ZSO 2 Moleculaire technieken

DNA libraries
Een collectie van DNA clones die alle type DNA sequenties representeerd. Een andere vorm
is een cDNA bank die ontstaan is door mRNA. RNA kan niet gekloneerd worden, vandaar
dat er een DNA kopie van is gemaakt. Per cel verschilt deze cDNA bank omdat er andere
mRNAs tot expressie komen. Zijn ook alleen de exons.

PCR
Polymerase chain reaction is om buiten het lichaam in een buisje DNA te kloneren. Dit begint
met een oligonucleotide primer die een specifieke complementaire sequentie heeft van het te
kloneren DNA fragment. De primer moet ongeveer 20 nucleotiden lang zijn en de verhouding
AT/GC moet ook goed zijn. Bij 94 graden is er denaturatie, bij 55 graden binden de primers
en bij 72 graden is er polymerisatie. Polymerase is Taq polymerase.

Bij kwantitatieve PCR wil je erachter komen hoeveel en of er van een bepaalde sequentie
aanwezig was. Bij PCR is er sprake van een lag phase waarbij de stijging in de hoeveelheid
materiaal langzaam stijgt, een exponentiële fase en een saturatie fase waarbij het niet zo
veel meer toeneemt. De relatieve fluorescentie tijdens de exponentiële fase kan een maat
zijn voor relatieve hoeveelheid DNA.
Real-time PCR is een vorm van kwantitatieve PCR die goed is voor absolute kwantificatie en
relatieve kwantificatie. Je wacht niet op de eindreactie, maar het geamplificeerde DNA wordt
tijdens de toename al gedetecteerd.
Nucleïnezuur hybridisatie
Er zitten twee waterstofbruggen tussen A en T en drie tussen C en G. Een GC rijke regio is
daarom ook meer stabiel en denatureert pas bij hogere temperatuur.
Het binden van twee complementaire stukken DNA tot dubbelstrengs DNA heet hybridisatie.
Wanneer bij het verhitten en daarna weer afkoelen de oorspronkelijke stukken weer
hybridiseren is er een homoduplex. Is dit een andere streng, dan is het een heteroduplex. De
lengte hoeft niet overeen te komen. Dit gebeurt vaak wanneer er kunstmatig is wordt
gedaan. De complementaire sequentie komt vaak ook niet helemaal 100% overeen.
Om DNA of RNA te onderzoeken worden er gelabelde probes gebruikt. Dit zijn kleine
oligonucleotiden die een signaal geven en alleen binden bij een homologe sequentie.
Hierbij kan ook gebruik gemaakt worden van strengheid van de hybridisatie door de
temperatuur of de zoutconcentratie aan te passen. Stukken die minder complementair zijn,
zijn instabieler dan stukken die volledig complementair zijn.
De identificatie kan alleen plaatsvinden wanneer je gepaarde en ongepaarde probes van
elkaar kun scheiden. Dit doe je door de test sample op een vaste ondergrond te brengen.
Wanneer de probes binden, zullen ze hieraan vast zitten. Wanneer er dan gewassen wordt
zullen alleen de ongebonden probes wegspoelen.
Vormen van gelabelde hybridisatie zijn Southern blotting voor stukken gen en DNA in een
sample. Een in situ hybridisatie voor RNA transcripten en chromosomen voor een
karyogram. Ongelabelde probes worden gebruikt in combinatie met een gelabeld sample in
bijvoorbeeld een genoombrede search of cancer profiling (op zoek gaan naar een specifiek
gen).

Western Blotting
Voor het analyseren van eiwitten. Is een vorm van elektroforese op een
polyacrylamide. Er wordt SDS toegevoegd om de eiwitten een negatieve
lading te geven zodat ze alleen op grootte gescheiden worden. Ook wordt er
een stof toegevoegd die de disulfide bruggen verbreken. Daarna wordt er
een staining toegepast om de eiwitten zichtbaar te maken. Er kan ook nog
gescheiden worden op basis van lading door eerst isoelectric focussing toe
te passen met een pH gradiënt. Met antilichamen kunnen specifieke eiwitten
geïdentificeerd worden.

DNA analyse en manipulatie

1. Restrictie nucleases knippen het DNA op specifieke plekken. Op
deze manier heb je een klein stukje van het genoom.
2. DNA ligatie maakt het mogelijk om verschillende stukjes DNA, van
andere oorsprongen, aan elkaar te zetten.
3. DNA klonering zorgt ervoor dat je heel veel van een bepaald product
kunt maken.
4. Nucleïnezuur hybridisatie maakt het mogelijk om complementaire
sequenties in DNA en RNA te herkennen
5. DNA synthese maakt het mogelijk om compleet nieuwe stukken DNA te maken, die
misschien niet eens in de natuur voorkomen.
6. Snelle sequencing van DNA of RNA moleculen
Restrictie enzymen kunnen een
dubbelstrengs stuk DNA knippen en soms
een flankering overlaten waardoor er een
stuk DNA in een plasmide kan worden
gebracht. Op deze manier kun je DNA
kloneren. Bepaalde restrictie-enzymen
knippen bij een specifieke DNA sequentie.
Blunt knips hebben geen overhang. Kan
ook gebruikt worden om DNA weer te
scheiden op lengte. Hierbij geen SDS nodig
omdat DNA al een negatieve lading bij zich
draagt. Wordt gebruik gemaakt van een agarose voor langere stukken DNA.
Door de techniek in plasmides kun je ook een gen en het product
daarvan laten produceren. Dan moet het stuk DNA wel op de juiste
manier en richting ten opzichte van de promotor worden ingebouwd.
Als je van een plasmide het gekloneerde DNA weer wil analyseren
moet je weer dezelfde restrictie-enzymen gebruiken. Echter zal ook
volledig, nicked en supercoiled plasmide aanwezig zijn. Met maar
één knip heb je een lineair stuk DNA van de plasmide.

Northern en Southern blotting

Northern blotting Southern blotting
Het DNA en RNA moet van elkaar Het DNA en RNA moeten van elkaar
gescheiden worden. gescheiden worden.

Het mRNA moet van de andere soorten
RNAs worden gescheiden door specifieke
binding van de poly-A staarten aan een gel.
Of wanneer je andere RNAs wil
onderzoeken met een secundaire structuur
moet je deze eerst denatureren voor de
scheiding.
Het DNA wordt in stukken geknipt met
behulp van restrictie-enzymen.
Er wordt een gel-elektroforese uitgevoerd.
Het resultaat wordt overgebracht op een
blotting papier met probes waarin de
complementaire stukken worden herkend.

Er wordt een gel-elektroforese uitgevoerd.
Het resultaat wordt overgebracht op een
blotting papier waarin met probes
complementaire stukken worden herkend.
Om het DNA te herkennen moet je het wel
eerst enkelstrengs maken door het te
denatureren.
Voor aanwezigheid van een gen.

Voor expressie.