Inleiding

Het doel is 16S barcoding van het DNA, om erachter te komen welk microbiotoom aanwezig
is in het gefermenteerde tomatenstengelsap, wat bewerkt is met Bokashi.
Het principe van de 16S barcoding kit is dat het DNA geamplificeerd wordt door middel van
PCR. PCR is gebaseerd op de wijze waarop een cel vermenigvuldigt bij de celdeling.
Aangezien er bij ons experiment te weinig DNA aanwezig is, wordt er een PCR gedaan om
ervoor te zorgen dat het DNA wordt vermenigvuldigd zodat het in de nanopore kan gaan.
Door middel van de 16S barcoding kit wordt het DNA vermenigvuldigt in de PCR, maar
daarnaast wordt het DNA ook gelijk gebarcoded doordat er 16S barcode aan de reactiemix
wordt toegevoegd.
De verwachting is dat er genoeg DNA wordt verkregen dat al gebarcoded is om verder te
gebruiken in het project.

Methode
Uitgevoerd volgens protocol ‘16S Barcoding Kit (SQK-RAB204)’, te vinden op de nanopore
site, Inholland 2021-2022

Materiaal
DNA
Nuclease-free water
Taq 2x mastermix
70% ethanol in nuclease-free water
Agencourt AMPure XP beads
10 mM Tris-HCL pH=8 met 50 mM NaCl
0,2 mL PCR epjes
16S Barcodes
Rapid Adapter
Minispin
PCR
Vortex

In het protocol staat dat er gebruik gemaakt moet worden van de Longamp taq 2x mastemix,
echter hebben wij deze niet op het lab daarom wordt er gebruik gemaakt van de normale
taq 2x mastermix. De longamp zorgt ervoor dat er grote stukken DNA geamplificeerd kan
worden, alleen hebben wij te maken met korte stukken DNA dus is de longamp niet nodig.

Veiligheid
Naam stof Ethanol
Gevaren

GHS02 GHS07
H225: Licht ontvlambare vloeistof en damp.
H319: Veroorzaakt ernstige oogirritatie.
Maatregelen P210: Verwijderd houden van warmte, hete oppervlakken, vonken, open vuur en andere ontstekingsbronnen.
Niet roken.
P233: In goed gesloten verpakking bewaren.
Wat te doen bij: BIJ CONTACT MET DE OGEN: voorzichtig afspoelen met water gedurende een
aantal minuten; contactlenzen verwijderen, indien mogelijk; blijven spoelen.
Afval Niet-halogeen houdende stoffen
Werkplan
Tijd Wat te doen
9:00-9:30 Inloop, dagstart
9:30-10:00 Concentratie bepalen van verkregen DNA op de qubit en nanodrop dus
qubit opstarten
10:00-10:30 Materialen pakken en voorbereiden 16S Barcodes:
16S Barcodes ontdooien, mixen dmv pipet en afdraaien en op ijs bewaren
10:30-11:00 Labjournaal bijwerken (alles er in schrijven wat er in moet!!!
11:00-11:45 Voorbereiden DNA:
10 ng DNA (afhankelijk van concentratie qubit en nanodrop)
Aanvullen tot 10uL met nuclease-free water

Reactiemix maken voor PCR:

Reagens volume
Nuclease-free water ?
DNA (10ng) ?
16s Barcode, at 10 uM 1 uM
Taq 2x mastermix 25 uM
totaal 50 uM
11:45-12:15 PCR inzetten, dus progamma instellen, te vinden in protocol
12:15-13:00 pauze
13:00-13:30 De rest van het protocol volgen tot stap 18 (poolen)
13:30-15:00 Kijken voor het poolen met de rest
15:00-16:30 Uitloop + opruimen en afsluiten
Naam stof Ethanol
Gevaren

GHS02 GHS07
H225: Licht ontvlambare vloeistof en damp.
H319: Veroorzaakt ernstige oogirritatie.
Maatregelen P210: Verwijderd houden van warmte, hete oppervlakken, vonken, open vuur en andere ontstekingsbronnen.
Niet roken.
P233: In goed gesloten verpakking bewaren.
Wat te doen bij: BIJ CONTACT MET DE OGEN: voorzichtig afspoelen met water gedurende een
aantal minuten; contactlenzen verwijderen, indien mogelijk; blijven spoelen.
Afval Niet-halogeen houdende stoffen