Virscan: Een high throughput techniek voor meten van antilichaam titers tegen humane virussen in

het lichaam.
Inleiding
Bestaande serologische/aminozuur testen voor antilichaam titers zijn zeer specifiek opgebouwd voor
bepaalde virussen. Dit zorgt ervoor dat er veel testen nodig zijn om een globaal beeld van de
aanwezige antilichamen in het menselijk lichaam te meten. Nu is er een nieuwe techniek ontwikkeld
namelijk Virscan. Virscan is een programmeerbare high throughput methode die antivirale
antilichamen analyseren aan de hand van immunoprecipitatie en next generation sequencing van
een bacteriofaag library die ‘proteome wide coverage’ hebben van alle peptiden van humane
virussen.
Technische opbouw Virscan
Virscan baseert zich op 3 concepten. Eerst het hebben van een eigen bacteriofaag library. Eerst was
het belangrijk om de humane virussen die men in de test wou te identificeren en hiervan
verschillende proteïnen te hebben. De database die hiervoor werd gebruikt was Uniprot. Men brak
deze proteïnen in stukken van 56 aminozuren waar telkens 28 aminozuren overlap was met de vorige
en volgende proteïne tegel. Dit werd gedaan op een DNA microarray. We verkrijgen een library met
206 virussoorten met meer dan 1000 verschillende virus ‘strains’. Deze library werd uiteindelijk
gekloneerd in T7 bacteriofagen. De bacteriofagen gaan deze proteïnen projecteren en zijn deze
gebruiksklaar.
Tweede en derde concept zijn beide belangrijk tijdens de test. Bij toediening van het serumstaal bij
de bacteriofagen gaan de antilichamen die aanwezig zijn in het staal reageren met de proteïnen
waartegen ze bestemd zijn. Dit is het tweede concept namelijk immunoprecipitatie. Na het binden
worden ongebonden bacteriofagen verwijdert via proteïne A en G gecoate magnetische beads (A/G
proteïnen stammen af van bacteriën en binden immunoglobuline (IgG)). Hierna komt het derde
concept aan bod namelijk PCR met daarna ‘next generation sequencing’ in de vorm van Illumina. Dit
zorgt voor quantificatie van de aanrijking van alle library tegels. Deze methode kan geautomatiseerd
worden op een 96-well plaat en alle PCR producten worden individueel gepoold en krijgen een
barcode om zo de prijs per staal te kunnen verlagen naar $25. Dit is goed want in dit experiment
worden alle stalen tweemaal getest om reproduceerbaarheid te garanderen.
Na de sequencing worden alle peptides voor en na immunoprecipitatie geteld. Er wordt een Poisson
model toegepast bij de distributie van elke output voor elke input. Hierdoor kan een P waarde
worden aangesteld, deze stelt de significantie voor. Een ‘read’ moet deze bepaalde threshold
overbruggen om als significant geteld te worden (2,3).
Correcties
Er moeten, bij het gebruik van Virscan, correcties toegepast worden. Een eerste is dat er een virus
specifiek aantal ‘niet-overlappende peptide tiles’ moeten aanwezig zijn. Enkel als dit voldaan wordt
wordt een virus meegeteld. Dit is afhankelijk van de grootte van het proteoom van het virus.
Bijvoorbeeld voor HSV1 moesten er 3 niet-overlappende aangereikte peptiden gedetecteerd worden
voor een goede detectie. Antilichamen kunnen reageren met gelijkaardige peptides van verschillende
virussen. Om vals positieven te vermijden worden peptiden met 7 aminozuur match bij elkaar
genomen en wordt er maar 1 geteld namelijk die de meeste hits krijgt. Dit kan omdat het virus die
dan meerdere hits krijgt ook herkend wordt door andere antilichamen die in het lichaam aanwezig
zijn als de persoon met dat virus in contact is gekomen. Het virus dat dan de vals positieve meting
veroorzaakt wordt genegeerd omdat er ook geen andere antilichamen van dat virus aanwezig zijn.
Peptiden die ook maar in 1 van de 596 stalen voortkwam werden genegeerd.
Sensitiviteit en specificiteit
Voor het uitvoeren van een grootschalig onderzoek ging men eerst de sensitiviteit en specificiteit van
de test gaan evalueren. Des te hoger de sensitiviteit, des te minder virus titer er nodig is voor een
positief signaal. Als de specificiteit hoog is betekent dit dat de kans op vals positieven/negatieven
laag is. Ze vergeleken stalen van mensen waarvan we wisten dat ze negatief/positief waren voor HIV
en HCV. Deze werden geverifieerd via ELISA en Western blot. Virscan had een hoge sensitiviteit en
specificiteit van ongeveer 95% desondanks de aanwezigheid van verschillende virustiters. Men
probeerden ook HCV genotypes te onderscheiden door een conservatie van 70% vormt dit een
probleem voor zelf normale serologische testen. Virscan kon het in 69% van de gevallen juist
inschatten. Dit toont aan dat Virscan ook gebruikt kan worden om zeer gelijkaardige genotypen van
zowel kleine virussen (HIV en HCV) als grote virussen (zoals HSV1 en HSV2) van elkaar te
onderscheiden.
Populatie analyse
Na alles te testen en te corrigeren voerde ze een grootschalige test uit op 596 participanten. Ze
maakte verschillende groepen op basis van HIV-status (positief of negatief), leeftijd en locatie. Ze
hadden participanten van 4 landen: Verenigde staten van Amerika, Peru, Zuid-Afrika en Thailand.
Gemiddeld was er een antilichaam respons op 10 virussen. Antilichamen van 68 virussen werden
gevonden in minstens 5 participanten, 22 virussen werden in maar 2 van de 596 mensen gevonden.
Vals positieven werden gedetecteerd een voorbeeld hiervan Cowpox virus dat gevonden werd in 29%
van de stalen. Deze infecteert de mens normaal gezien niet maar heeft wel een 8 aminozuur match
met een proteïne die van clumping factor B die aanwezig is op Stafylococcus. Deze infecteert de
mens wel dus op deze manier hebben ze vals positieven proberen te verklaren. Dit zal minder een
probleem vormen als ze meer onderzoek gaan doen met stalen waarvan ze weten dat er een infectie
is met een bepaald virus om te kunnen pinpointen wat de belangrijkste antigen peptides zijn. Hier
werd de graad van specificiteit geverifieerd toen ze zagen dat er geen hoge percentages waren van
zeer zeldzame virussen.
De meest voorkomende virussen waren Rhinovirussen en respiratoire syncytieel virus (RSV), dit zijn
virussen die geen viremie hebben. Dit laat zien dat Virscan de mogelijkheid heeft om virussen die
niet aan viremie doen toch te detecteren. Influenza en Polio, die vaak enkel in het lichaam aanwezig
zijn door immunisatie via vaccinatie, kunnen we ook detecteren. De hoeveelheid die we detecteren is
lager dan verwacht dit kan verklaard worden door het feit dat deze antilichamen aangemaakt
worden door lang levende memory B cellen die na een tijd afsterven of minder sensitief worden.
Kleine virussen, zoals JC virus, hebben vaak speciale epitopen in een bepaalde conformatie die deze
test niet nabootst waardoor de eventuele antilichamen die hiervoor aanwezig zijn in het bloed die
niet herkennen en dus geen signaal geven. Varicella zoster wordt veel minder gevonden dan andere
latente virussen zoals CMV en EBV. Dit kan verklaard worden aan de hand van de verschillende
frequentie waarmee deze virussen partikels in het lichaam vrijlaten. Dit zorgt ervoor dat er voor
bepaalde virussen net meer antilichamen aanwezig zijn ten opzichte van de andere. Ook kunnen
bepaalde antigenen gevormd worden die nutteloos zijn voor de 56 aminozuur peptide tiles die dit
systeem gebruikt.
De participanten werden in verschillende groepen verdeeld (afbeelding). De eerste groep vergelijk
HIV negatieve volwassenen en kinderen van de Verenigde staten. Hierbij zagen we dat de meeste
kinderen minder vaak positief waren voor de meeste virussen. Dit is te verklaren met het feit dat
kinderen vaak minder blootgesteld zijn aan deze virussen (zoals HSV2 dat seksueel overdraagbaar is)
en dat kinderen vaak ook minder antilichamen aanmaken als ze geïnfecteerd worden. De tweede
groep vergeleek HIV positieve en negatieve volwassenen uit de Verenigde staten. Hier zagen we dat
er veel meer positieve signalen zijn bij mensen die HIV positief zijn. Dit komt door opportunistische
infecties die misbruik maken van het verzwakt immuunsysteem van HIV positieven mensen (zoals
Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus). Patiënten met HIV nemen vaker ook risicovolle
beslissingen waardoor ze makkelijker bepaalde infecties oplopen. De andere groepen vergeleken
Amerikaanse volwassenen met volwassenen uit 3 verschillende landen. Over het algemeen hadden
Amerikaanse participanten een lager positief signaal in vergelijking met de andere (buiten Rhinovirus
en EBV die overal even frequent gedetecteerd werden). Onderling hadden de 3 andere landen ook
verschillen. Bijvoorbeeld de frequentie HSV1 deze was significant hoger in Peru en Zuid-Afrika dan in
Thailand. Verschillende Adenovirussen hadden verschillende frequenties. Type C was in alle landen
gelijk, type D was hoger buiten de Verenigde staten en B was hoger in Peru en Zuid-Afrika ten
opzichte van Amerika maar stond gelijk met Thailand. De verklaringen voor deze verschillen zijn
eindeloos: hygiëne, ecosystemen, voedingsstijlen, genetische susceptibiliteit enz. Het enige virus dat
statistisch een hogere frequentie had in Amerika was influenza B. Dit komt waarschijnlijk omdat daar
jaarlijks massaal gevaccineerd wordt voor dit virus. In andere landen gebeurt dit waarschijnlijk niet
op zo een grote schaal.
Publieke epitopen
Uit de resultaten bleek ook dat voor virusherkenning maar 1 tot 3 peptides echt van belang zijn. Deze
worden herkent door alle individuen, ongeacht leeftijd,locatie,... Voor RSV bijvoorbeeld was er maar
1 immunodominant peptide van AZ 141 tot 191 dat terugkwam in bijna alle stalen over alle
continenten. We merken dus dat antivirale B cel respons vrij stereotiep is. Toch zijn er enkele
variaties die onder andere te wijten zijn aan verschillende varianten die in bepaalde omgevingen
meer aanwezig zijn of polymorfismen in MHC genen van mensen. In dit onderzoek hebben ze aan de
hand van mutaties getest of dit echt klopt en men vond dat indien men mutaties invoerde in deze
regio's er veel minder signaal kwam op de testen. Des te meer mutaties, des te minder signalen. Dit
kan toegepast worden voor verdere verbeteringen van de specificiteit van Virscan.
Conclusie
Virscan is een goede methode voor detectie van antilichamen voor meerdere virussen in 1 staal.
Desondanks een hoge specificiteit en sensitiviteit heeft het een aantal limitaties. Het is nog niet
mogelijk om epitopen die post translationeel nog zijn aangepast te vormen in het labo. Ook vormt de
lengte van de peptide tiles in sommige gevallen een probleem. Door de lage kost en hoge throughput
kan Virscan gebruikt worden in grootschalige onderzoeken om het humaan viroom verder te
onderzoeken en onderscheiden te kunnen maken tussen verschillende populaties. In dit onderzoek
zijn er veel nieuwe B cel epitopen gevonden die ervoor zorgden dat er een verdubbeling kwam in het
aantal gekende virale epitopen. Publieke epitopen zijn een fenomeen dat door deze techniek ook
verder kunnen uitgewerkt kunnen worden. Dit zouden medicijnen en vaccinaties veel gerichter
kunnen maken afhankelijk van de populatie waar ze gebruikt zouden kunnen worden. Tot slot is
Virscan een methode die ook kan omgevormd worden voor gebruikt met protozoa, bacteriën en
schimmels wat maakt dat deze techniek eindeloze mogelijkheden heeft.
Afbeeldingen