Protocol: uitvoeren van een PCR

Benodigdheden

- Commercieel pUC18 plasmide DNA

- Zelf geïsoleerde plasmide DNA
- DNAse en RNAse vrij water (DEPC behandeld water)
- PCR reactie mix ( bevat the forward en reverse primers, de DNTP’s en het Taq polymerase in PCR
buffer)
- Steriele PCR eppjes
- Steriele 1,5 mL eppjes
- Steriele pipetpuntjes (P1000, P200, P20)
- PCR apparaat

Voor de pUC18 vector zijn de volgende primers aanwezig die gelegen zijn aan beide zijden
van de Multiple Cloning Site (MCS):
reverse primer: 5’-tga-gcg-gat-aac-aat-ttc-ac-3’
forward primer: 5’-ccc-agt-cac-gac-gtt-gta-3’

De PCR mix bestaat uit:

Conc. Voor 1 reactie Voor 10 reacties Eind conc. (na

toevoegen DNA)
PCR buffer 10X 2,5 µl 25 µl 1X
dNTPs 10 mM 0,5 µl 5 µl 0,2 mM
Fw primer 10 µM 1 µl 10 µl 0,4 µM
Rv primer 10 µM 1 µl 10 µl 0,4 µM
MilliQ 17,8 µl 178 µl
Taq polymerase 5 U/µl 0,2 µl 2 µl 1U
Totaal 23 µl

Al deze materialen van New England Biolabs.

Uitvoering

Per reactie wordt gebruik gemaakt van 23 µl mastermix en daarbij wordt gepipetteerd:
2 µl DNA verdund tot 1-10 ng (geïsoleerd m.b.v. de Macherey-Nagel kit)

Pipetteer in steriele PCR epjes 23 μl PCR mix.

Voeg 2 μl 2 µl DNA verdund tot 1-10 ng (geïsoleerd m.b.v. de Macherey-Nagel kit) (1-10 ng; dit is een
grote overmaat)
Neem controles mee zoals pUC18 vector, steriele milliQ i.p.v. DNA.

Meng dit goed door voorzichtig op en neer te pipetteren en sluit het epje.
De PCR wordt uitgevoerd onder de condities afhankelijk van de primers, bijvoorbeeld:

1. 3 minuten bij 94C

2. 15 seconden bij 94C
3. 30 seconden bij 58-60C
4. 3 minuten bij 72C
5. herhaal stappen 2 t/m 4 nog 29 maal
6. 10 minuten bij 72C
 7. 5 minuten bij 20C

Vermeld in je labjournaal welk PCR programma je hebt gebruikt!

Wanneer het PCR programma is afgerond kunnen de monsters in de vriezer bewaard worden.