Moleculaire Biologie - Les 3, 4 en 5

Transcriptie

Docent Nelleke Barendsen

1
2018-2019 Blok A
Lesindeling (zie ook cursushandleiding)

2
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
Prokaryote transcriptie algemeen
Regulatie prokaryote transcriptie: operons
Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
3
coderend RNA
Overzicht cursus

Genomen, chromosomen, DNA

Toegankelijkheid

Expressie Replicatie Onderhoud

Transcriptie Mutaties
Reparatie
mRNA Recombinatie

Translatie

Eiwit
(aminozuren)
DNA  RNA  eiwitten

Genen passen zich aan de omgeving

aan in de loop van de evolutie,
Zie artikel ‘De zwarte dood dwong
5
Figuur 6.1 Immuunsysteem tot evolutie’.
Transcriptie: DNA  RNA

Transcriptie DNA  RNA:

Eukaryoten: kern, mitochondria, chloroplasten
Prokaryoten: 1 compartiment 6
Figuur 6.20
Transcriptie efficiëntie

Genen worden met verschillende efficiëntie

tot expressie gebracht.

Hierdoor ontstaat uiteindelijk een verschil in

de hoeveelheid eiwit die in een cel aanwezig is.
7
Figuur 6.3
Dubbelstrengs DNA → enkelstrengs RNA

RNA zoekt complementaire basen

binnen de eigen streng en vouwt zo
zichzelf in een specifieke vorm.

8
Figuur 6.7 en 6.8
Namen DNA strengen (binnen een gen)

- non-template strand
- coding strand
- sense DNA
- positive (+) strand

- template strand
- non-coding strand
- antisense DNA
- negative (-) strand

9
Eiwitten binden aan template en non-template strand
van de DNA dubbel helix.

bv RNA polymerase

10
Verschillen tussen DNA en RNA

DNA
- Dubbelstrengs.
- Desoxyribose (H op 2e C atoom).
- Thymine als base (methylgroep).
- Lang (vele miljoenen basen).
- Informatieopslag.
- Stabiel.

RNA
- Enkelstrengs → interne hybridisatie.
- Ribose (OH op 2e C atoom).
- Uracil (geen methylgroep).
- Kort (paar duizend basen).
- Informatieoverdracht.
- Kortlevend.

11
Figuur 6.4 en 6.5
 12
Panel 2.6
Baseparing: RNA en DNA

RNA: DNA:
A–U A–T
G-C G-C

13
Figuur 6.6
RNA polymerases

RNA polymerase:
• Prokaryoten één, eukaryoten drie verschillende RNApol’s.
• Polymeriseren van 5’ → 3’.
• Gebruiken (meestal) DNA als template (matrijs).
• Kunnen zelf DNA dubbel helix openen (geen helicase nodig).
• Kunnen een verkeerd ingebouwde nucleotide zelf weghalen (minder
goed ontwikkeld dan DNA polymerase proofreading).
• Hebben geen primer nodig.
14
Figuur 6.8 en 6.9
RNA synthese
5’C
RNA polymerase
Synthese richting van 5’ naar 3’

Let op:
RNA heeft op 2’ C
atoom wel een OH
groep!!

RNA heeft dus een

ribose

DNA heeft een

desoxyribose

15
Opdrachten

2.9 THOUGT PROBLEMS

An RNA polymerase is transcribing a segment of DNA that contains the

sequence

5' -GTAACGGATG-3'
3‘ -CATTGCCTAC-5'

If the polymerase transcribes this sequence from left to right, what will the
sequence of the RNA be?

What will the RNA sequence be if the polymerase

moves right to left?

16
 Antwoord

2.9 If the polymerase transcribes the sequence from left to right, it will use the
bottom strand as a template to make the sequence

5’-GUAACGGAUG
(the RNA sequence corresponding to the top strand of the DNA).

If the polymerase moves from right to left, it will use the top strand as a template to
make the sequence

5’-CAUCCGUUAC
(the RNA sequence corresponding to the bottom strand of the DNA, written 5’  3’).

17
Transcriptie door RNA polymerase

DNA met aktieve RNA RNA strengen

polymerases

Transcriptie Transcriptie terminatie

initiatie site signaal sequentie
RNA polymerasen kunnen elkaar snel opvolgen.

Bij het terminatie signaal laat RNA polymerase los van de DNA template.
Ook de RNA streng laat los. 18
Figuur 6.10
 splicing

translatie
eiwit

ribosomen
Verschillende soorten RNA

transfer

spliceosoom

nucleolus

cytoplasmic
19

Small interfering
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
Regulatie prokaryote transcriptie: operons
Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
21
coderend RNA
Prokaryoten transcriptie

Prokaryote transcriptie:
Transcriptie en translatie in één
compartiment en nauwelijks RNA
processing → translatie kan al
beginnen vóórdat de transcriptie is
afgerond → snelle expressie.

Transcriptie:
- Initiatie
- Elongatie
- Terminatie

- RNA processing in beperkte

mate aanwezig

22
Figuur 6.20
Richting van transcriptie

Transcriptie richting niet altijd gelijk.

Wordt bepaald door positie en oriëntatie van promoter.

RNA synthese altijd van 5’ naar 3’.

23
Figuur 6.143
Richting van transcriptie

EEN RNA POLYMERASE DIE BEWEEGT VAN EEN RNA POLYMERASE DIE BEWEEGT VAN
LINKS NAAR RECHTS GEBRUIKT DE RECHTS NAAR LINKS GEBRUIKT DE
ONDERSTE DNA STRENG ALS TEMPLATE BOVENSTE DNA STRENG ALS TEMPLATE
VOOR RNA VOOR RNA

24
Voorbeeld prokaryote promoter

tie

tie
tra gin
ip
tra gin

la
cr

ns
be
ns
N.B. positie ‘0’ bestaat niet. be
25
Variatie prokaryote promoters

Consensus sequenties: “gemiddelde” promoter.

Meestal kleine afwijkingen van de consensus.

Net iets andere binding polymerase.

Er bestaan “sterke” en “zwakke” promoters, afhankelijk van bindingssterkte

RNA polymerase (kan factor 1000 verschillen).

26
Zie ook figuur 6.12
Voorbeeld consensus sequenties

Acht verschillende promoters

A A T G A
T C
A T T G A
T C
A A T G A
C T
A A C G T
T C
C A C C A
De consensus is: T T
A A T G A
T T
A A T C A
T T
C A T G A
T C 27
Prokaryote promoter binding:  factor

Prokaryoten hebben één RNApol (core enzyme) → vormt complex met de ‘

(sigma) factor’ (verschillende soorten aanwezig, holoenzyme).

-35 box promoter

Herkenning door σ subunit van RNApol.

-10 box promoter

σ Subunit duwt non-template strand weg → veel A=T en T=A baseparen →
relatief weinig H-bruggen.

29
Figuur 6.11
Transcriptie initatie en elongatie bij prokaryoot

Initiatie initiatie

RNA polymerase ontwindt

DNA op +1 positie →
begin transcriptie.

10 nucleotiden RNA
gevormd → promoter
verlaten →  factor laat
los (wordt hergebruikt).

Elongatie
Polymerisatie RNA in 5’
naar 3’ richting.

terminatie elongatie

30
Figuur 6.11
Transcriptie terminatie bij prokaryoot

Terminatie
RNApol komt terminator tegen → laat los van DNA en RNA.
RNApol vormt weer een complex met een  factor ( holoenzym).
Transcriptie kan opnieuw beginnen bij een promoter (zelfde gen of een
ander gen).

31
Prokaryote transcriptie terminator: intrinsiek

Spontane vorming Hairpin door

interne baseparing in RNA
transcript a.g.v. palindroom
sequentie (vergelijk: kok, lepel,
parterretrap etc.).

Gevolg: minder contacten met

DNA template in de bubble.

Vervolgens AAAAAA serie →

baseparing met serie U’s →
steeds twee H-bruggen →
dissociatie RNApol en RNA

N.B. de serie AAAA’s is niet

hetzelfde als de ‘polyA staart’ !!
(= eukaryoot)

32
Of Prokaryote transcriptie terminator: Rho afhankelijk

Rho eiwit bindt aan nieuwe RNA transcripten.

Rho klimt “omhoog”, maar RNApol blijft hem voor.

Inverted palindrome geeft hairpin → kost tijd → Rho haalt RNApol in

→ verbreekt DNA-RNA bindingen (helicase) → dissociatie.
33
Transcriptie initiatie: switch  -subunit

σ-subunit switch

Heat shock eiwitten beschermen

cellen tegen warmte.

Zijn normaalgesproken niet nodig

De normale RNA polymerase

σ-subunit (70 kDa) herkent de
heat shock promoter niet

Bij hoge temperaturen gaat de cel

een andere σ-subunit produceren
(32 kDa)

Nu bindt het RNA polymerase wel

aan heatshock genen

Door 1 eiwit (de σ-subunit) te

variëren kan een cel een hele
serie genen specifiek aanzetten

35
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
36
coderend RNA
Operons
Eukaryoten
Ieder gen eigen promoter
Eén mRNA (mono-cystronisch) > één eiwit

Prokaryoten
Sets van functioneel gerelateerde genen onder controle van één promoter
(plus een operator) = operon.

Eén mRNA (poly-cistronisch mRNA) → verschillende ORF’s met ieder hun

eigen ribosome binding site (RBS) → meerdere eiwitten.

Figuur 7.12 37
Tryptofaan operon

tryptofaan
productie
Tryptofaan operon
Vijf genen die bij biosynthese van tryptofaan betrokken zijn
Vijf genen na transcriptie op één lang mRNA aanwezig.
Operator aanwezig in promoter regio
Operator kan tryptofaan repressor binden
38
Figuur 7.12
Regulatie tryptofaan operon
• Tryptofaan is aminozuur.
• Tekort aan tryptofaan > repressor laat los van operator > promotor actief
• Voldoende tryptofaan aanwezig in bacterie > repressor bindt aan promoter >
inactief > geen expressie van enzymen voor tryptofaan productie.

Figuur 7.13 40
Lac operon
Drie genen die bij de opname en afbraak van lactose zijn betrokken.
Activiteit leidt tot stijging glucose niveau in de cel (= energie).

Operon hoeft alleen actief te zijn (tot expressie te komen), als

1) Er daadwerkelijk lactose aanwezig is.
2) Als het glucose niveau laag is (de bacterie heeft ‘honger’).

41
Lactose en allolactose

Allolactose is een isomeer van lactose

42
Lac operon

PROMOTER (DNA) OPERATOR (DNA)

43
Lac operon: negatieve regulatie dmv repressor
Promoter
Regulatory
Operator
gene
DNA lacl lacZ

No
RNA
made
RNA
3 polymerase
mRNA
5

Active
Protein repressor

De lactose repressor is een eiwit dat wordt gecodeerd door het LacI gen.

Geen lactose aanwezig → dan bindt de repressor aan een DNA gebied (de
operator) in het lac operon en voorkomt daarmee transcriptie van LacZ, LacY en
LacA. 45
Campbell zie figuren Lac operon
Lac operon: negatieve regulatie dmv repressor

lac operon

DNA lacl lacz lacY lacA

RNA
polymerase
3
mRNA mRNA 5'
mRNA 5
5

-Galactosidase Permease Transacetylase

Protein

Allolactose Inactive
(inducer) repressor

Voldoende lactose aanwezig → dan bindt allolactose (= een lactose isomeer)

aan repressor → conformatie verandering → repressor laat los van operator →
RNApol kan binden en transcriptie operon uitvoeren.
46
Campbell zie figuren Lac operon
Lac operon: positieve regulatie dmv CAP activator

Promoter

DNA lacl lacZ

CAP-binding site
RNA Operator
polymerase
can bind
Active and transcribe
cAMP CAP

Inactive lac
Inactive repressor
CAP

(a)
Glucose nivo laag (‘honger’) → omzetting van ATP in cAMP  cAMP bindt aan
CAP (catabolite activating protein) → cAMP-CAP bindt aan specifieke
bindingsplaats op DNA vlak vóór promoter → binding en activatie RNApol.
47
Campbell zie figuren Lac operon
Lac operon: positieve regulatie

Promoter

DNA
lacl lacZ

CAP-binding site Operator

RNA
polymerase
can’t bind

Inactive
CAP Inactive lac
repressor

(b)
Glucoseniveau voldoende  weinig cAMP  geen activatie van CAP  geen
binding op CAP binding-site op het DNA  vrijwel geen transcriptie.

48
Campbell zie figuren Lac operon
Regulatie Lac operon (samenvatting)

50
Figuur 7.15
Regulatie Lac operon (samenvatting)
glucose lactose CAP repressor RNApol
aanwezig?aanwezig?

ja ja niet gebonden niet gebonden niet gebonden

ja nee niet gebonden gebonden niet gebonden
nee nee gebonden gebonden niet gebonden
nee ja gebonden niet gebonden gebonden → transcriptie

51
Figuur 7.15
Plasmide vector vaardigheden VL3 met LacZ’ en LacZ’ promoter

52
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
 Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
53
coderend RNA
Transcriptie mRNA

RNA processing

+ RNA afbraak

Eukaryoot mRNA Prokaryoot mRNA

Transcriptie en translatie Transcriptie en translatie
in verschillende compartimenten. in 1 compartiment.
mRNA transcriptie en processing in kern, Geen mRNA processing.
mRNA translatie in cytoplasma Direct klaar voor gebruik
translatie. 54
Figuur 6.21
Genexpressie in Eurakyoten

Transcriptie initiatie
Transcriptie elongatie
Transcriptie terminatie
Regulatie van eukaryote genexpressie

Transcriptie initiatie
Transcriptie elongatie
Transcriptie terminatie

o.a. splicing

Translatie initiatie
Translatie elongatie
Translatie terminatie

Post-translationele
modificaties (PTM)

56
 splicing

translatie
eiwit
RNA polymerase II
Functioneel RNA
DNA

ribosomen
RNA polymerase I+III
transcriptie

transfer
RNA polymerase III

spliceosoom
RNA polymerase II+III

nucleolus
RNA polymerase I/II/III ??
Eukaryoot
Prokaryoot
1 RNA polymerase

cytoplasmic
RNA poymerase II
3 RNA polymerases (I, II, III)

Small interfering
57

RNA polymerase II
synthese van mRNA, rRNA en tRNA
Eukaryote promoter klassen

RNA polymerase I, II en III hebben een eigen promoter klasse

59
 Algemene transcriptie factoren voor RNApolII (TFII’s)

60
Tabel 6.3
Onderzoek mbv gel-mobility shift assay:
welke eiwitten binden aan de promoter en in welke volgorde

Principe
• DNA fragment met gebonden eiwit migreert
langzamer door gel dan ‘naakt’ DNA.

Uitvoering
• Het te onderzoeken DNA fragment
incuberen met eiwit (controle zonder
eiwitten).
• Verschillen geven aan welk DNA fragment
eiwit heeft gebonden.

Nadelen
• Geeft niet de exacte bindingsplaats weer.
• Er kunnen meerdere eiwitten op een
fragment zitten.
• Restrictie kan bindingsplaats geknipt
hebben.

62
Gel-mobility shift assay van eukaryote transcriptie factoren voor RNApol II

63
Experiment DNA-bindende eiwitten: DNA footprinting

Welke eiwitten binden direct aan

een DNA fragment?

Principe DNA footprint

Een plek waar eiwit gebonden zit, is
beschermd tegen Dnase I.

Uitvoering
- DNA fragment labelen.
- Incuberen met eiwit of (eiwit mix).
- Beperkte DNase digestie.
- Eiwit digestie.
- DNA fragmenten op gel.
- Visualiseren.
- Footprint geeft exacte positie van
bindende eiwit weer.

64
DNA footprint maakt zichtbaar aan welk DNA gebied de TF-II binden

65
Eukaryote RNA polymerase II promoter

Algemene transcriptie factoren: eiwitten die RNA polymerase helpen om

de promoter te vinden, er aan te binden en om in actie te komen.

Figuur 6.16 66
Initiatie: TBP bindt aan TATA box van promoter

TATA-binding protein (TBP) bindt aan

TATA box van promoter.

Wordt gestabiliseerd door TAF’s

TBP+TAF samen TFIID.

Door dit ‘platform’ worden de overige

transcriptie factoren en RNApolII
aangetrokken.

Figuur 6.17 67
Vorming transcriptie initiatie complex (TIC) RNApol II

TFIID (= TBP + TAF’s) bindt aan TATA box.

TFIIB bindt aan BRE element → zorgt er voor dat

RNApolII op de juiste plek aan DNA bindt.

TFIIF geleidt RNApolII naar TFIID en B.

TFIIE zorgt er voor dat TFIIH aansluit.

TFIIH is een protein kinase → fosforyleert C-terminal

domain (CTD) van RNApolII → conformatie (vorm)
verandering van het enzym → RNApolII laat los van
initiatie site (promoter clearance) → elongatie fase.

TFIIH is tevens een helicase → ‘opent’ DNA voor de

transcriptie.

Na clearance blijven de meeste TF’s achter op de

promoter → snelle binding nieuw RNApolII mogelijk.

Figuur 6.15 68
Initiatie transcriptie van mRNA
door RNA polymerase II

TFIIH is een protein kinase → fosforyleert

C-terminal domain (CTD) van RNApolII →
conformatie (vorm) verandering van het
enzym → RNApolII laat los van initiatie site
(promoter clearance) → elongatie fase.
Door fosforylering van RNApolII binden hier
vervolgens processing eiwitten aan.

TFIIH is tevens een helicase → H- bruggen

verbroken en DNA opent voor transcriptie.

ATP

69
Figuur 6.15
Activators en mediator

Voordat de elongatie fase daadwerklijk start moet RNApolII ‘toestemming’ krijgen

van upstream regulatory signals (bijvoorbeeld activators). Het mediator complex
integreert deze signalen (positieve en negatieve).

Weg vrijmaken voor RNApolII.

Chromatin remodeling
complex verplaatst tijdelijk de
histonen binnen een gen.

Figuur 6.18 70
Specifieke transcriptie factoren

Algemene transcriptie factoren

Zorgen voor binding RNApol aan promoter.
Voor ieder gen, in ieder celtype, op ieder moment nodig.

Specifieke transcriptie factoren

‘Besluiten’over activatie van RNApol.
Specifiek voor een bepaald gen, een bepaalde cel of een bepaald
ontwikkelingsstadium (bijvoorbeeld activators).
Bestaan steeds uit twee delen: DNA-bindend domein en een domein dat
aan het TIC bindt.

Figuur 7.31 71
Opdracht Plasmide vector

2.1 Van eukaryoot mRNA wordt dubbelstrengs DNA gemaakt.

Dit gen wordt in een bovenstaande plasmide vector gekloneerd (= geplakt)
op een bepaalde sequentie, de MCS sequentie geheten. Het gen wil je tot
expressie brengen.
a. wat wordt er bedoeld met het tot expressie brengen van een gen.
b. waartoe dient een promoter?
c. wat wordt er bedoeld met de PCMV sequentie, en waartoe dient dit?
d. waartoe dient de SV40 poly A sequentie?
e. je wilt het EGFP gen in een prokaryote cel tot expressie brengen en
niet in een eukaryote cel waarvoor bovenstaande vector geschikt is.
72
Wat moet je dan in deze vector veranderen? Verklaar je antwoord
Opdracht Plasmide vector

73
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
 Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
 Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
coderend RNA 74
Verschillen pro- en eukaryoot mRNA

Prokaryoot mRNA
• Polycistronisch (meerdere genen op één transcript)
• 5’ en 3’ uiteinden niet gemodificeerd

Eukaryoot mRNA
• Monocistronisch (één gen per transcript)
• 5’ cap en 3’ poly A staart
Figuur 6.21a 75
Processing van mRNA

RNA processing

+ RNA afbraak

Eukaryoot mRNA Prokaryoot mRNA

Wel mRNA processing: Geen mRNA processing.
1. 5’ cap Direct klaar voor gebruik in
2. polyadenylering 3’ einde mRNA translatie.
3. RNA splicing
4. RNA editing 76
Figuur 6.20
Transcriptie eukaryoot mRNA
Transcriptie mRNA door RNA pol II:
1. Initiatie
- Transcriptie initiatie complex
TFII: DAB + RNA pol II F + EH
hechten aan promoter

2. Elongatie
- Elongatie factoren (EF) helpen RNA
polymerase om lang genoeg aangehecht
te blijven om de transcriptie te voltooien.
EF geholpen door ATP-afhankelijke
chromatine remodelling complexen om
DNA toegankelijk te maken.

- DNA supercoiling (topoisomerase I)

- RNA processing:
1. 5’ cap
2. 3’ poly A staart
3. RNA splicing
4. RNA editing

3. Terminatie
- terminatie signaal
- CPSF, CstF, CF  klieving mRNA 78
- PAP  toevoegen poly A staart
Transcriptie elongatie eukaryoot mRNA – DNA supercoiling

Zowel bij prokaryote als eukaryote transcriptie ontstaat supercoiling

(bij alle RNA polymerasen).

80
Figuur 6.19
Transcriptie elongatie eukaryoot mRNA – DNA supercoiling

+ supercoiling voor RNA pol uit

- supercoiling achter RNA pol

Topoisomerases verwijderen supercoils.

81
Figuur 6.19 http://instructors.garlandscience.com/
Topoisomerase

Verschil topoisomerase 1 en 2

Topoisomerase 1
- Geen ATP verbruik
- Enkelstrengs breuk om spanning
op helix te verlagen

Topoisomerase 2
- ATP verbruik
- Dubbelstrengsbreuk waar twee
dubbelstrengs DNA streng over
elkaar heen lopen (supercoiling)

82
Elongatie transcriptie: CTD van RNApolII draagt processing eiwitten mee

C-terminal domain (CTD) van RNA pol II:

- CTD gefosforyleerd door TFII H 
vormverandering van RNA pol II en komt los
van de promoter.

- CTD verder gefosforyleerd door kinases

Op de CTD liften bepaalde eiwitten mee met
RNApolII (hangen aan de CTD ‘staart’) en
binden aan het gevormde mRNA zodra de
juiste signaalsequentie voorbij komt:
- capping eiwitten
- splicing eiwitten
- 3’-end processing eiwitten

Als RNA polymerase II loslaat van transcriptie

initiatie complex, wordt de CTD staart
gedefosforyleerd en kan RNA pol II opnieuw met
de transcriptie starten.

83
Figuur 6.22
1. Processing pre-mRNA: 5’ capping

• 5’ cap = gemethyleerde G met 5’-5’ (!) binding.

• Aangebracht zodra mRNA uit RNApolII komt (betrokken
enzymen ‘liften’ mee op CTD).
• Signaal ‘5-kant mRNA aanwezig’.
• Onderscheidt mRNA van andere (non-coding) RNA’s.

Functies 5’ cap
• Export mRNA uit de celkern.
• Regulatie van translatie (mRNA → eiwit).
• Bescherming mRNA tegen afbraak.

84
Figuur 6.21b
1. Processing pre-mRNA: 5’ capping

Verwijderen P groep

Toevoegen G (5’- 5’)

Methylering G

Methylering ribose

Binding Cap-binding complex

85
Figuur 6.23
2. Processing pre-mRNA:
polyadenylering 3’ einde mRNA
Poly-A staart/Terminatie
- aan RNA pol II zijn cleavage factoren gekoppeld.

- na vorming van pre-mRNA herkennen

cleavage factoren een specifieke sequentie
(pA signaal) op het mRNA en hechten daaraan vast.
CF
- cleavage factoren knippen op een specifieke
sequentie het mRNA

- poly-A polymerase hecht aan 3’OH einde van

mRNA en plakt ongeveer 250 A nucleotiden.

- RNA polymerase II gaat nog verder met mRNA

maken. Dit mRNA is niet meer beschermd door een
5’ çap en wordt afgebroken. Het RNA pol II laat los
van het DNA. Einde transcriptie.

Cleavage factoren = CPSF, CstF en CF

PAP : poly A polymerase

86
Figuur 6.35
2. Processing pre-mRNA: polyadenylering 3’ einde mRNA
mRNA heeft specifieke sequenties (polyadenylerings signaal = pA) waaraan eiwitten
koppelen.

CPSF CstF

CF

PAP

Functies 3’ poly A staart

Terminatie van transcriptie
Stabiliteit mRNA in cytoplasma
Helpt bij translatie 87
Figuur 6.34
Zelfde verhaal andere figuur 3’ polyadenylatie van mRNA

CF klieft het RNA

AAUAAA AA G/U
AA
PAP AA RNA na de klievings site
wordt afgebroken

PAP: poly A polymerase

CPSF, CstF, CFI/II: Cleavage factoren: 88
3. Processing pre-mRNA: RNA splicing

Exon = Expressed sequence

Intron = Intervening sequence

RNA splicing: Intronen verwijderen → exonen aan elkaar plakken.

Alternatief splicing: bij sommige mRNA’s kunnen verschillende intronen

verwijderd worden in verschillende celtypen.
Hierdoor ontstaan verschillende (isovorme) eiwitten. 89
Figuur 6.26
Alternatieve splicing

1 2 3
DNA
transcription start site

alternatieve RNA splicing protein isoforms

“one gene, one protein dogma”

90
3. Processing pre-mRNA: RNA splicing

RNA splicing:
1. consensus gebieden in intron

91
Figuur 6.27
3. Processing pre-mRNA: RNA splicing

Aanhechten verschillende U eiwitten mbv snRNA in snRNP (= U eiwitten)

aan consensus gebieden van mRNA

RNA splicing:
1. consensus gebieden in intron
2. aanhechten snRNP’s (snRNA + eiwitten = U eiwitten)

92
Figuur 6.29
3. Processing pre-mRNA: RNA splicing

RNA splicing:
Ribonucleoproteins (RNP’s)
- 200(!) Eiwitten en vijf snRNA’s

• Aanhechten snRNP’s
(snRNA + eiwitten = U eiwitten)
aan splice sites.
• Vorming lus (lariat) met een
adenosine als centraal
molecuul.
• Compleet spliceosome
gevormd, intronen worden
verwijderd, exonen aan elkaar.
• Catalyse door snRNA’s
(ribozymes).
• Succesvolle exon-exon
overgang gemarkeerd door
exon junction complex.

93
Figuur 6.28
Exon markering door SR eiwitten

Figuur 6.32 94
Pre-mRNA splicing: exon skipping en cryptic splice sites

Exon skipping
Soms wordt een exon, al dan niet opzettelijk, overgeslagen.

Cryptic splice site

Sommige nucleotide sequenties in exonen lijken erg op splice sites.
Deze sites worden soms per ongeluk gebruikt als splice site.

http://www.biomedisch.nl/film/exon_skipping.php
95
Figuur 6.30
Abnormaal pre-mRNA splicing in  thalassemie

b -thalassemie: door een verkeerd of niet gevormd -globine eiwit wordt te weinig
of verkeerd globine voor haemoglobine gevormd. Hierdoor kan bloedarmoede
optreden.

Bij -thalassemie treedt verkeerde splicing op als gevolg van een genetisch defect
in de intron sequenties.
96
Figuur 6.33
Voorbeelden humane genen met introns

Dystrofine eiwit zit in de membraan die om spiervezels heen ligt en voorkomt

dat de membraan beschadigd raakt tijdens spiercontractie.

In Duchenne muscular dystrophy worden 1 of meerdere exonen overgeslagen,

het dystrofine eiwit werkt niet meer. Gen ligt op X-chromosoom.
De ziekte is ongeneeslijk.

Gentherapeutische behandelingen (exon-skipping) worden oa onderzocht in het LUMC

met behulp van moleculair biologische technieken.
Het doel van deze aanpak is om zo de ziekte van Duchenne om te vormen in een
aandoening die meer lijkt op de - minder ernstige - spierdystrofie van Becker.
97
http://www.muscular-dystrophy.org/about_muscular_dystrophy/research_faqs/612_what_is_exon_skipping_and_how_does_it_work
Exon skipping in Duchenne muscular dystrophy

98
http://www.muscular-dystrophy.org/about_muscular_dystrophy/research_faqs/612_what_is_exon_skipping_and_how_does_it_work
Exon skipping in Duchenne muscular dystrofy

99
4. Processing pre-mRNA: RNA editing

Chemische modificaties van RNA nucleotiden

- ander codon → ander aminozuur
- vroegtijdig stopcodon → getrunceerd eiwit

stop cytosine uracil

• Voorbeeld mRNA editing: ApoB100 (lever) → ApoB48 (darm).

• Een darmenzym deamineert een cytosine in ApoB100 pre-
mRNA → uracil → stopcodon → truncated B100 gevormd (48
kDa i.p.v. 100 kDa, heeft iets andere functie).
102
Opdracht

2.6 TRUE/FALSE
Decide whether this statement is true or false, and then
explain why.
 
RNA polymerase II generates the end of a pre-mRNA transcript
when it ceases transcription and releases the transcript; a poly-A
tail is then quickly added to the free 3' end.

103
Antwoord

2.6 Antwoord
False. The 3’ ends of most pre-mRNA transcripts produced by
RNA polymerase II are defined, not by the termination point of
transcription, but by cleavage of the RNA chain 10–30
nucleotides downstream of the sequence AAUAAA and 30 or
so nucleotides upstream of a GU- or U-rich sequence.

104
Opdracht Plasmide vector

2.1 Van eukaryoot mRNA wordt dubbelstrengs DNA gemaakt.

Dit gen wordt in een bovenstaande plasmide vector gekloneerd (= geplakt)
op een bepaalde sequentie, de MCS sequentie geheten. Het gen wil je tot
expressie brengen.
a. wat wordt er bedoeld met het tot expressie brengen van een gen.
b. waartoe dient een promoter?
c. wat wordt er bedoeld met de PCMV sequentie, en waartoe dient dit?
d. waartoe dient de SV40 poly A sequentie?
e. je wilt het EGFP gen in een prokaryote cel tot expressie brengen en
niet in een eukaryote cel waarvoor bovenstaande vector geschikt 105
is.
Wat moet je dan in deze vector veranderen? Verklaar je antwoord
Opdracht Plasmide vector

106
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
 Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
 Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
 Nuclear transport

Les 5
Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
107
coderend RNA
Transport RNA van kern naar cytoplasma

Alleen correct gevormd RNA mag de kern uit.

Dit RNA wordt gemarkeerd door eiwitten
en krijgt een nuclear export receptor toegevoegd.

Het grootste gedeelte van het RNA is rommel

(bijv intron sequenties) en wordt vernietigd in
de kern door een groot eiwit complex:
het exosoom

108
Figuur 6.37
Transport RNA van kern naar cytoplasma: export ready mRNA

Alleen correct gevormd RNA mag de kern uit.

Dit RNA wordt gemarkeerd door eiwitten, zoals CBC, poly-A-binding proteins en EJC
en krijgt een nuclear export receptor toegevoegd.

Buiten de kern wordt nogmaals gecontroleerd of mRNA goed is en er geen

vroegtijdige stopcodons zijn ontstaan door mutaties of verkeerde intron splicing.
Dan wordt het mRNA alsnog vernietigd door het NMD systeem
(nonsense mediated decay sytem)

In het cytoplasma kan de translatie beginnen 109

Figuur 6.38
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
 Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
 Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
 Nuclear transport

Les 5
 Afbraak van RNA
Transcriptie en processing van niet
110
coderend RNA
RNA afbraak

De mate van cellulaire eiwitproductie wordt bepaald door een

dynamische evenwicht tussen enerzijds de aanmaak van RNA en eiwit,
en anderzijds de afbraak ervan.

DNA

afbraak

RNA

afbraak

eiwit
111
RNA afbraak in prokaryoten

Meeste mRNAs in bacteriën zeer

instabiel. Halfwaardetijd minder dan
een paar minuten.

mRNA afbraak:
- Exonucleases van 3’  5

- Degradosoom
Complex van eiwitten om
het prokaryote RNA af te breken

Als hairpin loop aanwezig

is, dan kunnen de exonucleases
het RNA niet afbreken.

Eerst moet de hairpinloop door een

endonuclease verwijderd worden.

112
RNA afbraak systemen in eukaryoten
mRNA in eukaryote cellen stabieler dan in prokaryoten.
De meeste hebben een halfwaardetijd van ongeveer 30 minuten.

Afbraak van mRNA in eukaryoten:

1. Exosoom
Complex van eiwitten in de kern om overgebleven RNA, zoals intronen, op
te ruimen.

2. Instability elements
In het mRNA zijn gebieden aanwezig die zorgen voor een versnelde
afbraak. Als er veel van een eiwit nodig is, kunnen deze instabiele gebieden
van het mRNA tijdelijk geblokkeerd worden, waardoor het mRNA weer
stabiel wordt.

3. Deadenylation-dependent mRNA
Zodra mRNA in cytoplasma komt, begint de afbraak van de polyA staart.
Als de polyA staart te kort wordt, dan kan er ook geen translatie meer
plaatsvinden. Het mRNA wordt volledig afgebroken.

4. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)

5. RNA interference 113

2. mRNA afbraak: instability elements

Instability element

Sequenties in 3’ UTR van mRNA waar

endonucleases kunnen knippen (i.p.v.
exonucleases).

Kunnen tijdelijk worden afgeschermd door

speciale eiwitten (bijv. aconitase).

Voorbeeld: regulatie expressie transferrine

receptor (opname van ijzer) → als er
weinig is veel receptoren nodig, als er veel
is weinig receptoren (voorbeeld van post-
transcriptionele regulatie).

114
Figuur 7.71
3. mRNA afbraak: deadenylation dependent mRNA decay

Zodra mRNA in cytoplasma komt,

begint de afbraak van de polyA staart
door deadenylase (3’  5’).

3’-UTR sequentie bepaald

levensduur mRNA (kan bepaalde
eiwitten binden).

Deadenylase hecht ook aan de 5’

cap, hierop volgt decapping.

Het onbeschermde mRNA wordt

verder afgebroken door
exonucleasen.

Competitie tussen polyA verkorting

en decapping + translatie.

Figuur 7.69 + 7.70 115

4. mRNA afbraak: nonsense-mediated mRNA decay system (NMD)

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD):

Een mRNA surveillance systeem.
Afbraak van mRNA’s met een stopcodon dat zich niet op het eind van de
coding region bevindt (a.g.v. mutatie of verkeerde splicing).
116
Figuur 6.76
4. mRNA afbraak: Nonsense-mediated mRNA decay NMD

Exon Junction Complexes (EJC) markeren succesvol voltooide splice sites.

Na een echt stopcodon volgen geen EJC’s, omdat er geen exonen meer
aanwezig zijn.

Op mRNA wat verkeerd gespliced is of door een mutatie een vroegtijdig

stopcodon heeft gekregen, komen na het nonsense stopcodon nog wel EJC’s
voor. Upf eiwit bindt hieraan en triggered afbraak van mRNA  Verkeerd
mRNA wordt niet meer vertaald in eiwitten.

Ongeveer 1/3e van alle genetische ziekten worden veroorzaakt door frame-
shift mutaties of splice-site mutaties, zodat een nonsens mutatie ontstaat.
Door het NMD systeem worden deze mRNA’s uitgeschakeld en blijft bij
heterozygoten alleen het tweede mRNA van het andere allel bestaan, zodat
een correct eiwit wordt gevormd.

117
5. RNA interference (RNAi): drie systemen

small interfering RNA’s (siRNA systeem)

• Bescherming tegen vreemde RNA’s

micro RNA’s (miRNA systeem)

• Regulatie eigen genen

piwi-interacting RNA’s (piRNA systeem)

• Bescherming tegen transposons
• specifiek voor geslachtscellen
• > 1.000.000 verschillende (!)
• geheugen: onderscheid lichaamseigen RNA’s en vreemde RNA’s?

118
Small interfering RNA’s (siRNA systeem)

• Bescherming tegen ‘vreemde’ RNA’s (cellulair immuunsysteem)

• Sommige (retro) transposons en (retro) virussen bevatten in een bepaald

stadium dubbelstrengs RNA (dsRNA).

• Vreemd dsRNA wordt herkend en geknipt door Dicer → dsRNA fragmenten

van 21-23 bp.

• RISC verwijdert één streng van deze siRNA’s en gebruikt de andere om

mRNA’s te scannen.

• Indien match (hybridisatie) afbraak mRNA en/of silencing betreffend gen.

• siRNA’s worden bewaard > geheugen.

119
5. RNA interference (RNAi)

dsRNA wordt herkend en

geknipt door Dicer → dsRNA
fragmentjes (21-23 bp): short-
interfering RNA’s (siRNA).

RISC hecht en verwijdert één

streng van siRNA’s en gebruikt de
andere om mRNA’s te scannen.

Indien match (hybridisatie) afbraak

mRNA en/of silencing betreffend
gen.

120
5. RNA interference (RNAi): micro RNA’s (miRNA)

• Regulatie genexpressie
• miRNA gecodeerd op genoom
• Ondergaan processing door
DICER en RISC
• Targeten 3’UTR
• Targeten hele sets aan mRNAs
• Volledige baseparing geeft
afbraak mRNA
• Onvolledige baseparing geeft
onderdrukking van translatie

122
Figuur 7.75
Gevolgen RNA interference

Micro RNA’s (miRNA systeem)  Regulatie eigen genen

Small interfering RNA’s (siRNA systeem)  Bescherming tegen vreemde RNA’s

(Piwi – interacting RNAs)

gene silencing
Figuur 7.74
Experimenteel: Sense-RNA + antisense-RNA: RNA interference

Om een mRNA uit te schakelen kan er opzettelijk een anti-sense RNA in de cel
worden gebracht.

124
http://www.biomedisch.nl/nieuws/2010/rnai_kanker.php
Om te lezen: micro RNA zwerft door je lijf NRC 27 september 2014

RNA zwerft door je lijf

Geneeskunde
Lichaamscellen communiceren
onderling via microscopisch kleine
blaasjes met genetisch materiaal
(micro RNA). Dat biedt nieuwe
mogelijkheden voor diagnostiek en
behandeling.

129
miRNA
2014 – 4 januari NRC weekend
Nanodeeltje stuit vroege borstkanker

Een klein RNA-molecuul, gekoppeld aan een vettig nanodeeltje smoort de vroegste stadia van borstkanker
in de kiem. Er wordt dan een gen geblokkeerd dat de overgang van voorstadium naar agressieve tumor
stuurt, toonden onderzoekers van Harvard University aan bij muizen. Als het ook bij mensen werkt kan het
in de toekomst veel operaties besparen (Science Translational Medicine, 1 januari).

De meeste borstkanker begint in cellen van de melkgangen, als zogeheten ductaal carcinoom in situ
(DCIS). Zo’n beginnend gezwel kan op den duur doorgroeien naar de rest van de borst en ook uitzaaien.
Dat gebeurt echter lang niet altijd. Omdat niet te voorspellen is of dit staat te gebeuren, worden die vroege
carcinomen verwijderd. Meestal volstaat een borstsparende operatie, soms gevolgd door een bestraling. De
genezingskans is vrijwel 100 procent, maar de behandeling is allesbehalve prettig. Eleganter zou het zijn
als de ontwikkeling van een DCIS gestuit zou kunnen worden.

Uit een grote analyse van genactiviteit in 11.000 ductale carcinomen rolde het gen HoxA1 als de
belangrijkste aanjager van de vroege borstkankergroei. Dat gen is stil te leggen met een zogeheten siRNA,
een specifiek op dit gen toegesneden stukje RNA. Gekweekte DCIS-cellen stopten door dat siRNA met
groeien. Deels veranderden ze weer in gezonde cellen.

Om dat ook in levende muizen te bereiken verpakten de onderzoekers het siRNA in een vetachtig
nanodeeltje, een beproefde methode om opname te vergemakkelijken. Dit spoten ze via de tepel in de
melkgangen van muizen die genetisch extra vatbaar voor borstkanker waren gemaakt. Vier maanden later
hadden alle onbehandelde controlemuizen kanker, tegen een kwart van de behandelde. Huup Dassen
130
RNAi
2014 – 23 aug NRC weekend

Medicijnontwikkeling Ebola: het virus met de zeven genen

Naast ZMapp zijn er nog enkele andere typen medicijn in ontwikkeling. Die zijn gebaseerd
op detailkennis van de erfelijke code en de eiwitten van het virus.
De erfelijke code van ebola telt ongeveer 19.000 letters. Het zijn 19.000 basen die in een
lange rij in een enkelstrengs RNA-molecuul liggen. (De mens leeft met 3 miljard baseparen
in dubbelstrengs-DNA.) Op dat RNA-molecuul liggen zeven genen. Dat is in al zijn
simpelheid voldoende om menselijke cellen binnen te dringen en de gastheer in
levensgevaar te brengen.
131
miRNA 2014 – 23 aug NRC weekend

Net als veel andere virussen maakt ebola het de menselijke afweer moeilijk. Het virus
verspreidt royaal een glycoproteïne, een eiwit met suikeraanhangsel. Daardoor heeft het
afweersysteem van de patiënt het moeilijk om de echte virusdeeltjes te vinden. Het virus
blokkeert ook een onderdeel van het menselijke afweersysteem.
De genetische kennis is gebruikt om kandidaat-medicijnen te ontwerpen die de werking van het
virus blokkeren. De twee belangrijkste lijken op dit moment TKM-ebola en BCX4430.
TKM-ebola is een medicijn dat uit drie korte stukjes RNA bestaat, gehuld in een vetbolletje. De
stukjes RNA hebben zo’n basevolgorde dat ze selectief hechten aan ebola-RNA, waardoor drie
viruseiwitten niet meer goed kunnen worden gesynthetiseerd. Deze small interfering RNA’s
(siRNA’s) zijn een bekende technologie voor moderne medicijnen. De vetbolletjes zorgen
er voor dat de siRNA’s lang in de bloedbaan blijven en makkelijk in de cel worden
opgenomen. Het werkt, dat bewees het bedrijf Tekmira Pharmaceuticals vier jaar geleden (The
Lancet, 29 mei 2010). Makaken die het medicijn binnen een half uur na ebolabesmetting
kregen, overleefden het virus.

132
Lesindeling
Les 3
 Transcriptie algemeen
 Prokaryote transcriptie algemeen
 Regulatie prokaryote transcriptie: operons
 Eukaryote transcriptie mRNA: initiatie

Les 4
 Eukaryote transcriptie mRNA:
elongatie en terminatie en processing
 Nuclear transport

Les 5
 Afbraak van RNA
 Transcriptie en processing van niet
155
coderend RNA
 splicing

translatie
eiwit
RNA polymerase II
Functioneel RNA
DNA

ribosomen
RNA polymerase I+III
transcriptie

transfer
RNA polymerase III

spliceosoom
RNA polymerase II+III

nucleolus
RNA polymerase I/II/III ??
Eukaryoot
Prokaryoot
1 RNA polymerase

cytoplasmic
RNA poymerase II
3 RNA polymerases (I, II, III)

Small interfering
156

RNA polymerase II
synthese van mRNA, rRNA en tRNA
Hoe werken functionele RNA’s op elkaar in, en waar?

cytoplasma
nucleus
nucleolus
coderende genen niet-coderende genen

transcriptie

pre-mRNA pre-rRNA

processing snRNA snoRNA processing

mRNA processing

translatie
tRNA

polypeptide miRNA
siRNA
post-translationele
modificaties (PTM) rRNA

eiwit

158
Drie eukaryote RNA polymerases (elk eigen promoter type)

RNA polymerase I, II en II hebben een eigen promoter klasse

met eigen transcriptie factoren 159
Overzicht RNA processing verschillende RNA polymerases

soort RNA capping poly A terminatie

prok. RNA polym. m,r,t nee nee hairpin/U-serie/Rho

euk. RNA polym. I r nee nee Reb1p/TTF-I

euk. RNA polym. II m,sn,sno,mi,si ja ja RNA poly A

euk. RNA polym. IIIt,r,sn nee nee onbekend

160
Ribosoom (prokaryoot)

small subunit
proteins (21x)

16s rRNA

tRNA

large subunit
proteins (34x)

5s and 23s rRNA

161
16S ribosomaal RNA (prokaryoot)

1541 nucleotiden.

Tientallen verschillende basen

(a.g.v. chemische modificaties).

5’ en 3’ nog steeds herkenbaar.

Heel veel interne hybridisatie.

(eukaryoot 28S rRNA bevat

4718 nucleotiden!)

162
Processing rRNA: rRNA knippen

23 S
Grote 5S
PROKARYOOT subunit rRNA
RIBOSOOM

Kleine 16S rRNA

subunit

28 S
5.8 S
EUKARYOOT Grote 5S
RIBOSOOM subunit rRNA
Kleine 18S rRNA
subunit

Ribosomen bestaan uit eiwitten en rRNA

rRNA knippen 163
Figuur 6.40
rRNA duidelijk zichtbaar op agarose gel

Een totaal RNA monster bevat na isolatie alle

soorten RNA; allen van verschillende lengten.

Elektroforese van RNA monster op een agarose

gel.

Intact eukaryoot RNA geeft na elektroforese twee

duidelijk zichtbare banden;
18S en 28S rRNA eukaryoten
16S en 23S rRNA prokaryoten

rRNA ~ 80% van het totaal

mRNA 1-5 % van het totaal

164
Typisch rRNA modificaties en snoRNP’s

Chemische modificaties van rRNA door small nucleolar RNA’s (snoRNA’s, guide
RNA’s) → vormen samen met eiwitten snoRNP’s (ribonucleoproteins). Hechten
aan rRNA en zorgen voor modificaties en klieving.

Veel voorkomende modificaties:

• Uracil → pseudouridine.
• 2’-O-methylated ribose.

Figuur 6.41 165

Transcriptie ribosomaal RNA

DNA

bv

RNA polymerase start aan de linker kant op het DNA,

Na een aantal nucleotide kan er een volgende RNA polymerase
hechten. De transcriptie van het rRNA gen gaat achter elkaar door.

166
Eukaryoten: rRNA wordt afgeschreven in de nucleolus

- Een cel bevat 10 miljoen ribosomen → meest voorkomende RNA is rRNA (80% van totaal).
- Bevat meer dan 200 kopieën van rRNA gen op 2x5 verschillende chromosomen.
- Continue transcriptie van rRNA in nucleolus (zie foto).
- Chemische modificatie van rRNA door snoRNA (guide RNA).
- Eiwitimport → ribosomen bijna compleet in elkaar gezet → functioneren pas in cytoplasma.

nucleolus

Vb: transcriptie van rRNA door

eukaryote RNA polymerase I
167
Figuur 6.39 en 6.42
Nucleolus tijdens celcyclus

Veranderingen van de nucleolus

tijdens de celcyclus

168
Figuur 6.43 en 6.44
Eukaryote nucleolus: ribosoom fabriek

169
Figuur 6.45
Processing transfer RNA

170
 Transcriptie transfer RNA door RNA polymerase.
Er zijn minstens 20 verschillende genen voor tRNA’s

DNA

bv
bv

Bv gen voor tRNA Bv gen voor tRNA

waar het aminozuur waar het aminozuur
leucine aan koppelt 171
proline aan koppelt
Processing stappen pre-tRNA
• Interne baseparing (spontaan).
• Knippen (‘trimmen’).
• Eventueel toevoegen CCA-3’ uiteinde (indien nog niet aanwezig).
• Intron splicing.
• Chemische modificaties (naast A, C, G en U nu bijv. ook ‘D’, ‘Ψ’ en T’s: 50
verschillende tRNA modificaties bekend).
• Aannemen van typische conformatie (drie-dimensionale vorm).
• Koppeling bijbehorende aminozuur (volgende les).

Figuur 6.50 172

Chemische modificatie tRNA: inbouwen van afwijkende nucleotiden

Chemische modificatie tRNA

G wordt vaak door deaminering gemodificeerd

173
Figuur 6.53 tot een I in het anticodon van tRNA.
Voorbeelden chemische modificaties tRNA nucleotiden

Figuur 6.53 174