Samenvatting Mgot 2

lOMoARcPSD|35251367
Samenvatting mgot 2
Moleculair genetische onderzoekstechniek (Universiteit Utrecht)
Scannen om te openen op Studeersnel
Studeersnel wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)
lOMoARcPSD|35251367
MGOT samenvatting deel 2

Hoorcollege Genetica en model-organismen
Biologische processen zijn enorm complex:
- Organismen: 10^3-10^14 cellen = 10^12-10^23 moleculen

- Cellulaire netwerken: 10^2-10^11 cellen
- Cellen: 10^6-10^9 moleculen
- Moleculen: 10^0 - 10^4 per cel
Twee experimentele aanpakken
- Genetische screens
- Eiwit-eiwit interacties
Wat maakt een modelsysteem makkelijk?
- Makkelijk in lab te houden

- Snelle groei/vermenigvuldiging
- Efficiënte genetica
o Mutanten vinden in screens
o Dubbelmutanten maken
- Manipulatie van het genoom
o Homologe recombinatie
o Expressie van plasmiden
- Je zoekt eigenlijk altijd een modelorganisme wat zo simpel mogelijk is, maar toch de vraag
kan beantwoorden die jij stelt
Veelgebruikte modelorganismen
 Prokaryoten
o Bacteriën (E. Coli) en bacteriofagen (Lambda)
 Eukaryoten
o Schimmels (Aspergillus) en gisten (eencellig) -> in het practicum
o Planten (Arabidopsis thaliana)
 Dieren
o Caenorabditis elegans (nematode) -> in het practicum
o Drosophila melongaster (fruitvlieg)
o Danio rerio (zebravis) ○ Mus musculus (muis) -> in het practicum
o Homo sapiens (mens) -> in het practicum
Gist
- Eencellige eukaryoten
- Basale levensprocessen zijn vergelijkbaar met die van ons:
o Celdeling (o.a. DNA-replicatie, chromosoom scheiding)
o Metabolisme
o Eiwitlokalisatie en transport
- Genetisch zeer goed te bestuderen
o Klein genoom met 6000 genen

lOMoARcPSD|35251367
o Weinig intronen
- Bijna vergelijkbaar met bacteriën in eenvoud om te gebruiken
- Er zijn vele verschillende gisten >1500
Bekendste soorten gist
 Bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) (a)

- Deling via knopvorming
- 6000 genen, 12.106 bp
- 16 chromosomen
- DNA sequentie sinds 1996
- 23% overeenkomst mens
 Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) (b)
- Deling via splitsen
- 5000 genen, 14.106 bp
- 3 chromosomen
- Volledige sequentie sinds 2002
- Evolutionair ongeveer even ver van de mens als S.
cerevisiae
Gist voordelen
 Gemakkelijk te groeien
o Agarplaten en vloeibare media
o Selectie mogelijk
o Doorstrijken, spotten en stempelen
 Plasmiden
o Transformeerbaar met plasmiden
o Stukken DNA die met transformatie wordt ingebracht in gist en selecteren op gisten
die de plasmide hebben opgenomen
o Plasmiden met verschillende replicatie origins en selectiemarkers (= organische
componenten die mutanten niet zelf kunnen maken)
o Promotors gebruiken die gereguleerd worden en aan staan in bepaalde
omstandigheden
 Homologe recombinatie
o Efficient in gist
o Zeer korte sequentie homologie is voldoende
o Systematische knockout van alle individuele
genen  beschikbaar
o Selectiemarker aanwezig  recombinatie
heeft plaatsgevonden
 Genotypes combineren
o Een gist kan wisselen van haploïde (1 kopie per
chromosoom) en diploïde (2 kopieën per
chromosoom) staat
o Als je twee haploïde gisten met elkaar kruist kan je een nieuwe diploïde gist maken
met een combinatie van twee genomen die hij eerder niet had  opposite mating
type
o Diploide maken met conjugatie

lOMoARcPSD|35251367
o Bij gist heb je twee verschillende mating types: a en alpha. Een gist kan gewoon in
zijn haploïde vorm blijven leven en delen. Maar deze kan ook maten met de andere
mating type en in een diploïde vorm blijven leven en delen. Onder bepaalde
omstandigheden kan een gist ook besluiten om haploid te worden. Dit proces heet
sporulatie. Een diploïde gist maakt dan vier haploïde gameten.
o Mating types: a en alpha
o Mating type switching  a kan alpha worden en andersom
o Homothalic yeast: in staat om twee soorten haploide cellen te maken die met elkaar
kunnen versmelten
o Er is een locus in gist wat uit drie stukken bestaat:
- In midden actief gen, MAT(mating type) locus, en geflankeerd door twee genen a
en alpha  bepaalt of een gist a of alpha wordt
- Aan beide kanten van het MAP locus heb je een kopie van het locus en het a
locus. Deze kopieën zijn niet actief en worden continu gesilenced.
- Switch door gen uit te knippen met HO endonuclease en kan dan gerepareerd
worden met homologe recombinatie  biased proces (switching gebeurt vaak)
- Middelste vervangen met a of alpha gen hierdoor kan het mating type
geswitched worden.
o In de natuur ontstaat gemakkelijk diploide vorm van bakkersgist; a en alpha naast
elkaar gevormd
o Na knippen HO volgt bijna altijd mating type switch
o In het laboratorium moet stam wel zelfde blijven en niet switchen  haploide vorm
is groot voordeel: gebruik mating type switch defeciënte stam (HO mutant)
o Sporulatie van diploide gist geïnduceerd door nutrient-arm medium
o Fission yeast heeft levenscyclus met haploide en diploide vormen, mating en
sporenvorming
- Ook verschillende haplotypen
- Alleen verschillende typen kunnen versmelten en een diploïde stam geven
(sexuele reproductie).
Genetische screens in gist
 Basis van genetische screen:

o 1. Vind mutanten waarin het proces is verstoord
o 2. Identificeer welke genen zijn gemuteerd
 Mutatie:
o Chemische mutagenese
o Bestraling
o Random integratie transposon

lOMoARcPSD|35251367
o Targeted knockout
o Overexpressie
- De ontdekking van celcyclus genen in gist
o Fission yeast en bakkersgist zijn in de basis hetzelfde.
o Bij fission yeast verlengt de gist zich en wordt het op deze manier verdeeld. Bij
bakkersgist wordt dit door knopvorming gedaan.
o De screen werd uitgevoerd door temperatuurgevoelige mutanten die stoppen in een
specifieke stap van de celcyclus  waarschijnlijk een mutatie gemaakt in een gen wat
nodig is voor de celdeling.
Voorbeelden celcyclus mutanten in bakkersgist:
o Tientallen cdc (cell division cycle)

mutanten gevonden die op
verschillende punten in celdeling
stoppen.
o cdc16: Metafase -> microtubuli zijn
vast te komen te zitten net voor het
delen van het DNA.
o cdc15: Voor cytokinese
o Extra DNA replicatie -> een te grote

cel
o Een verkeerde plaats van de groeitip
CDC28 (budding yeast) en cdc2 (fission yeast): cyclin-dependent kinases
- Cyclin-dependent kinsase  fosforyleert en wordt zelf gefosforyleerd

o Gebonden aan cycline  kinase actief
o Niet gebonden aan cycline  kinase inactief
o Door expressie te reguleren zorg je ervoor dat cdks actief zijn op juiste moment
- CDC28 en cdc2 zijn orthologen van elkaar. Geconserveerd tot in de mens: CDK1.
- CDK1 is essentieel voor meerdere stappen in de celcyclus van gist.
- Essentieel “rate limiting”
o Als je een mutant hebt, dan krijg je een defect in celdeling.
o Als je een dominant allel hebt met een te actief gen, dan krijg je een te snelle
celdeling.
o Recessieve allelen stoppen deling
o Dominante allelen delen te snel
 Kleine gist (wee)
o Humaan CDK1 kan het gist CDK1 kinase vervangen (complementeren)
- Twee andere bakkersgist celcyclus genen:

lOMoARcPSD|35251367
o Wee1: wee1 deletie mutanten zijn klein en delen te snel  net als cdc28gf (gain of
function).
o CDC25: cdc25 deletie mutanten stoppen in mitose  net als cdc28- (loss of function).
Genetische epistase analyse
- Door dubbel mutanten te maken kun je de volgorde van genen bepalen:

- Fenotypes van mutanten moeten verschillend zijn: liefst nul mutaties met tegenovergesteld
fenotype.
- Dubbel mutant moet fenotype van beide mutanten hebben.
o a  fenotype A
o b  fenotype B
o a + b  fenotype A
- Mutatie a is epistatisch t.o.v. mutatie b, als het resulterende van de twee fenotype a is.
Epistase voorbeeld
- cdc28-: mutant stopt celdeling (dus CDC28(+) stimuleert celdeling)

- wee1-: mutant deelt te snel (dus WEE1(+) remt deling)
o 1. WEE1+ CDC28+ celdeling
o 2. CDC28+ WEE1+ celdeling
o Als (1): cdc28 fenotype door teveel activiteit van WEE1
o Als (2): wee1 fenotype door teveel activiteit van CDC28
- Observatie: dubbel mutant heeft het cdc28- fenotype Mogelijkheid 2 kan dus niet: als deze
genen in een lineaire regulatie route werken dan werkt WEE1-upstream.
Begrip van celdeling door isoleren cdc mutanten en ordenen m.b.v. epistase:
- Cdk’s hebben voor hun activiteit een binding aan

cycline nodig en daarnaast een activerende
fosfaatgroep.
- Wee1 blijkt een remmer te zijn van Cdk, dit is ook
een kinase en deze fosforyleert cdc28 op een residu
dat remmend werkt voor de activiteit van cdc28.
- cdc25 is een fosfatase en haalt de fosfaatgroep er
weer af en activeert cdc28.
Complementatie
- Het compenseren van het effect van mutatie in een (of meerdere) genen
- Het is een test om te kijken of een mutatie in een bepaald gen zit.
o Als je een mutant en een normale haploïde gist met elkaar laat maten, dan krijg je
een diploïde gist met een wild type en een mutante kopie.
o In de meeste gevallen is die kopie van het wildtype voldoende om die gist gewoon te
laten celdelen. Dat kan je gebruiken als een test om te kijken of een mutatie in een
bepaald gen zit.

lOMoARcPSD|35251367
- Je pakt een gist waarvan je vermoed dat deze mutant is in cdc28 en stopt hier een plasmide
in met het wildtype van cdc28.
- Je krijgt nu een gist die het mutante fenotype heeft van het gen, maar door het plasmide ook
het wildtype van het gen.
- Als de mutatie inderdaad in a zit, dan is deze na het toevoegen van het wildtype plasmide
weer gezond. Als deze niet gezond is dan weet je dat de mutatie niet in a zat.
Rode gist mutanten zoeken met verlies ADE1 of ADE2, complementatie
- Gist kan AMP maken op de korte pathway (adenenine) en lange pathway (als geen adenine is,
dan via ADE2 en ADE1 etc)
- Mutatie in ADE1 en ADE2 voorkomt omzetting AIR  CAIR en CAIR  SAICAIR waardoor er
ophoping van rode kleur is in gist
Testen
- ADE1 mutant (met ADE2 wildtype kopie), ADE2 mutant (met ADE1 wildtype kopie)
- Als de gist een mutatie heeft in ADE1 en je kruist deze met een andere haploïde gist die ook
mutant is in ADE1, dan krijg je een diploïde gist die nog steeds mutant is in ADE1 en blijft dus
rood.
- Als de gist een mutatie heeft in ADE2 en je kruist deze met een ADE1 mutant, dan heb je van
ADE1 en ADE2 allebei een mutante en een wildtype kopie. Die wildtype kopie is voldoende
om de biosynthese pathway door te laten lopen, dus dan krijg je witte gist.
- Als de gist een mutatie heeft in geen van beiden genen, dan krijg je bij beide kruisingen met
ADE1 en ADE2 witte gist  mutatie in ander gen
- Gist op plaat met extra adenine  mutaties die rood zijn die ergens in de adenine
biosynthese pathway probleem hebben, zouden wit moeten worden. Als rood blijft zit de
mutatie ergens anders en niet in de adenine biosynthese pathway.
Eiwit-eiwit interactie mapping met Y2H (yeast two-hybrid) systeem
- Het yeast two-hybrid systeem maakt interacties zichtbaar door een reportergen af te
schrijven, wel of geen gistgroei
- Er wordt in YSH gebruik gemaakt van plasmiden die coderen voor twee verschillende eiwitten
(of delen ervan) gefuseerd aan het AD of DB domein van Gal4P.
- Je kan hier eiwitten mee testen uit allerlei organismen, welke eiwitten aan elkaar binden en
welke samenwerken

lOMoARcPSD|35251367
- Het maakt gebruik van en aantal genen die normaal in gist aanwezig zijn:
o Gal4p gen: is de master regulator van de GAL genen.
 Dit gen wordt actief in de aanwezigheid van galactose.
o De Gal4 transcriptiefactor werkt als een dimeer.
 Deze heeft een DNA-bindend domein en een transcriptie activatie domein.
o Als Gal4 aanwezig is kan deze binden aan de promotoren van bepaalde genen. En hij
kan de transcriptie van deze genen aanzetten.
- In het Y2H wordt gebruik gemaakt van de twee eiwitdomeinen (het DNA-bindend domein en
de transcriptie activatie domein). Deze kunnen van elkaar worden gesplitst, en vervullen op
zich nog steeds de functie.
- De Gal4 transcriptie factor is in tweeën gesplitst, je hebt een AD en DB domein. Deze kunnen
los niet van elkaar functioneren
 Je koppelt het DNA bindend domein (DB) aan een
eiwit van interesse (gen X)
 Je koppelt het transcriptie activatie domein (AD) aan
een tweede eiwit van interesse (gen Y)
 Als deze twee eiwitten X en Y aan elkaar binden dan
worden de twee domeinen (DNA bindend en
transcriptie activatie, DB en AD) weer bij elkaar
gebracht.
 Dus interactie van X en Y resulteert in een functioneel
transcriptiefactor Gal4 eiwit, wat kan binden aan Gal4
bindingssites in de gebruikte reportergenen  zet de
rest van de GAL genen aan  gist kan groeien op de
plaat
- Als er geen interactie is dan is er geen afschrifte hiervan, maar dan moet GAL4 normaal gen
wel weg, anders dan krijg je continue een reporter welke aanstaat. Gal80 is remmer.
- Gebruik met reportergenen  gen voor groei dat wordt gereguleerd waarvoor een promotor
zit met GAL4 binding sites.
- Als er interactie is en complex bindt, is er activatie van gen voor groei  gen groeit
- Als geen interactie is van binding eiwitten, geen transcriptiefactor, geen activatie gen voor
groei  gen groeit niet
- Twee reporters, allebei promotor waar GAL4 aan kan binden. De ene schrijft His3 af en de
ander ADE2 hierdoor kunnen ze groeien op platen waar deze niet op zitten. Beiden hetzelfde,
alleen de ene is iets sneller (His) om te groeien, dan bij adenine.
- Hoe meer ADE2 wordt afgeschreven, hoe witter de gist wordt
- Dus beneden gegeven oplopende activatie van reporter  hoe goed is de interactie tussen
twee eiwitten
- NIET: sterke activatie = sterke interactie  andere factoren spelen rol

lOMoARcPSD|35251367
Array based screening
- Kruis de individuele AD en DB gisten in 384 well formaat (robot) op selectieve platen

- Kijk welke groeien (geen sequencing nodig)
- Tijdrovend, maar je weet dat alle eiwit paren getest zijn.
- Paar puntjes die kunnen groeien, dit zijn combinaties van eiwitten die een interactie hebben,
op selectief medium.
Library screening
- Kruis of transformeer 1 DB (bait) gist met een bibliotheek van AD (prey) gisten/plasmiden.
- Pik kolonies die op de selectieve plaat groeien
- PCR AD plasmide
- Sequence
- Je kan dan veel meer constructen testen (fragment library)
Interactie domeinen vinden met yeast two-hybrid
- Welk deel van eiwit zorgt voor binding?

- Je maakt een bibliotheek met verschillende fragmenten van het eiwit.
- Deze fragmenten ga je testen, als er een paar met het andere eiwit interacteren dan kun je
concluderen dat het interactie domein zich daar bevindt.
Het genotype van de gebruikte gist
Auxotrofische markers:
- Gist kan geen leucine maken (leu1-3,112)

- Gist kan geen tryptofaan maken (trp-901)
- Gist kan geen histidine maken (his200)
- Gist kan geen adenine maken (ade2-101)
- Gist kan geen uracil maken (ura3-52)
Reporters:
- GAL2::ADE2 ->kan gebonden worden door een GAL4 transcriptiefactor, dan schrijft hij ADE2
af en dan complementeert dat dus ADE2 mutatie en kan de gist groeien zonder adenine.
- GAL 1:: HIS3LYS2 -> als er interactie is dan krijg je afschrijving van HIS3 en dan kan de gis
groeien op platen zonder histidine.
- GAL7::LacZ@met2 -> gebruiken we niet
Het Y2H practicum:
- Wij gaan kijken naar de interactie tussen Raf/Lin-45 en MEK

(allebei een kinase)
- Het doel van de proef is om te kijken of Lin-45 (de C. Elegans
homoloog van Raf) en MEK aan elkaar binden
 Welk domein van Raf/Lin-45 is verantwoordelijk
voor de binding aan MEK?
 Welk domein van MEK-2 is er nodig voor de
interactie?
- Om het interactie domein te bepalen krijgen we de volgende
plasmiden:

lOMoARcPSD|35251367
 DB::MEK-2 (full length)

 AD: LIN-45
 6 verschillende fragmenten
 Deze worden ingebracht in gist en dan kijken we of er interactie is.
C. elegans
- Kleine (1 mm) vrijlevende rondworm of nematode

- Een model organisme
- In het wild groeit C. elegans in de grond en leeft van bacteriën
- Makkelijk te groeien in het lab
 Groeien op agar planten met E. coli op 15-25 graden celsius
 1 ouder produceert 300 kinderen
 Nieuwe generatie is er in 3-5 dagen
- Transparant lichaam: alle cellen, celdeling en cel migratie is goed zichtbaar
- Eukaryoot
- Genen zijn geconserveerd
- Klein genoom
- Kleine genoom families
- Hoge kwaliteit genoom sequentie en annotaties

lOMoARcPSD|35251367
- Aantrekkelijk voor het vinden van mechanismen van meercellige ontwikkeling

- Ontwikkelt zich altijd hetzelfde in elke worm  makkelijk om mutaties te zoeken
- Makkelijk genetische screens
- Chemotaxis  beweging als reactie op chemische stimulus
Lichaamsplan
- 959 cellen in een volwassen hermafrodiet dier

- Gedifferentieerde weefsels
 Neuronen, spiercellen en epitheelcellen
- Vertoont verschillende gedragingen
 Aantrekking, afstoting, paring
- Celdeling Patroon is invariant
 Tijdstip van deling, lot van de cellen, richting van deling
Hoorcollege Genetische modelsystemen – diermodellen en reverse genetics
Hoe regulatie routes ontdekken?  gevolgen van veranderingen vaststellen:
1. ‘knock-out’ mutaties: rem weghalen

2. ‘gain of function’ mutaties: sterker effect, meer functie en sneller laten verlopen
Forward en reverse genetics
Forward genetics: iets muteren en kijken wat het gevolg is
- Kijken naar genetische basis van een bepaald fenotype  begin bij fenotype en kijken welke
genen hierbij betrokken zijn
- Begint met proces, zoek mutaties met specifiek fenotype
- Begint met een biologisch proces, hoe worden biologische processen gecontroleerd en
uitgevoerd? En welke genen zijn hierbij betrokken?
- Meestal genetische screens met modelorganismen bacteriën, C. elegans, Drosophila en
Arabidopsis.
- Bij menselijke ziektes kan er gekeken worden door middel van chromosomale microarray
analyse (CMA) of next generation sequencing (NGS).
- Aanpak: random mutagenese en identificatie van mutanten
Reverse genetics: kijken naar de functie van 1 bepaald gen bepalen, we weten welke genen we willen
onderzoeken en waar je de functie wilt bepalen. Begint met bekend gen, zoek naar de functie
- Analyseren van fenotypische effecten van een specifiek geïntroduceerde verandering in gen
sequenties
- Je begint met genen
o In animale model systemen
o In individuele cellen (in cultuur) als modelsysteem
- Duidelijk welke genen onderzocht willen worden
- Wat is de functie van specifieke genen?
- Aanpak: gerichte gen inactivering
Modelsystemen voor genetische studies dierlijke modelorganismen
- bacteriën, C. elegans, Drosophila en Arabidopsis.

- Niet humaan, toch nuttig om te bestuderen

lOMoARcPSD|35251367
- Intensief bestudeerd
- Representatief, studie verschaft algemeen inzicht
Drosophila melanogaster
 Voordelen:
- Diermodel
- Korte levenscyclus (10 dagen)
- Gemakkelijk te kweken
- Geconserveerde moleculaire processen en pathways
- Twee geslachten, man en vrouw. Embryo gelegd en hieruit groeit een larve, deze heeft
verschillende fase (instar), hierna metamorfose ondergaan.
- Hoop processen zijn bestudeerd.
 Screens  wat is het doel  mutaties maken om processen te bestuderen

- Klassieke genetische screen: random mutageniseert en naar homozygote nakomelingen
kijken)
- Klonale screens: lokaal een groep cellen mutant maken, dit doe je zodat de rest van het
organisme normaal ontwikkelt
- Overexpressie screen: iets meer tot expressie brengen (gain of function)  RNAi screen
(dRNA inbrengen in het embryo)
- Modifier screens (enhancer, supressors en synthetische interacties)
 Tools
- Balancer chromosomen
o Omgekeerde stukken chromosoom  voorkomt recombinatie
o Homozygoot is lethaal
o Gebruikt om een mutatie stabiel in een populatie te houden
o Voor zowel zichtbare als recessief lethale fenotypen
- P-elementen (transposons)
o Een transposon is een mobiel stukje DNA.
o Een P-elementen zijn transposons die in het DNA kunnen integreren.
o Voor mutagenese
o Inbrengen van transgenen
o P-elements in het wild hebben 21 bp repeats en het transposase enzym om in het
DNA te integreren
o P-element vectoren gemaakt in lab
 Marker (white+)
 Gen van interesse (X)
 Plasmide om in bacteriën op te groeien
o P- element vectoren hebben 21 bp repeats maar geen transposase

lOMoARcPSD|35251367
o Plasmide met transposose hebben geen 21 bp repeats en kan niet in het DNA
integreren
o Transposons zijn stukjes DNA die kunnen rondspringen, dit codeert voor enzym om
zichzelf te knippen en te integreren in de gastheer. Aan uiteinde stukje DNA heeft hij
21 bp die kan integreren in het chromosoom en kan er uit geknipt worden door het
enzym. Soms komt het terecht waar het geen kwaad kan, soms komt het terecht in
het gen waar je interesse in hebt.
o Transgene vlieg maken
 Plasmide nodig met een marker en je gen van interesse
 Plasmide met een transposase nodig en injecteren
 Het plasmide met transposase integreert niet in het DNA.
 P-element plasmide kan in het genoom integreren en doorgegeven worden aan
het nageslacht.
- P-elements repeats hebben transposase eruit geknipt  anders blijft het springen
- Gen X stop je tussen repeats
- Marker en plasmide nodig  rond de bacterie groeien zonder repeats
- Injecteren in embryo’s
- Stukje gen X integreren waardoor tot expressie komt
- Plasmide een zin meer in vlieg maar white gene wel
- GAL4/UAS systeem
o Weefsel specifieke genexpressie (ectopische-expressie)
o Gist GAL4 is een transcriptionele activator die bindt aan
Upstream Activating Sequences (UAS) op DNA.
o In het Drosophila genoom is het GAL4 gen geplaatst
achter vele weefsel specifieke promotoren in
verschillende lijnen.
o Gen van interesse (gen X) kan dit onder controle van
UAS geplaatst worden en dit wordt als transgen
geïntegreerd in het Drosophila genoom.
o Weefselspecifieke promotor voor Gal4 gen zetten,
 Bijv promotor nemen welke alleen in de
ogen is
 Gal4 komt alleen in de ogen tot expressie
 Gen X komt dus dan in de ogen voor
 Vliegen die deze twee transgenen hebben brengen gen X in bepaald
weefsel tot expressie.
 Twee verschillende vliegen met P-elementen in het genoom geintegreerd
 dus 1 vlieg met een weefselspecifieke promotor voor Gal4 en een
vlieg met UAS voor gen X
 De nakomelingen worden dan bekeken.

lOMoARcPSD|35251367
Vliegen die een weefsel-specifieke GAL-4 tot expressie brengen worden gekruist met
vliegen die gen X gekloneerd achter UAS hebben.
o Gen X wordt ectopisch tot expressie gebracht in weefsels waar GAL4 tot expressie
komt.
o Het is niet nodig om nieuwe lijnen te maken om gen X tot expressie te brengen in
verschillende weefsels  omdat als je dit systeem hebt en je hebt al veel linke lijnen,
dan hoef je maar 1x een UAS lijn te maken, dan kan je de vliegen kruisen. Je kruist
dus de ene vlieg met een hele hoop vliegen van TSP/Gal4.
- CRISPR/Cas9
o Cas9 is een bacterieel endonuclease, deze knipt DNA en gebruikt geassocieerd RNA
voor de specificiteit.
o Targeted knock out en knock in
o Dit systeem komt van bacteriën
o Cas9 wordt naar de plek gebracht door guide RNA waardoor je heel specifiek op een
bepaalde plek een breuk kan maken.
Drosophila genetica
 Forward genetics: Je begint met proces, zoek mutaties met een specifiek fenotype
- Chemische mutagenese (EMS)
- Transposon hopping en integratie (P-element)
 Klassieke screen
- Forward genetics
- Alleen de eerste essentiële genfunctie is detecteerbaar
- Door maternele producten zal vaak de genfunctie tijdens de embryogenese verborgen
blijven.
o Kan tijdje overleven door producten verkregen door de moeder, moeder
compenseert de mutatie
- Mutanten zijn vaak homozygoot mutant, maar de moeder is wel heterozygoot, dus die heeft
nog een kopie in het genoom waarmee zij die producten nog wel kan produceren.
- Moeder kan geen wildtype doorgeven als deze al gemuteerd is.
- De nakomelingen van homozygote mutanten worden bekeken: “maternal effect screen”.

lOMoARcPSD|35251367
Drosophila klassieke genetische screen
A. Mutagenese mannetjes
B. Random zaadcel mutaties
C. Kruisen met vrouwtjes
D. Elke nakomeling heeft een andere mutatie
E. Elke nakomeling apart kruisen
F. Lijnen maken met elke andere mutatie
G. Levende homozygote vliegen testen op
fenotype
- Wat als de homozygote mutanten niet

levensvatbaar zijn?
o  Indien niet homozygoot levensvatbaar: de homozygoot mutant embryo's en
larven bekijken voor fenotype.
- Wat als men screent voor maternale effect mutaties?
o  Indien een maternele contributie verwacht wordt: de nakomelingen van de
levende homozygoot mutanten testen
 Lokale “transposon hopping” en screen (PCR)

o Transposons hopping
 Transposons kunnen ook dienen als marker in het DNA, plasmide zit erin.
 Je kan weten waar het zich in een genoom bevindt, je kunt het lokaal laten
hoppen (PCR op screenen, primer in transposons en primer in het gen) zodra
je een bandje ziet dan heb je in het gen gehopt.
 Overexpressie met Gal4-UAS
o Gal4-UAS systeem voor geïnduceerde genexpressie:
o Het GAL4 gen is achter een groot aantal weefsel-specifieke promotoren gezet in
verschillende Drosophila stammen.
o Vliegen met GAL4 achter een weefsel specifieke promotor kunnen worden gekruist
met vliegen met een “gene of interest” (gen X) gekloneerd achter UAS sequenties.
o Screens in het drosophila oog met Gal4/UAS systeem
 Screen voor gemakkelijk te scoren fenotypes
 Het oog is niet nodig voor overleving van de vlieg in het lab
 Maternale contributie speelt geen noemenswaardige rol, maternele
producten zijn dan allang afgebroken
 Samengesteld oog van de fruitvlieg bestaat uit een groot aantal ommatidia
 Ommatidia vormen een regelmatig patroon
 Elk ommatidium bestaat uit:
o 8 fotoreceptor neuronen
o 4 cone cellen die de lens secreteren
o Pigmentcellen die elk ommatidium unit isoleren van licht

lOMoARcPSD|35251367
o Haarcellen
 Ommatidia patroon hangt af van de juiste ontwikkeling van de cellen in een
ommatidium
o Differentiatie van fotoreceptor cellen
o Celdeling
o Celdood
 RNAi:
o GAL4/UAS system kan ook worden gebruikt voor (weefselspecifieke) RNAi
o Expressie van “hairpin RNA’s, injectie dsRNA
 Targeted mutagenesis: CRISPR/Cas9 knock-out, knock-in
Efficiënte overexpressie en modificatie screens in Drosophila oog
- Suppressor  als mutant iets minder mutant wordt

- Enhancement  verergering van mutant
- Dominante supressors en enhancer genen werken vaak in hetzelfde
proces/signaaltransductie-route
Drosophila screen voor dominante modifiers van sevenless
- Sevenless is een gen wat zorgt voor R7 fotoreceptoren, dus als hier een mutant in zit krijg je
een ruw oog.
- Als je een modifier hebt kan je een enhancer krijgen van dit “ruw oog” fenotype  meer van
de R7 fotoreceptoren  donkere rondjes kleiner
- Sevenless mutant heeft 6 donkere plekjes (normaal 7 donkere plekjes)
- Sevenless is een Receptor Tyrosine Kinase en nodig voor ontwikkeling van het R7
fotoreceptor
- Sevenless receptor temperatuur gevoelig en afhankelijk of wel of niet groeit  bij hogere
temperatuur conformatieverandering
o Zwakke mutatie (temperatuur sensitieve sevenless84)
o Bij een niet permissieve temperatuur ontwikkelt de R7 photoreceptor zich net
o Door deze genetische achtergrond is het fenotype gevoelig voor veranderingen
o Ingekruiste mutaties kunnen tot meer of minder R7 photoreceptoren leiden
- Boven normaal oog en onder ruw oog

lOMoARcPSD|35251367
- Wildtype oog boven met 7 fotoreceptoren, soms geen

R7 bij bepaalde temperatuur dan is het nog min of meer
normaal. Soms meer en dan krijg je ruwe ogen.
- Slechts 1 mutant allel van een gen upstream of
downstream regulator is, duidelijk zichtbare gevolgen
heeft.
- Dit wordt een “dominante modifier” screen genoemd
 betekent dat je slechts een mutant allel van iets wat
upstream of downstream werkt van die receptor en dat
dat zichtbare gevolgen heeft.
- “Dominante modifiers” van sevenless zijn componenten van de Ras signaleringsroute
o Een zeer gevoelige aanpak om genen in de Groeifactor-Receptor-Ras pathway te
identificeren
o Meerdere componenten zijn geïdentificeerd door genetische screens
Dominante modifiers van sevenless zijn componenten van de Ras signaleringsroute
- Sevenless is de receptor tyrosine kinase

- Boss – Bride of Seveless: het ligand
- Dos – Daughter of Sevenless: Adaptor eiwit
- Sos – Son of Sevenless: Ras GTP exchange factor
- Genen die gekloneerd werden bleek in de

signaaltransductiepathway van Ras te zitten.
- Ras is een smalle GTPase, die kan van GTP naar GDP
veranderen en omgekeerd.
- Signaal doorgegeven aan aantal andere kinases wat eindigt in
de kern met transcriptie.
- Het ligand werd Bride of sevenless genoem
- Son of sevenless (exchange factor voor Ras)  zet GDP om in
GTP
- Daughter of sevenless (adaptoreiwit)  geeft signalen door
- Zeer gevoelige aanpak om genen in de groeifactor – receptor –
ras pathway te identificeren.
- Meerdere componenten geïdentificeerd door genetische screens  blijken geconserveerd
tot aan zoogdieren
- Belangrijk bij vorming van specifieke celtypen (zoals R7), maar ook cel proliferatie (kanker)
Epistase analyse: ordenen van signaaltransductie routes
 Epistase wordt in de genetica gedaan om genen te ordenen

 Kruis verschillende mutanten  wat is het fenotype?
 Het fenotype van het downstream gen is leidend.
 Voorbeeld: RAS gain-of-function mutant (ruw oog)
 Wat gebeurt er als je RAS mutant kruist met loss of function voor RAF? Of MAPK?

lOMoARcPSD|35251367
 RAF en MAPK zijn downstream van RAS in de signaal transductie route
C. elegans als modelorganisme
- Groei op agar platen met E. coli bij 15-25 C

- 1 ouder kan meer dan 300 nakomelingen geven
- Volgende generatie in 3-5 dagen
- Kleine 1 mm vrij-levende rondworm of nematode
- Leeft in de bodem en eet bacteriën
- Transparant: alle cellen, celdeling en celmigratie te zien
- Ontwikkeling reproduceerbaar
- Embryonale ontwikkeling duurt 16 uur
- Larvale ontwikkeling L1  volwassen 2-3 dagen
- Twee geslachten: een man en een hermafrodiet (959 cellen)
- De man heeft iets meer cellen
- Gemakkelijk te kweken en goedkoop
- Relatief simpel diermodel (beperkt aantal cellen)
- Screens voor mutaties die reproduceerbare ontwikkeling verstoren
 Genetica
- Forward genetica (proces  zoek fenotype)
o Chemische mutagenese (EMS)
o Transposon integratie (Tc1)
- Reverse genetica (bekend gen  zoek functie)
o Transposon hopping: screen (PCR) op deleties in gen na transposon excisie
o RNAi: feeding, soaking, injectie dsRNA
o Targeted mutagenese: CRISPR/Cas9 knock-out, knock-in
- Screenen is iets makkelijker, je geeft hermafrodiet EMS.

- De geslachtcellen worden gemutageniseerd
- De hermafrodiet bevrucht zichzelf
- Van dezelfde volgende nakomelingen de F2 en als deze met
elkaar kruisen kun je homozygote mutanten krijgen.
- Omdat hij hermafrodiet is hoef je minder handelingen te
doen.
RNAi (RNA interferentie) post-transcriptionele mechanisme om

genen te silencen en gen expressie te reguleren
1. Introductie van dsRNA (injectie, expressie, feeding)

2. Dicer enzym knipt dsRNA in kleine fragmenten  siRNAs (21 bp)
3. Guide RNA gaat samen met RISC complex (RNA-induced silencing complex)
4. Er is complementaire interactie met de anit-sense strand
5. Herkenning target mRNA
6. mRNA afbraak

lOMoARcPSD|35251367
- shRNAs zijn handiger dan siRNAs

o Reverse complementair aan DNA wat je kapot wilt knippen.
o De nucleotiden die reverse complementair zijn moeten tenminste 19 nucleotiden
hebben die overeenkomen met target mRNA.
o Mechanisme blijft hetzelfde van RNAi.
o shRNAs gebruken om in een neuron te bekijken wat er gebeurt
RNAi screens
- Alle genen te kloneren tussen twee T7 promotoren in plasmide, ongeveer 20.000

bacteriestammen welke apart gegroeid kunnen worden (in welletjes)
- Wormen in een wel doen en dan fenotype scoren en dan heb je het gele genoom gescreend
op knockdown en kijken naar waar je geïnteresseerd in bent.
 Vulva ontwikkeling
- Wildtype
- Multi vulva: heeft extra vulva’s, zijn andere cellen die primaire cell fate aannemen
- Vulvaless mutant: kan geen eieren leggen, zit vol met kleine wormpjes uit de eieren die
uitkomen in het lichaam en eten de mutant op
o Ventrale kant van beestje kijken of je extra blubjes ziet
- De vulva is niet nodig voor overleving in het lab
- Maternele contributie speelt geen noemenswaardige rol
- Verstoring van vulva ontwikkeling is gemakkelijk te herkennen
- Het is een hermafrodiet dus kan zichzelf bevruchten dus vulva niet perse nodig
Vorming vulva
- Bepaald door combinatie van verschillende signaleringsroutes
- Als model voor cell-fate regulatie door cel-cel signalering
- 6 vulva precursor cellen zijn equivalent (elke cel gelijk potentieel, maar ze worden allemaal
anders primair, secundair of tertair)
- 1 cel neemt primaire fate aan en de andere 2 cellen secundair.
- Deze fates zijn afhankelijk van verschillende signaaltransductieroutes
- De anchorcel zit iets boven deze 6 cellen waardoor 1 cel primair wordt en andere secundair
- Anchorcel geeft EGF ligand en bindt aan EGF receptor aan primaire cel
- RAS signalering wordt aangezet en cel wordt primair en minder signaal secundair
- Notch Delta signalering tussen primaire en secundair waardoor ze anders van elkaar worden

lOMoARcPSD|35251367
Ras signaleringsroute:
- Signaleringsroutes in verschillende organismen vertonen grote gelijkenis

- Mutaties in componenten van de signaleringsroutes zijn de oorzaak van ziektes (bijv. kanker)
- Door te weten hoe het signaal wordt overgedragen kunnen medicijnen ontwikkelt worden
Hoorcollege Reverse genetics en gene function
Klassieke genetica
- Overerving van een bepaald kenmerk

- Gebaseerd om visuele resultaten
- De basis is het concept van een gen
Moleculaire genetica
- De functie en structuur van genen op een moleculair niveau

- Achter de moleculaire functie komen van een bepaald gen
Forward VS reverse genetica
 Forward genetics
- De genetische basis bekijken van een bepaald fenotype
- Je begint bij een fenotype en dan kijk je welke genen hierbij betrokken zijn
- Meestal genetische screens en in het meeste geval toevallige mutagenese gebruiken.
- Gebruikt natuurlijke voorkomende mutaties of random geïnduceerde mutaties
- Bacteriën, C. elegans, Drosophila en Arabidopsis.
- Bij menselijke ziektes kan er gekeken worden door middel van chromosomale microarray
analyse (CMA), next generation sequencing (NGS), GWAS
 Reverse genetics
- Je wilt de functie van een bepaald gen bepalen
Je analyseert het fenotypische effect van een specifiek geïntroduceerde verandering in de
gensequentie.
- Dierlijk modelsysteem
- Een individuele cel als modelsysteem.
- Op moleculair niveau (biochemisch)
- De nadruk in het practicum ligt op reverse genetica, er is duidelijk welke genen onderzocht
willen worden.
Forward genetics:
- Project A: Forward genetics heeft het gen BicD2 geïdentificeerd wat gemuteerd is bij
patiënten met neurologische symptomen.
Reverse genetics:
- Lena project A: Identificeer de rol van BicD2 in de cortical ontwikkeling.

o BicD2 adaptoreiwit welke dyneine kan binden, adaptor bindt dus ene kant dyneine
en andere kant cargo. Wat is de rol in neuronale ontwikkeling van de cortex?
- Lena project B: Ontdek de moleculaire functie van MAp7 in de CNS neuronen
Project A

lOMoARcPSD|35251367
- Functie onderzoeken van BicD2 in neuronale ontwikkeling of cortex  weefsel betekent

knockout maken of conditionele knockout
- Begonnen met een globale knockout muis  BicD2 is dan uitgeschakeld in alle cellen van het
organisme.
- Het heeft een duidelijk fenotype, maar deze muizen gingen dood, dus kon er geen verder
onderzoek gedaan worden
- Toen conditionele knockout muis gemaakt  gen wat je wil onderzoeken alleen bij bepaalde
cellen uitgeschakeld.
o Alleen bij neuronen
o Bij neuronen en Cre-cellen
- Muizen bleven hier wel bij leven
Project B
- Welke genen zijn verantwoordelijk van de vorming van spikes -> map7.
- Spikes zijn verantwoordelijk voor de signalering van neuronen.
- Hierbij worden neuronen cellen gebruikt.
- Er was begonnen met een knockdown screen (geen forward genetics omdat er al een paar
kandidaten waren die getest werden en er geen sequencing werd gebruikt)
De moleculaire functie identificeren van Map7 in CNS neuronen
- Map7 is microtubuli bindend eiwit, de functie van Map7 in delende cellen is iets over
bekend maar niet over neuronen.
- Neuronen zijn beetje speciaal en in functie verschilt dat met delende cellen, dus wat is
hiervan de functie? Wat is de moleculaire rol van Map 7?
Bij remming / knockdown van RNAi dan zie je in de Map7 mutant weinig spines over
Modelsystemen in reverse genetics:
- Bacteriën
- Planten
- Gist
- Dierlijke modelsystemen: muis, rat, C. Elegans, zebravis
- In vitro: dierlijke cellen in een cultuur
Voordelen diermodel
- Complete deletie (ko/null allel) is mogelijk

- In vivo
- Analyse van ontwikkelingsprocessen in weefsel
- Modelsystem voor menselijke ziektes
Nadelen diermodel
- Kost veel tijd (2 jaar)

- Gebruik van dieren (ethiek)
- Het is duur om te genereren
Gene targeting in muizen
1. ES cellen worden geïsoleerd uit het ICM van een blastocyst.

lOMoARcPSD|35251367
2. Je weet de sequentie van het gen dat je wil uitschakelen. Je brengt een plasmide in die
geschikt is voor homologe recombinatie. Dit doe je met in silicio klonering. Je hebt twee
homologe armen van het gen wat je wil uitschakelen. Tussen deze twee armen plak je een
neo resistentie sequentie en hierachter een des gene sequentie.
3. Deze vector wordt ingebracht in de ES cel.
4. Er vindt homologe recombinatie plaats -> er wordt DNA uitgewisseld tussen de vector en het
gen wat je wil targeten.
5. In het target gen vind je een neo resistentie sequentie. Het gen wat je wil uitschakelen is nu
kapot gemaakt. Je kan de cellen selecteren op neo resistentie. Het des gene kan je gebruiken
voor negatieve selectie. Door de des gene sterven de cellen.
6. Deze ES cellen worden teruggeplaatst in een blastocyst.
7. Deze wordt teruggezet in een muis en wordt daar ontwikkeld. Deze worden mosaik muizen
genoemd. Omdat deze genetisch gezien mosaik zijn. De nakomeling kunnen ook knock out
zijn.
8. De mosaic muizen ga je kruisen met het wildtype. Wanneer je hierna het wildtype krijgt
betekent dit dat je een heterozygote knockout hebt.
Conditionele knockouts:
1. Je hebt een gen van interesse

2. Je gebruikt een target vector
3. Er vindt homologe recombinatie plaats, de neo resistentie wordt ingebouwd in een intron,
dus komt het gen nog steeds tot expressie
4. Cre sites, herkenning site voor enzymen (cre recombinase).
5. Je kan de muis kruisen met een muis met cre recombinase.
6. Fenotypisch is deze muis helemaal normaal, maar deze kan je kruisen met een andere muis.
Als deze muis een cre recombinase bevat komen in de nakomelingen ook cre recombinase
tot expressie. Deze kan precies op de loxP sites knippen en knipt hierbij ook twee intronen
mee.
7. Nu heb je wel een knockout allel gecreëerd.
Hoe komt dit in een specifiek celtype tot expressie?

lOMoARcPSD|35251367
- Cre recombinase zit onder controle van een celtype specifieke promotor. Hiermee kan je
celspecifieke conditionele knockouts creëren
Modelsysteem: zoogdiercellen in cultuur (in vitro):
- Verschillen in cellen
o Oorsprong (dier, weefsel)
o Grootte, morfologie
o Biochemische activiteit
- Primaire cellen vs immortalized cellijnen
o Primaire cellen worden van een dier geïsoleerd
o Cellijnen kan je voor altijd in de kweek houden
Primaire cellen
 Terminaal gedifferentieerde primaire cellen:

o Fibroblasten (figuur rechts, boven)
o Epitheel cellen
o Neuronen
 Ongedifferentieerde primaire cellen
o Pluripotente embryonale stamcellen (ES)
o Multipotente stamcellen (figuur rechts, onder)
 Glia progenitor cellen  kunnen differentiëren in
neuronen en gliacellen
o Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPCSs): cellen die je terugzet in een stamcel
fate.
 Je neemt fibroblasten en kweekt deze.
 Je voegt vier factoren toe door transfectie (Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc).
 Dan kan je de cellen terugzetten in een stamcel fate.
 Om ze te laten differentiëren moet je ze in een bepaald medium kweken met
bepaalde groeifactoren en differentiatiefactoren.
Primaire cellen hebben een gelimiteerd niveau van celdelingen en zijn moeilijk om te culturen.
Daarom wordt er vaak gebruik gemaakt van een immortalized cellijn.
- Cellijnen met spontane delingen (cellen van een tumor).

- Cellijnen die gemaakt zijn door onderzoekers met mutaties -> mutatie in proto-oncogenen
- Altijd mutatie of iets anders toegevoegd waardoor cellijnen geimmortaliseert zijn, maar ook
zijn er cellen welke dat niet hoeven bijvoorbeeld kankercellen.

lOMoARcPSD|35251367
Immortalized cellijnen meest voorkomend
 Hela cellen
o Meest bekende spontane geimmortaliseerde cellijn
o Geïsoleerd van nekkanker
o Komen uit humane foetale niercellen, immortalisatie door het adenovirus. De cellen
delen snel
o 1 ste humane cellijn
o Wereldwijd in bijna elk biologisch lab
o Als je de cellen goed verzorgt kan je oneindig doorgaan met het werken met deze
cellen
 COS cellen (COS-1 en COS-7)
o Cellen van een menselijke nier: epitheelcellen
o Expressie van wildtype en mutatie constructen
o ICC  test subcellulaire localisatie en cellulaire/moleculaire effecten van de mutaties
o Fibroblast like cellen van afrikaanse groene aap nier
o Relatief groot
o Relatief hoge eiwit productie
o COS= cv1 in origin and carrying SV40 genetic material
o Gemaakt door onderzoekers
 HEK293T cellen
o Humane embryonale nier: epitheel cellen
o Expressie van plasmiden/shRNAs
o Western blot  test algemene expressie/supressie
o Heel erg hoge eiwit productie
o Gemaakt door onderzoekers
o Immortalized door een adenovirus
o Het heeft extra virus sequenties: SV40 grote T antigen
 Extra eiwit expressie
 Extra replicatie van geïnduceerde plasmiden } western blot
o 64 chromosomen: hypotriploid
o Goed post translationele modificaties (PMTs)
o Relatief klein waardoor ze niet goed kunnen binden } ICC
 Cel cultuur
o Humane cellen
o 37 graden, vochtige omgeving, CO2  pH waarde constant van medium
o Speciaal medium, afhankelijk van celtype:
 Bevat aminozuren, vitaminen, zouten, suikers
 Vaak serum ((bevat heel veel eiwitten, niet handig als dit blijft zitten de
eiwitten moeten wel kwijt geraakt worden door het medium weg te wassen
en extra buffer toevoegen), groei factoren, eiwitten
 Antibiotica (optioneel, voor contaminaties in lage concentratie)
 Speciale groei factoren inhibitoren
 In ICC experiment gebruiken we COS-7 cellen , omdat ze groot zijn met een hoge
eiwitproductie
 Bij de Western Blot maken we gebruik van de HEK293T cellen

lOMoARcPSD|35251367
 HeLa cellen worden over het algemeen vaker gebruikt.

 Cellen worden gebruikt en zijn toevallig gevonden in een kanker
Routinewerk in de celcultuur:
- Steriel
- Primaire cellen: preparatie van weefsel
- Delende cellijnen:
o Als het vol is moet je de cellen verdelen over twee bodems
o Je maakt de cellen los om een beetje trypsine toe te voegen
o Om de cellijn te behouden: 1-2 keer per week ‘splitten’
o Ratio is afhankelijk van celtype
- Transfectie van de cellen: het inbrengen van plasmiden in DNA
Werken met primaire cellen
- Als je met primaire cellen werkt moet elke week embryonen eruit gehaald worden, oplossing
met cellen verspreiden over de wells en deze hechten met de glaasjes.
- Dan heb je wildtype neuronen, hieraan kun je transfecties toepassen (plasmiden inbrengen)
en bijvoorbeeld met shRNA en hiermee kan je RNAi toepassen en een gen remmen.
- Vaak voeg je een GFP toe dan kun je de getransficeerde cellen goed zien.
Werken met cellijnen
- Hier hoef je niet te isoleren en deze heb je in het lab  wel werk doen en splitsen, doordat
ze blijven delen op medium moet de plaat gesplitst worden want anders gaan ze ophopen en
dood  moet vaak 1 tot 2 keer per week.
- Het splitsen kan door middel van trypsine, dan komen de cellen los van de bodem en dan kan
je het medium weghalen en verspreiden over nieuwe platen.
- Nu transfectie doen, hier breng je DNA-plasmide de cel in.
Cel transfectie:
- Expressie of surpressie van plasmiden in de cellen brengen

- Transfectie methoden (biologisch)
 Virus gebruiken  efficiënt, maar vergunning nodig
 Fysische methoden:
o Elektroporatie: DNA inbrengen in weefsel (levende cellen)  vrij efficiënt
 Mechanische methode
o Micro injectie

lOMoARcPSD|35251367
- Laag efficiënt  fijne naald in een enkele cel maar je moet een stevige hand
hebben
 Chemische methoden:
o Calcium fosfaat methode (PEi):
- Formatie van complexen met DNA  zet zich vast een membraan  endocytose
- Goed voor sneldelende cellen (cellijnen)
- Goedkope methode
o Lipofectie (Kationische liposomen):
- Positieve geladen lipiden bollen: complexen met DNA  kan door celmembraan
gaan
- Niet delende cellen (neuronen); moeilijk om cellen de transfecteren
- Duur
Transient: extra chromosomaal (plasmiden), dus is aanwezig voor een bepaalde tijd en verdwijnt
daarna.
Stabiel: integratie tot het genoom nodig (selectie nodig).
Loss of function (LOF) methoden

Klassieke LOF methoden:
 Knockout
o Gene targeting in muizen
o Globale of conditionele ko’s
o Of: CRISPR/Cas9 systeem
 Knockdown (kd) door RNAi (shRNA plasmiden, siRNAs)
o RNA interferentie (RNAi)
 Het mRNA is vernietigd voordat het wordt getransleerd wordt tot een eiwit
 Gene silencing als post-transcriptionele mechanisme om genexpressie te
reguleren
 Als een endogene regulatie mechanisme van de cel
 Als een cellulair verdedigingsmechanisme tegen virale genexpressie
 Als een mechanisme voor wetenschappers voor knockdown van genen van
interesse
 Als een therapeutische applicatie in mensen

lOMoARcPSD|35251367
 Je gebruikt shRNAs of siRNAs

 In practicum gebruiken we shRNA
vector.
 De sequentie moet minstens
precies 19 nucleotiden perfect
overeenkomen aan het mRNA
wat je wil uitschakelen.
 Dicer herkent dubbelstrengs RNA
kan het in kleine stukjes knippen
van 21 nucleotiden.
 Deze kleine stukjes vormen een
complex met het enzymcomplex
RISC.
 Dit complex gaat naar het mRNA
en bindt hieraan en het wordt
geknipt.
 Overexpressie van dominant negatieve constructen
o Een inactieve kinase, inactieve motor eiwitten,
etc.
Gain of function (GOF) overexpressie
- Overexpressie van wildtype gen

o Moderate expressie: om subcellulaire lokalisatie te bestuderen  in gefixeerde
cellen (ICC)
o Dit is als controle voor mutanten
o Functioneel assay: effect van overexpressie
o Cellen bestuderen welke hoge expressie is (sterk GFP signaal) en ergens waar zwak
expressie is (laag GFP signaal)
- Over expressie van een hyperactief gen
- Overexpressie van een mutante gen versie
o Expressie van mutanten
 Punt mutatanten
 Punt mutatie van BicD2 is gevonden in patiënten, niet bekend wat er
op cellulair niveau gebeurt
 Missense mutatie: wordt een ander aminozuur gemaakt
 Silent mutatie
 Nonsense mutatie
 Deletie mutanten
 Deletie van 1 triplet  gen wel tot expressie want readingframe is
niet verandert
 Deletie van een basepaar  frameshift
 Deletie van functionele domeinen in eiwit structuren
Labelen van eiwitten
 Fluorescent (GFP, RFP en derivaat)

lOMoARcPSD|35251367
o 26 kDA
o GFP
 Voordelen:
 Je kan het zien in gefixeerde en levende cellen
 In cellen, weefsels en gehele organismen
 Veel tools ontwikkeld
 Nadelen:
 Kan interfereren met de lokalisatie/ functie (26 kDA = relatief groot)
- N-/C-terminal fusie kan verschillen
 Peptiden
o HA, myc, flag, V5…-> kleine peptiden die kunnen worden herkent door antilichamen
o Eiwitten gebruikt in biochemie zoals GST, HIS biotine
Loss of function: Suppressie van endogene genexpressie.
Gain of function of change of function: Exogene genexpressie, iets wat vanuit buiten wordt
ingebracht en hierna het effect bestudeerd kan worden.
- Het induceren van verandering of disruptie van gen expressie of een gen van interesse DNA
(mRNA) level
- Analyseren het effect van de verandering kan door te kijken naar de expressie: veranderingen
in cellulaire structuren en processen
 eiwit niveau
Analysemethoden in celbiologie:
 Analyse van eiwitten die tot expressie komen:

o Analyse van expressie (patroon):
 Biochemie: Western blot  expressie in het algemeen/ expressie niveau van
eiwitten
 Massa spectrometry
 Immunocytochemie (cellen)  lokalisatie
 Levende cellen imaging: dynamiek
o Analyse van cellulaire effecten /functie:
 Immunocytochemie (ICC)  het labelen van cellulaire structuren waar
mogelijk effect op is
 Levende cel imaging: dynamiek (bvb transport)
 Veel vraag afhankelijke assays
o Interactie studies:
 Biochemische interactie studies: pull-down, immunoprecipitatie
 FRET
 Analyse van DNA en RNA
o Analyse van DNA
 Sequencing
 Southern blot
 Gene chip analysis
 Methylation analysis
o Analyse van RNA
 RT-qPCR
 Northern Blot

lOMoARcPSD|35251367
 Microarray chip analysis
Methoden om naar de expressie, lokalisatie of functie te kijken van een eiwit
 Western Blot
 Immunocytochemistry (ICC) of IHC
Verdere functionele analyse  eiwit leven  speciale methodes en deze zijn van de functie van het
eiwit afhankelijk.
Soms kies je liever voor een kleinere tag dan GFP, dat waren de peptides bijvoorbeeld HA dit zijn
kleine aminozuursequenties welke antilichamen kunnen herkennen.
Immunocytochemistry (ICC) experiment
 De lokalisatie visualiseren van specifieke eiwitten of antigenen in/op cellen

o Direct ICC: Een specifiek primair antilichaam (AB) dat bindt aan een visueel
detecteerbare tag (fluorescente molecuul).
o Indirect ICC: Een secundair antilichaam wat bindt aan het primair antilichaam van
een bepaalde soort.
 Fluorescent secundair AB
 Konijn anti-X + Geit anti-konijn Alexa488
 405  blauwe fluorescentie
 488  groene fluorescentie
 568  rode fluorescentie
 Er wordt een kleuring gedaan met antilichamen en hierdoor
worden bepaalde eiwitten zichtbaar  willen zien waar het localiseert (bijv microtubuli)
 Gebruik indirecte ICC
 Indirect ICC is goedkoop, bijna alle primaire antilichamen gemaakt in konijn en muis.
Secundaire antilichamen beperkt aantal nodig, dus goedkoper. Het is meer flexibel want je
kan de secundaire voor alle toepassen.
 Visualisatie van de lokalisatie van specifieke eiwitten of antigenen in en op cellen
 Specifieke primaire antilichaam (AB) bindt het eiwit of de tag
Standaard ICC protocol:

- Fixatie en permeabilisatie vóór antilichaam kleuring
1. Fixatie
- Immobilisatie van antigeen
- Stabilisatie van de cel
- Inactivatie van proteases
- Bescherming van infecties
- Veel gebruikte methodes:
o Crosslinking van eiwitten
 PFA
 Formaline
 Glutaraldehyde
o Precipatie (dehydratie)
 Methanol (100%), Aceton
2. Permeabilisatie
- Toegankelijkheid tot het target eiwit/antigeen

lOMoARcPSD|35251367
- Veel gebruikte methodes:

o Sterke detergenten (Triton-X)
o Methanol
o Milde detergenten (saponinen)
Detectie van ICC: fluorescentie microscoop
- Je straalt licht op je sample, door specifieke golflengtes wordt fluorofoor in een actieve
status gebracht.
- De elektronen worden voor een kort moment in een hoger niveau gebracht.
- Wanneer deze elektronen terugvallen naar hun eigen niveau stralen ze fluorescentie uit.
o Epi-fluorescente microscoop: je ziet maar een vlakte van de cel scherp.
o Confocale microscoop: je kan optische coupes maken.
 Je kan elke vlakte van je sample scherp krijgen.
 Deze microscoop heeft een pinhole die ervoor kan zorgen dat het licht van
de laser (voor goede foto’s) op verschillende posities op de spiegel wordt
geworpen.
 Hierdoor wordt het licht op verschillende dieptes in het sample geschenen
waardoor je als de deze coupes op elkaar plakt de diepte te zien krijgt van je
sample.
 Je begint beneden in de cel  1e foto en dan steeds hoger  3D foto
ICC visualisatie van cellulaire structuren met antilichamen:
 Nucleus/DNA: wordt gekleurd door Dapi (blauw gekleurd  geen antilichaam)

 Microtubuli: wordt gekleurd door anti-tubuline
 Trans-Golgi: anti-GM130
 Fluorescente tags = direct of indirect
o GFP-MAP-7
o Zichtbaar zonder antilichaam kleuring
o Mogelijk om anti-GFP toe te voegen om het signaal te versterken
 Peptide tags (HA, myc) = antilichaam kleuring is nodig
 Visualisatie van cellulaire structuren met
antilichamen
 Visualisatie van endogenous eiwitten met antilichamen

lOMoARcPSD|35251367
 Visualisatie van eiwit tags van exogenous gen expressie
ICC om het effect van LOF, GOF of gemuteerde genen te bestuderen
 Intracellulaire lokalisatie van het endogenous eiwitten met antilichamen

 Celmorfologie/ cellulaire structuren
 Functie
 Ook kunnen weefsels gekleurd worden  IHC (Immunohistochemistry)
o Bijv structuur in hersenen, overlap en kolonisatie zorgt voor gele kleur
 Stel AL werkt niet op cellen en we willen wel lokalisatie
o Koppelen aan een ander eiwit en dan antilichaam tegen inbrengen
o Aan een fluorescentie koppelen

lOMoARcPSD|35251367
 Opties als AL niet werken:

o Fluorescente tags
o Peptide tags (HA, myc)
Western blot: het analyseren van eiwitexpressie
 Detectie van specifieke eiwitexpressie in weefsel/cellen

 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
o SDS: interactie met eiwitten -> zorgt voor een negatieve lading
 Scheiding van eiwitten op grootte  mobiliteit als functie van de lengte
o Post translationele modificaties detecteerbaar
o Meest gebruikte methode: denatureren eiwitgels  tertiaire structuur van de
eiwitten kapot gemaakt
 Detectie van endogenous eiwitten en tags
o Specificeert primaire antilichaam dat bindt aan eiwit en tag
o Secundaire AB bindt aan primaire AB of een bepaalde soort
 Fluorescente secundaire AB

lOMoARcPSD|35251367
 Enymen (HRP)
 Produceert immunoreactie positief product
Western blot stappen
1. Eiwit lysaten maken: bevat de endogene (eiwitten die zich al in de cel bevinden) en exogene
eiwitten (eiwitten die jij hebt ingebracht).
2. Je brengt dit in op een SDS gel en runt deze.
3. Je brengt de eiwitten over vanuit de gel over op het nitrocellulose membraan.
4. We gebruiken primaire en secundaire antigenen die specifiek zijn voor de eiwitten die we
willen visualiseren
ICC en Western blotting zijn twee voorkomende standaard methoes in reverse genetics
Practicum nabespreking
Analyse
1. Grootte van eiwit marker banden bepalen

- Gradient 8% gel: begin van boven grootste bandje
- Van boven beginnen met tellen
- 70 kDa bandje geen fluorescentie
- Bandje bij 55 kDA  tubuline heeft 55 kDA
2. Labeling van de blot conditie per laantje en de gebruikte antilichamen
- Met welke antilichamen kleurt het membraan
- Voor blot gebruikte antilichamen Anti-GFP en Anti-tubuline
3. Beschrijving & interpreratie resultaten
- Tubuline is overal gelijk, behalve bij derde laantje
- Hoe sterk, groot en waar expressie
4. Vergelijken met andere blots
- Emptiness  foutenanalyse
Foutenanalyse
- Lyseren cel, blotten (transfer eiwitten), gel, sds page is goed gegaan
- Hek293T cel lysaten gelukt
- GFP map 7 constructen komen tot expressie
- Antilichamen werken
- Fout bij transfecties (door docenten)
o DNA  misschien meten met NANO fout gegaan

lOMoARcPSD|35251367
o PEI
o Cellen  te dicht, gestrest?
Onderwerpen
 Gist
o Budding yeast (CDC28)
o Fission yeast (Cdc2)
o Mating type switching
 Epistase
o Wee1
o CDC28
 Complementatie (rode gist mutanten, ADE1 en ADE2)  TENTAMEN
 YSH (eiwit-eiwit interactie mapping)  TENTAMEN
o AD::Y (of in practicum AD::LIN-45)
o DB::X (of in practicum DB::MEK-2)
o Practicum uitleggen
 Modelsystemen, afwegingen  TENTAMEN
o Forward genetics
 Bacteriën
 C. elegans
 Drosophila
 Arabidopsis
o Reverse genetics
 Bacteriën
 Planten
 Gist
 Dierlijke modelsystemen; muis, rat, C. elegans, zebravis
 In vitro: dierlijke cellen in cultuur
o Voordelen diermodel
 Complete deletie  knockout
 In vivo
 Analyse van ontwikkelingsprocessen in weefsel
 Modelsysteem voor menselijke ziektes
o Nadelen diermodel
 Kost veel tijd (2 jaar)
 Gebruik van dieren  ethiek
 Duur om te genereren
o Zoodierencellen in cultuur (in vitro)
 Verschillen in cellen  oorsprong, grootte, biochemische activiteit
 Primaire cellen vs immortalised cellijnen
 Primaire cellen
 Uit weefsel dier
 Elke week uit embryo isoleren
 Makkelijker transfecteren
 Minder gevoelig
 Gelimiteerd niveau celdelingen
 Moeilijk om te culturen

lOMoARcPSD|35251367
 Gedifferentieerde primaire cellen  fibroblasten, epitheelcellen,

neuronen
 Ongedifferenteerde primaire cellen  pluripotente embryonale
stamcellen (ES), multipotente stamcellen, geinduceerde pluripotente
stamcellen (IPSC)
 Immortalized cellijn
 Niet hoeven te isoleren
 Lab
 Splitsen, anders blijven ze delen en ophopen en dood  met
trypsine
 Hela cellen
o Spontaan, niet door onderzoekers
o Geisoleerd nekkanker
o Uit humane foetale niercellen
o Cellen delen snel
 Cos cellen
o Uit menselijke nier: epitheelcellen
o Expressie wildtype en mutatie constructen
o ICC
o Groot
o Hoge eiwit productie
 HEK293T cellen
o Humane embryonale nier: epitheelcellen
o Expressie plasmiden/shRNAs
o Western blot
o Klein
o Hele hoge eiwitproductie
o PMTs
 Chemische screens
 Drosophila
o Balancer chromosoom
o P-elementen (transposons)
o GAL4/UAS systeem
o CRISPR/Cas9
o Klassieke genetische screen
o Knock-out
o RNAi (knock down)
o Dominante modifiers  Sevenless
 C. elegans
o Forward genetics en reverse genetics
o Chemische mutagenese
o RNAi
o Vulva ontwikkeling  TENTAMEN
 Forward genetics
 Reverse genetics
 Gene targeting muizen met ES cellen
 Condtionele knockout

lOMoARcPSD|35251367
o Cre recombinase
 Primaire cellen
 Immortalised cellen
 Cel transfectie
 Loss of function methoden
o Knockout
o Knockdown
o Overexpressie dominant negatieve constructen
 Gain of function methoden
o Overexpressie wildtype gen
o Overexpressie hyperactief gen
o Overexpressie mutante gen versie
 Labelen eiwitten
o Fluorescerende tags
o Peptiden
 ICC
 Western blot
Je hebt een expressie construct voor het actine bindende eiwit RAF gekloneerd. RAF wordt normaal
alleen in neuronen tot expressie gebracht. Omdat RAF een klein eiwit van 21 kDA is heb je een fusie
met een HA-tag gemaakt. Je wilt een ICC experiment doorvoeren om te testen of je RAF-HA tot
expressie komt.
1. Transfectie van de cellen (bijv COS cellen) met RAH-HA plasmide

2. Fixeren cellen
3. Permeabiliseren
4. Blocking
5. Kleuring met primaire antilichaam
6. Kleuring met secundaire antilichaam (fluorescent gekleurd)
7. Mounten
8. Fotos van cellen van fluorescente microscoop
Leg het principe van het Y2H systeem uit!
- YSH is een systeem om eiwit-eiwit interactie aan te tonen in gist, door een reportergen af te
schrijven.
Benoem hoe het Y2H systeem eiwitinteracties praktisch kan aantonen.
- In het YSH wordt gebruik gemaakt van twee eiwitdomeinen; het DNA bindend domein (DB)
en het transcriptie activatie domein (AD).
- Je koppelt een eiwit van interesse (gen X) koppelt aan DB, en een tweede eiwit van interesse
(Y) aan AB.
- Als de twee eiwitten aan elkaar kunnen binden dan worden de DB en AD domeinen weer
dicht bij elkaar gebracht, waardoor het geheel als een transcriptiefactor kan werken.
- Een reportergen kan deze interactie laten zien, doordat het complex naast de
transcriptiefactor ook het reportergen activeert.
- Eiwit komt tot expressie en aanwezigheid kan makkelijk worden getoond
Practicum YSH

lOMoARcPSD|35251367
In het practicum wordt er gebruik gemaakt van het GAL4P gen met de eiwitdomeinen AD en DB.
Wanneer de twee eiwitten van interesse AB en DB bij elkaar brengt en de Gal4 transcriptiefactor
aanzetten, bindt deze aan Gal4 binding sites in de gebruikte reportergenen. Dit zet de rest van de Gal
genen aan wat zorgt voor gist groei op de plaat.
De reportergenen zijn GAL1::HIS3 en GAL2::ADE2  bestaan uit promotor GAL1 en GAL2 en eiwit
coderende sequenties HIS3 en ADE2.
De promotoren hebben bindingsites voor Gal4 DB domein, HIS3 sequentie codeert voor HIS3 (voor
Histidine) en ADE2 sequentie codeert voor ADE2 (voor Adenine). In de gebruikte gist stam is het HIS3
en ADE2 gen gemuteerd, dus ze kunnen alleen groeien met Histidine en/of Adenine.
Maar als de GAL::HIS3 en GAL::ADE2 reportergenen aanstaan en er dus eiwit interactie plaats vindt,
kan het wel die histidine en adenine afschrijven, en kan de gist ook zonder medium met histidine en
adenine groeien. ADE2 reportergen is moeilijker aan te zetten, dus als deze aanstaat duidt dat op een
sterke en stabiele interactie.
In practicum kijken naar interactie met LIN-45 en MEK-2 (Raf en MEK1 in mensen). Welk deel van LIN-
45 interacteert met MEK-2 en welk domein van MEK-2 is nodig voor de interactie?
- Plasmiden DB::MEK-2 en AD::LIN-45

- 5 verschillende LIN-45 plasmiden samen met elke keer dezelfde MEK-2 plasmide
- Transformeren en uitplaten op plaat zonder leucine en tryptofaan  degene die wel groeien
hebben interactie van beide plasmiden LIN-45 en MEK-2
- De kolonies gevormd op plaat zonder leucine is Gal4-DB plasmide en op plaat zonder
tryptofaan is Gal4-AD plasmide aanwezig.
- Dan deze kolonies strijken we op twee platen met een zonder histidine en een zonder
adenine, want kijken of ze groeien en dus interactie hebben. Bij interactie staan de
reportergenen zijn GAL1::HIS3 en GAL2::ADE2 die dus voor de histidine en adenine zorgen
zodat ze nog kunnen groeien.
- Bij twee stammen kolonies gevonden die de transformatie dus hebben en dus interactie
hebben van dat deel van LIN-45 met MEK-2.
- Domein PK-Tyr-Ser-Thr domein zorgt voor binding tussen Raf/LIN-45 en Mek/MEK-2 en een
CR2 of CR3 domein.
Complementatie test; rode mutanten hunt
Tijdens het experiment The hunt for the red cerevisiae, wat laat de mutant roodkleuren?
Een mutatie in ADE1 en ADE2, waardoor deze ophoopt in de AMP biosynthese pathway en de rode
kleur geeft.
Wat is het doel van een complementatie test?
- Genetische screen (met UV straling) in gist om mutanten (rode gistkolonies) te zoeken

betrokken bij aanmaken van adenine.
- Complementatie om te kijken of mutaties in 2 stammen in hetzelfde gen liggen of in
verschillende  test tussen mijn mutante gist stam, 2 verschillende gist stammen (eentje
met een bekende mutatie in het ADE1 gen, en eentje met een mutatie in het ADE2 gen)
Waarom is een complementatie test alleen mogelijk met diploïde organismen?

lOMoARcPSD|35251367
- Complementatie test werkt alleen bij diploide organismen, omdat ze twee genen moeten
hebben waar een wildtype en/of mutant op moet zitten.
Leg uit hoe je met de Complementatie Test bepaalt dat twee mutaties op hetzelfde gen liggen.
- Voorbeeld recessieve mutatie die leiden tot totaal verlies van functie van het eiwitproduct.
o Begin kruisen van twee individuen, die elk een mutatie in hun genoom hebben
o Na kruising zijn er twee mogelijkheden voor de samenstelling van het genoom van de
nakomelingen.
 Als de mutaties in 2 verschillende genen zaten, dan hebben de nakomelingen
van elk gen een wild type en een mutante kopie. De wild type kopieën van
het gen zorgen ervoor dat het organisme niet het mutante fenotype vertoont
 Of mutatie ligt in hetzelfde gen  de nakomelingen zullen dus twee mutante
kopieën van het gen ontvangen van hun ouders, en het mutante fenotype
vertonen
o Een complementatie test in gist is mogelijk omdat gist zowel haploı̈de als diploı̈de kan
zijn.
o Een andere complementatie test  kijken of de aanwezigheid van adenine in het
medium de mutatie complementeert (YED en YEDP plaat).
Hierbij zoek je dus uit of de mutatie in één van de genen van de biosynthese route
ligt.
- Na bestraling krijg je rode kolonies. Je weet niet of de mutatie erin zit, maar je kruist ze met
andere haploide stammen (HB1 en HB2, missen ADE1 en ADE2).
- Resultaat:
o Blijft rode kolonie: mutatie zit in rode kolonie en in hetzelfde gen  geen
complementatie
o Wordt witte kolonie (wildtype): mutatie zit niet in de rode kolonie en dus in ander
gen  complementatie
o De HB1 en HB2 stammen laten dus altijd een mutatie in respectievelijk ADE1 en ADE2
zien, waardoor de locatie van de mutatie van de rode kolonie bepaald kan worden
Aan welke drie voorwaarden moet worden voldaan om een succesvolle complementatie test te
doen?
1. Organisme moet diploid zijn
Aan het eind van de tweede dag van het The hunt for the red cerevisiae experiment, plaat je de
gisten uit op zowel een YEPD als een YED plaat.
- Hoe verschillen YED en YEDP platen?

o YED plaat = weinig adenine
o YEDP plaat = veel adenine
- Wat wordt er onderzocht door de gisten op de YED plaat uit te laten groeien?
o YED plaat had weinig adenine
o Rode kolonies bij HB1 en HB2 indiceren dat ze een mutatie in ADE1 en ADE2 hebben
ondergaan
o De YEPD plaat zal naar verwachting minder rode kolonies groeien omdat deze plaat
een andere pathway gebruikt voor de synthese van adenine door de grote
hoeveelheid adenine die al in de bodem zit. Bij deze andere pathway worden ADE1
en ADE2 niet gebruikt waardoor er geen rode kolonie zal groeien.

lOMoARcPSD|35251367
Waarom is het gebruikelijk om voor de complementatie testen een rode kolonie te reinstijken?
- Het is namelijk mogelijk dat je rode kolonie ook wat witte gist bevat (hoe meer gist je groeit
op een plaat, hoe groter de kans dat kolonies over elkaar groeien). Om absoluut zeker met 1
mutant afkomstig van 1 bestraalde gist te werken, zou je de rode kolonie reinstrijken
Waar of niet waar: Een mutatie in de AMP biosynthese pathway leidt altijd tot een rode kolonie?
- Nee,
Tijdens het Yeast-two-hybrid experiment worden er eiwit-eiwitreacties aangetoond. Hoe wordt er

geselecteerd op een succesvolle eiwit-eiwitinteractie?
- Met een reportergen
Waarom werden bij de Y2H proef specifiek de –leu –trp –his en –leu –trp –ade platen gebruikt?
- Omdat dit essentiele voedingsstoffen zijn voor de gist, maar deze niet zonder deze kon
groeien. Met een plaat zonder Leucine selecteerde je op aanwezigheid van GAL4::DB
plasmide, plaat zonder tryptofaan selectie op aanwezigheid van GAL4::AD plasmide. Dus als
er wel gist groeide was dit doordat er interactie was met GAL1::HIS3 en GAL2::ADE2 die de
adenine en histidine gaf.
Welke techniek is het meest geschikt om interacties tussen 2 eiwitparen aan te tonen? Geef ook aan
waarom!
a) Eiwit purificatie
b) RNA sequencing
c) Y2H system
d) Massa spectrometrie
Wat is er in ieder geval nodig om transformatie plaats te laten vinden?
- Plasmide
Wat is de functie van de positief geladen ionen in de transformatie master mix?
- De positief geladen ionen worden aangetrokken door DNA waardoor ze complexen met DNA
maken en hierdoor door celmembraan gaan
Wat is chemotaxis? En wat zijn repellents en attractants?
- Chemotaxis is de beweging als reactie op chemische stimulus

- Chemische signalen die aantrekken of aanstoten
Met welke factoren moet je rekening houden tijdens het ontwerpen van een chemotaxis experiment?
- Externe factoren kunnen beïnvloeden

- Met een kwantitatieve waarde aan kunnen geven hoe sterk de dieren worden aangetrokken
of afgestoten
- Hoelang experiment, waar de wormen en hoeveel
Concentratie oplossing
ICC

lOMoARcPSD|35251367
Mounting medium
- Mowiol
- H2O
- Glycerol
- Tris
- DABCO
Blokbuffer
- NGS
- Triton x
WB
Sample buffer
- Tris Cl
- Glycerol
- Sds
- Bromephenol blue
- DTT
Ripa buffer
- Tris HCl
- Sds
- Pic
- Nacl
- Sodium deoxycholate
- Triton x 100
Running buffer
- Tris
- Glycine
- SDS
Blotting buffer
- Tris
- Glycine
- Methanol
Running/stacking gel (running is 8%, stacking 5%)
- Acrylamide
- Tris
- Sds
- Temed
Eiwitgrootte bij 8% acrylamide gel  40-250 kd

Samenvatting Mgot 2

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Samenvatting Mgot 2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

lOMoARcPSD|35251367

Moleculair genetische onderzoekstechniek (Universiteit Utrecht)

Scannen om te openen op Studeersnel

Studeersnel wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit

MGOT samenvatting deel 2

Biologische processen zijn enorm complex:

- Organismen: 10^3-10^14 cellen = 10^12-10^23 moleculen

Twee experimentele aanpakken

Wat maakt een modelsysteem makkelijk?

- Makkelijk in lab te houden

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Bekendste soorten gist

 Bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) (a)

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Genetische screens in gist

 Basis van genetische screen:

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Voorbeelden celcyclus mutanten in bakkersgist:

o Tientallen cdc (cell division cycle)

o Extra DNA replicatie -> een te grote

CDC28 (budding yeast) en cdc2 (fission yeast): cyclin-dependent kinases

- Cyclin-dependent kinsase  fosforyleert en wordt zelf gefosforyleerd

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Genetische epistase analyse

- Door dubbel mutanten te maken kun je de volgorde van genen bepalen:

- cdc28-: mutant stopt celdeling (dus CDC28(+) stimuleert celdeling)

- Cdk’s hebben voor hun activiteit een binding aan

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Rode gist mutanten zoeken met verlies ADE1 of ADE2, complementatie

Eiwit-eiwit interactie mapping met Y2H (yeast two-hybrid) systeem

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Array based screening

- Kruis de individuele AD en DB gisten in 384 well formaat (robot) op selectieve platen

Interactie domeinen vinden met yeast two-hybrid

- Welk deel van eiwit zorgt voor binding?

Het genotype van de gebruikte gist

- Gist kan geen leucine maken (leu1-3,112)

Het Y2H practicum:

- Wij gaan kijken naar de interactie tussen Raf/Lin-45 en MEK

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

 DB::MEK-2 (full length)

- Kleine (1 mm) vrijlevende rondworm of nematode

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

- Aantrekkelijk voor het vinden van mechanismen van meercellige ontwikkeling

- 959 cellen in een volwassen hermafrodiet dier

Hoorcollege Genetische modelsystemen – diermodellen en reverse genetics

Hoe regulatie routes ontdekken?  gevolgen van veranderingen vaststellen:

1. ‘knock-out’ mutaties: rem weghalen

Forward en reverse genetics

Forward genetics: iets muteren en kijken wat het gevolg is

Modelsystemen voor genetische studies dierlijke modelorganismen

- bacteriën, C. elegans, Drosophila en Arabidopsis.

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

 Screens  wat is het doel  mutaties maken om processen te bestuderen

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

Drosophila klassieke genetische screen

- Wat als de homozygote mutanten niet

 Lokale “transposon hopping” en screen (PCR)

Gedownload door olaf (olaf33635@gmail.com)

 Targeted mutagenesis: CRISPR/Cas9 knock-out, knock-in