen 3 proteinas importantes como son PR, RT € IN; y el precursor slicoproteico Env 0 g9160 el cual, proteolizado por proteasas propias del huésped en el aparato de Golgi, da gp120 y gp41". Las Todas estas proteinas y el RNA viral, son transportados hasta el lugar de la membrana celular donde se llevara a cabo la eneapsidacién de los nuevos viriones para su extrusién. El proceso de ensamblaje esta dirigido por Gag, que coore incorporacién de cada uno de los componentes virales asi como de algunos factores de la célule huésped“, Una vez todos los componentes necesarios estén en el lugar indicado, por gemacién, el viridn se libere de la célule huésped. Pare ello, el dominio 6 de Gag secuestra componentes de la maquinaria endosomal celular*“7. Mientras se da la extrusion la proteasa virica (PR) proteoliza los precursores Gag y Gag-Pol en sus respectivos dominios proteicos que permiten la maduracién del virion” a la 20En cuanto a la patologia provocada por la infeccién por el HIV-1, cabe mencionar el SIDA o Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida, que se desarrolla en los pacientes tras un tiempo variable de haber sido infectados por el virus. El SIDA se caracteriza por un descenso notable de los Linfocitos T CD4+ Io cual provoca que el paciente no see capaz de tener una respuesta inmune, hecho que deriva en multiples infecciones oportunistas***?. Tras la infeccién se da una fase en la que aumentan los niveles del virus HIV en sangre en pocas semanas, en lo que se conoce como fase aguda. En la primera parte de esta fase aguda se da la infeccidn, en la mayoria de casos por las tipicas vias sexual © parenteral, Cuando la infeccién se da por via parenteral el virus entra directamente sexual, el virus debe hacer frente a las mucosas. Las células dendriticas (DC) estén presentes en las mucosas en el torrente sanguineo, en cambio si la infeccién se da por vi de las zonas proclives de contacto sexual como la vagina, ano o eséfago y faringe™. Estas células serian las primeras en entrar en contacto con el HIV y de esta manera, posteriormente extenderfan el virus entre los linfocitos T CD4+ y macréfagos, déndose la primera amplificacidn del virus a nivel linfético. El tiempo de vida medio de un virién es de 30 minutos y el ntimero de viriones producidos en una persona, puede llegar a ser de unas 10° perticulas viricas por dia. Las vias por las cuales el virus podria transmitirse de las DC a los linfocitos T CD4+ y macréfagos podria ser en trans a través n directa del de exosomas procedentes de las células dendriticas®? 0 en cis por ut virus a los receptores de manosa. Una vez los viriones 0 los linfocitos T infectados se encuentran en el torrente sanguineo se da la segunda parte de la fase aguda, la amplificacidn. En esta etapa se da una infeccidn de todas las células que sean susceptibles y se observan tanto un pico en la cantidad de virus en plasma como un marcado descenso de linfocitos T CD4+. En este estado se pueden manifestar los primeros sintomas clinicos. El final de la fase agude viene marcado por la produccién de anticuerpos para el HIV-1™, aFigura S. Acontecimientos que ocurren a nivel de carga viral (linea oja) madido en copias de RNA de HIV /ml y linfocitos T CD4+ (linea azul) medido en linfecitos T CD4+/ul, alo largo de las fases de infecei6n por parte del virus HIV en presencia o ausencia de terapia HAART. INFECCION AGUDA (>> CRONICA [> SIDA | BR eee REE Targa vial RRA Ga AV one Tras estos acontecimientos se da la fase de latencia (0 crénica) que se caracteriza por la ausencia de sintomatologia. La viremia es mas baja que durante la fase eguda a pesar de que la replicacién es constante, en parte debido a la respuesta especifica contra el HIV de los linfocitos-T CD8+ citotéxicos y en parte debido al descenso de células diana. La cantidad de linfacitos CD4+ continiian menguando hasta niveles muy bajos que marcarian el inicio del SIDA propiamente dicho”. Esta fase presenta alta variabilidad en su duracién dependiendo del paciente. Puede llegar a durar de 8 a 10 afios. La resistencia ¢ la infeccién por el virus es muy rar, pero existen 2 tipos de pacientes que presentan inmunidad o alta resistencia a la infeccién por HIV-1. Se trata de los LTNP (Long terminal Non Progressors) y los HEPSN (Highly exposed persistently seronegative) respectivamente®’. Sus mecanismos de inmunidad innata y adquirida estén siendo estu virus. dos con especial interés de cara a lograr una vacuna contra este Cuando el paciente es tratado con la terapia HAART, los niveles de RNA viricos disminuyen hasta niveles indetectables, y por el contrario se recuperan los niveles de linfocitos cD4+*7, 22. TERAPIA HAART Y TOXICIDAD ASOCIADA, 2. A.INTRODUCCION Tras el descubrimiento de que el virus HIV-1 era el culpable de la pandemia que estaba provocando la inmunodepresién de un alto numero de pacientes ocasionando irremediablemente su muerte, se comenzé a trabajar en la busqueda de una solucién. Quedando lejos la posibilidad de encontrar una vacuna, que atin hoy en dia se busca sin éxito, aparecieron los primeros farmacos de la terapi antiretroviral a finales de los 80%, Estos primeros férmacos, administrados en mono o bi-terapia, mostraron poca eficacia ya que eran incepaces de controlar el virus y suprimir la replicacién viral. Tuvieron que pasar algunos afios, hasta que a mediados de los 90 se aprobaron nuevos compuestos que pertenecian a familias farmacolégicas novedosas. Este hecho marcé el comienzo de la terapia HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy). La base de la capacidad de esta terepia para suprimir casi completamente la replicacién viral, radice en las combinaciones que se realizan utilizando farmacos de las diferentes familias que componen la terapia y que actuan a diferentes niveles del ciclo virico multiplicando su capacidad de controlar del virus. De esta manera cada una de las familias que componen la terapia es capaz de inhibir enzimas esenciales en el ciclo viral por separado y actuando conjuntemente logran una eficacia mayor inhibiendo tanto la replicacién como la maduracién o Ia entrada del virus en la célula huésped. Gracias a esta estrategia la HAART es capaz de reducir los niveles de RNA viral en plasma y de recuperar los niveles de células Cb4+", asi como recuperar la capacidad de responder a antigenos de estas células y las CD8+, que consecuentemente ha derivado en la desaparicién de infecciones secundarias. Todo esto ha transformado la infeccién en una enfermedad crénica en vez de una mortal, lo cual ya es un gran logra®*. Existen 6 familias de medicamentos que componen la terania HAART y que actdan en 5 dianas clave del ciclo de replicacién viral. Existen dos tipos de inhibidores de transcrintasa reversa virica, los andlogos de nucleésidos (NRTI, Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors) y los no anélogos (NNRTI, Non Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors), que bloqueen la retrotranscripcién del material genético del virus. Otro enzima diana para otra familia de férmacos es la protease virica, sobre la cual actian los inhibidores de proteasa virica (PI, Protease Inhibitors), impidiendo la maduracién de las proteinas viricas ya traducidas. Estas tres familias de férmacos componen los medicamentos més clésicos de la terapia HAART. En los ultimos afios se han deserrollado diferentes farmacos basados en mecanismos que bloquean dianas diferentes a las clasicas. Si bien no son atin primeras elecciones en las pautas preferenciales de administracion de la terapie HAART, vanganando peso. Uno de los medicamentos con los cuales se ha logrado bloquear el funcionamiento de una nueva diane enzimatica, la integrasa virica, son los inhibidores de integrasa (Il, integrase Inhibitors). Estos férmacos actiian sobre la integrasa, impidiendo que lleve a cabo su funcién de integrar el dsDNA virico en el genoma de la célula huésped, Por otra parte también existen los inhibidores del correceptor CCRS (CCR5-l) que evitan de esta manera que el virus pueda penetrar en las células cD4+, Del mismo modo tiltimamente han aparecido férmacos capaces de bloquear la fusién del virus con la célula huésped (FI, Fussion Inhibitors). ra 6, Dianas de les diferentes familias de férmacos que componen la terepia HAART a lo largo del ciclo replicativo de virus HIV en la célula 7 CD4+ del huesped. Interact ano once ‘rue de ia cua nocd A pesar del éxito de esta terapia y su capacidad para_mantener las copias de limite de deteccién) y la recuperacién del sistema inmune con |os linfocitos CD4+*7, su uso resulta RNA viral en plasma muy bajas (por debajo de les 50 copias, obligetoriamente continuado, y con los afios se han observado diferentes efectos adiversos asociados a la terapia HAART. Existe controversia sobre la aportacién de cada uno de los farmacos a los efectos adversos, ya que depende de diferentes factores idad interindividual, tanto de los valores del entre los que se encuentra la varia 24medicamento en plasme como de le respuesta a este. Otro hecho que dificulte eclarar el peso de cada medicamento en los efectos adversos es que los farmacos se administren de forma combinada. Hoy en dia se siguen realizando estudios para determinar la aportacién de cada farmaco a estos efectos secundarios no deseados. Tabla 1, Familias de farmacos antirretroutrales utllzadas para el tratamiento de la infeccién por HIV (terapia HAART). En gris los farmacos de nueva generacién, or owncsntcs eemcraane ro suerte an gcc istce tse wom eroaanaiae, ‘perrsautribevsu trees a arnuenate) eeievecmnaettie te vreeo 3 Soigiouk osarecna USO TE soanese ona. sven Bocwuona EaAR HS arene oats sae are Someries AeA te eoeccensrersecer Serre He Divittaa (2Py a 7 : - PRR AT Sa cue on aan A sures sles ela ptese vee i BonaA oe auvraerceinenosucewosen one ae oqrenewsarcaia rata nS ra reas Se Toa oT k eesneicanen vt atin deincaber acon cela menbearace In eluln tsps [rob ans asa va, tan 36 1 inmpacan de DRA vic ancl ao de sea mudd Isceven ln rnerscesin wneconrrcsne| [cox arnre a fson dt vrs co in cata espe " naxrecaannecyy onc 2. B. FAMILIAS DE FARMACOS DE LA HAART 2. B. |. INHIBIDORES DE TRANSCRIPTASA REVERSA ANALOGOS DE NUCLEOSIDOS (NRTI) Fueron los primeros férmacos aceptados en Ia lucha contra el HIV-1, siendo el primero el AZT (Zidovudina)®. Se trata de derivados de Adenosina, Guanosina, Citosina y Timina, que son considerados pro-farmacos ya que deben ser fosforilados una vez penetran en las células, generandose le forma 5'-trifosfato para ser activos. De estamanera, son capaces de inhibir competitivamente el proceso de polimerizacién llevado a cabo por la transcriptasa reversa, ya que son un sustrato alternativo™. Su mecanismo de bloqueo del proceso de retrotranscripcién, se basa en que carecen de extremo 3°0H 0 Io tienen modificado, de manera que impiden la formacion del enlace ” evitando la elongacién de la cadena de DNA. fosfodiester 3° Hoy en dia hay 8 férmacos aprobados de este familia y existe variabilidad en la tolerancia que presentan los pacientes asi como en su eficacia, Figura 7. Estructuras quimicas de los NRTI aprobados para terapla HAART. ‘Andlogoe de Pimidinas 2. B. Il. INHIBIDORES DE TRANSCRIPTASA REVERSA NO ANALOGOS DE NUCLEOSIDOS (NNATI) ‘A pesar de actuar al mismo nivel que los anteriores, es decir bloqueando la transcriptasa reversa, su meca es alostérica no competitiva ya que no se unen al dominio activo sino a una cavidad adyacente hidrofébica cercana al sitio catalitico del enzima, provocando un cambio conformacional que evita el correcto funcionamiento del enzima®. A diferencia de los mo es diferente. En este caso la inhibicion del enzima NRTI no necesitan ser modificados para ser activos. Se caracterizen por tener una larga vida media en plasma, lo que contribuye a facilitar la dosificacién, Se metabolizan via citocromo 9450 y para cada compuesto hay diferentes isoenzimas implicados en esta metabolizacién, lo que provoce que sus niveles plasméticos puedan variar o que existan interacciones con otros farmacos que comparten la misma via. Se considera que el virus es capaz de generar resistencia con 2cierta facilidad a estos compuestos®. Hoy en dia hey 5 medicamentos aceptedos, pero hay varios en distintas fases de desarrollo clinico. Figura 8. Estructuras quimicas de los NNRTI aprobados para terap'a HAART. 2. B. Il. INHIBIDORES DE PROTEASA La proteasa virica se encarga de la maduracién de las protefnas del virus para que sean funcionales, hecho que la convierte en una diana interesante pare una terapie antirretroviral. Los Pl se asemejan a las poliproteinas sustrato de esta enzima y por lo tanto actiian como sustratos andlogos bloqueando el centro activo de la proteasa. De este modo se impide uno de los pasos importantes en el ciclo de replicacién virico y se bloquea la generacién de nuevas particulas viricas””. En muchos casos se administran acompatiados con una baja dosis de otro Pl, el Ritonavir (RTV) debido @ que este hace de potenciador de estos férmacos ya que inhibe el citocromo P450 en higado € intestino aumentando la vida media de los Ply otros férmacos. aFigura 9. Estructuras quimicas de los Pl aprobados para terapia HAART. 2. B. IV. INHIBIDORES DE LA FUSION El Unico férmaco de esta familia aceptado hoy en dla es la enfuvirtida. Su mecanismo implica la unién a la proteina gp41 de le cubierta virica. Esta unién impide que el virus, una vez unido a le célule huésped, provoque los cambios conformacionales desencadenados por esta proteina (gp41]. De esta manera se impide ue las dos bicapas lipidias se fusionen y que el virién puede penetrar en el citoplasma celular, 2. B. V. INHIBIDORES DEL CORRECEPTOR CCRS Del mismo modo que en los inhibidores de fusién, @ dia de hoy existe solo un férmaco aceptado representando a esta nueva familia. Se trata del Maraviroc. Su diana 5 el coreceptor CCRS. De esta manera se busce bloguear la unién y la fusion del virién con la célula huésped ya que este coreceptor de la célula huésped esté implicado en el cambio conformacional que sufre la célula huésped para facilitar la unién y fusi6n del virién y la célula CD44". 2. B. VI. INHIBIDORES DE LA INTEGRASA, En este caso, la diana de esta familia de farmacos es la integracién del DNA viral en el genoma de la célula huésped. Este paso es crucial para que, utilizando la maquinaria del huésped, el virus se replique y realice numerosas copias. Estos farmacos bloquean especificamente la transferencia de la cadena genética viral”. Como en los dos anteriores casos, se trata de nuevos férmacos y por ahora solo hay un medicamento aceptado, es el raltegravir. 282. C. MODOS DE ADMINISTRACION PREFERENTES PARA HAART La base de le terapia HAART es la combinacién de diferentes férmacos para optimizar el bloqueo de la replicacién virica. En general, algunos farmacos son menos utilizados que otros debido en parte a su limitada eficacia o por los efectos adversos que provocan. Aun asi existen numerosas opciones de combinaciones de entre las cuales se intenta seleccionar la més adecuada en funcidn de los requerimientos de cada individuo. Principalmente se parte de la terapia base, que incluye un NRTI y un Pl como minimo, ya que entre ambos optimizan el efecto antirretroviral evitando aparicién de resistencias al atacar dos dianas diferentes. Pero esta terapia puede variar dependiendo del estado de la infeccidn y, por supuesto, de las caracteristicas de los pacientes. La pautas més aceptadas actualmente, al iniciar la terapia aconsejan la administracién de 2 NRTI mas un NNRTIo un P17, Estas pautas preferentes recomiendan seleccionar entre el Tenofovir y el Abacavir como primer NRTIs. Entre la Emtricitabina o Lamivudina como segundo NRTI, Y por Ultimo seleccionar un farmaco de una lista de NNATIs y Pls que incluye: Efavirenz, Nevirapina, Atazanavir, Darunavir, Fosamprenevir, Lopinavir y Saquinavir, incluyéndose iltimamente en esta lista el raltegravir como inhibidor de integrasa (Combinaciones de férmacos recomendadas para triple terapia por GESIDA, 2010). De esta manera el paciente debe tomar tres férmacos que posibilitan muchas combinaciones para hacer frente a la infeccién. Desgraciadamente, las caracteristicas del HIV, obligan @ que la terapia HAART debs realizarse durante toda la vida. Le exposicién crénica a estos férmacos ha generado la aparicién a lo largo de los afios de diferentes efectos adversos. Hoy en dia todos los férmacos antirretrovirales que forman parte de la terapia HAART presentan cierta toxicidad, cuyo nivel varia. Estos efectos adversos han hecho que se centren esfuerzos en elucidar los mecanismos de toxicidad implicados pera controlarlos y disefiar nuevos compuestos. 2. D. EFECTOS ADVERSOS DE LA TERAPIA HAART Existen diversos factores que juegan un papel importante influenciando la aparicién de complicaciones en los pacientes bajo terapia HAART. Para una dosis igual, hay pacientes que no responden al farmaco mientras otros presentan toxicidad. Se ha sugerido que esta variabilidad interindividual deriva entre otras cosas de determinados polimorfismos genéticos, si bien también puede ser debida a la interaccién con otros farmacos y le dieta™. Es importante tener en cuenta que los férmacos se distribuyen de manera diferente por los distintos tejidos, hecho que puede provocar que los tejidos expuestos 20@ mayores concentraciones de ciertos férmacos sean més propensos @ mostrar toxicidad”’. Sumado a esto, cabe sefialar que los farmacos se administran de forma combinada tal y como se ha comentado anteriormente. De esta manera resulta complicado determinar el perfil toxicolégico especif farmacos. De todas formas la toxicidad ha sido estudiada para las familias clasicas de la terapia HAART, ya que las nuevas no se asocian atin con toxicidad, y se han sefialado diferentes patrones de toxicidad asociados a la familia en si o @ los farmacos especificamente. ico asociado a cada uno de los Los NRTI presentan gran variedad de efectos adversos que son atribuidos normalmente 2 efectos téxicos sobre la mitocondria y que varfan dependiendo del tejido 0 el tipo celular sobre el que se observen™. Entre cllos cabe destacar la neuropatia periférica, la miopatia de musculo esquelético y cardiaco, pancreatitis, esteatosis hepatica, acidosis léctica, alteraciones metabélicas y lipodistrofias. Estos efectos téxicos se asocian mas a los férmacos més antiguos de la familia, exceptuando el 37C, es decir, sobre todo al AZT, el ddl y el d4T, los cuales han sido asociados a mayor toxicidad mitocondrial”®™””, Los NNRTI, por su parte se asocien a una alta incidencia en reacciones cuténeas, as como hepatotoxicidad y alteraciones metabolicas”***. El EFV y la NVP, son los férmacos més empliamente utilizados de esta familia ya que se consideran seguros y bien tolerados. Pero la administracién a largo plazo presenta perfiles toxicolégicos que resultan diferentes para cada uno de ellos™. El EFV ademés de las comentadas anteriormente, se asocia también a una importante toxicidad sobre el sistema nervioso” y una recientemente descubierta implicacién en la lipoatrofia periférica™’. Los PI son asociados principalmente con el aumento de riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares™ y alteraciones a nivel del metabolismo de lipidos y giticidos, como pueden ser resistencia a insuli 55-87 a, lipohipertrofie, lipoatrofia o dislipidemia’ ‘este nivel se asocian sobre todo a una acumulacién de grasa a nivel visceral”, Los nuevos férmacos de este familia, que se potencian con el uso de RTV, se consideran mas seguros que los antiguos, pero atin asi siguen asociados a un aumento de riesgo de enfermedades cardiovasculares™. 03, TEIDO ADIPOSO 3. A. INTRODUCCION Una de las actividades més importantes de los seres vivos, es sin lugar a dudas asegurarse una fuente de energia, que es la base para pader mantener el resto de actividades necesarias para mantenerse con vida. A lo largo de la evolucién, los animales han encontrado una solucién a este problema. Se trata de elmacenar el excedente de energia, que se obtiene por los nutrientes que se absorben durante la alimentacién, en forma de lipides en un tejido del mesoderma, el tejido adiposo. Hasta hace pocos afios se ha entendido este tejido como un simple almacén de energia, pero hoy en dia se esta destacando como un érgano que juega un papel crucial en la regulacién y disfuncién de homeostasis energética®. Esta homeostasis, implica un compromiso entre el aporte y el gasto energéticos que se logra gracias a una respuesta coordinada entre el sistema nervioso y el tejido adiposo. Situaciones como la ingesta, la necesidad de producir calor, el ejercicio fisico o la gestacién, son procesos que determinarén este balance energético, que en ultima instencia afectaran al peso corporal. Un balance positive de este equilibrio, bien sea por una ingesta excesiva o un bajo gasto energético, provoca una hipertrofia del tejido adiposo, provocando un aumento del peso del individuo que puede conducir a la obesidad. Cada dia se conocen mas altera nes metabélicas asociadas a la obesidad que implican un alto riesgo para la salud como la resistencia a insulina, dislipidemias 0 enfermedades cardiovasculares. Estas alteraciones se conocen en conjunto como sindrome metabdlico. Hoy en dia en los paises desarrollados debido al acceso a alimentos altamente caléricos y al sedentarismo de la sociedad en general, las tasas de obesos con respecto a los individuos delgados o de pesos normales, esté llegando a numeros preocupantes. Han sido identificados tres tejidos adiposos diferentes en mamiferos, el tejido adiposo blanco (White Adivose Tissue, WAT), tejido ediposo marrén (Brown Adipose Tissue, BAT) y el tejido adiposo de |a medula ésea°”®”. Los mas estudiados han sido el WAT y el BAT, ambos presentan capacidad para metabolizar y almacenar Iipidos, pero funcionalmente resultan muy diferentes. En ambos casos, se almacenen triglicéridos, pero en el caso del tejido adiposo blanco, esto sirve como almacén del exceso de energia y en cambio en el tejido adiposo marrén se usa como combustible para la generacién de calor mediante la disipacién de energie. De esta manera el WAT es capaz de hidrolizar estos triglicéridos pera liberar écidos grasos y glicerol en situaciones de falta de sustratos energéticos como el ayuno. Ademés el tejido adiposo blanco es considerado un érgano endocrino. Ambos tejidos se desarrollan en lugares concretos y diferentes. aEn cuanto a estas localizaciones diferenciales, cabe destacar que incluso dentro del WAT, se reconocen diferentes localizaciones (como la subcuténea y le visceral) que presentan un conjunto de caracteristicas metabdlicas y moleculares diferentes. En cambio el papel de los adipocitos medulares ha sido poco estudiedo y no se conoce en profundidad®”. su numero y medida parece inversamente proporcional a la actividad hematopoyética de la médula ésea. El patrén de expresién de estos adipocitos se parece al de los adipocitos subcuténeos de humanos, hecho que hace pensar que sus funciones padrian ser similares™. 3. B. TEJIDO ADIPOSO BLANCO EI tejido ediposo blanco es el tejido adiposo mayoritario y aparece distribuido en gran cantidad y en diferentes depésitos concretos (como el subcutdneo y el visceral 0 alrededor de algunos érganos) que presentan diferentes patrones metabélicos y de expresién génica®’°. Ademés de los adipocitos diferenciados tipicos de este tejido adiposo blanco, podemos encontrar otros tipos celulares, que pueden llegar a constituir hasta el 50% del ntimero total de células del tejido, como prea diferenciados, fibroblastos, células endoteliales de los vasos, células del sistema inmune 0 células nerviosas. Las células adiposas maduras de este tejido se caracterizan por tener una gran vacuola lipidica que ocupa la mayoria del citaplasma (desplazando el niicleo a una posicién lateral) y unas pocas mitocondrias con crestas poco desarrolladas. Figura 10. Morfologia tipica de los adipocttos blancos. WUSLED OCONORA 2Como se ha comentado, su funcién asociada @ le homeostasis energética implica almacenar Ia energie sobrante obtenida mediante la dieta en forma de triglicéridos y liberar esta energia en forma de dcidos grasos libres y glicerol cuando es necesario. Del mismo modo cada dia se conocen més factores endocrinos y paracrinos que son berados por el tejido adiposo blanco, que juegan un importantisimo papel en la regulacién metabdlice de la homeostasis corporal. Ademas de actuer como érgano endocrino y reservorio de energia, cumple otras funciones siendo un excelente aislante térmico asi como ofreciendo una proteccién mecanica al cuerpo”. 3. B. |. DIFERENCIACION ADIPOCITARIA DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO. En humanos el tejido adiposo blanco aparece a mitad de la gestacién aproximadamente, més tarde que el marrén. Su origen son las células madre mesenquimales multipotentes que tiene origen mesodérmico. Cabe destacar que los preadipocitos aislados de diferentes depésitos, como el visceral y el subcuténeo, °° Este hecho hace que una vez maduras, las células adipocitarias tengan diferentes comportamientos metabélicos™ poseen diferentes potenciales adipogénicos cuyas bases son desconocidas Existen dos fases en el proceso de diferenciacién del tejido adiposo. La primera es la determinacién’®*. Este proceso abarca los mecanismos por los cuales la célula madre pluripotente adquiere las caracteristicas de Ie linea adipocitaria e implica la transformacién de la célula madre 2 preadipocito, que morfolégicamente alin seré igual @ su precursora. Este hecho conlleva la pérdida por parte de la célula de la capacidad para convertirse en otro linaje mesenquimal como los miacitos, condriacitos 302 © osteocitos in ter Tras este paso se da la diferenciaci wal, que se caracteriza por la adquisicién por parte del preadipocito de la maquinaria proteica necesaria para el transporte y sintesis de lipidos, la sensibilided a la insulina y la capacidad de secretar , 402 adipoguinas, convirtiéndose ya en un adipocito maduro Los acontecimientos que promueven la determinacién permanecen atin poco claros, en cambio las vias transcripcionales de la diferenciacién terminal _han sido bien descritas. Para realizar estos estudios se han utilizado estudios in vitro con las limita nes que esto conlleva, ya que el tejido adiposo es un sistema complicado. Para estos cultivos celulares se han utilizado lineas celulares preadipocitarias murinas como lo son las 3T3-L1 0 las 3T3-F4424"*"™ y también cultivos pr preadipocitos aislados de la fraccién del estroma vascular del tejido adipaso jatios de disociado*™. Aun asi, hasta hace poco no existia ninguna linea celular de adipocitos humanos con capacidad de ferenciarse después de diversos ciclos de divisién. Peroen 2001 aparecieron unos adipacites aislados del tejido adizoso de unos nifios que sufrian el Sindrome de Simpson-Golabi-Behnel (S6BS)"*. Este sindrome provoca un fenotipo de hipercrecimiento generalizado. Las células obtenidas se pueden diferenciar tras més de 50 rondas de divisién manteniendo una morfologia, funcionalidad y bioqui sido y serén una herramienta muy importante en el estudio del desarrollo y el metabolismo del tejide adiposo blanco humano, a idéntica a adipocitos de individuos sanos"”*. Por eso han 3. B. II CASCADA DE ACTIVACION DE LA DIFERENCIACION Y FACTORES IMPLICADOS Como se ha comentado, los pasos que siguen los preadipocitos para convertirse en adipocitos han sido ampliamente estudiados in vitro. Los pasos que se llevan a cabo han resultado altamente ordenados. El primer acontecimiento es le parada de la proliferacién por parte de los preadipocitos proliferantes que salen de esta manera, del ciclo celular. Este hecho se debe generalmente a procesos de inhibicién por contacto, a pesar de que el contacto célula-célula no parece ser indispensable“**"”, En cultivos celulares este paso se induce con la adicién de factores adipogénicos tras lo cual se dan avin una o dos rondas de divisién celular (expansién clonal) y se inicia la activacién transcripcional de genes marcadores del adipocito, lo que conlleva a una paulatina adquisicién del fenotipo adiposo. Los acontecimientos a nivel transcripcional que tiene lugar en este punto se dan en dos fases. Durante la primera ocurre una induccién de dos factores de transcripcién de la familia C/EBP (CCAAT/Enhancer Binding Protein) como son: C/EBPB y C/EBPS. Estos factores de transcrigcién son responsables del inicio de le segunda fase de diferenciacién ya que activan la expresién de PPARY (Peroxisome Proliferator Activated Receptor y) y C/EBPa***", Estos dos son genes master del resto del proceso de diferenciacién, se trata de dos factores de transcripcién capaces de activar la gran mayoria de genes que caracterizan el fenotipo adipocitario y que se expresan durante este segunda fase como son le FAS (Fatty Acid Synthase), le glicerofosfato deshidrogenasa, la acetil-CoA carboxilasa, el transportador de glucosa GLUT4, el receptor de insulina y la proteina aP2/FABP (Fatty Acid Binding Protein) especifica de adipocitos) entre otros‘. Durante la fase primera, la célula adopta una morfologia esférica, mas acorde con el fenotipo adipocitario y comienza e aumentar la expresién de marcadores adipogénicos como LPL (Lipoprotein Lipase}, A lo largo del proceso de diferenciacién van apareciendo en el citoplasme de Ia célula gotas lipidicas que van aumentando de volumen para después fusionarse formando una o dos grandes vacuolas lipidicas que ocupan una gran parte del citoplasma celular. El factor de transer ién PPARy resulta crucial para este proceso de diferenciacién pero también es necesario para mantener el estado diferenciado del adipocito'. Por 4si solo PPARy es capaz de que se expresen la mayoria de genes adipocitarios pero C/EBPa es indispensable para que el adipocito adquiere sensibilided @ insulina™*. Ambos factores de transcripcién son capaces de autoinducirse y también se inducen el uno al otro. Otros factores de transcripcién que estin implicados en el proceso de adipogénesis son el LXR (Liver X Receptor), SREBPc (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1) y CREB (CAMP Response Element Binding Protein) Las C/€BPs son proteinas de unién a CCAAT/enhancer que pertenecen a la familia de los factores de transcripcién bZIP (Basic leucine Zipper) con un dominio bésico de unién a DNA y una cremaliera de leucinas. Acttian como homo y como ribucién tisular no se limita al tejido adiposo™, heterodimeros y su La expresin ectpica de uno de los miembros de la familia C/EBP, el C/EBPB es suficiente para inducir la diferenciacién de las células 3T3-L1 murinas sin ningts inductor hormonal adicional y su activacién parece estar inducida via cAMP™*. En el caso de C/EBPS su presencia es clave pare acelerar el proceso de diferenciacién“*. De este modo la expresién ectépica de C/EBPB y no de C/EBPS, es capaz de determinar el linaje de adipocito las células fibroblasticas NIH 3T3 y promueve su diferenciacién en presencia de inductores hormonales*”. De esta manera los fibroblastos a los que falta una de estes dos proteinas presentan una cierta pérdida de capacidad de diferenciacién adipocitaria, en cambio si les faltan ambas pierden esta capacidad de manera muy severa*™, En ratones sin alguno de estos factores se observa un tejido adiposo blanco normal mientras en el marrén se aprecia una pérdide de acumulacién lipidica, asi como un descenso en la expresion de UCP1 (Uncoupling Protein 1 especifica de tejido adiposo marrén). Si no se expresa ninguno de estos factores el fenotipo es mucho més severo muriendo un 85% de los ratones en el periodo perinatal y el resto que sobrevive presenta un WAT y un BAT reducidos™™. reduccién del BAT es debido a una disminucién de la acurnulacién lipidica, mientras la En este caso la del WAT se debe a una disminucién del nimero de células que son normales en todos los aspectos. La sobreexpresidn de otro miembro de esta familia C/EBPa en células 373-L1 da luger a su diferenciacién y en cambio su bloqueo con RNA antisentido evita esta 4°. Se conoce que C/EBPa se une y transactiva a muchos genes relacionados con el fenotive adipogénico como: aP2/FABP, SCD1 (Stearoy!-CoA Desaturase 1), GLUT4, PEPCK, leptina y el receptor de insulina entre otros. También se le atribuye una funcién antimitética’”””. su delecién en homocigosis en ratones provoca una importante reduccién de la acumulacién de grasa en ambos tejidos adiposos“*_ Estos ratones mueren de hipoglucemia ya que no pueden realizar la gluconeogénesis en el higado, pero si se introduce un transgen en el higado para que i an diferenciaciénpuedan realizarla, la supervivencia aumenta pero el tejido ediposo blanco no se bn gflttl2s recupera, mientras el marrén si El receptor activedo por proliferadores peroxisomales gamma, PPARy es el mas adipogénico de los PPAR. Pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas y es un factor de transcripcién que necesita heterodimerizarse con otro receptor nuclear de hormona, en este caso RXR (Retinoid X Receptor) para poder unirse al DNA y llevar 2 cabo su funcién transcripcional”™*. El gen PPARy presenta dos jadas de un splicing alternativo, la isoforma 1 y la 27. La primera se expresa poco y en un amplio espectro de tejidas mientras la segunda es especifica del tejido adiposo™, estando relacionads con el metabolismo lipidico. isoformas de Figura 11. Heterodimero uniéna DNA. PARY y RXR con sus caracteristicos dominios de unin a ligando y toon dounior (ees \f sauren || nn | x eam Se ha observado que fibroblastos en cultivo infectados con retrovirus que dirigen la expresién de PPARY son capaces de diferenciarse 4 adipocitos, dendo una idea de |a capacidad adipocitaria de este factor de transcripcién™ observado que PPARy es necesario para el desarrollo y la diferenciacién adipocitaria“*. PPARy juega un papel crucial en la expresién de genes como PEPCK 0 aP2/FABP™. ~ In vivo se ha Estudiando PPARy se observé que los TZD (Tiazolidinedionas) como la troglitazona, pioglitazona y rosiglitazona, agentes antidiabéticos sintéticos, son sus agonistas***"**, Los TZD son farmacos con potencial para tratar la resistencia a insuling. En tejido adiposo los TZD son capaces de aumentar la sensi supuestamente aumentando | diferenciacién adipocitaria via PPARy logrando jad 2 insulina adipocitos mas pequefios y mds sensibles a la hormona, sobre todo en el tejicdo adiposo blanco”. adipogénesis tanto In vivo como in vitro™**, Ademaés de estos compuestos estén los Se ha observado que el tratamiento con TZDs aumenta la 2ligandos naturales de PPARy, entre otros la 15 deoxid? “prostaglandina 12 0 15dPGI2, capaz de activar PPARy provacando edipogénesis en fibroblastos en cultivo™” u otros como dcidos grasos como el oleico 0 el linoleico'****, En cuanto al RXR cabe decir que es un miembro de los receptores nucleares de hormonas que tiene 3 isoformas a, B y y, siendo Ia isoforma RXRy la preferente en tejido adiposo marrén y la RXRa en tejido adiposo blanco“*. Estos receptores pueden homodimerizar 0 heterodimerizar. La heterodimerizacién se puede dar con diferentes receptores actuando en diversas vias. En cuanto a la accién adipogénica que nos ‘ocupa, la heterodimerizacién que sucede, se da con PPARy, como se ha comentado”” (figura 11). El ligando de RXR es el dcido 9-cis retinoic“. Se ha observado que los ligandos sintéticos de RXR son capaces de provocar efectos similares a los de los TZD sobre alteraciones metabélicas como la diabetes mellitus tipo Il, del mismo modo que el tratamiento con estos agonistas potencia la diferenciacién de los adipocitos blancos ymarrones", Otro de los factores implicados en la diferenciacién adipocitaria es el ADD1/SREBP1 (Adipocyte Differentiation and Determinotion Factor 1/ Sterol Regulatory Element Binding Protein 1). Estos factores de transcripcién actéan uniéndose a los elementos de respuesta a esterol. Se induce durante la adipogénesis y se regula por procesos de ayuno y realimentacién“***, Parece que la insulina juega un Papel importante en su activacién durante la realimentacién*”. La molécula completa de este factor de transcripcién es una molécula inactiva anclada a la membrana del reticulo endoplasmatico que tras una protedlisis se trasloca al nucleo donde lleva a cabo su cometido como factor de transcripcién para diferentes genes relacionados con metabolismo de dcidos grasos y triacilgliceroles como FAS, ACO 0 la glicerofosfato aciltransferasa 1 y 2. Este factor también parece involucrado en la adipogénesis pero no de forma tan importante como PPAR 0 C/EBPa. Su expresién ectépica induce la diferenciacién de la célula adigose probablemente induciendo la sintesis de ligendos enddgenos de PPARV*, 3. B, Ill, SENALIZACION EXTRACELULAR DE LA ADIPOGENESIS Existen diversos factores extracelulares capaces de activar vias de seftalizacién que en dltima instancia regulan los factores de transcripcién que se han comentado anteriormente y que controlan la adipogénesis. Estos factores, entre los que encontramos activadores ¢ inhibidores del proceso de adipogénesis, determinaran que los preadipocitos inicien el proceso de diferenciacién 0 permanezcan quiescentes. Entre los factores activadores se encuentra la Insulina, que promueve el almacenaje de lipides en el tejido adiposo y que promueve Ia diferenciacién aadipocitaria. También inhibe la lipdlisis inducide por catecolamines. En el tejido adipose la Insulina actua via el receptor de IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1), |GF-1R. n Otros inductores de la adipogenesis in vitro son los glucocorticoides (GC). Su accién probablemente regulada a través de los receptores de glucocorticoides (GR), es capaz de regular la actividad transcripcional de C/EBPB dirigiendo Ia acetilacién de este factor de transcripcién’. También son capaces de inducir répidamente c/eBrs'*. Otros moduladores posi jos de la adipogénesis son los deidos grasos mono- saturados 0 poli-insaturados, que parecen actuar como ligandos o precursores de igandos de PPARy. El cAMP también promueve la adipogénesis como se ha comentado anteriormente, induciendo la expresién de C/EBPB™*. Las prostaglan: también provocan la diferenciacién adipogénica de los preadipocitos. La prostaciclina (PG) es un metebolito del cio araquidénico que es capez de estimular la adipogénesis uniéndose al receptor IP de membrana de los preadipocitos. Esta unién activa la adenilato ciclasa y el consecuente aumento de cAMP que promueve la induccién de C/EBP6 y C/EBPB™’. Del mismo modo la PGI, también parece ser un ligando PPARy"**. En cuanto @ los inhibidores de la adipogénesis cabe destacar algunos de los mas conocides. | deido retinoic 2s un derivado de la vitamina A obtenida en la dieta. A altas concentraciones es capaz de inhibir la diferenciacién adipocitaria en las primeras 19 fases del proceso“? ya que en los pasos finales del proceso ya no resulta efectivo. Perece que su mecenismo de inhibicién se basa en impedir la induccién de los C/EBPs**. La Pref-1 (Preadipocyte factor 1) también es inhibidora de este proceso por 4s 151 ; mecanismos atin poco claros*™, Las glicoproteinas de la familia Wnt son importantes en la inhibicién de la adipogénesis. Estas glicoproteinas son capaces de unirse a receptores rizzled inician cascadas de seftalizacién que inhiben la diferenciacién de los preadipocitos afectando sobre todo a la induccién de los factores de transcripcién PPARy y C/EBPa*™*. La hormona de crecimiento (GH, Growth Hormone) es otro factor is, También las de los que inhibe el proceso de edipogénesis y activa la lipo! citoquinas Interleukin 1), IL-6, IL-1 0 IFNy (Interferon gamma) inhiben la preadipocitos****. Del mismo modo TGF-B (Transforming Growth Factor 1) es capaz de estimular la proliferacién de los preadipocitos inhibiendo su diferenciacién*”. flamatorias como son TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha), IL-1( renciacién de los 3. B. IV. EL TEJIDO ADIPOSO BLANCO COMO ORGANO DE RESERVA Y MOVILIZACION DE LIPIDOS Durante la alimentacién, los lipidos que provienen de la dieta son basicamente triglicéridos (TAG, triacylglycerol), algunos acidos grasos libres (FFA, Free Fatty Acids) , ecolesterol y otros esteroles. Estos lipides pueden acceder al torrente sanguineo como auilomicrones, via el sistema linfético o via el higado que ayude @ distribuir los lipidos, esterificando los cidos grasos a triglicéridos y empaquetdndolos en forma de VLDL (Very Low Density Lipoprotein). Una vez que los quilomicrones y las VLDL interaccionan con LPL (Lipoprotein Lipase) de las células endoteliales, se liberan écidos grasos no icados (NEFA). Los dcidos grasos se tansportan dentro de las células almente por dos tipos de transportadores: los CD36 y la familia de proteinas transportadoras de écidos grasos (FATP, Fatty Acid Transport Protein) formada por 6 miembros no homélogos a CD36. Una vez en las células los acidos grasos se esterifican a aciles CoA y su destino varia dependiendo del tipo celular. En el tejido adiposo de humanos cercanos a su peso ideal, el primer destino de los Aciles CoA de cidos grasos es su reesterificacion a triglicéridos'**. En cambio durante el ayuno el tejido adiposo se convierte en fuente principal de Acidos grasos. Se da una cafda del ratio insulina-glucagén y las catecolaminas aumentan activando la lipdlisis en el tejido adiposo, hecho que genera dcidos grasos y glicerol. De este mado el ayuno provoca la estimulacién de la oxidacién de los dcidos grasos y un descenso del uso de la glucose en varios tejidos para que otros tejidos que dependen de ella exclusivamente, como el cerebro, pueden seguir funcionando. El higado es el primer drgano en el que se inhibe la oxidacién de glucosa, reduciéndose el flujo de sus metabolitos hacia las vias mitocondriales. También se inhibe la lipogénesis y se estimule la oxidaci6n de los dcidos grasos, basicamente por la des-represién de la CPTA (Carnitine Polmityl Transferase 1), enzima que permite la entrada de dcidos grasos a la mitocondria. Esta oxidacién de dcidos grasos conlleva la inhibicién de la oxidacién de la glucosa ya que la acumulacién de Acetil CoA, NADH y ATP inhiben alostericemente le piruvato deshidrogenasa (PDH). El efecto neto de todo este proceso es un aumento de tasa de oxidacién de dcidos grasos y una disminucién de la glucosa*®, Por otro lado también se observa durante el ayuno un descenso de la expresi6n del transportador de glucosa GLUT-4 en el tejido adiposo, asociado a cierta resistencia a la insulina™*. 3. B. V. EL TEJIDO ADIPOSO BLANCO COMO ORGANO ENDOCRINO Tradicionalmente el tejido adiposo blanco ha sido considerado como un almacén de lipides metabélicamente pasivo. En cambio en 1994, se descubrié la leptina, una hormona secretada por el tejido adiposo blanco, que revolucioné la idea que se tenia del tejido adiposo blanco. Actualmente esté ampliamente aceptado que el tejido adiposo blanco es un érgano endocrino que secreta un alto nimero de hormonas y otros factores que pueden actuar a nivel autocrino 0 endocrino. A estas hormonas se les ha llamado adipoquinas y juegan un papel muy importante en el control de la ingesta, la homeostasis metabdlica y en el desarrollo de alteraciones 0metabilicas relacionadas con la obesidad, sobre todo la diebetes mellitus tipo II o las 150162 enfermedades cardiovasculares La primera adipoquine que se descubrié fue la hormona leptina. Es producida en un 95% por el tejido adiposo, especialmente por los depésitos subcuténeos. Sus niveles circulantes se correlacionan positivamente con el indice de masa corporal". La falta de leptina o la de su receptor provocan obesidad mérbida tanto en ratones ‘como en humanos"**. sus niveles en plasma parecen estar afectados por la insulina, la 15455, entrada de glucosa a los adipocitos y por reguladores del sistema nervioso simpatico*""_ En cuanto a sus funciones, actuando a nivel hipotaldmico, la leptina inhibe la ingesta y activa el gasto energético y le funcién neuroendocrina, regulando de esta manera el peso corporal. Entre otros también se han descrito funciones \n, fa funci6n de la placenta, respuesta 368168 reguladoras durante la pubertad y la reproducci inmune y sensibilidad del musculo y el higado a la insulina La adiponectina también es una adipoquina que se expresa preferentemente en el tejido adiposo blanco subcutdneo y circula por el torrente sanguineo en forma de varias isoformas multiméricas’””. Se conocen dos receptores de adiponectina, AdipoR1 y R2.”" que se expresan principalmente en el musculo y el higado respectivamente. En pacientes obesos se ha observado un descenso de adiponectina en la obesidad’”, “7? 9 estados de inflamacién™™, m7 1g enfermedades relacionadas con la resistencia @ insulina’ mientras que al recuperar un estado de geso normal se recuperan los niveles administracién de adiponectina recombinante revierte la resistencia 2 insulina incrementando la oxidacién de dcidos grasos, la disipacién de energfa en el musculo esquelético, suprimiendo la inflamacién en el propio tejido adiposo asi como reduciendo la captacién de glucosa por parte del higado. Los dcidos grasos libres no esterificados (NEFA) suponen el producto de secrecién més importante de los adipocitos blancos, que también liberan otros derivados lipidicos como son el colesterol, retinol, hormonas esteroides y prostaglandinas””>. Los NEFA provienen de la lipdlisis que se da en los adipocitos y pasan al torrente sanguineo dond= normalmente aparecen acompaitados por la albimina, Ademés de su tarea como sustrato energético, también juegan un importante papel como moléculas sefializadoras relacionadas con la regulacién de la expresion génica de diversos genes. Los tejidos lipogénicos como el higado o el propio WAT son capaces de sintetizar de novo los 4cidos grasos (lipogénesis) gracias a la glucosa, por ese motivo estos mismas tejidos son las principales dianas de regulacién génica por parte de los dcidos grasos. De esta manera los NEFA son capaces de estimular la transcripcién de proteinas implicadas en el transporte y el metabolismo de cides grasos, como son FABP (Fatty Acid Binding Protein), la LPL ,la CPT-1 0 las proteinas desacoplantes 2 y 3, entre otras. Del mismo modo también son capaces de inhibir la transcripcin de algunas proteinas implicadas en el metabolismo como son el 40transportados GLUT4 o la L-PK (Liver Piruvate Kinase) asi como la FAS (Fatty Acid Synthase|""*, Uno de los mecanismo para llevar a cabo su funcién de reguladores de expresién génica es uniéndose de forma directa a algunos receptores nucleares de hormonas, como los PPAR™*. Las citoquinas proinflamatorias son otro producto secretado por el tejido adiposo blanco. En 1993 se demostré que ratas obesas sufrian un aumento de ‘expresién de TNFa en su tejido adiposo””. La TNFa es una proteina transmembrana que sufre procesos proteoliticos por los cuales se da lugar a la forma activa de la proteina que acta sobre dos receptores (I y Il). Su sintesis se da tanto en adipacitos como en células del estroma vascular’, En un principi pero hoy en dia se sabe que esta implicado en la patogénesis de la obesidad y la resistencia a insulina’””*”°, Desde que se descubriera la TNFa se han descrito una serie se relacion6 con la caquexia, de factores pro-inflamatorios que van ganando protagonismo en la determinacién de la obesidad como un estado inflamatorio siendo el tejido adiposo uno de los érganos patogénicos principales. Entre estas citoquinas pro-inflamatorias encontramos TGFB, el interferén y, interleuquinas (1, 6, 10 0 8), MCP1 (Monocyte Chemotactic protein 1) y otros factores de le cascada del complemento como pueden ser metalotioneina, fibrinégeno o plasminégeno****. Estas pueden ser producidas por células del estroma vascular y también por adipocitos. Cuando la masa del tejido adiposo aumenta estos factores circulantes aumentan, y relacionado a este aumento de masa también se ha descrito un aumento en Ia activacién de dos cascadas tipicamente inflamatorias como son la de la JNK (c-Jun NHz-terminal Kinase)""*"** y la de la IKKB (ikappaB Kinase 6)**° en hepatocitos, hecho que se ha asociado a la resistencia a La protefna de unién a retinol RBP4 (Retinol Binding Protein 4) es el transportador especifico de retinol (vitamina A), y 2 pesar de que el higado es el 6rgano principal de secrecién el tejido adiposo también es capaz de sintetizerle y secretarla en cantidades importantes que pueden llegar a significar el 20% de los producido por el higado™’. En 2005 se sugirid que el tejido adiposo secretaria RBP4 ante la ausencia de glucosa para inhibir la seffalizaci6n por la insulina en el miisculo y activar la expresién en higado de PEPCK (Phosphoenolpyruvate carboxykinase), un enzima gluconeogénico, siendo el resultado neto un aumento de glucosa circulante™*. Pero estudios posteriores han puesto en debate la relacién de RBP4 con la resi insulina. La resistina es otra adipocitoquine. Originariamente fue descrita como inductora de la resistencia a insulina***°, La produccién de resistina en humanos se do en diferentes tejidos entre ellos el tejido adiposo blanco. Parece que las células que mas altamente la expresan son los PBMCs (Peripheral-Blood Mononuclear cells). Su expresién parece estar inducida por citoquinas proinflamatorias como las ainterleuquinas 1 y 6 o el TNFa“. También se ha descrito que le administracién de . i 5300392 agonistas PPARy atentia su expresién 9 ‘ #52 Hoy en dia se debate su implicacién en la resistencia a insulina. 3. B, VI. DISTRIBUCION DEL TEJIDO ADIPOSO BLANCO, EL DEPOSITO VISCERAL FRENTE AL SUBCUTANEO EI telido adiposo blanco se distribuye anatémicamente en diferentes depdsitos por el cuerpo de manera subcuténea en lo conocido como tejido adiposo subcuténeo (SAT, Subcutaneous Adipose Tissue) 0 en un depésito intra-abdominal llamado tejido adiposo visceral u omental (VAT, Visceral Adipose Tissue). Las areas en las que principalmente podemos encontrar tejido adiposo blanco subcuténeo son las regiones femorogluteales y los depdsitos abdominales. Entre este Ultimo y el tejido adiposo visceral se encuentran los miisculos abdominals marcando una clara separacién entre ambos. Esta distribucién es importante ya que existen diferencias entre las caracteristicas estructurales y funcionales entre el depésito visceral y el depésito subcuténeo. El 80% de la grasa total en humanos, se encuentra en el tejido adiposo subcuténeo, y el depésito visceral cuenta con un 10-20% en hombres y un 5-8% en mujeres‘? Figura 12. Distribucién anatémica difarencial de los depdsitos de tejide adipose visceral y subcutineo. Teo adiposo weceralo omental La acumulacién de grasa en forma de triglicéridos en el tejido adiposo subcuténeo representa el almacenaje habitual del exceso de energia obtenido en la diets. Pero en algunas situaciones en las cuales se excede la capacidad de almacenaje de este depésito o existe algiin motivo que inhibe la copacidad de generar nuevos adipocitos en el tejido ediposo subcuténeo, bien sea por una predisposicién genética 0 por motivo del stress, el exceso de energia comienza a acumularse en otras éreas 2como el tejido adiposo visceral"*. A pesar de esto, es dificil establecer un patrén por el cual el tejido adiposo visceral aumente de volumen ya que, a pesar de su relecién con el aumento de BMI (Body Mass Index) y obesidad, existen individuos no obesos que presentan un aumento de adiposidad visceral en los cuales se aprecian diferencias metabdlicas inter-individuales y del mismo modo, pacientes obesos que no muestran un aumento del depésito omental, indicando que puede existir una pre 138:186 posicién de algunos individuos a acumular grasa en este depésito omental Observando la distribucién de los depdsitos omental y subcuténeo, una de las primeras diferencias que podemos apreciar es que el depésito visceral est4 directamente irrigado por la vena porta”, en cambio el tejido adiposo subcuténeo aparece irrigado por venas de la circulacién sistémica periférica. La vena porta, conduce directamente al higado y debido a esto los FFA y las adipoquinas secretadas por el tejido adiposo visceral tendran una conexién inmediata con el higado pudiendo #8199 Ademés en este dmbito, cabe destacar que el tejido adiposo visceral esté més vascularizado, mds irrigado y més inervado que 138 generar diferentes respuestas en éste el subcuténeo’ En cuanto a los adipocitos presentes en ambos tejidos adiposos se han observado algunas diferencias. Entre ellas es interesante el hecho de que el tejido adiposo visceral presente un mayor tamafio medio de adipocitos en contraste con el subcuténeo, que si bien posee adipocitos de gran tamajio, también se pueden observar pequefios adipacitos!?”2092%2, Este hecho, que ha sido observado significativamente en un estudio con hombres, estd relacionado con una tendencia ceral, ya que los adipocitos de mayor tamafio resultan més disfuncionales mostrando esta resistencia al efecto mayor a la resistencia a Ia insulina en el tejido adiposo anti-lipolitico de la insulina y siendo metabdlicamente mAs hiper-lipoliticos que los adipocitos presentes en el SAT“77°° adipocitos de! VAT son més insulino resistentes o resistentes a la accion anti-lipolitica *. En otros estudios se ha demostrado que los de Ia insulina que aquellos del SAT?“ y esto parece estar altamente relacionado con las pruebas que muestran que los pacientes con mayor volumen de grasa en el a la insulina @ pesar de existir un debate sobre si es una causa 0 un efecto™. De acuerdo con esto, diferentes estudios depésito omental sufren una mayor resisten han determinado que los adipocitos de SAT presentan una mayor captacién de triglicéridos y FFA que los viscerales y en cambio parece que los adipocitos de la zona visceral son capaces de captar més glucose**"*, Resulta interesante la diferencia en la presencia de diferentes receptores implicados en las funciones del tejido adiposo que se evidencia entre ambos depésitos y que ademés pueden explicar las diferencias inter-sexuales que se muestran entre los tejidos adiposos subcutneos y el omental. Los receptores de andrégenos presentan, una mayor densidad en el VAT que en el SAT”, En cambio la densidad de receptoresde estrégenos parece ser mayor en el tejido adiposo subcuténeo™*, hecho que podria ser protectivo contra la acumulacién de grasa en el VAT, ya que favoreceria la acumulacién periférica de la grasa. Este hecho va acorde con las diferencias inter- sexuales que se aprecian en cuanto a la adiposidad visceral. Con la edad en ambos sexos el tejido adiposo subcutdneo va descendiendo de volumen mientras el tejido adiposo visceral va aumentando la acumulacién de grasa, pero este hecho es mas 277 ya que los estrégenos parecen tener una patente en hombres que en mujeres funcién protectora en estas Ultimas. En cambio en mujeres post-menopéusicas la curva de aumento de le adiposidad visceral se iguala a la de los hombres“. De esta manera, siendo los andrégenos movilizadores de lipidos, y reduciéndose en hombres los niveles de testosterona con la edad, y reduciéndose los estrégenos en las mujeres tras la menopausia, adquiere sentido la correlacién existente entre la acumulacién de grasa enel VAT y la edad. En cuanto al control nervioso de Ia lipdlisis, se ha descrito un aumento en la cantidad de receptores Bz-adrenérgicos en el VAT respecto al SAT. Estos receptores han sido descritos como capaces de provocar lipdlisis via aumento de cAMP en adipocitos aislados de tejido adiposo visceral”**”, Este hecho se suma a los estudios que indican que el tejido adizoso visceral es ms sensible que el subcuténeo a la lipélisis provocada por las catecolaminas por una mayor sensibilidad de sus receptores B adrenérgicos 1 y 2 que los mismos en el SAT"“°. Ademas también se ha observado una menor sensibilidad en el tejido adiposo visceral de los receptores inhibidores de la lipélisis ag-adrenérgicos, hecho que refuerza el estado metabélico mas lipalitico debido a la mayor sensibilidad a las catecolaminas de este depdsito omental”!+2!? También se han descrito diferencias entre el VAT y el SAT en cuanto ala sintesis y la secrecién iferencial de adipoquinas en ambos depésitos. &l tejido adiposo subcuténeo parece secretar més leptina™*?¥, siendo la mayor fuente de esta. En cambio la adiponectina se expresa en mayor cantidad en el VAT. En cuanto a las adipoauinas proinflamatorias como la ILE o IL8, es interesante comentar que el tejido adiposo visceral esté mas infiltrado por células inflamatorias que el SAT, y por lo tanto presenta una mayor capacidad de generar estas proteinas que este ultimo™*”"”, Es interesante mencionar en este Ambito, que el VAT se asocia también con una mayor secrecién de mcP1™ El aumento de adiposidad visceral se ha relacionado estrechamente con la re encia a la insulina y el sindrome metabdlico' >". De tal manera que hoy se ha convertido en una de las alteraciones que forman parte de la combinacién de disfunciones que forman dicho sindrome como son: _hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, resistencia a insulina, hipertension y la propia adiposidad visceral que suele ser medida por el WHR (Waist to Hip Ratio) o técnicas de imagen como la DEXA (Dual-emission X-ray absorptiometry). De hecho es uno de los sintomas que 4sugieren une future apericin del sindrome metabdlico™®. De este modo existen un gran némero de estudios que asocien la adiposidad visceral y no la subeuténee con un alto riesgo de sufrir accidentes cardiovasculares™”. Este hecho tiene sentido asumiendo que existe una hiperinsulinemia asociada a la adiposidad visceral que puede provocer una hipertensién arterial y un aumento en la secrecién de PAIL, factor trombogénico, por parte de este tejido adiposo™. La capacidad del tejido adiposo visceral de ser metabélicamente mas lipalitico que el subcuténeo por su mayor sensibilidad a las catecolaminas y ademés siendo su \dicar respuesta a la insulina mas resistente que en el depdsito subcutdneo, parece it que este tejido adiposo omental contribuye en mayor medida al aumento de FFA en plasma**#**, Como se ha comentado la irrigacién por la porta de este tejido adiposo omental provoca una conexién directa con el higado y de esta manera, diversos autores han propuesto que se podria dar un aumento crénico de FFA en plasma provocado por este hecho y que esto podria provocar disfunciones hepaticas provocando finalmente una intolerancia a glucosa, hiperinsulinemia, resistencia a insulina © dislipideria, explicando la relacién entre el aumento en el tejido adiposo .. i , 294 visceral y la resistencia a le insulina y el sindrome metabdlico™*. 3. C. TEJIDO ADIPOSO MARRON En los ult imos afios se est levando @ cabo un (re)descubrimiento del tejido adiposo marrén en humanos. Se asumia que este tejido, importante para los neonatos humanos desaparecta a los pocos meses del nacimiento. Fue descrito que algunas células adiposas del tejido adiposo blanco, eran capaces de expresar marcadores espectficos de tejido adiposo marrén, como la protein UCP1 (Uncoupling Protein 1) asumiéndose que algunos adipocitos del tejido adiposo blanco tenian un fenotipo brown-like 0 que existian edipocitos marrones infiltrados en el tejido adiposo blanco. Pero fue mas tarde y gracias al PET (Positron Emission Tomography) cuando se pudo identificar los depdsitos de tejido adiposo marrén en humanos adultos”. Hoy en dia se asume la presencia de este tejido adiposo en humanos y se relaciona su presencia y funcionalidad tanto con la termorregulacidn, como se explica a continuacién como con un gasto energético que eyuda @ mantener |e homeostasis metebdlica evitando un excesivo almacenaje de grases, ha! nueva diana para presentes y futuras investigaciones que intentan evitar la cada dia més comin entre las sociedades desarrolladas obesidad y sus problemas metabélicos ndose convertido el tejido adiposo marrén en una asociadosFigura 13. Morfologia tipica de los adipocites marrones. NUCLEO ECHO. as LFIGICS \ MTOCONNRIS La capacidad de mantener la temperatura corporal o eutermia es una de las funciones bésicas de los animales superiores. Existen diversos mecanismos dirigidos a generar calor y mantener I temperatura. €n cuanto a la generacién de calor se destacan dos mecanismos. Uno i pica, en aves y mamiferas el temblor provocado por el sistema muscular que se contree involuntariamente para producir calor. El otro, en mamiferos, es la termogénesis no asociada a temblor que se lleva a cabo en el tejido adiposo marrén™*. Por otro lado este mismo tejido juega un importante papel en la termogénesis adaptativa inducida por la dieta que sirve para regular el gasto energético y el peso corporal. El tejido adiposo marrén se localiza en los pequetios mamiferos en diversas zonas del arganisro como la regién interescapular, cervical, axilar, intercostal y envolviendo la aorta, el timo y los riffones” los érganos y vasos sanguineos principales. En humanos se aprecia una distribucion, ademés de la forma difusa en la que se mezclan adipocitos marrones en el tejido . Esta distribucin permite la transferencia de calor a adiposo blanco, que implica zones cervicales-supraclaviculares asi como renales 0 perirenales y zonas paravertebrales cercanas a los vasos principales” EI color marronoso del tejido adiposo marrén viene dado por su alta vascularizaci6n asi como por su alto contenido en mitocondrias. La alte vascularizacién responde a una demande de una alta tasa de perfusién para llevar a cabo la activided termogénica, ya que esta requiere mucho oxigeno y sustratos que necesarios para las mitocondrias, asi como un medio para exportar el calor producido””. Es importante tambign en este telido le alta inervacién del sistema nervioso simpatico que la controla desde tres areas del cerebro: El hipotélamo anterior, que controlaria la actividad del tejido al bajar la temperatura, el centro hipotelémico ventromedial (centro de la 6saciedad) que activa el tejido en relacién e la ingesta y por ultimo, el centro lateral hipotalamico (centro del hambre) que inhibe la actividad del tejido durante el ayuno. En el tejido adiposo marrén hay principalmente adipocitos marrones que representan un 40% del total de las células de este tejido*®. El resto son células endoteliales, fibroblastos, células perivasculares mesenquimales, preadipocitos, mastocitos y células de Schwan que conforman el estroma vascular. El sustrato principal de los adipocitos marrones son los Acidos grasos que se almacenan en forma de TAG en las numerosas gotas lipidicas que podemos encontrar en su citoplasma Cuanto mayor es la actividad de la célula mds pronunciada es la disposicién multivacuolar de los depésitos de lipidos, lo que permite una més fécil mo. las reservas para su oxidacién. Esta oxidacién se lleva a cabo en las numerosas mitocondrias, grandes, de morfologia alargada y con un alto ntimero de crestas altamente desarrolladas que indican su alta actividad. La membrana de estos adipocitos presenta un alto numero de receptores ay B adrenérgicos”™*, acion de La capacidad de producir calor que presenta este tejido es debida a un desacoplamiento regulado de la cadena respiratoria y la fosforilacién oxidativa que permite que la energie se disipe en forma de calor. Un adipocito marrén diferenciado expresa en sus mitocondrias UCP1, que es la proteina de la membrana mitocondrial interna que permite este desacoplamiento y la comentada produccién de calor**. 3. C. I. DIFERENCIACION ADIPOCITARIA DEL TEJIDO ADIPOSO MARRON Los adipocitos marrones, como los blancos derivan de las células del mesodermo”. Su proceso de adipogénesis no esta tan bien caracterizado como el del adipocito blanco. Su desarrollo en mamfferos se da sobre todo durante el periodo fetal 0 inmediatamente post-natal madurando los primeros dias de vida”**. A lo largo de su diferenciacién intervienen también factores de transcripcién de la familie de los PPAR y de los C/EBP, También adquiere una gran importancia en le diferenciacién del adipocito marrén el coactivedor PGC-1a (PPARY Coactivator 1)**° y el recientemente descubierto PRDM15™*. A los largo de su diferenciacion adquieren la tipica morfologia multivacuolar y con un alto numero de mitocondrias, asi como la capacidad especifica termogénica con la expresién de genes caracteristicos del metabolismo lipidico y de la biogénesis y diferenciacién mitocondrial, asi como la expresién de UCP1, considerado el principal marcador de este tejido™®, a3. C. Il. CASCADA DE ACTIVACION DE LA DIFERENCIACION Y FACTORES IMPLICADOS Tal y como sucede en el adipocito blanco, los factores de transcripcién que son considerados responsables del proceso de diferenciacién de los adipocitos marrones pertenecen bésicamente a las familias PPAR y C/EBP. PPARy presenta un perfil de expresién parecido a C/EBPa y su papel podria ser similar al que tiene en el tejido adigoso blanco™***, La administracién de TZD promueve igualmente la diferenciacién de los preadipocitos e induce el crecimiento del tejido adiposo interescapular™*. Siguiendo con la familia de los PPAR, se cree que PPARE controla la proliferacion de preadipocitos’**. PPARa parece estar inducido por la disminucién de expresién de PPAR6™*, y a diferencia del tejido adiposo blanco su expresién es alta y tiene lugar posteriormente a la de PPARY y PPAR6, coincidiendo con la adquisi inducen la expresién de UCP1 y UCP3, proteinas marcadoras de la adquisicién del fenotipo marrén diferenciado™”. Entre los diferentes estudios realizados en tejido adiposo marrén y blanco se intuye que PPARy no es, aparentemente, el primer factor en determinar si una célula adiposa asume un fenotipo marron?*”"*, de hecho ambos tipos de adipocitos parecen estar determinados a un tipo de diferenciacién dependiendo de su origen fibroblastico”™*"* (figura 14). 1n del fenotipo diferenciado terminal. En el tejido adiposo marrén los PPAR La importante implicacién del tejido adiposo marrén en el balance energético ha motivado un gran interés por conocer las claves de la determinacién de la diferenciacién de estos adipocitos ya que se busca el modo de transformar células adipociticas blancas en marrones pare convertir células que elmacenan gresa en células que las oxidan. En este aspecto es importante destacer PGCla, coactivador con una importante presencia en el tejido adiposo marrén respecto al blanco. Este coactivador es capaz de activar el programa termogénico cuando es expresado ectépicamente en adipocitos blancos, haciendo que expresen UCP1, proteinas de la cadena respiratoria y enzimas que toman parte en la B-oxidacién mitocondrial™+?. Este coactivador esté implicado en miltiples procesos relacionados con el metebolismo energético celular y la capacidad y funcionamiento mitocondrial. Preadipocitos de TAM carentes de PGC1a son capaces de diferenciarse, pero en cambio se reduce severamente la induccién de genes termogénicos via cAMP™?. Por tanto PGCla parece esencial para la respuesta termogénica pero no para la diferenciacién del adipocito marrén™“*. Otro factor que parece influenciar selectivamente el fenotipo marrén es FOXC2 (Forkhead box C2), que es capaz de inducir algunas caracteristicas de adipocitos marrones en blancos™*. Es interesante resaltar que se han descrito factores que reprimen la expresién del fenotipo marrén en adipocitos blancos, como san: Rb (retinoblastoma), p107 o RIP140 (Receptor Interacting Protein 140/°°**", 6Recientemente se ha identificado PRDM16 (PRDI-BFI-RIZ1 homologous domain- containing protein 16) 0 MEL1 como un factor clave en la diferenciacién adipocitaria igado, rifién y cerebro y de forme diferencial en el tejido adiposo marrén respecto al blanco. Se expresa en marron, Se trata de una proteina que se expresa en el adipocitos maduros. No se aprecia que su expresién se induzca por el frio 0 por la presencia de cAMP, lo que sugiere que esté més relacionada con la determinacién y la diferenciacién que con la respuesta termogénica. Su expresién ectépica en tejido adiposo blanco es capaz de inducir la expresién de genes caracteristicos del BAT como UCP1, PPARa, la desiodasa 2(DI02), PGC1a y genes del sistema OXPHOS (oxidative phosphorilation), asi como de reprimir genes especificos del tejido adiposo blanco ‘como la resistina y la adiponectina™*. La ausencia de PRDM16 en cultivos primarios de adipocitos marrones promueve una diferenciacién hacia células musculares y lo mismo ocurre con ratones deficientes en PRDMI6. Esto indica que PRDM16 es un determinante critico pare la determinacién del linaje del precursor de tejido adiposo marrén”™, Parece que PRDM6 acta de manera independiente a unién a DNA. Este hecho sugiere que su accién tiene lugar a través de la interacci6n con otras proteinas. Se ha descrito que PRDM16 forma un complejo transcripcional con C/EBPB™*. De hecho la deplecién de C/EBPB impide la accién de PROM16 de inducir la diferenciacién a adipocito marrén y la combinacién de estos dos Factores es suficiente para inducir un fenotipo marrén en células no adipogénices como fibroblasts embrionarios o de la piel Estas evidencias y otras acumuladas a lo largo de los ultimos affos parecen indicar ue los adipacitos marrones tienen un origen mas cercano @ los miocitos que a las células del tejido adiposo blanco. Estudios de caracterizacién indican que los adipocitos marrones de la zona interescapular y el musculo esquelético, a diferencia de los adipocites blancos, provienen de las células que expresan Myf5, un gen que hasta ahora se asumia que se expresaba exclusivamente en células de linaje muscular”. Ademés se he descrito en estudios de expresién génica global que los precursores de adipocitos marrones muestran un perfil de expresion muy parecido a las células de misculo esquelético, mientras que los precursores del tejido adiposo blanco no. También se ha determinado que el perfil proteémico del BAT es mas cercano con el perfil muscular que con el de WAT”. 49Figura 14, Relacién entre la diferenciacién adipogénica de los adipocitos marronas y los biancos con los factores implicados con una posible via de transdiferenciacién de los adipocites biancas un fenotipo Brown-ike par diversos estimulos. (Adaptado de CCristancho A. et ol. Nature. 2011) —] f * PRARY $ rgpete Pap he wes . on S22 EE | = Adieocto ‘Adoocito Miocito ‘ansciferenciaco a Mann Brownie Uno de los factores que se cree que puede estar relacionado con la expresién de PRDM16 y PGCia en adipocitos y fibroblastos multipotenciales es BMP7 (Bone Morphogenetic Protein-7), miembro de la superfamilia TGFB™*. Como se ha comentado existen células adiposas marrones dentro del WAT. Estos adipocitos marrones expresan UCP1 y receptores B-3 adrenérgicos pero no parecen tener un origen comun 2 los adipocitos marrones del BAT ya que sus precursores no expresan MyfS. Hasta el momento no se ha podido determinar cémo estos adipocitos adquieren un fenotipo brown-like y si tienen un origen comin al de los adipocitos blancos“® 23. C. Ill, TERMOGENESIS ADAPTATIVA ¥ FACTORES QUE LA REGULAN En general la capacidad del tejido aciposo marrén de generar calor depende de la temperatura ambiental, el estado de desarrollo y de la ingesta, ya que estos Factores parecen influir en la cantidad de proteina desacopladora presente en la membrana de la mitocondria como su actividad. El principal estimulo para la termogénesis es la disminucién de la temperatura ambiental que se asocia a un aumento en la expresién de UcP1"*”. En la exposicién aguda al frio se observa un incremento de actividad simpética, una répida respuesta termogénica en el tejido adiposo marrén y un aumento de flujo sanguineo en este tejido. En una exposicién crénica aumenta la proliferacién y diferenciacién de prea mitocondrias € incremento de sintesis de proteinas UCP1, LPL, DIO2 y enzimas implicados en la B oxidacién™*, nde jocitos (recruitment), prolifera Durante la ingeste también se estimula el tejido ediposo marrén, incrementéndose la actividad del sistema nervioso simpético sobre el tejido ediposo marron, estimulando la actividad termogénica**. De esta manera el BAT participa en la regulacién del peso corporal*. Los animales que son sometidos a dietas hipercaléricas, presentan una hipertrofia de! tejido adiposo merrén y una alta expresién de UCP 12°. 7 © las hormonas tircideas™*** también Ademds, hormonas como la leptina”” regulan positivamente la actividad del BAT. Y por otro lado se disminuye su activided 260 inocaléricas?* por altas temperaturas, durante el ayuno™®, dietas hipocaléricas™* o por glucocorticoides™”, La noradrenalina (NA) es capaz de interactuer con diferentes receptores adrenérgicos que se asocian a diferentes vias de sefializecién. El BAT expresa los 3 receptores 8 adrenérgicos (1, 2 y 3), siendo el Bi y el B3 los que participan en la respuesta termogénica™*. Estos receptores estan acoplados a proteina G™* y cuando son estimulados se incrementan los niveles de cAMP a través de la adenilato ciclasa. Este aumento active PKA (Protein Kinase A) que es capaz de activar la lipasa sensible a hormonas (HSL, Hormone Sensitive Lipase) que incrementa la lipdlisis y promueve consecuentemente la termogénesis favoreciendo la activacin de UCP1 por los dcidos grasos liberados**. Ademés a la vez que esto sucede se de una induccién de expresién de UCP1. PKA activa une cascada de proteinas quinasas (como la MKK3 Map Kinase Kinase 3) que finaliza con la activacién de p38 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase)". La p38 es capaz de fosforilar el factor de transcripcién ATF2 (Activating Transcription Factor 2) y CREB (cAMP Response Element Binding protein). Ademas PKA contribuye de forma directa también a la fosforilacién de CREB. Por Ultimo estos factores se unen a elementos de respuesta en el promotor de UCP1 y PGC1a activando su transcripcién”*”"*, Por otro lado le p38 también fosforila PGCLa que coactiva otrosfactores de transcripcién que se unen el promotor de UCP1 como los PPAR, RAR (Retinoic Acid Receptor) y TR (Thyroid hormone Receptor). Todos estos procesos permiten mantener la respuesta termogénica aumentando la mitocondriogénesis dependiente de PGC1a y aumentando los niveles de proteina ucp1*?”9, Los receptores B1-adrenérgicos estan involucrados en el incremento de la division celular que se da en el BAT en respuesta al frio”™. EI BAT también presenta dos subtipos de receptores a-adrenéraicos (1 y 2). La activacién de los a, estimula la proteina Gi ¢ inhibe la adenilato ciclasa disminuyendo los niveles de cAMP que se producen durante la estimulacién simpatica del tejido. Los a1 en cambio producen un aumento de inositol-trifosfato””” y un aumento de calcio intracelular”*. La estimulacién simultanea de los receptores ai y los B-adrenérgicos resulta en un incremento del efecto provocado por el cAMP”, El tejido adiposo marrén es capaz de producir hormona tiroidea activa (T3, 3,3°5- dotironina) a partir de tiroxina (T4) gracias a la expresién en el BAT del enzima desiodasa 2 (type II iodothyronine deiadinase)*** cosa que no ocurre en el WAT. Le T3 a4 . la T3 es producida en el BAT puede incluso ser liberada al torrente sanguineo’ necesaria para la termogénesis inducida por el frio y actua de forma sinérgica con la a a diferentes niveles: activando la adenilato ciclasa, en el efecto de cAMP sobre la lipdlisis y en la accién termogénica de los dcidos grasos sobre las mitocondrias””. El efecto del frio sobre la accién de la desiodasa 2 viene vehiculado noradrenalit ereicot™® , por los receptores ail y B-adrenérgicos’”. Le hormona que se produce en situaciones de frio es suficiente pare saturer sus receptores nucleares y activar junto a la NA, la expresion de UCP1"**” al unirse a sus elementos de respuesta en el promotor””**”. Otro factor a tener en cuenta es el dcido retinoico (RA, retinoic acid) derivado de la vitamin 4 que toma parte en la proliferacién celular, morfogénesis y diferenciacién de diversos tejidos en mamiferos. Hay dos isémeros que principalmente llevan a cabo esta funcién, se trata de 9-cis RA y el all-trans RA. Su funcidn se lleva a cabo a través de factores de transcripcién dependientes de ligando como son el RAR y el RXR, siendo el all-trans RA ligando especifico del RAR y el 9-cis RA panagonista de ambos factores de transcripcién™. Los efectos sobre RAR en adipocitos marrones activan la expresién de uce1”**?* por una parte y por otra, paraddjicamente, pueden inhibir le diferenciacién a ‘ 283 a adipocito, cosa que sucede también en los adipocitos blancos™*. Por otra lado el Acido retinoico 9-cis, capaz de activar RXR tiene efecto positive sobre la diferenciacién de los adipocitos marrones, tal y como sucedia con los blancos”*****, La insulina contribuye al mantenimiento de la capacidad termogénica del BAT y participa en el metabolismo del adipocito marrén estimulando la captacién de glucosa y Acidos grasos, asi como su oxidacidn, Se ha descrito que interviene en la diferenciacién a adipocitos marrones uniéndose a sus receptores de insulina/IGF1 y