DIAGNOSTIC SEROLOGIC

IN INFECTIA HIV/SIDA

1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI

SAU A PRODUSELOR VIRALE
IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24 ELISA de detectie a Ag virale
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL (ARN HIV PLASMATIC)

TESTE DE TRIAJ

ELISA de detectie a Ac antivirali

ELISA de detectie a anticorpilor antivirali

TEHNICA INDIRECTA

ETAPE
1. Incubare ser pacient 1h la 37C
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37C
4. Spalare

5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei

6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut off, zona gri

Distribuirea probelor cu
pipeta automata

Spalator
automat

Spectrofotometru

TESTE DE CONFIRMARE
WESTERN BLOT

Tehnica
WESTERN BLOT
1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer)
3. DETECTIA
ANTICORPILOR

WESTERN BLOT detectia Ac serici

Substrate

Antiviral antibody

Stop

color

gp160
gp120

p66

p55
p51

gp41

p31
p24

p17
p10/11
p7/9

Western blot
in infectia HIV
Criteriul minim de
pozitivitate
2 env
+
1 gag

DIAGNOSTIC SEROLOGIC HIV

ELISA
NEGATIV=

POZITIV IN DUPLICAT

ABSENTA
INFECTIEI HIV

WESTERN BLOT
NEGATIV

POZITIV=
INFECTIE HIV

! Ferestra
serologica

INDETERMINAT

risc rezidual al
transfuziei = 2/1 milion

repeta la 6-8 saptamini

alt test de confirmare

Ag p24- 1.48/1 milion

ADN proviral1.48/1 milion
ARN HIV 1.01/1 milion

DIAGNOSTIC SEROLOGIC
IN INFECTIA HIV/SIDA

Este bine sa doresti sa fi diagnosticat la

timp!

CONTAGIOZITATE
SCADE CALITATEA VIETII

TRATAMENT
MONITORIZARE

CRESTE CALITATEA
VIETII

Beneficii

AGRAVARE

Temeri

1990
Romania
raporteaza 1094
cazuri de SIDA la
copii,
reprezentnd
jumtate din
totalul de cazuri
de
SIDA pediatric din
Europa

ENCEFALOPATIE HIV

Infectie HIV in SNC

1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI

SAU A PRODUSELOR VIRALE
IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL
(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)

TESTE DE TRIAJ

ELISA INDIRECTA

ETAPE
1. Incubare ser pacient 1h la 37C
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37C
4. Spalare
5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei
6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut off

Distribuirea probelor cu
pipeta automata

Spalator
automat

Spectrofotometru

ELISA de competitie

ETAPE

Incubare ser pacient si conjugat 1h la 37C

Spalare
Incubare substrat 20 30 min la temp camerei
Citire la spectrofotometru DO probe, martori,
cut off

TESTE DE CONFIRMARE
WESTERN BLOT
- test imunoblot folosit pentru confirmarea prezentei anticorpilor
in diferite infectii
- se bazeaza pe detectia anticorpilor defalcati pe grupe antigenice

UTILIZARE
Detectia proteinelor virale
Caracterizarea preparatelor de anticorpi
mono- si policlonali
Determinarea specificitatii raspunsului
imun impotriva antigenelor virale

PRINCIPIU
Proteinele dintr-un lizat viral sunt separate
electroforetic dupa greutatea moleculara
prin SDS-PAGE (sodium dodecil sulfat)
Transferate pe o membrana de
nitroceluloza
Detectie prin anticorpi marcati radioactiv
(autoradiografie) sau enzimatic
(COLORIMETRIC)

ELECTROFOREZA
Pe gel de poliacrilamida
Apoi proteinele sunt transferate pe o
membrana de nitroceluloza prin difuzie,
electroforeza sau prin afinitate
Fixarea se face prin simpla absortie
pasiva, prin legaturi covalente pe
membrana diazotata sau prin legare
specifica pe membrana acoperita de
anticorpi

Tehnica
WESTERN BLOT
1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer)
3. DETECTIA
ANTICORPILOR

WESTERN BLOT detectia Ac serici

Substrate
Stop

color

gp160
gp120

p66

p55
p51

gp41

p31
p24

p17
p10/11
p7/9

Western blot
in infectia HIV
Criteriul minim de
pozitivitate
2 env
+
1 gag

DIAGNOSTIC SEROLOGIC HIV

ELISA
NEGATIV=

POZITIV IN DUPLICAT

ABSENTA
INFECTIEI HIV

WESTERN BLOT
NEGATIV

POZITIV=
INFECTIE HIV

! Ferestra
serologica

INDETERMINAT

risc rezidual al
transfuziei = 2/1 milion

repeta la 6-8 saptamini

alt test de confirmare

Ag p24- 1.48/1 milion

ADN proviral1.48/1 milion
ARN HIV 1.01/1 milion

Test Elisa + in duplicat

WB
Este posibil acest rezultat?; explicati.

Pacient 15 ani
test de triaj infectie HIV

Ce test s-a folosit si care sunt urmatorii pasi?

Diagnostic
molecular in virusologie
AMPLIFICAREA TINTEI
PCR
NASBA (nucleic acid sequenced based amplification)

AMPLIFICAREA SEMNALULUI
b-DNA (branched DNA)

B-DNA

PCR

Amplificarea semnalului

Amplificarea secventei tinta

Target Sequence
DNA Strand
Double Helix
DNA Strand

Chromosome

1 ciclu PCR

Primul ciclu PCR

Etapa 1- Denaturare
Secventa tinta

PCR- Etapa 2 CUPLAREA PRIMERILOR LA

CAPETELE SECVENTEI TINTA
Secventa tinta

Biotin
Primer 1

Primer 2
Biotin

Secventa tinta

PCR -3 Elongarea primerilor sub actiunea

Taq Polimerazei
Secventa tinta

ADN Polimeraza Taq

Secventa tinta

La sfarsitul primului ciclu PCR rezulta 2 copii

identice ale SECVENTEI TINTA
Secventa tinta

Secventa tinta

Amplificarea tintei
1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

No. of
Cycles
Target

No. Amplicon
Copies of

16

32

64

20

1,048,576

30

1,073,741,822

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

PCR:
Master Mix
Target DNA

Mg2+

Taq DNA
Polymerase

Mn2+

dNTP

Primers
forward primer
reverse primer

Dogma centrala a geneticii

RT- PCR
Reverstranscriere

+ PCR

Real-time PCR
sonde moleculare legate cu doua tipuri de molecule-semnal:
o molecula fluorescenta (reporter) si una de intarziere (quenching).

Real time PCR

capacitatea de a realiza simultan amplificarea si detectia acidului nucleic,

permitand astfel monitorizarea continua a reactiei PCR

Basic Lab Setup

Unidirectional workflow!

Echipament protectie

Thermal Cycler

Thermal Cycler
with interchangeable blocks

DETECTIA AMPLICONULUI
Electroforeza in gel de agar, colorare
cu bromura de ethidiu si comparare
cu markeri de GM cunoscuta
Hibridizare cu sonde moleculare
marcate complementare si apoi
detectie (+/- spectrofotometrica)

Hibridizare cu sonde moleculare

marcate complementare

(more formally called an DNA blot)Southern blot

Hibridizare
Avidin-horseradish peroxidase
(Av-HRP conjugate)
Biotin Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate
BSA

Addition
of Substrate
Microwell Plate

Hydrogen
Peroxide

Capture
Probe

Detectie
spectrofotometrica

BSA

Add Stop Solution and

Measure Absorbance

GENOTIPAREA VIRALA

Amplicon (ADNc)

Secventiere nucleotidica
pt ampliconii din diferite
zone genomice
Banci de date

RFLP pt
ampliconi

Analiza filogenetica

LiPA ampliconi

Analiza genotipurilor

Arbori filogenetici
Hepatitis C Virus Resource at the Los Alamos National Laboratory (HCV-LANL)
Viral Bioinformatics Resource Center (VBRC)
Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB)

Secventiere nucleotidica

Arbore filogenetic - epidemiologie moleculara

RFLP (restriction fragment length polymorfism)

Cu enzime de restrictie (ER)

ER 1

ER 2

ER 3

ER 1

ER 2
ER 3

LiPA
Line Probe Assay
Hibridizare cu sonde
moleculare cu
specificitate pentru
regiuni conservate
din cadrul
genotipurilor si
subtipurilor
evidentierea profilului
specific unui
genotip prezent in
ampliconi

Diagnostic in infectia HIV

DIAGNOSTIC SEROLOGIC
TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA
TESTE RAPIDE
TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta
WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR

VIRALE
IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL (ARN HIV PLASMATIC)

Utilizarea metodelor moleculare in

infectia HIV

Fereastra serologica perioada de la contactul infectant pana la

sinteza anticorpilor antiHIV; testele serologice sunt negative

Nou-nascutii din mame seropozitive HIV toti sunt

seropozitivi testele serologice sunt pozitive, anticorpii materni trec bariera fetoplacentara;
doar o parte dintre nou-nascuti fac si infectia HIV (transmiterea materno-fetala a
infectiei ~25% sau << cu profilaxie).

Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale

Diagnostic molecular in
virusologie

Diagnosticul molecular in
virusologie
AMPLIFICAREA TINTEI
PCR
NASBA (nucleic acid sequenced based
amplification)

AMPLIFICAREA SEMNALULUI
B-DNA (branched DNA)

PCR
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
Metoda utilizata pentru detectia ADN-ului de orice tip.
-se bazeaza pe obtinerea unui numar mare de catene
tinta prin repetatea unui nr. n de cicluri, ce contin in
principal 3 etape:

- denaturarea
- aditia primerilor la capetele secventei tinta

- extensia primerilor

PCR Amplifies a Targeted

Sequence
Target Sequence

DNA Strand
Supercoiled
DNA Strand

Chromosome

Double Helix
DNA Strand

PCR 1- Denaturare
Secventa tinta

PCR- 2 CUPLAREA PRIMERILOR LA

CAPETELE SECVENTEI TINTA
Target Sequence

Biotin
Primer 2

Primer 1

Biotin

Target Sequence

PCR -3 Elongarea primerilor sub actiunea

Taq Polimerazei
Secventa tinta

ADN Polimeraza Taq

Secventa tinta

End of the 1st PCR Cycle - Results in Two

Copies of Target Sequence

Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

No. of
Cycles
Target

No. Amplicon
Copies of

16

32

64

20

1,048,576

30

1,073,741,822

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

PCR:
Master Mix
Target DNA

Mg2+

Taq DNA
Polymerase

Mn2+

dNTP

Primers
forward primer
reverse primer

RT- PCR
Reverstranscriere + PCR

Reverse Transcription - Step 1 Aditia Primer

la secventa tinta ARN

Reverse Transcription - Step 2

Reverstranscriptaze Catalizeaza extensia
Primerului prin incorporarea nucleotidelor
complementare

End of Reverse Transcription - Step 3

Rezulta sinteza ADNcomplementar (cDNA)
pe secventa tinta ARN

Basic Lab Setup

Unidirectional workflow!

Safety Gloves, Laboratory Coat

Safety Glasses

Biohazard Container

0.5% sodium hypochlorite, ethanol,

Biological Safety Hood

Vortex Mixer

Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),

some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)

Dry-heat Temperature Block

Incubator (37 0C 2 C)

Dedicated Pipettor and Screw-cap Tube Rack,

Multichannel Pipettor and Tips

Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)

PCR System consumables

(tubes, base, tray and retainer).

Analyser Consumables/parts
D-cups

A-rings, A-ring Holder

Thermal Cycler
PCR System 9600 or System 2400

COBAS AMPLICOR Analyser

DETECTIA AMPLICONULUI
Electroforeza in gel de agar, colorare
cu bromura de ethidiu si comparare
cu markeri de GM cunoscuta
Hibridizare cu sonde moleculare
marcate complementare si apoi
detectie (+/- spectrofotometrica)

Hibridizare
Avidin-horseradish peroxidase
(Av-HRP conjugate)
Biotin Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate
BSA

Addition
of Substrate
Microwell Plate

Hydrogen
Peroxide

Capture
Probe

Detectie
spectrofotometrica

BSA

Add Stop Solution and

Measure Absorbance

Diagnostic molecular in
infectia HIV

DIAGNOSTIC SEROLOGIC
TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR

VIRALE
IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL
(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)

Utilizarea metodelor moleculare in

infectia HIV
Fereastra serologica
Nou-nascuti din mame seropozitive HIV
Initierea si monitorizarea terapiei
antiretrovirale
iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic
iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic
Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN
HIV/ml la 24 sapt

Precizati tipul de
reactie
reprezentata
mai sus si
principiul
tehnicii.
In ce viroze
aceasta
tehnica este de
electie?

 MC, 25 ani . Se apreciaza ca se gaseste

in fereastra serologica pentru infectia HIV.
Ce semnifica aceasta notiune si ce etapa
urmeaza in diagnostic.

Nou nascut din mama seropozitiva HIV.

Care este testul de electie folosit pentru
diagnosticul infectiei, precizand si etapele
sale.

 CE TEHNICA ESTE UTILIZATA IN

ETAPA DE CONFIRMARE A INFECTIEI
HIV? CE CRITERII TREBUIE
OBLIGATORIU INDEPLINITE PENTRU A
SPUNE CA TESTUL ESTE POZITIV?
CUM SE PROCEDEAZA IN CAZUL UNUI
TEST INDETERMINAT? MENTIONATI
PRINCIPALELE CAI DE TRANSMITERE
ALE INFECTIEI HIV.