Les 3

Chromosomenonderzoek

Prof. Dr. Nadine Van Roy

 Chromosomenonderzoek

 klassieke cytogenetica-karyotypering

 fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

 ondiepe genoom sequenering (sWGS)

 Chromosomenonderzoek

 klassieke cytogenetica-karyotypering

 fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

 ondiepe genoom sequenering (sWGS)

 Conventionele cytogenetica - karyotypering

indicaties: constitutioneel
 onverklaarde mentale beperking
 aangeboren afwijkingen, dysmorfieën
 herhaalde miskramen, prenataal of kort na de geboorte
overlijden
 zwangerschap – maternele leeftijd
 verminderde fertiliteit
 segregatie van een gebalanceerde translocatie in de familie
 verstoorde puberteitsontwikkeling

indicaties: maligniteiten
 hematologische ziekten (leukemie, lymfoom, ...)
 vaste tumoren
 Conventionele cytogenetica - karyotypering

Welk weefsel ??

Criteria waaraan weefsel moet voldoen:

 gemakkelijk te verkrijgen

 in staat zijn om te groeien en delen in cultuur, ofwel spontaan

ofwel door stimulatie met externe producten
 Cytogenetisch onderzoek

Type van weefsel voor analyse

Postnataal (na geboorte)

Perifeer bloed
Huidfibroblasten
Maligne cellen: bloed, beenmerg, lymfeklier, tumor

Prenataal (voor geboorte)

Vruchtwatercellen (amniocyten – week 15-16)
Vlokken (chorion villi – week 10-12)
Navelstrengbloed
 Karyotypering

 onderzoek van het aantal en de structuur van

de chromosomen

 aanleg van een karyotype (chromosomenkaart)

 geen onderzoek van de individuele genen !

 beperkt resolutievermogen
 Conventionele cytogenetica - karyotypering

Tellen van chromosomen: gemakkelijker gezegd dan

gedaan.....

 1923: Painter – aantal humane chromosomen: 48

 1956: Tijo and Levan - correct aantal chromosomen : 46
 i.e.: 3 jaar later dan de beschrijving van het dubbel helix
model van Watson and Crick !

1953

1956 Watson en Crick

 Karyotypering: procedure

bloed staal karyotype digitale beeldvorming

Korte termijn cultuur (37°C, 48-72hr)

bandering
PHA-stimulatie

maken van preparaten

fixatie
Stop in mitose (colchicine)
Hypotonische behandeling
 Karyotypering
methanol-azijnzuur
heparine colchicine

bandering

preparaat

PHA KCl
Filmpje maken van preparaten https://www.youtube.com/watch?v=yoxMGHNj3ZU
 Chromosoom bandering

 pas ontdekt in de jaren 1970

 ganse variëteit aan banderingstechnieken

 bandering reflecteert de base samenstelling van een

bepaalde regio (DNA) en de mate van condensering
 Karyotypering-bandering

banderings technieken:

 G-banding: Giemsa bandering

 Q-banding: quinacrine bandering

 R-banding: reverse bandering

 C-banding: centromeer bandering

Banderingstechnieken

G-bandering
Banderingstechnieken

Q-bandering
Banderingstechnieken

R-bandering
Banderingstechnieken

C-bandering
 Banderingstechnieken
resolutie:

 klassieke bandering
450 banden (~5Mb)

 hoge resolutie (pro(meta)fase chromosomen)

550-850 banden (~1Mb)
Banderingstechnieken-resolutie

links: 400 banden niveau

midden: 500 banden niveau

rechts: 850 banden niveau

Chromosoom 1
Chromosomenkaart – karyotype
Chromosoom nomenclatuur
Chromosoom nomenclatuur
 Chromosoom polymorfismen

16qh+
 Karyotypering

in praktijk:
 evaluatie van ~20 metafasen (2 onafh laboranten)
 resultaat: ~1 maand, in dringende gevallen: ~3 dagen

voordelen
 ‘volledig genoom’
 goedkoop
 detectie van gebalanceerde chromosoom afwijkingen
 ‘enkel cel’ detectie, belangrijk in geval van mosaïcisme

nadelen
 delende cellen zijn vereist
 beperkte resolutie (5-10Mb)
 veel training nodig
 Karyotypering

1 haploid genoom: = 23 chromosomen

= ~20.000 genen
= 3 x 109 bp

1 chromosoom: = 1000 - 2500 genen

= 1,3 x 108 bp

1 band op een chromosoom: = 25 - 75 genen

= 3 x 106 bp

chromosoom 8
 Chromosomenonderzoek

 klassieke cytogenetica-karyotypering

 fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

 ondiepe genoom sequenering (sWGS)

 Fluorescentie in-situ hybridisatie (FISH)

DNA probe

labeling

bacterie-cultuur

denaturatie

wassen,
chromosomen tegenkleuren
en kernen
denaturatie

hybridisatie o/n
 FISH ANALYSE

 fixatie van cellen in metafase of interfase op draagglas

geen delende cel meer nodig !

 denaturatie van het DNA in de chromosomen

 incubatie met DNA probe (in situ hybridisatie)

 detectie van probe dankzij fluorescentiesignaal

FISH-probes
 FISH-probes

DNA

probe
E. coli bacterie

vector

Grootte probe:
1 kb tot 200 kb bacteriecultuur

DNA isolatie probe

FISH-soorten probes

bank
FISH-soorten probes

cen 1

centromeer specifieke probes

FISH-soorten probes

telomeer probe
 FISH-soorten probes

bank 1
bank 17
gen/locus-specifieke probe
chromosoom specifieke bank
 FISH-soorten FISH
1-kleur

2-kleur
 1-kleur FISH

 2-kleur FISH

 multi-kleur FISH

 fiber FISH

fiber FISH
multi-kleur
Fiber FISH

uitgerokken DNA

na hybridisatie

f
 Multikleur FISH of spectrale karyotypering

multikleur-FISH
 probe set: differentieel gelabelde chromosoom banken
M-FISH karyotype
MULTIKLEUREN-BANDING FISH
 FISH analyse-toepassingen

 diagnose van aandoeningen veroorzaakt door een

microdeletie

vb. velocardiofaciaal syndroom (VCF syndroom)

del

Gevolg van een microdeletie op de lange arm van chromosoom 22

 FISH analyse-toepassingen

 diagnose van aandoeningen veroorzaakt door een

microdeletie
vb. velocardiofaciaal syndroom

 opsporen van subtelomerische deleties bij mentale beperking

 karakterisatie van structurele chromosoomafwijkingen

vb. multicolour FISH (verschillende probes)
Multikleur FISH

L960638
 FISH analyse-toepassingen

 diagnose van aandoeningen veroorzaakt door een microdeletie

vb. velocardiofaciaal syndroom

 opsporen van subtelomerische deleties bij mentale beperking

 karakterisatie van structurele chromosoomafwijkingen

vb. multicolour FISH (verschillende probes)

 cytogenetisch onderzoek op niet-delende cellen

(interfasekernen)

vb. snelle diagnose bij prenataal onderzoek

FISH analyse-toepassingen

FISH op interfasekern

47, XY, +21

 FISH analyse-toepassingen

 diagnose van aandoeningen veroorzaakt door een microdeletie

vb. velocardiofaciaal syndroom

 opsporen van subtelomerische deleties bij mentale beperking

 karakterisatie van structurele chromosoomafwijkingen

vb. multicolour FISH (verschillende probes)

 cytogenetisch onderzoek op niet-delende cellen

(interfasekernen)

vb. snelle diagnose bij prenataal onderzoek

 kankeronderzoek: opsporen van translocaties

FISH analyse-toepassingen

metafase van kanker cellijn met

translocatie tussen chromosoom 1 en 17
t(1;17)

bank 1
bank 17
 FISH- voordelen en beperkingen

voordelen

Hogere resolutie: detectie van deleties van < 500kb

Interfase detectie mogelijk (prenatale, tumoren,…!!)
Multipele doelwitten (multi-kleur-FISH)
Snelheid: ~48 hr
Niet-delende cellen: amniocyten, wang brush, archiefmateriaal,
tumorcellen

beperkingen
Gericht onderzoek, niet genoomwijd
Kostprijs commerciële probes
 Chromosomenonderzoek

 klassieke cytogenetica-karyotypering

 fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

 ondiepe genoom sequenering (sWGS)

 Ondiepe genoom sequenering (sWGS)

DNA fragmentation
bloed, BM, tumor,… library preparation
3 kb
& amplification

duplication deletion

sequencing of 15 M reads (<1x coverage) NGS toestel

Ondiepe genoom sequenering (sWGS)
 Ondiepe genoom sequenering (sWGS)

duplicatie
deletie
 sWGS-toepassingen

constitutionele genetica
• detectie van submicroscopische deleties

• detectie van submicroscopische duplicaties

kankergenetica
• detectie van genamplificatie

• detectie van chromosoom winsten of verliezen

 sWGS-microdeleties

1 maand: karyotypering omwille van slapheid, gezichtsafwijkingen met

kleine, diep ingeplante neus en korte ledematen-karyotype normaal
5 jr: verwezen naar kliniek omwille van korte gestalte, zwaarlijvigheid
en mentale beperking (IQ 58) - botafwijkingen - karyotype normaal
sWGS-microdeleties
chromosoom 12
 sWGS-microduplicaties

geen diagnose

16

16 22

46,XY,ins(22;16)(p13;p13.2p13.3) de novo
sWGS-genamplificatie

amplificatie

maagtumor
Array-CGH-chromosoom afwijkingen
maagtumor

verlies van chrom 14 en 22

 sWGS-toepassingen

Screening 900 patienten met congenitale afwijkingen en mentale

beperking : 167 (~20%) chromosoom afwijking (2007)

 Outcome:
• deletions: 106
• duplications: 43
• mosaicisms: 3
• unbalanced translocation: 13
 Sizes of anomalies:
• 1 clone: ~1/3(100kb-3 Mb)
• 2 to 5 clones: ~1/3(~2 – 6 Mb)
• > 5 clones: ~1/3(> 6 Mb)
 Origin of the anomaly:
• De novo ~3/4
• Familial ~1/4
 sWGS-toepassingen
Afwijkingen zijn verspreid over het genoom

deletie

duplicatie
 sWGS-conclusies

• bij patienten met mentale beperking zou sWGS deel moeten uitmaken van de routine
diagnostische testen
Kopie nummer variatie
Nat Genet. 2004 Sep;36(9):949-51. Epub 2004
Aug 01.
Detection of large-scale variation in the
human genome.
Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML,
Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C.

Kopie nummer variatie geschat op

12% van genoom
=
400 Mb
 sWGS-conclusies

Uitdaging: welke afwijkingen zijn causaal voor fenotype ?

 recurrente afwijkingen met zelfde fenotype zijn causaal

 hoe groter de afwijking, hoe meer kans dat het causaal is

 kopie nummer varianten die ook worden teruggevonden in de populatie

zijn niet causaal

 overerfbare afwijkingen zijn goedaardig terwijl de novo afwijkingen meestal

causaal zijn
Humane kopie nummer afwijkingen

Database of genomic variants May 2008

Redon et al. Nature, 2008
Identificatie recurrente afwijkingen en fenotypes
 sWGS

voordelen:
 geen delende cellen nodig

 snel

 hoge resolutie

nadelen:
 geen detectie van gebalanceerde afwijkingen

 oppikken van genomische varianten

 Les 3: Take Home Messages

 Verschillende manieren om chromosoom afwijkingen op te sporen

 Alle technieken hebben voordelen en beperkingen

 Begrip kopie nummer variatie