Biotechnologie les 2

RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE

Polymerase kettingreactie
- Magnesiumconcentratie is van groot belang voor de werking van PCR
- De primers zelf = startblokken moeten op heel correcte manier gedesigned zijn
o Enkelstrenginge stukjes DNA synthetisch aangemaakt
o Mogen geen hairpins bevatten = dat er in de primer baseparing gebeurt
 Kan onmogelijk tot goede pcr reactie leiden
o Primers mogen onderling ook geen baseparing vertonen
o Temperatuur waarbij primers weer loskomen van template DNA = 60-65°
o Aanhechtingstemperatuur paar graden onder smelttemperatuur
o 3’ uiteinde rijk aan G en C’s (veel stabieler door 3 H-bruggen) en mag zeker
geen mis-prime bevatten (kan er geen baseparing gebeuren, als dit op het
einde gebeurt kan een DNA polymerase dit niet verlengen)
- zeer gevoelige reactie!!
o Nadeel: Per ongeluk DNA molecule in PCR mengsel (als je niest bv)
 contaminatie
 vals positieve signalen
 vermijden door filtertips = bevatten klein filtertje zodat aerosols niet
tot in de schacht van de pipet geraken.
Ook andersom, als je reeds gecontamineerde pipet hebt, zorgt filter er
ook voor dat aerosols niet terug in PCR mengsel terechtkomen.
- Valse positiviteit door DNA contaminatie vermijden
o Verschillende reacties in verschillende ruimtes laten doorgaan
 Ruimte 1: isolatie DNA
 Ruimte 2: PCR mengsel maken
 Ruimte 3: PCR amplificatie
 Minder kans op contaminatie
o Geen dTTP, maar dUTP
 DNA polymerase taq kan even goed dUTP inbouwen dan dTTP
 Na PCR reactie: DNA gegenereerde strengen bevatten U, geen T
 Oorspronkelijk materiaal bevatten WEL T
 Stel dat er niet goed gewerkt worden en bepaalde kopieën uit PCR 1
komen terecht in PCR 2
Om te beletten dat het DNA dat per ongeluk in PCR2 terechtkomt,
wordt gebruikt als template, wordt er een enzym toegevoegd
= urail N-glycosidase: knipt alle U-basen weg
 Ontstaan van een gat
 Kan niet meer verlengd worden door een DNA polymerase
o Gebruik maken van UV
 2 dubbele bindingen tussen 2 thymines gaan openklappen en
samen’smelten’ ( pyrimidine dimeren)
 heel eenvoudige en krachtige manier om molecule te inactiveren voor
PCR: kan niet verder kopieerd worden
- PCR varianten
o Hot start PCR: hoe lager de temperatuur, hoe groter de kans bestaat dat een
primer op een verkeerde plaats op het DNA kan binden. Kan zijn dat niet alle
nucleotiden kunnen baseparen.
PCR pas laten lopen bij hoge temperatuur: DNA polymerase pas toevoegen of
actief laten worden bij hoge temperatuur.
 Bijkomende handeling (PCR tube openen en DNA polymerase
toevoegen) = nadeel wanneer er veel verschillende stalen zijn + gevaar
voor contaminatie.
Niet meest praktische methode
 DNA polymerase inkapselen in bepaalde materie die hitte gevoelig is,
vb: was, agarose. Daarna temperatuur opvoeren -> was gaat smelten
en DNA polymerase komt vrij
 Chemisch gemodificeerde DNA polymerasen: enkel actief bij hogere
temperatuur.
Nadeel: te lang bij 94° -> depurinatie: schade van DNA
 Polymerase dat men toedient, gaat men koppelen aan een bepaald
ligand, in de meeste gevallen een antilichaam. Bij opwarmen van
mengsel, zal antilichaam denatureren waardoor polymerase vrijkomt
en actief wordt.
o Nested DNA: in’t kort: 2 PCR reacties na elkaar, elk met ander koppel van
primers. In eerste PCR reactie 2 primers toevoegen die ver genoeg van elkaar
staan. Ontstaan van PCR product dat je niet wenst. Dan gaat men 2de PCR
laten lopen en men neemt ander paar van primers die veel dichter bij
gewenste DNA zitten. De kans dat 2 primers opnieuw op foute plaats gaan
binden is nagenoeg 0. Normaal wordt alleen gewenste product gevormd
 zeer specifieke PCR reactie
o touchdown PCR: vertrekt van bepaalde DNA moleculen waarop je PCR wil
doen. In dit geval gaat men de temperatuur waarbij de primers moeten
binden, in de eerste cyclus zeer hoog kiezen (vb : 68°). Er bestaat veel kans
dat bij die temperatuur de primers nog niet kunnen binden. In cyclus 2
temperatuur iets laten zakken (67°). Kan zijn dat deze temp nog steeds te
hoog is. Bij cyclus 3 opnieuw laten zakken. Kan zijn dat bij deze temp wel
binding optreedt. Deze binding gaat altijd specifiek zijn aangezien
temperatuur zo hoog mogelijk is. Cyclus 4: temp laten zakken: er gaat ook PCR
optreden: 4 kopijen. Cyclus 5: 8 kopijen. Cyclus 6: 16 kopijen. Zo gaat men
verder tot men aan een cyclus komt waarbij de kans bestaat dat er valse
bindingen optreden. Al zodanig specifieke kopijen gemaakt, dat als het bij
cyclus 7 fout loopt, dit niet heel erg is. De totale PCR reactie is uiteindelijk
goed genoeg. Men blijft dan ook bij temperatuur van cyclus 7.
Men weet natuurlijk niet waar de grens ligt: moet men
inschatten/experimenteel vastleggen.
o Kolonie PCR: meest eenvoudige PCR: gebeurt rechtstreeks op cellen, er hoeft
geen DNA geïsoleerd worden. Als je dan PCR laat lopen bij 94° gaan cellen
openbreken, gaat DNA vrijkomen en kan PCR op normale manier gebeuren.
o Reversed transcriptase PCR: zeer vaak gebruikt. mRNA draagt polyA-staart.
Ook stukje oligo dT primer toevoegen: kan hybridiseren met polyA-staart!
mRNA opwarmen tot 70° om structuur te ontvouwen tot 1 lange keten.
Structuur nadien op ijs brengen omdat keten anders zich terug gaat
opvouwen. Dus om structuur in ontvouwde vorm te houden. RTase
toevoegen werkt optimaal bij 42° = in staat om een streng aan vast te breien,
met RNA als template = RNA afhankelijk DNA polymerase. Nadien opwarmen
naar 70° om enzym te inactiveren. Ontstaan van hybride (RNA bovenaan en
DNA onderaan) structuur die je behandeld met RNase H dat RNA afbreekt
maar DNA intact houdt. Men bekomt enkelstrengig cDNA = complementair
DNA / copy DNA. Klaar voor PCR reactie.
 RNA afhankelijk DNA polymerase
o Real time PCR: PCR producten die gevormd worden detecteren in real time
dus tijdens dat de PCR aan het lopen is. Men kan dit doen doordat producten
in staat zijn een fluorescent signaal uit te zenden tijden de PCR reactie.
Fluorescent signaal is evenredig met totaal aantal kopieën. Machine bevat
lade waarin je stalen kan inbrengen. Bevat ook halogeenlamp (laser in meer
moderne gevallen) die staal gaat bestralen via spiegel. Fluorescent signaal
wordt terug uitgezonden en passeert filterwiel en land op detector.
2 varianten:
 5’ nucleaase assay = taq/man assay: 2 primers nodig, maar
mogelijkheid om derde primer te laten binden = taqmanprobe: heeft
fluorescente groep = reporter en quencher. Reporter is een hoog
energenisch molecule terwijl quencher laag energetisch is.
Op normale manier PCR uitvoeren, enkel op einde van elke cyclus aan
de hand van lamp gaat men PCR mengsel bestralen. Als er niets
gebeurt is, gaat volgens het FRET-principe de energie uit de lichtbron
via de hoog energetische reporter naar de laag energetische quencher
-> quencher fluoresceert (rood signaal)
Als er wel PCR doorgaat, gaat Taq polymerase primer verlengen en
komt op bepaald moment taqmanprobe tegen (die in de weg zit).
Maar taq polymerase heeft 5’ exonuclease activiteit -> gaat
taqmanprobe afbreken. Wanneer dat product bestraalt word, kan de
energie die op de reporter valt niet meer getransporteerd worden
naar quencher waardoor de reporter fluoresceert (groen signaal).
Hoe meer groen signaal, hoe makkelijker PCR verlopen is.
Nadeel: prijs!
 SYBR green methode: variant van etyliumbromide = zeer gevaarlijke,
zeer kankerverwekkende stof. Kan zich tussen basenparen van het
DNA wringen. Wanneer SYBR green zich in oplossing bevind, zal het
weinig fluorescent signaal geven.
Wanneer het SYBR green zich heeft geïntercalleerd heeft in DNA zal er
een fluorescent signaal gevormd worden.
Hoe meer fluorescentie, hoe meer dubbelstrengig DNA in PCR
mengsel.
Nadeel: gaat niet specifiek binden op dsDNA: ook niet specifieke
producten gaat signaal geven.
 Hoe meer curve naar links staat, hoe meer uitgangsproduct.
Laat toe uitgangsmateriaal te quantificeren. Men gaat arbitraire lijn trekken
(ergens in exponentieel gebied)
Ct-waarde = cyclus waarbij arbitraire lijn curve kruist
Op basis van CT waarde kan men berekenen hoeveel meer startproduct er in
de ene staal zat dan in de andere.
Voordelen:
Real-time PCR collecteert gegevens tijdens de exponentiële groeifase van PCR.
Dit zorgt voor betere kwantificatie
Gevoeliger: je kan al veel vroeger in de cyclus kwantificaties doen.
Als PCR afloopt, heb je onmiddellijk data. Bij gewone PCR moet analyse nog
gebeuren.
Restrictie enzymen
DNA kopieën moeten vaak nog bewerkt worden met bepaalde enzymen = restrictie
enzymen: natuurlijk voorkomende enzymen = endonucleasen (kunnen in DNA knippen,
moleculaire scharen). Bacteriën gebruiken dit van nature uit om zich te beschermen tegen
virussen.
- GAATTC = palyndromische DNA molecule
CTTAAG
- Er zijn enzymen die blind knippen, enzymen die 5’ sticky ends vormen en enzymen
die 3’ uitstekende eindjes genereren.
- Isoschizomeren: restrictie-enzymen afkomstig van verschillende bronnen, maar wel
dezelfde DNA sequentie herkennen.
- Bepaalde restrictie-enzymen zijn gevoelig voor dam-methylatie: sommige gaan hun
herkenningsplaats niet meer herkennen. Anderen hebben methylatie juist nodig om
te kunnen knippen.
- Structuren helemaal op uiteinde van DNA worden vaak niet herkend. Met moet
nucleotiden toevoegen voordat dit herkend word. Men heeft synthetisch stukje
dsDNA gemaakt.
DNA sequentie die men wil knippen mag niet op uiteinde staan.
- Staractiviteit: het enzym gaat op aspecifieke manier knippen. Dit kan geïnduceerd
worden door bepaalde indicatoren
o hoge glycerolconcentraties (alle commerciële restrictie-enzymen zitten in 50%
glycerol)
o teveel enzym
o …

Biotechnologie les 3

Hulpenzymen = modifying enzymes

Om het DNA verder te manipuleren naar een vorm die bruikbaar is voor verdere stappen.
- Methylasen plaatsen methylgroepen op DNA-sequenties die herkend kunnen worden
door restrictie-enzymen waardoor de activiteit van restrictie-enzymen beïnvloed
wordt (kunnen niet meer knippen op de plaats waar ze normaal zouden knippen).
Gebruikt door biotechnologen om DNA te beschermen tegen knipping.
 CpG methyltransferase plaatst methylgroepen op de C van alle CG-sequenties. Al een
bepaald restrictie-enzym een CG sequentie heeft in zijn herkenningsplaats, zal de
activiteit worden geblokkeerd.
- Ligasen doen het tegenovergestelde. Gaat stukjes DNA aan elkaar plakken. Meer
bepaald gaan ze fosfodiester verbindingen maken. Gaan 5’ fosfaatgroepen koppelen
aan 3’ OH-groepen.
o E. Coli DNA ligase. Nadeel: geen blinde eindjes/enkelstrengige eindjes ligeren.
Minder gebruikt
o T4 DNA ligase: het meest gebruikt. Maakt ook fosfodiester verbindingen
waarvoor het ATP nodig heeft. In tegenstelling tot E. coli kan het zowel sticky
als blunt eindjes aan mekaar ligeren.
o T4 RNA ligase. Kan alles eigenlijk ligeren.
- Polymerasen: heel vaak gebruikt
o Kornberg polymerase (= E. Coli DNA Polym.) heeft 3 activiteiten. Zie nota 1
 1 DNA-structuur met een 5’ sticky end.
Kornberg polymerase + 4 nucleotiden: eerste werking treedt in actie =
polymerase activiteit. 3’ wordt verlengd -> wordt een volledige
dubbelstrengige DNA-keten. (Aan 5’ wordt nooit verlengd, enkel aan
3’!)
in afwezigheid van nucleotiden: kan niet polymeriseren (geen
nucleotiden, wel templatestructuur). Gaat vanaf 3’ de DNA-structuur
afbijten
 1 DNA-structuur zonder sticky end.
Kornberg polymerase + nucleotiden: er gebeurt niets
In afwezigheid van nucleotiden: vanaf 3’ DNA-structuur afbijten
 1 DNA-structuur met een 3’ sticky end.
Kornberg polymerase + nucleotiden: Er kan niet gepolymeriseerd
worden want het is een 3’ uitstekend eind. Kornberg polymerase gaat
nucleotiden afbijten tot enkel de dubbelstrengige structuur overblijft.
Als het nog verder gaat afbijten, dan ontstaat er een
templatestructuur waardoor polymerase terug kan gaan inbouwen
(zoals 1ste geval)
In afwezigheid van nucleotiden: vanaf 3’ DNA-structuur afbijten
o Klenow enzymen
 Fragment van DNA polymerase I
 Slechts 2 activiteiten: heeft de vervelende derde activiteit van
Kornberg polymerase niet.
o T4 DNA-polymerase
 DNA afhankelijk, gecodeerd door T4
 3’->5’ exonuclease
 Polymerisatie van 5’->3’
o T7 DNA-polymerase
 DNA afhankelijk, gecodeerd door T7
 3’->5’ exonuclease
 Polymerisatie van 5’->3’
 o Taq DNA-polymerase (zie PCR)
 DNA-polymerase dat thermostabiel is
 Polymerase activiteit + 5’->3’ exonuclease. Nodig tijdens real time PCR
(taq man probe)
 GEEN 3’->5’ EXONUCLEASE. Polymerasen zijn geen perfecte enzymen.
Als die een streng polymeriseren durven ze weleens fouten maken (bv
verkeerd nucleotide inbouwen). Kunnen dit wel herstellen met 3’->5’
exonuclease om nadien correct nucleotide in te bouwen = proof
reading
 Taq polymerase kan dus geen fouten herstellen. Kan niet
gebruikt worden voor kloneringsdoeleinden.
 Alleen gebruikt om aan te tonen of een DNA-molecule
aanwezig is al dan niet.
o Aanvullende enzymen hebben wel proof reading functie.
 Ook hittebestendig, zelfs tot hogere temperaturen dan taq polymerase
 Geen 5’->3’ exonuclease
 Nadeel: enzymen die hittebestendig zijn voegen uit zichzelf vaak een
extra nucleotide toe (meestal A) aan 3’. Vooral taq heeft dit probleem.
o Reverse transcriptase = RNA afhankelijk DNA-polymerase.
 Als je RNA-structuur hebt kan reverse transcriptase DNA-molecule
opbouwen.
 RNase H activiteit: zal RNA afbreken bij RNA/DNA hybride structuur.
o Superscript reverse transcriptase = reverse transcriptase zonder RNase H
activiteit.
o Terminaal deoxynucleotidyl transferase: gaat nucleotiden aanhechten aan 3’
uiteinden. Zowel enkelstrengig als dubbelstrengig. Kan zelfs een staart zijn
van meer dan 100 nucleotiden lang. Tenzij je aan enzym didyoxynucleotiden
toevoegt: er kan maar 1 nucleotide aangehecht worden (er is geen OH meer
over dus verlenging is niet mogelijk)
 Wordt gebruikt om apoptosen aan te tonen = celdood waarbij DNA in
de cellen zal verknipt worden in kleine stukjes -> je krijgt massa’s
fragmentjes DNA en elk fragment heeft 3’ uiteinde.
Als die nucleotiden dan een kleurmerker meekrijgen, kan je in
weefsels die apoptopische cellen aankleuren.
= TUNEL-techniek
o RNA polymerasen: gebruiken DNA als template, maar maken wel RNA streng
 Gebruikt om in vitro transcriptie te doen
- Guanilyltransferase = capping enzym: zie eerste les
- T4 polynucleotide kinase: gaat fosfaatgroepen overzetten vanuit ATP naar 5’ OH-
groepen = DNA kineren. Altijd een gamma-fosfaat van ATP die nodig is.
- Fosfatasen = tegenpool van kinasen: gaan 5’ fosfaat ergens afhalen. Zowel van DNA
als van RNA, en zelfs van nucleotiden
- Nucleasen
o DNase 1: breekt DNA af. Werkt zowel endonucleolytisch (ergens in de DNA-
structuur een knip geven) als exonucleolytisch (op einde nucleotiden afbijten)
o Nuclease S1: valt enkel enkelstrengig DNA aan. Zowel in de structuur als op
uiteinde. Dan bekom je als eindresultaat volledig dubbelstrengig DNA.
 MAAR DNA kan ademen: uiteinden kunnen even van elkaar gaan en weer
terug samengaan. -> heel kortstondig enkelstrengig DNA: kan dus afgebeten
worden.
o Mung Bean nuclease: zelfde als S1 maar minder agressief.
o RNase H
o RNase A
o RNase T1
o RNase T2

Plasmiden zie nota 2

Je kan DNA-fragmenten niet stabiel houden in de gastcel. Stabiel houden niet makkelijk met
een simpel PCR-product
 PCR-producten kloneren
Meest gebruikte kloneringsfactor
- Klein en dubbelstrengig
- Komen van nature voor in bacteriën
- Kunnen autonoom repliceren, maar hebben eiwit van gastcel nodig
- Op plasmiden zitten vaak unieke plaatsen
- Ori-sequentie = origine van replicatie. Die bepaalt of het een low of een high copy
enzym is. Vanuit ori vertrekt verdubbeling van het DNA
- Classificatie:
o Stringent plasmiden: gaan alleen repliceren als ook het bacterieel genoom
repliceert. Altijd low copy. Als je gen wilt binnenbrengen dat de groei kan
verminderen/dodelijk kan zijn. Heeft minder effect dan bij high copy
o Relaxed plasmiden: gaan onafhankelijk van bacterieel genoom repliceren.
Meestal high copy
Hoe kleiner het DNA, hoe meer materiaal het nog kan opnemen
Hoe gebruiken we plasmiden voor klonering?
- Plasmide bevat uniek restrictie-enzym EcoR1 = herkent GAATTC.
We kunnen dat knippen met ecoR1 enzym
Je bekomt opengeknipte structuur

Ligatie
Voorwaarden:
- Juiste buffer om ligase te laten werken
- Temperatuur moet juist zijn = 37° maar dat is goed als je sticky eindjes wil ligeren.
Ligase moet enkel de koppeling maken onderling.
Als je blunte eindjes hebt? Kunnen niet onderling baseparen -> ligase heeft al veel
meer moeite om ze aan elkaar te zetten -> lagere temperatuur = 16° waarbij de
kinetische energie van de molecuultjes lager is. DNA ligase zal makkelijker uiteindes
aan elkaar hangen. COMPROMIS tussen kinetische energie en optimale temperatuur
Zelfsluiting: 2 uiteinden van eenzelfde molecule worden het makkelijkst aan elkaar gezet
tenzij je fosfaatgroepen gaat verwijderen.
Men gaat ervoor zorgen dat het PCR-product in overmaat aanwezig is dan het plasmiden ->
kans groter dat PCR-product goed geligeerd wordt.
Biotechnologie les 4
Ligatie (vervolg)
Alternatieve methoden om PCR fragmenten in plasmides te krijgen waarbij geen ligase nodig
is:
- Ligatie in TOPO-plasmiden
o Topoplasmiden = plasmiden die commercieel beschikbaar zijn en zijn al op
voorhand gelinialiseerd (volledig open gemaakt). Op de uiteinden bevinden
zich DNA topoisomerase 1 moleculen die covalent gebonden zijn.
o Topoisomerasen herkennen bepaalde sequentie (zie nota 3). kunnen DNA
gaan knippen in 1 streng, enkel achter de sequentie. Je krijgt dan geen 3’ OH,
maar wel een 3’ fosfaat waaraan dat enzym dan gaat binden. Vervolgens kan
DNA gaan ontwinden rond de streng die nog intact is -> volledige DNA gaat
ontwinden. Vervolgens komt enzyme terug los en daarbij zal het 3’ fosfaat
gaan koppelen aan 5’ OH = ligase activiteit.
o DUS restrictieactiviteit + ligase activiteit na ontwinding
o Men kan die activiteit gebruiken om PCR producten in plasmiden te kloneren.
Examen: leg uit topoisomerasen + belang
- Ligase independent cloning
o Vertrekken van bepaald plasmide dat gesloten is maar dat een bepaalde
klievingsplaats (in het rood op dia) bevat voor restrictie-enzymen.
Plasmide openknippen -> 3’ uitstekende eindjes.
Vervolgens uiteindjes behandelen met T4 DNA polymerase zonder
nucleotiden -> polymerase gaat 3’ beginnen afbijten aan de 2 kanten. WEL
dTTP -> polymerase gaat afbijten maar vanaf het T tegenkomt en dit wordt
afgebroken, wordt T onmiddellijk terug ingebouwd.
o 2 als eindresultaat.
o 3 = PCR fragment dat men wou kloneren. Behandelen met T4 DNA
polymerase in afwezigheid van nucleotiden, enkel dATP -> T4 DNA
polymerase gaat beginnen afbijten aan 3’ maar vanaf een A wordt afgebeten,
wordt die meteen terug ingebouwd.
o 4 als eindresultaat.
o 5: als uiteinden nu complementair zijn, kan je dat inbouwen. Je hoeft niet
meer te ligeren. Zelfs zonder ligase u PCR product in plasmide krijgen.
Als je dit binnenbrengt in bacterie zal het wel ligeren om stukken verder aan
elkaar te zetten.

Transformatie van E. Coli

Transformatie na behandeling CaCl2
- Als je ligatie afgerond hebt, bekom je een 1000 kopijen: echter niet voldoende
(microgram is nodig) -> op een of andere manier product gaan kopieren zodat je veel
meer materiaal hebt. Kan NIET met PCR.
- Binnenbrengen in bacteriën en door bacteriën op te kweken in cultuur, cultuur
bekomen die veel meer plasmid DNA bevatten dan oorspronkelijK
- Binnenbrengen van plasmid DNA in E. Coli + stabiel overerven van de erfelijke
kenmerken (doorgeven van plasmid DNA naar alle dochtercellen) = transformatie .
Bepaalde G+ bacterien gaan spontaan plasmid DNA opnemen, maar E coli gaat niets
doen -> je moet ze eerst competent maken/behandelen met CaCl 2
Electroporatie = stroomstoot: kleine poriën crëeren in celwand van bacterie waardoor
plasmid DNA naar binnen kan.
- Geen zout in oplossing, anders celwand kapot roosteren.
- Uitgevoerd bij lage temperatuur omdat er al warmte wordt gegenereerd.
- Ook wel een uur in voedingsbodem laten kweken
- Efficiëntie ligt ruim 10 keer hoger in vergelijking met chemische methode.
Transformatie-efficiëntie = aantal transformanten bekomen per microgram gebruikt
supercoil plasmide DNA

Selectie van E. Coli transformanten.

Hoe gaat men nakijken of de bacterie het plasmide heeft opgenomen?
- Gebruik maken van antiobiotica: op plasmide een bepaald gen dat codeert voor
resistentie. Voor de transformatie kunnen cellen niet groeien op voedingsbodem met
AB, na transformatie wel.
- Selectie op bacterien die niet alleen plasmide hebben genomen, maar je wilt ook
weten dat op plasmide het gen zit dat je erin hebt gekloneerd.
o pBR322: door op plaats 1 (zie dia) gen in te bouwen: zit midden in ampicilline
resistentie gebied. Hierdoor gaat ampicilline resistentie gebied kapot gemaakt
worden -> ampR gebied is niet meer functioneel. Vervolgens uitplaten. Cellen
niet in staat om te groeien op een bodem met ampicilline. Als het gen er niet
in zit kan plasmide groeien op beide bodems (tetracycline en ampicilline).
 Op die manier selecteren welke cellen plasmide DNA hebben opgenomen met
daarin het gen van interesse.
o Lac- complementatie systeem is gebaseerd op het lactose operon van E. Coli
Operon = set van genen die coderen voor een bepaalde functie.
 Lactose operon = set van genen die nodig zijn voor metabolisme van lactose
(p64!)
 Zie nota 4: Laq I gen codeert voor een repressoreiwit en zou normaal
gesproken binden ter hoogte van de operator. Dus repressor eiwit
wordt continue gevormd en gaat binden achter de promoter thv de
operator. Gevolg: polymerase (dat normaal zou binden ter hoogte van
de promotor) kan niet verde. Zit geblokkeerd door repressor eiwit ->
geen transcriptie.
Als er lactose aanwezig is: Lactose zal binden op repressor eiwit
waardoor het repressor eiwit niet langer kan binden op de operator ->
komt los waardoor er wel mogelijkheid is tot transcriptie -> vorming
mRNA.
 Lac Z gen codeert voor een beta –galactosidase: zal lactosen gaan
hydroliseren: gaat knip geven zodat 2 monosachariden van elkaar
loskomen. Naast lactose ook synthetische galactosidasen: ONPG en X-
gal
X-gal: als dat door beta-galactosidase gehydrolyseerd word, krijg je
een blauw, onoplosbaar product. Al je Coli cellen gaat opgroeien in
een medium met X-gal, kleuren alle colicellen blauw.
Mutanten van Coli die in lac Z gen een stukje ontbreken waardoor een
inactief beta-galactosidase wordt gecreëerd dat niet in staat is om het
X-gal om te zetten naar een blauw product. Tenzij dat je een plasmide
 zou binnenbrengen in Coli mutant met daarop een stukje van het lac Z
gen, meer bepaald het stuk dat codeert voor eerste 90 Azn. Kan
complexeren met inactief beta-galactosidase -> complex is WEL actief
-> x-gal kleurt blauw.
 Plasmiden met -segment = pUC plasmiden.
 Multiple cloneringsplaats: allemaal unieke restrictie-enzymen. -> heel
wat verschillende mogelijkheden om gen van interesse op plasmide te
kloneren. Door een enzym te kiezen en te laten knippen onderbreek je
een alfa-segment -> gaat dus niet meer kunnen complexeren.
CONCREET: men neemt coli stam die deletie bevat. Men gaat dan zo’n
pasmide naar coli stam transformeren waarbij gen van interesse in 1
van unieke restrictieplaatsen zit. Na transformatie uitplaten op
medium dat ampicilline bevat. In het medium x-gal steken +
lactose/variant.
Als het gen op het plasmide zit en dus het alfa-segment onderbreekt,
dan blijft beta-galactosidase inactief en zullen de kolonies wit blijven.

Isolatie plasmide DNA uit E. Coli

Hoe isoleren we plasmid DNA uit E. Coli?
- Alkalische lyse/methode van Birnboim en Doly (EXAMEN) = heel klassieke methode
om plasmid DNA uit E. coli te isoleren.
Eenmaal je E. Coli cultuur hebt, ga je die lyseren door die te brengen in een mengsel
van SDS en NaOH. SDS gaat membranen van de cellen oplossen -> bacterie-cel breekt
open. NaOH gaat DNA dat vrijkomt denatureren. Maar de denaturatie zal vlot
gebeuren van chromosomaal DNA, maar plasmide DNA is daar zeer resistent tegen
(zit in heel opgedraaide (supercoil) structuur -> is veel moeilijker).
Vervolgens gaat men mengsel neutraliseren door toevoegen van kaliumacetaat ->
verzuring waardoor gedenatureerde genomische DNA gaat neerslaan -> witte
vlokken.
Plasmide DNA scheiden van genomisch DNA door centrifugatie -> plasmide DNA blijft
in oplossing.
Vloeistoffase met plasmide DNA precipiteren met een alcohol (isopropanol/ethanol)
+ zout toevoegen. Hier echter geen extra zout toevoegen omdat het er al bij zit
(kalium acetaat volstaat).
Geprecipiteerde plasmide DNA centrifugeren
 Plasmid DNA, echter NIET zuiver (nog heel veel onzuiverheden zoals RNA,
andere componenten van de cel,…)
 Ruwe plasmide DNA bereiding.
- Heel zuiver DNA? Nadien DNA oplossing opmengen met cesiumchloride +
etyliumbromide. Mengsel centrifugeren bij zeer hoge toerentallen =
ultracentrifugatie gedurende minstens 16 uur.
- Men maakt vaker gebruik van commerciele kits die op de bodem DEAE matrix
bevatten = bruikbaar om plasmid DNA te zuiveren.

Biotechnologie les 5

Mutagenese
= Mutaties inbouwen in DNA structuur.
In vivo methode
- Men gaat de bacterie-stam die het plasmide draagt behandelen met allerlei
mutagene stoffen: chemicaliën die in staat zijn mutaties te induceren in DNA. Na
behandeling plasmide isoleren en verplaatsen naar nieuwe E. Coli stam omdat
mutagene stoffen ook mutaties zullen veroorzaken in het genoom van de bacterie ->
allerlei gevolgen (groei remmen,…). Dit wil men vermijden.
In vitro methode
- Niet plaatsgericht
o DNA behandelen met bisulfiet -> aminogroep gaat verwijderd worden en
wordt omgezet tot een ketogroep -> omzettingen van cytosine naar uracil.
o DNA behandelen met bepaalde stoffen die ook de basen van het DNA gaan
beschadigen. Nadien kan je primer laten binen en mbv reversed transcriptase
(kan DNA als template gebruiken) gelijk welk nucleotide inbouwen. Op die
manier kan je dus ook op heel wat plaatsen mutaties induceren.
- Plaatsgericht = preferentieel
o Plasmide met bepaald gen in gekloneerd + er zit een unieke ecoR1 plaats. En
je wil restrictieplaatsen weg. Mutatie inbouwen door plasmide open te
knippen met ecoR1 enzyme. Vervolgens 2 mogelijkheden
 Eindjes behandelen met S1 nuclease: al het enkelstrengig DNA afbijten
-> je bekomt blunte eindje die je kan dicht ligeren met DNA ligasen ->
ontstaan van nieuw plasmide waar 4 baseparen zijn uit verwijderd tov
oorspronkelijke + ook ecoR1 knippingsplaats is weg.
 Uiteinden behandelen met DNA polymerase in aanw van nucleotiden
-> uiteinden opvullen en nadien ligase om alles weer te sluiten -> 4
baseparen toegevoegd maar ook ecoR1 restrictieplaats is weg.
Meestal wil men een heel specifiek codon wijzigen. Daarvoor moet
puntmutatie gecrëerd worden: opnieuw plasmide met gen waarin unieke
ecoR1 restrictieplaats zit. Het codon bevind zich tussen 2 genen. Plasmide
openknippen door restrictie-enzymen. Stukje wordt verwijderd -> plasmide
met aan de ene kant ecoR1 uiteinde en aan de andere kant Hindi3 uiteinde.
Vervolgens ertussen een synthetisch stukje DNA steken = (dezelfde sequentie
maar een welbepaalde mutatie). Dit doet men door 2 lange DNA primers te
laten synthetiseren -> vormen dubbelstrengig DNA. Dan kan men stukje DNA
opnieuw laten ligeren in het plasmide -> je bekomt nieuw plasmide maar
ditmaal bevat je gen van interesse een nieuw stukje mutant DNA.
Er zijn limiten op dit systeem. Kan alleen als 2 restrictieplaatsen vrij
dicht bij elkaar staan. Afstand mag niet groter zijn dan 100
nucleotiden. Je kan geen synthetische primers maken die veel langer
zijn dan 100 nucleotiden.
 Serieuze beperking. In de praktijk ga je nooit/ zelden zo’n situatie
meemaken
 Op andere manier mutaties inbouwen

o Mutator oligonucleotide EXAMEN

 Stel: je hebt een bepaald plasmide = dubbelstrengig. En op plasmide zit er gen
van interesse. Plasmide behandelen met NaOH -> enkelstrenging DNA. Stel: je
wil A weg muteren en je wil ander nucleotide in de plaats
Men gaat primer ontwikkelen die ipv een T een ander nucleotide bevat.
Primer met mutatie = mutator oligonucleotide.
De primer gaat binden met het plasmide. Enkel tussen A en C geen
baseparing. Vervolgens gaat men polymerase + nucleotiden + ligase
toedienen.
Polymerase gaat vanaf 3’ uiteinde de streng verlengen tot het aan het 5’ terug
tegenkomt. Dan zal ligase zijn werk doen. (Cornberg kan je bv niet gebruiken
want gaat mutatie vernietigen -> Klenow fragment WEL: heeft derde activiteit
niet waardoor mutator oligonucleotide op plasmide behouden blijft)
 Hybride DNA-structuur
Vervolgens plasmide transfereren naar E. Coli. E. coli kan er voor kiezen de
binnenste streng te repliceren of de buitenste streng
 Binnenste streng: oorspronkelijke plasmiden worden gecreëerd.
 Buitenste streng: transformanten op de plaat bevatten het mutante
plasmide.
= 50/50
Om tot die verhouding te komen zijn er 2 voorwaarden
 Na de behandeling met NaOH moeten alle enkelstrengige plasmiden
binden met primer
 De coli stam kan geen mismatch repair doen. E. Coli heeft een
herstelsysteem dat ervoor zorgt dat als er een niet baseparing
optreedt, dat E. coli dit zal herstellen.
 werken met E. Coli stammen die geen functioneel eiwit mutS niet meer
bevatten zodat mutatie in plasmide blijft behouden.
Nadeel: Wanneer spontate mutatie gebeurt, kan die niet hersteld worden. ->
plasmide niet te lang in E. Coli stam laten.
In de praktijk veel moeilijker.
- Hogere frequentie mutanten
o E coli stam die dUTPase mist -> hoeveelheid dUTP in de cel neemt toe -> De
kans dat er U-basen in het DNA zullen worden ingebouwd verhoogt.
o UNG-enyme ook afwezig -> U-basen die ingebouwd worden in het plasmide
DNA gaan blijven zitten.
 Je bekomt zelfde plasmiden, maar met inbouw van U-basen
Enkelstrengig maken door te bewerken met alkali (NaOH)
Vervolgens mutator oligonucleotide laten binden. Polymerase toevoegen +
nucleotiden + ligase. Nieuwe streng wordt gevormd, maar buitenste streng
bevat geen U-basen, de binnenste streng wel.
Dan gaat men plasmide transformeren naar een Coli stam (mutS) die wel UNG
enzyme bevat. In die stam zal dat UNG enzyme die U’s in binnenste streng
herkennen -> U’s wegbijten -> streng kan niet meer gebruikt worden voor
replicatie. Buitenste streng (gemuteerde) WEL.
 100% mutanten

- Hogere frequentie mutanten 2

 o Plasmide draagt 2 resistentiegenen voor AB.
 Ampicilline resistentie gebied die mutatie bevat waardoor amp
resistentie niet functioneert.
 Tetracycline resistentie gebied is wel functioneel. Bevat ook multiple
kloneringsplaats = waaier van verschillende unieke restrictieplaatsen.
o Vervolgens plasmide behandelen met NaOH -> enkelstrengig
o Tegenover de plaats dat men wil muteren: mutator oligonucleotide laten
binden.
Ook thv amp gebied primer laten binden die ervoor zorgt dat mutatie hersteld
wordt.
Ook thv tetr gebied primer laten binden die een mutatie gaat inbouwen
waardoor gebied niet meer functioneel is.
o Vervolgens zelfde methode als hierboven
 Transfereren naar mutS E Coli stam.
 Binnenste streng: kan groeien op tetr, niet op amp
 Buitenste streng: kan groeien op amp, niet op tetr
Zo kan men de mutanten eruit halen die men wenst.

DNA sequentie bepaling

Nagaan of de DNA structuur wel degelijk gewijzigd is. Kan men alleen als men de
basevolgorde stap per stap gaat analyseren = sequencing.
- Enzymatische methode = methode van Sanger:
o Eerst gaat men op uiteinde een primer laten binden die gemerkt is met een
fluorescente groep (rode stip).
Als primer gebonden is gaat men DNA-polymerase toevoegen in
aanwezigheid van 4 nucleotiden
 Nieuwe DNA-streng gevormd, maar naast 4 nucleotiden ook zeer kleine
hoeveelheid van een dideoxynucleotide toevoegen (ddATP hier).
 In sommige gevallen zal het een ddATP inbouwen. Als ddATP wordt
ingebouwd, kan dat niet meer verlengd worden.
Je bekomt allerlei fragmenten van verschillende lengtes (door ad random
inbouwen van ddATP). Die fragmenten gaat men lijnen op een polyacrylamide
gel -> DNA fragmenten scheiden volgens grootte. De grootste fragmenten
blijven bovenaan zitten. (niet alleen reactie met ddATP, vervolgens ook met
andere dideoxynucleotiden)
 Op basis van patroon kan men DNA sequentie bepalen.
o Tegenwoordig reactie doen met 4 primers die elks een verschillende kleur
hebben. 4 reacties apart doen en dan samen op 1 gel
+ niet de primers merken, maar wel de dideoxynucleotiden
voordeel = geen 4 reacties meer, maar alles in 1 reactie.

- Next generation sequencing

Methode die toelaat om heel veel DNA sequenties te bepalen
Leesraam is korter maar men gaat heel veel fragmenten in parallel gaan sequencen.
o Methode van Roche: GS-FLX technologie nota 5
 DNA fragmenteren in kleine stukjes en vervolgens enkelstrengig
maken + op uiteinde een A en een B primer aankoppelen. DNA
fragmenten opmengen met beats -> DNA zodanig verdunnnen dat je
per parel/beat 1 DNA molecule hebt.
Olie suspensie met allemaal waterdruppeltjes met daarin 1 beat met
daarop 1 dNA-molecule
 Vervolgens emulsie PCR waarbij een polymerase een nieuwe streng
gaat maken. Verschillende cycli. Opwarmen tot 94° zoals bij gewone
PCR: streng komt los en gaat naar de volgende primer.
Na X aantal cycli bekom je beat die volstaat met kopijen van
oorspronkelijke DNA-streng.
 Vervolgens beats in picotiterplaat brengen. In elk putje past juist 1
biet. Elke biet is drager van een ander DNA molecule.
 Plaat in toestel brengen dat is voorzien van 4 reservoirs met in elk
reservoir een verschillend nucleotide.
Toestel gaat eerste reservoir aanspreken = reservoir met A-basen -> A-
basen worden over plaat gepompt. Men zorgt dat er een sequencing
primer aanwezig is die op uiteinden van die strengen gaat binden. Als
er in oorsprongelijke streng een T stond, kan er een A worden
ingebouwd. Door inbouw ontstaat er pyrofosfaat dat vrijkomt en zal
samen met APS (adenosinefosfosulfaat) door het enzyme sulfurylase
omgezet worden in ATP. ATP zal door het enzyme luciferase gebruikt
worden om luciferine om te zetten in oxyluciferine waarbij licht
vrijkomt.
Sommige lichtsignalen intenser dan anderen.
 In alle putjes lichtsignalen opmeten met computer
 Vervolgens 2de reservoir aangesproken -> systeem herhaald, enzovoort
o Methode van illumina = GA-II technologie
 DNA met aan weerszijden voorzien van adaptoren -> enkelstrengig
maken -> laten binden op een klein plaatje/chip.
Chip bevat al korte enkelstrengige primers: eenmaal DNA heeft
gebonden, gaat bovenste adaptor hybridiseren met primer ernaast ->
kromming.
 Je bekomt template structuur. Door toevoegen van polymerase en
nucleotiden wordt nieuwe streng gevormd.
 Door opwarmen komen strengen weer los die op hun beurt kunnen
binden met andere primers
 Clusters van kopijen van allemaal verschillende DNA moleculen

 Men gaat sequencing primer laten binden op bovenste adaptor + DNA

polymerase en fluorescente merkers toevoegen.
 Polymerase zal sequencing primer verlengen, maar nucleotiden die
toegevoegd zijn, zijn chemisch gemodificeerd zodanig dat er maar 1
nucleotide kan worden ingebouwd, maar GEEN dideoxynucleotiden!
 Door de kleur kan men zien welk nucleotide ingebouwd is. Computer
onthoudt dit.

Biotechnologie les 6
ANALYTISCHE METHODEN
Gelelectroforese
Agarose gels worden heel klassiek gebruikt om DNA te analyseren.
Nieuwe ontwikkelingen: gel casettes

HETEROLOGE GENEXPRESSIE = we maken menselijke eiwitten in een bacterie (ander species)

Belangrijke DNA/RNA elementen
Efficientie eiwitsynthese bepaald door:
- Hoeveelheid speciefiek mRNA gevormd in de cel
Hoe meer transcriptie, hoe meer mRNA in de cel: bepaald door de promoter die voor
je gen van interesse staat.
Promoter, gen en transcriptieterminator = expressiecasette. Hoe meer kopijen van
dit, hoe meer mRNA.
o Prokaryotische promoter = gebied voor de start van transcriptie waar het RNA
polymerase zal binden op het DNA. 2 gebieden van belang: -
 Prebnow box met consensussequentie = TATAAT. Hoe meer je van
sequentie afwijkt, hoe minder krachtig promotor zal zijn.
 -35 regio
o Eukaryotische promoter: veel groter, waarop het RNA polymerase II gaat
binden. In deze regio bevindt zich een TATA box waarop een eiwit gaat binden
(heeft een zadelvormstructuur en gaat zo op het DNA binden. Vervolgens gaat
TATA box bindende eiwit bijkomende transcriptiefactoren aantrekken die een
complex gaan vormen. Complex (meer dan 40 eiwitten) zal RNA polymerase II
aantrekken -> transcriptie kan plaatsvinden.
o Op de promotor bevinden zich ook nog bijkomende boxen die de transcriptie
positief of negatief gaan beïnvloeden.
o In het gen zelf kunnen ook bepaalde sequenties voorkomen die transcriptie
kunnen beïnvloeden.
- Stabiliteit van het mRNA
o Halfleven: bepaalde mRNA’s worden heel snel afgebroken, anderen blijven
lang intact. Hiervoor is geen verklaring. Maar de 5’ PEP structuur en de polyA-
staart cruciaal zijn voor stabiliteit.
o Transcriptieterminator is van groot belang. Zo krijg je altijd transcriptie’s van
dezelfde lengte. Om problemen te vermijden aangeraden een
transcriptieterminator te gebruiken.
o Bij E. Coli zijn bepaalde sequenties aan het 3’ einde van vele operons die
stabiliteit van mRNA verbeteren = REP sequenties.

- Efficiëntie van translatie

 o Ribosoombindingsplaats: als je mRNA gevormd hebt, moet dat aanleiding
kunnen geven tot eiwitten via proces van translatie. Daarbij moeten
ribosomen kunnen binden op mRNA. Er bestaan nu consensus sequenties
voor de AUG (start translatie).
 Voor startcodon bevind zich specifieke sequentie waar ribosoom zal
binden : RBS sequentie (ribosoom binding sequentie). Als die
sequentie te veel afwijkt, gaat het ribosoom minder makkelijk binden.
= Shine-Dalmago sequenties. Ongeveer 3-12 plaatsen verwijderd van
startcodon.
EXAMEN: Wat zijn shine dalmago sequenties en wat is hun belang?
 Kozak sequenties in prokaryoten: sequenties waarbij het startcodon
IN de sequentie zit.
o Naast ribosoombindingplaatsen is ook het codongebruik van groot belang.
Het mRNA wordt afgelezen per 3 nucleotiden. Er zijn verschillende codons
mogelijk voor een aminozuur. Nus is het zo dat niet elk codon even frequetn
voorkomt in gelijk welke species. Vb: het AGG is het codon dat veel voorkomt
in mRNA van de mens, en codeert voor arginine. Maar relatief weinig terug te
vinden in bacteriën. Dat wil zeggen dat als je menselijk gen binnenbrengt in
bacterien om nadien eiwitten te vormen met dat gen, dan moet bacterie zich
aanpassen aan ander codongebruik. Bacterie heeft transportRNA’s niet dus
moet deze eerst aan te maken.
EXAMEN: Wat zijn de meest belangrijke aspecten om een goeie eiwitsynthese
te realiseren ( 3 aspecten + uitleg)

Escherichia coli
Kunnen F-pili aanmaken waardoor genetische informatie wordt doorgegeven van de ene cel
naar de andere.
- Algemene werkwijze: men vertrekt van plasmide die men in coli wil binnenbrengen.
Op plasmide zit promoter gevolgd door lac operator en ook transpcriptieterminator.
Daartussen bevindt zich polylinker = multicloneringsplaats = sequentie van allemaal
verschillende unieke restrictieplaatsen waar je plasmide kan openknippen om gen in
te kloneren. Gen van interesse ga je inkloneren in polylinker regio -> men bekomt
nieuw plasmide. Plasmide binnenbrengen in coli volgens al eerder besproken
procedures (elektroporatie, chemische transformatie,…). Men zorgt ervoor dat men
bacterien opgroeit in een medium zonder lactose/IPTG = variant van lactose zodanig
dat het repressoreiwit op operatorregio gaat binden en er geen transcriptie kan
optreden. Als cultuur voldoende gegroeid is, gaat met IPTG toedienen. IPTG gaat
binden op repressoreiwit waardoor repressoreiwit loskomt van operator regio
waardoor transcriptie kan plaatsvinden -> vorming van eiwit van interesse. Nadien
kan je eiwit gaan isoleren en opzuiveren en gaan gebruiken als geneesmiddel.

- Andere promotors
 o Tryptofaan promotor: maakt deel uit van tryptofaan operon van E. Coli
 Bevat 5 genen die instaan voor aanmaak van enzymen die nodig zijn
voor synthese van tryptofaan.
 Repressor gen - Promoter – operator regio – 5 genen nodig voor
synthese
 Als tryptofaan bindt kan het repressoreiwit binden op operator
( <-> lac promotor!! )
 Je kan promotor induceren door ofwel door tryptofaan niet aan
medium toe te voegen ofwel door stof toe te voegen = indolacrylzuur
dat tekort aan tryptofaan gaan nabootsen.
Indolacrylzuur gaat binden op repressoreiwit waardoor tryptofaan niet
langer kan binden -> tekort aan tryptofaan nabootsen.
 Veel gebruikt!
o Hybride promotoren: Tac en Trc
 Kruising van tryptofaan en lac systeem
Problemen met E. Coli
EXAMEN: wat zijn de mogelijke problemen die men kan verwachten bij de aanmaak van
eiwitten in E.Coli?
- E. Coli kan geen splicing uitvoeren = verwijderen van introns uit mRNA.
 Als je bepaalde genen tot expressie wil brengen in E.Coli moet je ervoor
zorgen dat die geen introns bevatten of dat je eerst cDNA (bevat geen introns)
gebruikt en daarna dit gebruikt om expressie te realiseren.
- Kan geen posttranslationele modificaties uitvoeren. (bv: suikerstructuren erop
zetten/acetylaties). Modificaties zijn vaak van balang voor biologische activiteit.
- Eiwit dat aangemaakt word kan toxisch zijn voor de cel.
 Groei van de cultuur wordt geremd
- De eiwitten worden niet uitgescheiden maar blijven intracellullair en kunnen zich
daar opstapelen.
 Je moet bacteriën open gaan breken om eiwit eruit te krijgen waardoor
zuivering bemoeilijkt wordt aangezien ALLE eiwitten vrijkomen.
 Als je eiwitten laat accumuleren in E.coli cel kan opvouwing van eiwit in
problemen komt. Dan krijg je vaak onoplosbare aggregaten = inclusion bodies
= typisch probleem!
- Aanwezigheid van pyrogene lipopolysachariden in celwand van E.coli. Eiwitten
kunnen gecontamineerd zijn met deze lipopolysachariden.
 Kan shockproblemen induceren.
 Moeten LPS zuiver gemaakt worden.
Optimalisatie van hetereloge genexpressie
- Eiwitten kunnen dus intracellullair accumuleren. Men gaat voor het eiwit een
bepaalde sequentie brengen = signaalsequentie/secretiesignaal.
Deze sequentie heeft tot doel om de eiwitten mee naar buiten te krijgen of in de
periplasmatische ruimte te krijgen. Daar bevindt zich een peptidoglycaanlaag.
= vrij korte sequentie bestaande uit 3 delen
o N-domein: hydrofiele aminozuren
o H-domein: hydrofobe aminozuren
o C-domein: neutrale aminozuren: bevat AXA met X gelijk welk aminozuur vlak
naast gen van interesse. Alanines hebben korte zijketens = nodig om nadien
 een knipping toe te laten door een signaalpeptidase. Op moment dat eiwit
naar periplasmatische ruimte gaat wordt signaalsequentie terug afgeknipt.
Sec-eiwit translocatie systeem: eerste dat gevormd is is signaalsequentie. Hierop
gaat bepaald eiwit binden = sec B eiwit: brengt de eiwitketen brengt keten naar
ander eiwit = sec A dat zich bevindt ter hoogte van plasmamembraan. Sec A zorgt
ervoor dat eiwitketen doorheen cytoplasmatische membraan kan via complex van
eiwitten (3 eiwitten die samen een porie vormen waardoor polypeptideketen
doorheen gestuurd wordt). Sec A heeft ATPase activiteit en zal ATP omzetten naar
ADP en fosfaat waardoor het van vorm verandert. Als eiwit erdoor gaat zal
signaalpeptidase signaalsequentie afknippen -> nature eiwit kan zich vormen in
periplasmatische ruimte.
o 1 belangrijke voorwaarde: eiwitten die door kanaal gaan mogen nog niet
opgevouwd zijn.
Als toch eiwitten zeer snel opvouwen -> twin arginine translocatie systeem = TAT-
systeem: werkt onafhankelijk van sec eiwitten.
Voorwaarde: bepaalde signaalsequentie nodig met motief (niet vanbuiten kennen),
maar bevat 2 arginines!
- Eenmaal in de periplasmatische ruimte kan er nog vanalles mislopen vb: inclusion
bodies.
-> Coexpressie van periplasmatische chaperones = Eiwitten die andere eiwitten
helpen met hun opvouwing. -> chaperonnes overexpresseren om ervoor te zorgen
dat eiwit correct wordt opgevouwen.
Slecht opgevouwen eiwitten worden vrij snel afgebroken door proteasen. Je kan dus
ook opteren voor colistammen die die proteasen niet meer hebben waardoor
chaperonnens meer tijd hebben om eiwitten correct op te vouwen.
- Eiwit koppelen aan een bacteriëel eiwit dat heel efficiënt in E.coli wordt gemaakt. Vb:
thioredoxine.
Door vreemde eiwit eraan vast te koppelen -> opbrengst extra bevorderen. Men
maakt een fusie-eiwit (door coli gemaakt). Meestal maakt men gebruik van speciaal
thioredoxine: amines verandert door histidines zodanig dat je histidine rijke patch
verkrijgt die kan gebruikt worden voor de eiwitzuivering. Zone gaat heel gemakkelijk
binden op bepaalde matrices die nikkel bevatten. Op die manier kan men heel
selectief eiwit van interesse gaan zuiveren.
= affiniteitschromatografie
werkwijze:
o Vertrek van plasmide: bevat origine van replicatie + amp res gebied + delen
van het lac operon + lac promotor + kopierende gebied voor thioredoxine +
multiple cloneringsplaats waar je gen van interesse kan ingeven.
o Nadien plasmide transfereren in E. Coli. E coli dan opgroeien in medium
zonder IPTG waardoor lac repressor eiwit op operator bindt -> geen
transcriptie.
o Als cultuur voldoende gegroeid is: IPTG toedienen -> transcriptie
o Fusie-eiwit gevormd = thioredoxine + eiwit van interesse
o Eig thioredoxine: gaat selectief accumuleren in adhesiezones = plaatsen waar
de binnenste membraan contact maakt met buitenste membraan.
Voordeel = je kan E.coli cellen onderwerpen aan osmotische shock (tijdje in
20%sucrose -> coli-cel gaat water afstoten om osmotische balans te
 behouden. Nadien onmiddellijk in water -> cel gaat water opzuigen.
Binnenste membraan komt onder spanning te staan.)
 Ter hoogte van adhesiezones kunnen scheurtjes ontstaan waardoor eiwitten
gemakkelijk naar buiten kunnen.
Extracellullaire productie van recombinante eiwitten in E. Coli.
- Door E.coli heel weinig eiwitten actief gesecreteerd.
- Eiwitten kunnen wel lekken via allerlei poriën = vooral kleine eiwittten
- Methoden om sectretie te bevorderen
o Osmotische shock (zie hierboven)
o Vries-dooi cycli: E. Coli constant invriezen en ontdooien waardoor celwand
van bacterie beschadigd worden. Eiwitten kunnen dus makkelijk naar buiten
o Lysozyme behandeling. Lysozyme gaat peptidoglycaanlaag kapot knippen
door tussen NAM en NAG een knip te geven.
o Toediening van glycine aan het medium waardoor glycine ingebouwd worden
in peptides ipv alanines. Heeft tot gevolg dat crosslinking niet kan
plaatsvinden. Peptidoglycaanlaag krijgt veel lossere structuur.
o Ipv met thioredoxine: fusie-eiwit maken met eiwit dat zich bevindt in
buitenste membraan van de coli-cel waardoor eiwit eigenlijk al buiten hangt.
Dan moet je enkel nog zorgen voor een knipplaats om eiwit vrij te stellen.
OF bepaalde eiwitten overexpresseren die poriën gaan maken in de
membraan langs waar het eiwit makkelijk naar buiten kan.
DE meest luxueuze situatie: kanaal dat 2 membranen overspant waardoor
eiwit rechtstreeks naar buiten kan: hemolysine.
1 voorwaarde: je moet aan C-terminus een hemolysine secretiesignaal
brengen
Therapeutisch gebruikte eiwitten
- Insuline
o Polypeptide bestaande uit A en B-keten
o Wordt in de mens gemaakt als preprohormoon = precursormolecule. Pre-
sequentie is nodig om eiwit naar ER te brengen = heel korte sequentie die
wordt afgekliefd inclusief het start-methionine.
 Vorming van pro-insuline.
Er worden dan zwavelbruggen gevormd tussen A en B-keten en ook intern in
A-keten
Nadien een knip gegeven waardoor rode stuk wordt verwijderd en je krijgt
mature insuline
o Oudste insuline preparaten waren afkomstig uit de pancreas van
varkens/runderen = nagenoeg identiek aan menselijk insuline. In de B-keten
een alanine ipv een threonine. Heel lang geleden heeft men insuline
behandeld met trypsine dat 2 knips geeft. Dan heeft men synthetisch peptide
eraan gekoppeld: draagt menselijk threonine
 Men bekomt semisynthetische menselijk insuline.

o Biotechnologische productie van insuline in E. coli

 Men heeft 2 plasmiden nodig met op elk plasmide de lac promoter gevolgd
door lac operator en het eerste gen van lac operon.
In het eerste plasmide plakt men achter beta-galactosidase DNA dat codeert
voor de A-keten van insuline.
In tweede plasmide koppelt men DNA dat codeert voor B-keten.
Men brengt 2 plasmiden binnen in 2 verchillende E. Coli stammen. Men
maakt 2 verschillende culturen. Men kweekt die op: eerst in afwezigheid van
IPTG. Nadien wel IPTG als cultuur voldoende gegroeid is en gaat men beta-
galactosidase insuline fusie eiwit vormen.
Cellen lyseren om eiwit eruit te kunnen zuiveren. Eiwitten behandelen met
cyanogeenbromide CNBr = heeft de eigenschap dat het kan klieven na elk
methionine. A en B-keten hebben geen methionines behalve bij de aansluiting
met beta-galactosidase.
 A en B-keten losgeknipt van beta-galactosidase.
Beta-galactosidase bevat zelf methionines dus wordt in stukjes geknipt.
A en B-keten worden verder opgezuiverd en op chemische wijzen geoxideerd
waardoor zwavelbruggen kunnen vormen
 Matuur insuline gevormd.
Examen: Hoe kunnen we insuline op biotechnologische wijze maken?
o Biotechnologische productie van pro insuline in E. Coli
Ipv met 2 ketens, met 1 keten werken -> werken met pro-insuline (A en b-
keten, maar ook C-keten). Op zelfde manier te werk gaan als hierboven.
o In hoge concentraties kan insuline multimere complexen vormen, die
gestabiliseerd worden door zink.
Complexvorming geeft aanleiding tot langwerkende insuline-preparaten.
Bepaalde aminozuren van zeer groot belang bij complexvorming:
 Je kan complexvorming tegengaan door aminozuren te gaan muteren.
 Zo maak je snelwerkende insuline-preparaten. Je moet letten op dat je
de rode niet muteert (staan in voor binding met insuline receptor)
 Met behulp van mutagenese technieken heeft men allerlei vormen
van insuline gemaakt

Biotechnologie les 7

- Groeihormoon
o Wordt bij de mens in de hypofyse gemaakt als een prehormoon. Normaal
wordt pre-gedeelte afgekliefd op moment dat eiwit ER inkomt. Pre-sequentie
bevindt zich aan N-terminus: start met methionine + 22 AZ’n. Mature eiwit
wordt uiteindelijk door hypofyse gesecreteerd.
o Vroeger werden crue hormoon preparaten gemaakt door extracten te maken
van de hypofyse (risico’s!)
o Nu enkel nog groeihormoon van biotechnologische oorsprong

o Werkwijze:
  Aangemaakt in E.coli. Coderende gebied is het cDNA.
 De signaalsequentie wordt niet herkent door Coli. Dus je kan
signaalsequentie niet gebruiken.
 Men verwijdert dus signaalsequentie door het cDNA te knippen met
ecoR1. Ook stukje DNA dat codeert voor de eerste 24 AZ’n wordt
weggeknipt.
 Om dit te corrigeren heeft men synthethisch stukje DNA gemaakt voor
stukje van 24 AZ’n en geplakt aan de rest van het coderende gebied.
Bevat dus codons voor de eerste 24 AZ’n, maar ook ATG stukje = start
codon. Uitstekend HindiIII stukje zodat men aan beide einden zo’n
eindje heeft. En dit kan men dan cloneren in plasmide dat met het
HindiIII enzyme is opengeknipt.
 Plasmide transfereren naar E.coli.
 1 probleem: de N-terminus start met een methionine = niet identiek
aan menselijk hormoon. (want methionine wordt weggeknipt door
presequentie). Dit maakt dat preparaat eigenlijk immunogeen is.
Worden vaak antilichamen aangemaakt door mens. Om dit probleem
op te lossen: alternatieve manier.
 Men heeft menselijk groeihormoon gecloneerd in een plasmide maar
ervoor heeft men een beacterieel secretiesignaal geplaatst die door
E.Coli wel herkend word. Je krijgt N-terminus zonder extra methionine
= beste manier
EXAMEN: is er verandering opgetreden in productieproces en waarom
is dat gebeurt?

Saccharomyces cerevisiae
De bakkersgist als heteroloog expressiesysteem
- Klassiek gebruikt als alternatief expressiesysteem
- Eukaryoot organisme, wel enkelcellig!
- GRAS-organisme = zijn veilig om te gebruiken.
- Af en toe groene bolletjes op cellen = bud scars. Cellen delen door middel van
budding. Zo kan je nagaan of het een oude of een jonge cel is.
Secretiepathway die je niet bij bacteriën hebt
- In de kern bevindt zich genetisch materiaal waar ook transcriptie plaatsvindt. RNA
gaat naar het cytoplasma waar de eiwitsynthese plaatsvindt. Het eerste wat
verschijnt uit de ribosomen is een signaalsequentie = stuk van het eiwit dat nodig is
om het te loodsen naar de secretiepathway.
- Signaalsequentie wordt herkend door signaalpeptide = SRP en bindt erop. Als dit
gebeurt stopt de translatie tijdelijk totdat RSP-partikel gebonden wordt aan RSP-
receptor die zich in ER bevindt.
- Als dat gebeurt kan translatie verdergaan en gaat de eiwitketen via een specifiek
kanaal doorheen het membraan van het ER tot in het lumen van het ER. In lumen
wordt dan signaalsequentie afgekliefd.
- Eenmaal in lumen van ER gaan al een deel van de glycosidaties plaatsvinden.
- Als dit gebeurt is zal het eiwit overgebracht worden naar golgi-apparaat: glycosidatie
wordt verder afgewerkt + evt post-translationele modificaties.
 - Gistcel kan het eiwit ofwel naar buiten toe sturen ofwel wordt het gestuurd naar de
vacuole (=alternatief voor lysosoom die bij hogere eukaryote cellen terugvinden).
- Dit systeem is vrijwel identiek in hogere eukaryote cellen, bv zoals bij mens.
Shuttlevectoren/pendelfactoren = specifieke plasmiden.
- Plasmiden gemaakt in E.Coli maar als het klaar is, getrasformeert naar gistcel. Dus
zowel bruikbaar in coli als in gistcellen. Vandaar de naam.
- Integratieplasmiden = plasmiden die moeten integreren in de chromosomen van de
gist om stabiel te blijven. Op plasmide zit een bepaalde bacteriële sequentie op
(oranje) die origine van replicatie bevat die werkzaam is in Coli + selectiemerker die
bruikbaar is in coli bv: amp res = nodig om het plasmide te kunnen gebruiken in Coli.
Verder bevindt zich daar ook genetische merker voor gist transformatie (paars).
Gisten zijn van nature resistent tegen antiobiotica. Voor transformatie van gist
moeten we gebruik maken van andere merkers: vaak genen coderend voor enzymen
betrokken bij synthese van aminozuren.
o Bv gistcel die LEU 2 gen niet bevat = enzyme nodig voor synthese leucine. Als
de giststam dit gen niet heeft kan het niet groeien in een medium zonder
leucine. Tenzij je plasmide binnenbrengt die functioneel LEU 2 gen bevat.
Plasmide moet unieke restrictieplaatsen bevatten.
Geen origine van replicatie die werkzaam is in gist!
- Replicerende gistvectoren: volledig hetzelfde maar bevatten een replicatieoorsprong
die ook werkzaam is in Coli. Kunnen dus autonoom repliceren (moeten niet meer
integreren) en meegenomen worden naar dochtercel.
o Daarvoor moeten er bepaalde replicatiesequenties op plasmide worden
overgebracht. Oorspronkelijk afkomstig van natuurlijk voorkomende gist 2
plasmide: kunnen in meerdere kopijen in de cel voorkomen. Bevat onder
andere een origine van replicatie die je mee kunt brengen op die vector die je
wil maken. Je gaat DNA van 2 op plasmide brengen en bevat dan origine van
replicatie. Bevatten maar klein stukje DNA van 2 -> YEP
o YEP vectoren = vectoren zoals integratievectoren maar extra origine van
replicatie afkomstig van 2 plasmide. Mist heel wat functies die ook
voorkomen op gist 2 plasmide. Als we alleen maar origine op plasmide
brengen, moeten we plasmide transformeren naar cir+ stam = gist stam die
ook natuurlijk voorkomende 2 plasmide bevat. Zodanig dat de functies nog
kunnen gebruikt worden voor de replicatie van het plasmide dat je
binnenbrengt.
Nadeel: door aanwezigheid endogeen 2u treedt er vaak competitie op ->
geringe stabiliteit.
o Men heeft ook plasmiden gemaakt waar volledige 2 sequentie in het
plasmide heeft gebracht dat men aan het maken was. Dan kun je
transformeren naar cir0 stam: bevat geen endogeen 2. Er is dus geen
concurrentie meer -> veel stabieler + hoger kopijenaantal.
Je hebt endogeen 2 niet meer nodig want zit al ingebouwd.
o Naast 2 gebruikt men ook soms ARS sequenties = stukje DNA dat voorkomt
in de chromosomen van de gist en bevat replicatiefuncties van de
chromosomen.
 Nadeel: leiden tot weinig stabiliteit tenzij je naast ARS ook 2de sequentie
brengt = centromeer sequentie = centrale gedeelte in de chromosomen in de
gist die van belang zijn bij een correcte verdeling van chromosomen naar
dochtercellen.
o YAC= lineaire moleculen die een ARS seq bevatten + centromeer seq, maar
ook telomeer sequenties = uiteinden van de chromosomen.
Voordeel = Men maakt dus minichromosomen waar je heel gemakkelijk
bijkomendeDNA sequenties bij kan steken. Je kan er heel veel vreemd DNA op
verder cloneren (tot 100’en kilobasen groot)
Gist reguleerbare promotors:
- men maakt gebruik van galactose induceerbare promotoren. Promotoren zijn:
o zeer krachtig, kan aanleiding geven tot 1% van het mRNA
o heel goed gecontroleerd door galactose. Worden pas geactiveerd als je
gistcellen in galactose brengt
- Werkwijze: in promotorgebied bevindt zich UAS-sequentie waarop een GAL4 eiwit
moet gebonden worden, anders kan je geen inductie krijgen (1ste voorwaarde).
o Als je gistcellen groeit in glycerol (geel galactose) gaat er een gal4-eiwit
binden op UAS, maar tegelijkertijd 2e eiwit GAL80 binden op Gal 4 waardoor
RNApolymerase niet meer kan binden op promotor.
 geen transcriptie
o In galactose medium gaat gal4 eiwit nog steeds binden op UAS, maar er wordt
ook bepaalde inducer gevormd die bindt op GAL80 eiwit waardoor dit van
plaats veranderd. RNA polymerase kan wel op promotor binden.
 Wel transcriptie
o In glucose medium: gerepreceerde toestand = er wordt een CRP molucule
gevormd (catabolisch repressor proteïne) dat zal binden op GAL 4 waardoor
GAL4 niet meer op UAS kan binden.
 Geen transcriptie
Transformatie van S. Cerevisiae
- Behandeling met lithium = chemische methode
o (Bij E.Coli met Calcium)
o Door behandeling met lithium gaat gistcel competent worden. Na
behandeling kan je dus DNA toevoegen in aanwezigheid van
Polyethyleenglycol PEG = visceuze substantie waardoor DNA zich gaat
concentreren rond de gistcel -> hitteshock bij 42°. Tijdens hitteshock kan DNA
opgenomen worden. In laatste fase gistcellen wassen zodat PEG
weggewassen wordt = toxisch voor de cellen en nadien ook gedurende
minstens een uur incuberen bij 30° om selectiemerker te kunnen vormen.
Dan pas uitplaten op een selectieve voedingsbodem (Leu2merker -> uitplaten
op medium zonder leucine -> enkel gistcellen die plasmide met LEU2merker
hebben opgenomen zijn in staat te groeien.)
- Electroporatie (zoals bij E. Coli). Door een puls te geven gaten slaan in de gist en
plasmid DNA kan worden opgenomen = meest eenvoudige manier.
Problemen
- Afwijkend glycosylatiepatroon t.o.v. hogere eukaryoten: de beginstructuur van gist is
hetzelfde, maar complexe structuur van de mens is niet aanwezig. Gist heeft vanaf de
basisstructuur enkel nog maar mannoses = hoge mannose = gigantische suikerboom:
zorgt voor problemen
o Door het feit dat je gemakkelijk honderden mannosestructuren hebt, ga je je
eiwit volledig afdekken met suikerstructuur. (stel eiwit voor vaccin -> kan
onmogelijk door immuunsysteem herkend worden om antilichamen te
vormen).
o Op de uiteinden van de structuren mannoses (en geen siaalzuur). Als je eiwit
zou inspuiten bij mens, zal eiwit heel snel uit de bloedbaan van de mens
geklaard worden door mannosebindende receptoren.
o Men kan dit oplossen door het aanpassen van de glycaanstrucuur = glycan
engineering. Situatie in ER zowel bij mens als bij gist zichtbaar. De start is dus
hetzelfde: je krijt een mannose 8 structuur. Zodra de structuur naar het golgi
gaat beginnen er afwijkingen te vertonen.
 Bij de mens wordt mannose 8 structuur omgevormd tot mannose 5
structuur. Vervolgens wordt door enzym een N-acetylglucosamine aan
toegevoegd. Weer 2 mannones afgebroken en weer N-
acetylglucosamine opgezet. Tot slot 2 galactoses en 2 siaalzuur
opgezet.
 Bij gist worden er geen mannoses verwijderd maar enzym OCH1 gaat
een 9e mannose-eenheid er mee opzetten = start om ganse keten te
vormen waarop allemaal mannose vertakkingen kunnen komen. Zo
ontstaat hoge mannose suiker structuur
-> Men heeft nu mannose mutanten gemaakt die geen OCH1 enzyme
bevatten. Ook ALG 3 verwijderd -> geen mannose 8 meer naar een
mannose 5 structuur. In het golgi-apparaat ook bepaalde enzymes
ingebracht die in staat zijn complexe suikerstructuur te vormen.
 Probleem: substraten dat het enzym nodig heeft om op de suikers te
zetten ontbreken ook. Dus men zou dan ook substraten moeten
toevoegen.
Examen: Wat zijn de problemen die men kan verwachten in
saccharomyces en hoe kan men dit oplossing
- Sekretie-efficiëntie van vele heterologe eiwitten (niet gist eiwitten) vaak
teleurstellend
Optimalisatie
- Fusie met een gist secretiekanaal: -factor sekretiekanaal (=gistseksferomoon).
o Als promotor actief is wordt er 1 lange eiwitketen gevormd beginnend met
pre-sequentie = bedoeld om het eiwit naar het ER te brengen. Als het
transloceert naar ER, zal door signaalpeptidase pre-sequentie worden
afgekliefd. Je hebt dus prosequentie op einde = signaal om eiwit verder naar
golgi-apparaat te brengen. In het golgi-apparaat zitten er meerder proteasen
die -factor verder gaan processen.
o KEX 1 protease gaat achter prosequentie knip geven -> prosequentie
verdwijnt.
 o Brugpeptide over. Begint met lysine en argine + EAEA. Door KEX 2 protease
herkent en geknipt. Door STE13 gaan -factoren individueel vrijkomen en
worden gesecreteerd.
o In de biotechnologie gaat men gebruik van pre-pro-en DNA dat codeert voor
lysine en arginine.
- Fusie-eiwitten maken: vreemde eiwit koppelen aan gisteiwit. Vb: ubiquitine:
makkelijk aangemaakt en gesecreteerd door gist. Vreemde eiwit aankoppelen en
hopen dat het mee wordt aangemaakt.
- Chaperonnes overexresseren: eiwitten die andere eiwitten helpen met opvouwing.
Een niet correct opgevouwen eiwit gaat niet gesecreteerd worden en blijft achter in
ER en wordt uiteindelijk afgebroken. Men zou in ER chaperonnes kunnen
overexpressioneren. Zo secretie van vreemde eiwit bevorderen.
- Isoleren van super secretie mutanten -> giststam muteren met chemische stoffen ->
willekeurig mutaties in de chromosomen. Na inbreng van mutaties screenen naar
mutanten die een betere secretie vertonen.
- Bepaalde externe parameters aanpassen (pH, samenstelling,…). Nadeel: rijker
medium betekent moeilijkere zuivering.
Hoe lager temperatuur hoe trager eiwitsynthese, maar hoe meer kans het eiwit heeft
om correct op te bouwen.
Therapeutisch gebruikten eiwitten
- Vaccin tegen Hepatitis B: gesynthetiseerd in saccharomyces
o Probleem ter hoogte van de lever. Meeste mensen genezen spontaan. Soms
treden er echter chronische ontstekingen op -> chronische dragers van het
virus. Adhv deze dragers maakt men vaccin.
o Blauw enveloppe eiwit dat virus omgeeft. Bij chronische dragers zit in het
bloed partikels/aggregaten van manteleiwit. Die partikels heeft men
gezuiverd uit het bloed van chronische dragers en gebruikt als vaccin.
o Tegenwoordig via recombinant DNA technologie.
o Concreet: DNA dat codeert voor manteleiwit van virus op een gistplasmide
gebracht achter een gistpromotor (galactose). Selectiemerker (leu2 merker)
erop en getransformeerd naar Leu 2 deficiënte gistcellen. Hiervan kolonies
genomen en in vloeibaar medium gebracht. Galactose gegeven -> inductie
van de promotor -> manteleiwit gevormd. Eiwit blijft intracellullair. Gistcellen
worden op gegeven moment afgecentrifugeerd -> opengebroken -> eiwit uit
gezuiverd = synthese van Hepatitis B vaccin.

Pichia pastoris
- Methylotrofe gisten: kunnen groeien op methanol als enigste koolstofbron voor
energie = heel bizar aangezien ethanol toxisch is product voor zowat elke organsime
op aarde.
- Heeft min of meer zelfde eign als saccharomyces maar:
o Kan groeien op methanol (lage kostprijs)
o Veel beter secretievermogen: 10-100 keer beter
o Kunnen veel hogere celdensiteiten halen. Veel meer eiwit per volume
o Kunnen posttranslationele modificaties uitvoeren die vglbaar zijn met hogere
eukaryoten. Geen complexe suiker met galactose en siaalzuur, maar niet zo
groot als saccharomyces.
 o Om te kunnen groeien op methanol moeten ze beschikken over speciaal
enzyme = alcohol oxidase = AOX: katalyseert de eerste stap in
methanolmetabolisme = omzetting methanol -> formaldehyde. CH3OH wordt
opgenomen in gistcel en door AOX omgezet in formaldehyde en daarbij wordt
waterstofperoxide gevormd = giftig product -> moet geneutraliseerd worden
met behulp van catalase: zet dit om naar zuurstof en water. Omdat er
waterstofperoxide gevormd worden, worden eerste stappen uitgevoerd in
peroxisoom, anders zou gistcel zichzelf vergiftigen.
Vectoren
- Replicerende vectoren: worden nauwelijks gebruikt. Bevatten ARS sequenties maar
zijn zeer onstabiel.
- Integrerende vectoren: bevat promotor van AOX1 gen = zeer krachtige die
induceerbaar is in methanol + DNA dat codeert voor secretiekanaal: kan vaak
secretiekanaal zijn van -factor van saccharomyces + multiple kloneringsplaats =
unieke restrictieplaatsen waarin je vreemd gen kan inkloneren + transcriptie
terminator van AOX1 gen + selectiemerker voor transformatie van gist: meestal HIS4
gen + DNA dat codeert voor 3’ onvertaalde gebied van AOX1.
Integratie van vectoren in het pichia genoom
- Integratie in de HIS4 locus: gebeurt door proces van homologe recombinatie: stukje
van het chromosoom van pichia waar een defect HIS4 gen op zit (dus wel aanwezig,
maar niet werkzaam). Als je dat plasmide binnenbrengt gaan 2 HIS4 genen zich naast
elkaar positioneren. Volgens homologe recombinatie gaat er cross-over gebeuren (de
losse eindjes worden kruiselings aan elkaar gezet).
In de praktijk gaat men plasmide eerst knippen met SAL 4 zodanig dat homologe
recombinatie nog makkelijker kan doorgaan. Men geeft dus op voorhand al een knip
in het HIS4 gebied
 Volledige plasmide gaat integreren in chromosoom van de gist = eerste
mogelijkheid

Biotechnologie les 8

- Integratie in de AOX1 locus: knippen met Bgl II. Knipt vlak voor AOX1 promotor +
tweede knip op het uiteinde van het 3’ onvertaalde domein van het AOX1 gen. Stukje
dat ertussen zit transformeren naar Pichia. -> er gebeurt dubbele homologe
recombinatie: we hebben opnieuw Bgl chromosoom dat AOX1 promotor bevat + AOX
1 gen + transcriptieterminator + 3’ onvertaalde domein. Dit breng je binnen en thv
promotor gaat eerste homologe recombinatie + thv 3’ onvertaalde domein ook
homologe recombinatie .
Gevolg: wat er in het genoom zat, ga je volledig uitwisselen met wat je hebt
binnengebracht. Je speelt dus AOX1 gen volledig kwijt en wordt vervangen door
construct = gen van interesse.
-> je maakt mut S transformanten = transformanten die niet langer beschikken over
AOX1 gen en dus heel traag groeien op een voedingsmedium met methanol
= enigste manier om een AOX1 gen te verwijderen.
Transformatie van P. Pastoris. Hoe brengen we consruct binnen?
- Transformatie van P. Pastoris sferoplasten = cellen waarvan de celwand is verwijderd
door de gisten te bewerken met enzymes zoals chitinases
= meest gebruikt
o Sferoplasten behandelen met DNA in aanwezigheid van CaCl. Dit zorgt ervoor
dat DNA gaat percipiteren. Men gaat sferoplasten behandelen met
polyethyleenglycol = visceuze substantie die wordt toegevoegd om
membraanfusies te veroorzaken. Laat toe meedere kopijen van plasmide in
de cel te krijgen.
o Nadeel: arbeidsintensief + delicaat: de afbraak van celwand moet zeer goed
gemonitord worden. Als die niet voldoende wordt afgebroken heb je geen
goede transformatie DNA wordt dus niet goed opgenomen. Als je teveel
afbreekt bestaat kans dat celwand niet meer kan regenereren. Je moet dus
goed kritisch punt vinden: normaal gesproken afbreken tot ongeveer 70%. En
ook werken in osmotische gestabiliseerd medium.
- Alternatieve methoden
o Electroporatie zoals bacteriën en bakkersgist
o Chemische behandeling met lithium zoals bij bakkersgist. 1 verschil: men
gebruikt liever lithiumchloride -> verbeterde efficiëntie. (lithiumacetaat bij
saccharomyces)
Belangrijke parameters bij expressie van heterologe eiwitten in P. Pastoris
- Kopijenaantal van expressiecassette: hoe meer kopijen hoe hoger de expressie zal
zijn.
o Uitzondering voor hepatits B oppervlakte gen en humaan serum albimine: 1
kopij is voldoende. Meerdere kopijen gaan niet zorgen voor hoger
expressieniveau.
o Screening naar transformanten die meerdere kopijen bevatten mogelijk door
gebruik te maken van PCR. Op basis van PCR aantal kopijen bepalen. men
gaat primers nemen die binden in AOX1 promotor en in TT. Men gaat dit
PCR’en. Als je dat op gel steekt krijg je sowieso een band voor AOX1 gen,
maar als er nog kopijen zijn ingekropen, krijg je extra band van gen van
interesse. Hoe dikker die band wordt, hoe meer kopijen. Of met real-time
PCR, maar dan kan je onderscheidt niet maken tussen 2 verschillende banden.
- Lengte en nucleosidesamenstelling
o 5’ onvertaald gebied voor het startcodon speelt belangrijke rol.
 5’ onvertaalde gebied van AOX 1 gen: 114 nucleotiden lang, als je geen
plasmide binnenbrengt -> geen expressie van serum albumine
 als je plasmide binnenbrengt dat serum albumine met eigen 5’
onvertaalde gebied -> relatief zwakke expressie
 als je 5’ onvertaalde gebied vervangt door dat van AOX1 gen ->
opbrengst met factor 50 omhoog
 3’ onvertaalde gebied identiek maken aan dat van AOX1 geen, maar
dit heeft geen invloed op expressieniveau.
- Procent GC
o GC gehalte te laag -> remt transcriptie
o Codongebruik zoveel mogelijk gelijk aan codongebruik in pichia
- Medium en groeicondities
 o Om maximaal expressieniveau gebruik maken van rijk medium dat gebufferd
is bij pH 7 en dat voldoende zuurstof bevat.
Ocriplasmine: therapeutisch eiwit
- Eiwit dat bloedklonters kan oplossen. Bestaat uit verschillende domeinen, maar
bedrijf heeft enkel omkadert domein in grote hoeveelheden aan te maken in Pichia
Pastoris. Domein heeft men microplasmine/ocriplasmine genoemd. Men produceert
dit ook als precursor (eig microplasminogeen) die nadien wordt geactiveerd in vitro
(na zuivering met eiwit stafilokinase: gaat knip geven zodanig dat lus wordt
opengeknipt -> actief microplasmine).
- Dit wordt verkocht onder de naam Jetrea.
- Wordt gebruikt om bepaalde oogaandoeningen te behandelen. In het oog glasvoct
aanwezig. Er zijn patiënten waarbij glasvocht loskomt van retina. Vaak gaat vocht
achteraan volledig loskomen. Op zich niet heel erg, maar het probleem is ernstiger
als het glasvocht niet volledig loskomt. Dit gaat trekken aan de retina -> allerlei
problemen (zichtverlies, lichtflitsen,…). Moet ingegrepen worden !! vroeger adhv
operatie, maar dankrij Jutrea 1 enkele injectie waardoor glasvocht volledig loskomt.
- Veel goedkoper en veel makkelijker.

Filamenteuze schimmels = zeer aantrekkelijk voor biotechnologie.

Filamenteuze schimmels als heteroloog expressiesysteem
- Groeien op zeer goedkope media (zoals gisten).
- Uitstekend secretiecapaciteit
- Produceren geen toxines -> vaak GRAS-status
- Post-translationele modificaties
- Ze hebben wel nog altijd terminale mannoses. Echter niet zo groot.
- Probleem: aanmaak van schimmeleiwitten gaat heel goed en worden ook zeer goed
secreteerd maar secretie van menselijke eiwitten (heterologe eiwitten) toch
problematisch -> men gaat heterloog eiwit fusioneren met schimmeleiwit.
Productie van recombinante eiwitten in Aspergillus door fusie met flucoamylase
- Industriële stammen die zeer efficiënt glucoamylase kunnen secreteren. Men heeft
schimmelpromotor (glucoamylase promotor) genomen die induceerbaar is als je
schimmel groeit in media met zetmeel bv. Daarachter bevindt zich coderend gebied
van flucoamylase en dan achter linkerdomein coderend gebied voor menselijk hIL6.
Stukje DNA ertussen codeert voor brugpeptide met op uiteinde lysine en arginine
(gisten!!) = knipplaats voor KEX2.
- Als promoter actief is wordt er fusie-eiwit gevormd dat in de secretieweg gaat.
Eenmaal in golgi-apparaat gaat KEX 2 die plaats herkennen en knippen en komt hIL6
vrij van glucoamylase en wordt gesecreteerd. -> grote hoeveelheden hIL6
aangemaakt.
- Hij heeft vastgesteld dat men best niet volledige glucoamylase gebruikt.
o Hij had eerst aan C-terminus hIL-eiwit gehangen. Ging makkelijk maar met
grotere eiwitten ging dit veel moeilijker. Zit tegen elkaar geplakt dat ervoor
zorgt dat opvouwing van 2 domeinen in de problemen geraakt.
o Vervolgens domein gemaakt zonder klein domein aan C-terminus. Opvouwing
komt niet meer in problemen. Eiwit rechtstreeks aankoppelen -> opbrengst
stijgt aanzienlijk.
Productie van recombinante eiwitten in Trichoderma door fusie met cellobiohydrolase
- Trichoderma reesei (groene schimmel) bezit nog veel betere secretiecapaciteiten als
Aspargillus.
- Kan zeer goed cellullasen secreteren en voornamelijk cellobiohydrolasen CBH. Dit
eiwit is men dus gaan gebruiken als fusie-partner om vreemde eiwitten in schimmel
aan te maken.
- Finse wetenschappers: CBH promoter gebruiken (kan geïnduceerd worden door
cellullose), daarachter coderend gebied van cellobiohydrolase en daarachter DNA dat
codeert dat voor Fab-fragmenten = antilichaamfragmenten. Blijkt dat deze zeer
efficiënt worden gesecreteerd. Er zit eign geen TEX2 knipplaats maar in deze
structuur ander protease dat knip geeft zodanig dat antilichaamfragmenten worden
losgeknipt en apart gesecreteerd kunnen worden

Planten
Genetisch niet gemodificeerde planten
- Extracten maken van planten met daarin sec metabolieten. Je hoeft ze niet genetisch
te wijzigen. Gwn met klassieke plant therapeuten bekomen
- Problemen:
o Zeldzame plant
o Moeilijk te kweken plant
o Als metaboliet maar in zeer lage concentratie voorkomt
- Oplossingen:
o Metabolieten chemisch synthetiseren. Vaak zeer moeilijk omdat metabolieten
vaak zeer complex zijn.
o Planten in vitro gaan kweken en evt culturen aanleggen van plantencellen.
Elke cel heeft alle genetische info van de volledige plant -> bevat informatie
om sec metaboliet te maken
 Verschillende stadia
In vitro propagatie van planten
- Stadium 0: Verder manipuleren van moederplant die het best in zo’n proper
mogelijke omstandigheden gekweekt is geweest.
o Als dit niet kan, dan moet je die uit de natuur halen en moet je plant eerst
volledig ontbladeren om nadien te steriliseren met probleem dat
gesteriliseerde delen de stengel kunnen binnendringen en de auxiliarie
knoppen kunnen aantasten. Waardoor alleen apicale knop bruikbaar is. –
o Moest moederplant op voorhand in serre gekweekt zijn volstaat het om
bladeren ¾ de verwijderen waardoor zijknoppen wel beschermd tegen de
sterillisatie.
- Stadium 1: aanleg van aseptische cultuur
o LAF kast met microscoop: zijknoppen vrijtetaneren -> knop isoleren op vaste
voedinsbodem brengen. Geeft na enige tijd aanleiding tot nieuwe plant.
Uitgaande van knoppen planten generen
- Stadium 2: van nieuwe plantjes kleine stukjes afknippen (om de zoveel weken) om
die stukjes in vloeibaar medium te brengen.
- Stadium 3: er kan wortelgroei ontstaan in het vloeibaar medium. Eenmaal er wortels
zijn kan men dit in normale bodem brengen.
- Stadium 4: deze potten verder in serre kweken.
Plantaardige weefsel- en celcultuur
- Uitgaande van planten kan men culturen aanleggen. Vertrekkende van planten
stukjes afknippen en op vaste voedingsbodem brengen. Aangezien stukjes verwond
zijn, gaat langs de randen nieuw plantenweefsel groeien = callus-weefsel
= ongedifferentieerd plantenmateriaal dat ontstaaan is uit gedifferentieerd
plantenmateriaal. Heeft als eigenschap een heel efficiënte celdeling. Onder invloed
van hormonen kan men proces van celdeling nog extra stimuleren.
Regeneratie nieuwe planten uit plantencellen
- De verhouding van auxines versus cytokines is van belang.
o Veel auxines en weinig cytokines -> wortelgroei
o Veel cytokines en weinig auxines -> scheutvorming
- Somaclonale variabiliteit: plantencellen in culturen zijn niet genetisch stabiel. De
genetica kan dus toch verschillen. Waarschijnlijk door transposons = kleine stukjes
DNA die springen tussen elkaar.
Plantaardige weefsel- en celcultuur
- Om aggregaatvorming tegen te gaan gaat men enzymen toevoegen die dit afbreken.
- Zowel batchculturen als continue culturen
Probleem:
- Concentratie secundaire metabolietien in individuele plantencellen is vaak te laag. Dit
doordat plantencellenculturen geREdifferentieerde cellen zijn. Secundair
metabolisme is altijd gekoppeld aan graad van differentiatie.
- Oplossen door cultuur aan te leggen van gedifferentieerde cellen, bv scheuten maar
hebben licht nodig en zijn zeer gevoelig aan scheerkrachten. WEL wortelculturen
aanmaken
Genetisch gemanipuleerde plantencellen: al eeuwen lang: allerlei kruisingen van planten om
betere opbrengsten/oogsten te realiseren.
- Echter zeer trage en zeer onzekere manier van werken -> technieken ontwikkeld om
op vrij snelle en betrouwbare manier genetische wijzigingen aan te brengen
o Fusie van protoplasten: je neemt blad van plant 1 en twijg van plant 2. 2 delen
van de plant in stukken snijden en in vloeibaar medium brengen waarin een
aantal celwand afbrekende enzymen aanwezig zijn -> ontstaan protoplasten.
Kunnen de mijding hebben om met elkaar te versmelten. Men voegt PEG toe
om dit te stimuleren -> protoplasten fusioneren waardoor genetisch materiaal
ook fusioneert -> op vaste voedingsbodem brengen die bepaalde cellen bevat
die groeifactoren produceren -> uitgaande van hoopje cellen kan stengel
groeien -> vervolgens stengels overbrengen in vloeibaar voedingsbodem met
veel auxines -> wortelgroei -> nieuwe planten gegenereerd.
o Bladschijf-techniek: uit een blad kleine schijfjes snijden en in medium brengen
waaraan men bacterie-suspensie aan toevoegt: agrobacterium-suspensie:
heeft eig om genetische informatie over te dragen naar beschadigde
plantendelen. Vervolgens bladschijven verder kweken (feeder cells,
plantenhormonen voor stengelgroei, plantenhormonen voor wortelgroei,…)

Agrobacterium tumefaciens
- Bacterie die tumoren kan veroorzaken, vooral thv wortels, maar soms ook
bovengronds.
- Bacterie kan cellen van de plant zodanig wijzigen dat plantencellen zeer snel gaan
delen -> tumor
- Naast klassieke genoom heeft het een plasmide = tumor inducerend plasmide.
Stukje van dit plasmide = T-DNA wordt in plantencel binnengebracht en veroorzaakt
tumor.
- Ti plasmide
o Vrij groot, bevat 196 genen
o T-DNA wordt langs weerszijden geflankeerd door bordersequenties (25 bp
lang).
Op T-DNA heel wat verschillende genen die coderen voor auxines en genen
die coderen voor cytokines. Verder op T-DNA ook genen die coderen voor
opines = speciale AZ’n die plant niet kan gebruiken maar die agrobacterium
wel kan gebruiken
 Agrobacterium zet plantencel dus aan om opines te produceren die hij dan
kan gebriken voor eigen metabolisme.
Verder ook origine van replicatie en virulentiegenen die nodig zijn om T-DNA
over te dragen naar plantencel.
- Wanneer plantencel beschadigd wordt, gaan er fenolische verbindingen naar de
bacterie = signaal voor bacterie om virulentiegenen te activeren. Ter hoogte van
celwand van bacterie bevindt zich een virulentie-eiwit A = kinase -> gaat virulentie
eiwit G kineren, fosfaatgroep opzitten -> virulentie-eiwit G wordt actief en gaat
andere virulentiegenen activeren. Bepaalde virulentie eiwitten gaan dan in de
bordersequenties een knip geven zodanig dat T-DNA wordt vrijgesteld. Vervolgens
zullen andere virulentie eiwitten een porie vormen tussen bacterie en plantcel
waardoor T-DNA wordt doorgegeven. Daarbij wordt T-dNA bezet door virulentie-
eiwitten om ervoor te zorgen dat het niet wordt afgebroken door nucleasen. T-DNA
gaat naar nucleus en gaat integreren in de chromosomen. -> plantencel is
getransformeerd en gaat ongecontroleerd groeien + opines vormen.
- Dus nu wil men in T-DNA een gen van interesse stoppen om zo de plant aan te zetten
tot expressie van dit gen.
o Probleem: Ti-plasmide is zeer groot (200 kB), dus je kan dat zeer moeilijk
zomaar op T-DNA kloneren.
 Oplossingen: EXAMEN !
 Co- integratie: men vertrekt van plasmide waarop kloneringsplaats zit,
waar je gen gaat inkloneren. Klein stukje van T-DNA in plasmide
gebracht. Verder nog selectiemerkers en bacteriele sequentie pBR322
omdat het plasmide geconstrueerd werd in E.Coli.
Men kloneert gen van interesse op plasmide. Vervolgens
transformeren naar E. Coli. Dan E.Coli samenbrengen met
agrobacterium. Coli kan F-pilus vormen en gaat plasmide via pilus
overdragen naar agrobacterium. Eenmaal in agrobacterium komt
plasmide het natuurlijk voorkomende Ti-plasmide tegen -> homologe
recombinatie tussen klein stukje T-DNA in plasmide en T-DNA dat zich
bevindt op Ti-plasmide.
 2 homologe domeinen komen naast elkaar -> uiteinden worden
kruiselings aan elkaar gezet. -> plasmide van Coli volledig opgenomen
in het T-DNA van het Ti-plasmide van agrobacterium.
 Je bekomt gemodificeerde agrobacterium. Daarmee ga je
plantencellen infecteren. Als die T-DNA overdragen wordt gen van
interesse dus ook mee overgedragen. -> plantencellen genetisch
gewijzigd
 Binaire systeem: je vertrekt van binair plasmide = binaire factor,
bevat: left en right border van Ti-plasmide. Alle genen van T-DNA die
er normaal tussen zitten worden eruit gehaald zodat er plaats is om
een ander gen in te kloneren. Evt aantal selectiemerkers +
kloneringsplaats. Verder ook bacteriële sequentie.
Men brengt vreemd gen binnen in kloneringsplaats. Plasmide
overbrengen naar Coli. Die ga je dan opnieuw laten meeten met
agrobacterium. MAAR agrobacterium bevat Ti-plasmide zonder het T-
DNA, bevat wel virulentiegenen.
Via F-pilus komt plasmide in agrobacterium, die op zijn beurt
plantencellen gaat infecteren -> fenolische verbindingen gaan de
virulentiegenen activeren -> virulentie-eiwitten gaan op zoek naar T-
DNA maar vinden dit niet op het Ti-plasmide, maar vinden wel left en
right border op ander plasmide -> gaan daar knippen en materiaal
ertussen wordt dus vrijgesteld = gen van interesse.
Andere technieken voor transfer van genen in plantencellen
- Geminivirussen als vector voor vreemd DNA
o Plantenvirussen die gebruikt worden om vreemd DNA in plantencel binnen te
brengen.
o Bevatten 2 DNA-moleculen:
 DNA A: codeert voor manteleiwit en replicatiefunctie.
 DNA B: codeert voor virale infectie.
 Beide zijn nodig om een productieve virale infectie te bekomen.
o Manteleiwit kan men vervangen door vreemd gen zonder viruspoduct in
gedrang te brengen.
o Manteleiwit vervangen door gen van interesse. Vervolgens DNA molecule
openknippen -> lineaire molecule met in midden gen van interesse. Dit in
binaire vector steken. Vervolgens binaire plasmide binnnebrengen in
agrobacterium zoals hierboven. Agrobacterium gebruikt om plantencellen te
infecteren die al genetisch gemanipuleerd zijn en al DNA B bevatten.
Agrobacterium brengt dus DNA A binnen met gen van interesse -> virussen
geproduceerd die zich vermenigvuldigen en verspreiden -> in elke cel op den
duur gen aanwezig.

Biotechnologie les 9
- Bombardement met microprojectielen = biolischtisch transformatiemethode
o Mbv een bepaald apparaat partikeltjes gieten in plantencellen. Partikeltjes
zijn dan gecoat met DNA dat je in de plantencel wil binnenbrengen.
 o Start met plasmide waarop gekloneerd gen aanwezig is -> op kleine partikels
brengen (vaak wolfraampartikels/goudpartikels), daarop wordt DNA gecoat
mbv CaCl -> DNA precipiteren. Vervolgens gaat men partikels binnenbrengen
in gene gun (bullet kan afgevoerd worden doorheen toestel en wordt op
einde tegengehouden door bepaalde plaat die opening bevat. Partikels net
voor bullet aangebracht en worden mee afgeschoten. Wanneer bullet
tegenhgehouden worden, zullen partikeles door opening op plantenmateriaal
gebracht worden.
Vaak plantenmateriaal in vacuum gebracht omdat anders door wrijving van
de lucht kleine micropartikeltjes worden vertraagd
Pratikels geraken tot in cytoplasma van plantencellen.

Dierlijke cellen
Isolatie en kweek van dierlijke cellen
- Celmateriaal moeten geïsoleerd worden uit een orgaan/weefsel met behulp van
bepaalde enzymen, meestal trypsine. Die worden in cultuurfles gebracht = primaire
celcultuur. Cellen in fles laten groeien tot ze 1 mooie laag vormen.
o Confluentie: volledige oppervlakte van de fles is bedekt.
o Contact-inhibitie: wanneer cellen in elkaars buurt komen gaat hun
groeisnelheid vertragen
o Cellen terug losmaken met behulp van trypsine bv en cellen uitverdunnen, om
dan opnieuw in meerdere nieuwe flessen brengen
o Tot flessen ook weer volgegroeid zijn
o In de loop der tijd steeds meer cellen en flessen. In de loop der dagen meer
een meer celmateriaal. Tot het punt is bereikt dat cellen gaan beginnen
afbreken = celdood -> limiet aan de kweek. In sommige gevallen kunnen
cellen toch verdergroeien zonder dood te gaan = continue cellijn
Continue (onsterfelijke) celllijnen
- Niet meer onderhevig aan contact-inhibitie
- Mogelijkheid dat cellen over elkaar heen gaan groeien (monolaag overgroeien).
- Als je deze injecteerd in proefdieren, gaan ze tumoren veroorzaken.
- Je kan zo’n cellen bekomen door ze te bahandelen met carcinoge stoffen of met
kankerverwekkende virussen.
- In de industrie:
o HeLa cellijn
o CHO cellen vaakst gebruikt: afkomstig van chinese hamster.
Groeicondities van zoogdiercellen = zeer specifieke media
- Dierlijk serum moet toegediend worden om ervoor te zorgen dat cellen in leven
blijven. Echter heel wat nadelen:
o Bevat heel wat eiwit. Dus wanneer eiwit wordt gesecreteerd heel moeilijk te
zuiveren
o Heel duur
o Samenstelling is niet constant. Verschilt tussen verschillende loten. Dus groei
verschilt ook.
o Mogelijkheid tot contaminatie met virussen/mycoplasma. Wordt zeer grondig
op gescreent.
- Men gebruikt meer en meer serumvervangers
Groei van zoogdiercellen in suspensie
- Conventionele suspensiecultuur. Cellen gewoon in reactorvat brengen (kan
scheerkrachten veroorzaken!!). vandaar gebruik maken van air lift suspensor: lucht
houdt de cellen in suspensie.
o Batch proces: reactorvat vullen met medium en fermenteren tot gewenst
punt is bereikt
o Fed-batch proces: suspensie/deel van suspensie vervangen door vers
medium.
Echter niet vaak gebruikt doordat afvalstoffen zich opstapelen in het medium.
- Continuous flow suspensiecultuur = beter systeem. Constant medium toegevoegd en
cultuurmedium met cellen wordt afgevoerd
o Ook niet ideaal aangezien groeisnelheid gelijk moet lopen met snelheid
waarmee je verdunt.
- Perfusiecultuur
o Continue vers medium toevoegen, maar cellen behouden in het reactorvat
waardoor je makkelijker voldoende hoge celdensiteiten kan bekomen.
 Filters plaatsen waardoor cellen in reactievat worden weerhouden.
Zorgen dat filters niet verstopt kunnen worden
 Gebruik maken van microencapsulatie: cellen ingebed in een
bepaalde membraan die semipermeabel is: doorlaatbaar voor
voedingsstoffen, alfvalstoffen. In membraastructuur kunnen cellen
groeien tot vrij hoge celdensiteit
Membraan die cellen omgeeft zorgt ervoor dat cellen beschermd zijn
tegen scheerkrachten.
Men kan membranen gebruiken die eiwit van interesse kunnen
vrijgeven.
Nadeel:
 Kost heel veel
 Gevaar van contaminatie (aantal handelingen!)
 Niet elke cel laat toe zich in te kapselen.
 Kans op zuurstofgebrek door inkapseling
 Hollow fibers: gebruik maken van kleine cultuurflessen= cilinders die
aan binnenzijde kleine vezels bevatten die hol zijn. Doorheen vezels
loopt het cultuurmedium. Vezels zijn semipermeabel. Cellen worden
gekweekt tussen vezels en krijgen vanuit vezels nutriënten
aangeboden
 Nadeel: Er ontstaat gradiënt ontstaan over lengte-as van
cilinder
Groei van zoogdiercellen op een vast oppervlak
- Roller bottles = meest eenvoudig: cellen kweken aan binnenzijde van flessen. Aan
flessen klein beetje medium toevoegen rond zijn lengte-as laten ronddraaien
o Nadeel: heel veel flessen nodig om groot aantal cellen in kweek te houden.
- Fixed bed cultuur: reactor gevuld met allemaal kleine glazen bolletjes. Op bolletjes
worden cellen gekweekt. Door bolletjes op te stapelen, ga je volledig volume
reactorvat benutten.
 - Fluidised bed cultuur: cellen kweken in kleine poreuze deeltjes= partikels die holtes
bevatten -> poreuze deeltjes in reacorvat gebracht en door middel van lucht in
suspensie gehouden.
- Microcarrier cultuur: vergelijkbaar met fixed bed cultuur. Echter zéér fijne partikels
waardoor je ze kan kweken zoals bacteriën. Op partikels worden de cellen gekweekt.
Kleine deeltjes worden dan heel makkelijk in suspensie gehouden zonder dat je lucht
moet pompen door reactorvat.
- Homolytische drager: vaste structuren van keramisch materiaal die honinggraat-
structuur bezitten: niet zeer belangrijk in industrie.
- Allerlei varianten:
o Fibracel schijven: Kleine schijfjes dat bestaat uit kleine polyestervezels die
enige stevigheid hebben gekregen door een grid erop te plakken
polypropyleen. In holtes kunnen cellen gekweekt worden. Schijven kunnen in
grote massa’s opgestapeld worden in reactorvat -> ganse volume benutten
Transfectie van dierlijke cellen
- Terminologie:
o Transformatie van dierlijke cellen: de conversie van dierlijke cellen naar
tumorcellen.
o Transfectie: binnenbrengen van vreemd DNA in dierlijke cellen
 Transient = transfer van DNA is van voorbijgaande aard. Je brengt het
binnen maar kan niet stabiel aanwezig blijven. Spelen het dus terug
kwijt.
 Stabiele = plasmide DNA zal integreren in de chromosomen van de cel
en blijft dus permanent aanwezig.
o Transductie: virus-afgeleid materiaal binnenbrengen in dierlijke cellen.
- Als je DNA transfecteert in dierlijke cel komt het terecht in het cytoplasma ->
systemen nodig die DNA naar de nucleus brengen
- DNA dat je binnenbrengt gaat heel moeilijk integreren in de chromosomen ->
plasmide eerst knip geven en dan pas integreren
- Als integratie gebeurt in zones met hoge transcriptieactivitiet, kan je verwachten dat
gen van interesse sterk voor expressie zal zorgen.
Transfectietechnieken
- Chemische transfermethodes
o Ca-fosfaatmethode.
 DNA wordt gemengd met een fosfaat-buffer. Vervolgens CaCl
toevoegen -> neerslag van Cafosfaat en DNA. Deze neerslag kan je op
cellen pipeteren. DNA kan dan opgenomen worden aan de hand van
endocytose
o Transfectie met positief geladen polyplexen
 DEAE-dextraan: dextraanmolecule met op bepaalde plaatsen DEAE-
groepen die pos geladen zijn. DNA gaat dus makkelijk hiermee
associëren. Vervolgens op cellen brengen.
o Transfectie met lipoplexen of liposomen = lipofectie
 Liposomen opladen met DNA door lipideoplossing te mixen met DNA.
Door membraanstuctuur kan je die op cellen brengen en dit
membraan gaat dan samensmelten met plasmamembraan -> DNA-
 inhoud wordt vrijgegeven. Dit gebeurt aan zeer hoge transfectie-
efficiëntie + niet veel DNA nodig
- Fysische transfermethodes
o Micro-injectie
 Met zeer fijne naald DNA injecteren in de cel
 Nadeel: geen grote hoeveelheid cellen + enkel mogelijk voor grote
cellen (eicellen,…)
o Biolistische transfectie
 Gene gun dierlijke cellen transfecteren, MAAR moet in vacuüm, maar
dierlijke cellen kunnen helemaal niet tegen vacuüm.
o Electroporatie
o Nucleofectie = betere variant van electroporatie
 Nucleofector kan elektrische pulsen geven die voorgeprogrammeerd
zitten in toestel. Firma verkoopt oplossing in kits. Je moet oplossing
kopen die bedoeld is voor het materiaal dat je wil transfecteren. De
vloeistof in combinatie met pulsen leiden ertoe dat je cellen kan
transfecteren. Firma beweert zelfs dat DNA rechtstreeks in de nucleus
van de cel terechtkomt
 Enorme tijdswinst
 Gebruikt om heel moeilijk te transfecteren materiaal toch te
transfecteren.
Vectoren
- Dierlijke plasmiden = klassieke plasmide
o Bacterieel gedeelte: origine van replicatie + selectiemerker die werkt in Coli =
nodig om plasmide te kunnen construeren in Coli.
o Eukaryotische sequenties: promotor die werkt in dierlijke cellen + gen van
interesse + eventueel transcriptieterminator + eventueel andere
toevoegingen.
o Promotors
 Constitutieve promotors: geven continue expressie = zeer krachtig
 Induceerbare promotors:
 Promotors die reageren op bepaalde niet-fysiologische
omstandigheden
 Op natuurlijke wijze induceerbaar
 Artificieel induceerbare promotorsystemen: Tet-off en tet-on
systeem
Gebaseerd op tetracycline resistentie operon van E.Coli. In coli
bepaalde promoter gevolgd door operator en daarachter
genen die coderen voor resistentie tegen tetracycline. Voor
promotor bepaald gen dat aanleiding geeft tot repressoreiwit
dat kan binden op operator waardoor transcriptie geblokkeerd
is = gekend.
Als je tetracycline toedient gaat dit binden op repressor eiwit
waardoor het terug loskomt van operator -> wel transcriptie.
= principe van lac operon
Er bestaan nu dierlijke cellen (kan je aankopen) met een kern
met daarin construct die promotor bevat, gevolgd door N-
 terminaal gedeelte van tetracycline repressor eiwit, gekoppeld
aan VP16-eiwit = transcriptionele activator. Door deze 2 aan
elkaar te koppelen maak je dus fusie-eiwit = trans-activator:
gaat dus transcriptie stimuleren:
Fusie-eiwit wordt door de cellen continue aangemaakt.
Biotechnologen hebben die cellen in kweek. We maken
plasmide met gen van interesse met daarvoor minimale CMV
promoter (mist bepaalde sequentie waardoor deze niet
constant aanstaat). Om deze aan te zetten zit er voor promotor
TRE-element: bevat operatorregio waar tetR eiwit op kan
binden. Dit plasmide gaat men transfecteren in dierlijke cellen
-> fusie-eiwit dat door cellen continue wordt gevormd gaat
binden op TRE-element. Hierdoor wordt promotor actief.
Als je aan deze cellen tetracycline/doxycyline geeft gaat dat
binden op TetR gedeelte waardoor dat loskomt van operator
-> geen transcriptie. = tet-off
Bij tet-onn heeft men 4 mutatie gebracht in tetR gedeelte
waardoor fusie-eiwit niet meer kan binden op TRE-element
tenzij je doxycyline toedient. Dan gaat dit binden op fusie-eiwit
en gaat het dus wel binden op TRE -> wel transcriptie.
- Virale vectoren
o Redenen:
 Zeer goede promotoren die ook werken in dierlijke cellen
 Vreemd gen wordt massaal geproduceerd
 Virale DNA gaat stabiel integreren
 Virussen hebben vaak efficiënte transfectie-mechanismen
o Simian virus 40
 Cirkelvormig DNA-genoom
 Cyclus: virus gaat adhereren aan dierlijke cel, gaat binnendringen in de
cel. In de cel ontmanteling van het virus. DNA van het virus gaat naar
de kern van de cel waar transcriptie gebeurt.
Eerst vroege promotor: die aanleiding geeft tot T-antigenen: nodig
voor replicatie van het virale genoom -> herkennen ori en gaan
genoom van het virus massaal kopiëren -> in de cel massaal veel
kopijen van oorspronkelijke DNA.
Nadien komt late promotor actief: zorgt voor structuur van
manteleiwit -> nodig voor vorming nieuwe viruspartikels.
Cel gaat afsterven en partikels komen vrij.
 In de biotechnologie: ze gebruiken DV40 virus dat een defect heeft
waardoor vroege promotor niet actief is. Late promotor is wel intact.
Plasmide met ipv late promotor/structuureiwitten het gen van
interesse. Dit gebeurt in E. Coli: dus eerst bacteriële sequentie op
plasmide moeten zetten. Als gen van interesse is ingebracht gaat men
bacteriële sequentie weer verwijderen. Vector wordt terug gesloten ->
vector waarin structuureiwitten zijn vervangen door vreemde gen.
Alle twee de plasmiden moeten dus in dierlijke cel gebracht worden
om aanleiding te geven tot nieuwe viruspartikels.
 Recombinante virussen kan je gebruiken om massaal cellen te
transfecteren.
COS-cellen: cellen afkomstig van de nieren van apen waarin men een deel van het SV40 virus
heeft ingebracht, namelijk de vroege promoter + DNA dat codeert voor T-antigenen. Cellen
zijn dus in staat T-antigenen te vormen, er kan echter geen replicatie gebeuren aangezien de
ori niet functioneel is. Men maakt plasmide waarop functioneel ori van sp2 zit. Verder ook
gen van interesse en krachtige promotor. Dit plasmide binnenbrengen in COS-cellen via
klassieke methodes. Eenmaal in de cel herkennen de ori waardoor ze plasmide massaal gaan
repliceren -> 1000’en kopijen. Op elk plasmide zit krachtige promotor die aanleiding kan
geven tot expressie van gen van interesse.
- Nadelen:
o Werkt alleen maar in apencellen
o Lengte van DNA dat je er kan opbrengen is beperkt (ong 2500 nucleotiden).
Bij een groter gen wordt plasmide veel groter en kan het niet meer
ingekapseld worden.
o Chromosoomafwijkingen vastgesteld
- Tegenwoordig andere systemen
o Vaccinia virus: men probeert vreemde gen op het genoom van virus te
stoppen. Genoom is echter zeer groot, waardoor het meestal niet lukt
 Andere oplossing
 Vaccinia virus gemaakt die het T7 RNA-polymerase kunnen maken. Extra
stukje DNA dat codeert voor T7 RNA-polymerase, staat onder controle van
een vaccinia promotor. Men gaat recombinante vaccinia virussen cellen laten
infecteren. Vervolgens plasmiden maken met daarop gen van interesse en
daarvoor een T7 promotor site: sequentie die herkend door T7 RNA-
polymerase. Dit binnenbrengen via transfectie. Eenmaal in de cel zal T7 RNA-
polymerase promotor plaats herkennen wat aanleiding zou geven tot
transcriptie van het vreemde gen

Biotechnologie les 10

o Baculovirus: virus dat alleen maar insectencellen infecteerd.

 Langwerpig capside waarin dubbelstrengg DNA zit. Je kan meerdere
nucleocapsiden naast elkaar is, die omgeven wordt door lipide-
enveloppe. Viruspartikels vaak ingebed in polyhedrine-mantel =
polyhedron.
 Werkwijze: polyhedra worden opgegeten door insecten en virussen
komen in darmsysteem terecht. Daar gaat polyhedrine-mantel binden
en virruspartikels worden vrijgesteld. Die partikels omgeven door
lipidemembraar zijn in staat te versmelten met plasmamembraan van
de cel aanwezig in het darmsysteem. Vervogens komen nucleocapside
in het cytoplasma van de cel terecht, worden naar de nucleus
gebracht. In de nucleus vindt de replicatie/transcriptie plaats
waardoor nieuwe nucleocapside gevormd worden. Enkele hiervan
gaan de cel verlaten via budding om andere cellen te gaan infecteren.
Op den duur hele insect aangetast.
 Op moment dat nucleocapside gevormd wordt, gaat massaal
polyhedrine-eiwit gevormd worden in de nucleus. Nucleocapsiden
gaan dus ingebed worden in polyhedrine-matrix. Wanneer cel afsterft
komen deze vrij.
Producite poly-hedrine wordt zo massaal geproduceerd dat het een
heel krachtige promotor moet zijn. Genoom van virrus is echter veel te
groot.
 Oplossing: DNA isoleren uit virussen. In DNA zit krachtige polyhedrine
promotor gevolgd door polyhedrine-gen, met daarachter tt. Volledige
expressiecassette eruit geïsoleerd en op gewoon plasmide gebracht.
Polyhedrine-gen vervangen door gen van interesse. Daarna
transfecties uitvoeren waarbij men plasmide met gen van interesse
samen met normale baculovirus DNA naar insectencellen heeft
gekloneerd = co-transfectie. Als 2 DNA moleculen zijn opgenomen door
cellen gaat infectiecyclus van virus in werking treden -> viruspartikels
gevormd en op den duur vrijgesteld uit afstervende cellen.
 Plaques in celcultuur = lege zone van afgestorven cellen die
baculovirussen hebben vrijgegeven.
Aan hele lage frequentie: 2 DNA-moleculen gaan dubbele homologe
recombinatie uitvoeren met elkaar. Op die manier crëer je
recombinant baculovirus DNA dat niet meer polyhedrine-eiwit bevat,
mar wel eigen gen van interesse, onder controle van polyhedrine-
promotor. Deze geven ook plaques die er lichtjes anders uitzien dan de
gewone plaques. Uit deze plaques isoleert men recombinante
viruspartikels. Die gebruiken om nieuwe cellen te infecteren.
o Retrovirussen: centraal nucleocapside met daarin RNA. Naast RNA bevinden
zich ook eiwitten in capside. Nucleocapside op zijn beurt omgeven door
lipide-membraan met eiwitten die belangrijk zijn om infectiecyclus te initieren
 Infectiecyclus: met behulp van eiwitten die uit membraen steken, gaan
virussen absorberen aan een receptor die voorkomt op de cellen die
geïnfecteerd moeten worden. Vervolgens gaat membraan van virus
versmelten met plasmamembraan OF via endocyose. In beide gevallen
komt centraal nucleocapside vrij. Reversed transcriptiase gaat RNA
omzetten naar dsDNA. Capside wordt naar celkern gevoerd -> dsDNA
wordt ingebouwd in de chromosomen van de cel. Hievoor speciaal
enzyme nodig = integrase dat mee in capside zit. Eenmaal in de
chromosomen noemt men dat een provirus. Vervolgens gaat
transcriptie plaatsvinden van virale DNA. Dit kan gebruit worden voor
translatie, of het wordt rechtstreeks naar de celmembraan gevoerd
om daar nieuwe viruspartikels aan te maken.
CEL STERFT NIET AF!
 Provirus wordt geflankeerd door LTR-sequenties, met daartussen drie
sets van genen, gag, pol en env die aanleiding kunnen geven tot
verschillende eiwitten die structuur van virus kunnen maken. Linkse
LTR heeft promotoractivitiei en gaat aanleiding geven tot transcriptie
 types van transcripten obv alternatieve splicing
  Lange transcript gaat in 95% van de gevallen eiwitten opleveren die
manteleiwitten gaan vormen. In 5% van de gevallen start translatie
ergens anders en ga je reversed transcriptase en integrase vormen.
 In de biotechnologie: men vertrekt van plasmide met daarop de 2 LTR
sequenties gekloneerd. De drie genen ertussen verwijdert men, maar
in de plaats zit daar gen van interesse. Dit gaat men trasfecteren naar
de cellen: packaging cellijn: cel die al provirus bevat: provirus dat alle
zaken kan vormen maar het kan niet zijn eigen RNA verpakken omdat
er ee, bepaald packaging signaal ontbreekt. Er worden wel
viruspartikels vrijgegeven maar die gaan RNA verpakken dat afkomstig
is van plasmide dat je hebt binnengebracht. Op RNA zit dus vreemde
gen van interesse. Je bekomt recombinante retrovirussen. Deze
virussen gebruikt men om cellen te infecteren. RNA omgezet in
dsDNA, gaat integreren in chromosomen, vervolgens expressie vanaf
LTR.
Selectie van recombinante zoogdiercellen na transfectie
- Gen coderend voor thymidine kinase: enzyme betrokken bij DNA synthese.
o Nucleotiden kunnen volledig door de cel zelf worden gemaakt uitgaande van
bepaalde precursoren. Dit tenzij dierlijke cellen worden gekweekt in medium
dat aminopferine bevat. Dit blokkeert beide pathways. Dierlijke cel heeft
back-up systeem om toch nog nucleotiden te vormen. Als er hypoxanthine en
thymidine aanwezig zijn kunnen de nucleotiden nog altijd gevormd worden.
o Er bestaan dierlijke cellen die defect hebben in thymidine kinase. Als je die
cellen zou groeien in cultuurmedium met aminopferine, hypoxanthine en
thymidine, kunnen de cellen niet groeien, tenzij je plasmide binnenbrengt
waarop gen voor thymidine kinase zit. Op die manier kan je selectie doen
voor cellen die dat plasmide hebben opgenomen.
o Meerdere selectiemogelijkheden: zie tabel
o Plamide dat APH gen bevat: codeert voor enzym dat G418 inactiveerd. Na
transfectie cellen tijd laten staan om de cellen de tijd te geven om enzyme tot
expressie te brengen. Als je geen G418 toedient, gaat minder dan 1% van de
cellen nog plasmide bevatten. Als je G418 toedient aan medium, ga je meeste
cellen doden (alle cellen die delen, en cellen die plasmide niet bevatten) en
krijg je beperkte populatie van cellen die resistent zijn tegen G418. Op die
manier stabiele transfectanten.
Gen amplificatie: ter bevordering van genexpressie: artificieel kopijenaantal verhogen, NA de
transfectie.
- Dihydrofolaat reductase = DHFR: enzyme dat dihydrofoliumzuur omzet naar
tetrahydrofoliumzuur= actieve vorm die nodig is voor DNA-synthese.
o Methotrexaat remt DHFR enzyme -> veel gebruikt in oncologie. Bij gebruik
van Methotrexaat zijn er cellen die resistent zijn tegen Methotrexaat.
Vastgesteld dat in het DNA van resistente cellen, het DHFR gen meerdere
keren wordt vermenigvuldigd. Niet alleen gen, maar ook gebieden links en
rechts worden meegekopiëerd. -> meerdere DHRF enyme waardoor ze
makkelijker methotrexaat kunnen weerstaan.
o Gen gestoken vlak naast DHFR-gen.
 - Principe gen amplificatie
o Men gebruikt cellen die geen DHFR gen bevatten. Men transfecteerd die met
plasmide die DHFR gen wel bevatten met vlak daarnaast gen van interesse.
Cellen worden dus DHFR-positief, waardoor cellen in staat zijn te groeien op
medium zonder nucleoside. Eenmaal getransfecteerd cellen in kweek houden.
Nadien lage dosis methotrexaat toevoegen -> meeste cellen gaan afsterven.
Echter beperkt aantal cellen dat overleeft. Die gaat men verder kweken en
vervolgens dosis methotrexaat verhogen. Opnieuw meeste cellen afsterven.
Verder kweken en dosis nogmaals verhogen. Zelfde verhaal. Nieuwe cellen
hun DNA bevatten meer dan 100 kopijen van oorspronkelijke DNA.
Therapeutisch gebruikte eiwitten
- Weefsel plasminogeen activator:
o Gevormd in endotheelcellen van bloedvaten. Verschillende plaatsen S-
bruggen en glycosidatie -> je kan het eiwit niet vormen in Coli.
o Eiwit is nodig om plasminogeen te activeren -> omgezet tot plasmine: lost
bloedklonters op.
o Alteplase: gemaakt in GHO-cellen.
 Werkwijze: bevat 2 restrictieplaatsen. Men knipt materiaal ertussen
eruit en kloneert dit in plasmide achter promotor. Dit transformeert
men naar GHO-cellen. Men gebruikt DHFR als selectiemerker.
o Reteplase: verkorte vorm die niet geglycolyseerd is

Transgene dieren
Transgene organismen= dieren die een extra gen bevatten = trans-gen. Daardoor hebben ze
bepaalde extra eigenschappen. Vreemde gen zit zowel in voorplantingscellen als in
somatische cellen. Niet verwarren met gen-therapie (enkel extra gen in somatische cellen)
- Introductie van vreemde genen in dieren
o Directe micro-injectie van DNA in de pro-nucleus van bevruchte eicellen.
 Men vertrekt van vrouwelijke muis die net bevrucht is geweest. Je
haalt hier de net bevruchte eicel eruit: bevat nog 2 afzondelijke
pronuclei. Vervolgens gaat men micro-injectie doen van vreemd DNA
in 1 van de 2 pronuclei. Meestal kiest men voor mannelijke aangezien
die iets groter is.
 Vervolgens die cel in vitro verder kweken tot twee-cellig stadium. Dan
embryo inplanten in fostermoeder: muis die pseudo-zwanger is
gemaakt door omgang met gevasectomeerde mannetjes: door
paargedrag gaan ze embryo’s minder makkelijk afstoten. In
fostermoeder gaat men 10-20 van die embryo’s inplanten. Fractie zal
voldragen worden -> pups. Deel van die pups gaat drager zijn van
transgen = founders
 Founders gaat men kruisen met wild-type muis. Omdat elke founder
een unieke muis is, waardoor men de founders niet onderling kan
laten kruisen. Men bekomt G1-generatie met 50% kans op
dragerschap van transgen.
 Vervolgens gaat men 2 dragers onderling verderkruisen -> G2
generatie met 75% dragerschap en 25% homozygoot voor transgen.
 o Retrovirale infectie
 Men vertrekt van embryo’s die men blootstelt aan vrij
geconcentreerde stock van retrovirussen die gen van interesse in
embryo gaat binnenbrengen.
 Veel bij kippen gebruikt.
 Nadeel: vooplantingscellen worden zelden geïnfecteerd. + limiet op
DNA die kan worden binnengebracht
 Niet zo frequent gebruikt
o Embryonale stamcellen: cellen die nog niet gedifferentieerd zijn. Je kan deze
groeifactoren geven die dan groeien tot bepaalde cellen
 Men vertrekt van vrouwelijke muis waar men eicel uithaalt die men in
vitro verder kweekt tot blastocyt stadium. Vervolgens huiruit
stamcellen halen en in vitro verder kweken. In vitro stamcellen
getransfecteerd met DNA van interesse volgens klassieke methoden.
 Tweede muis die andere vachtkleur heeft. Hieruit haalt men bevruchte
eicel en men injecteerd in die eicel de getransfecteerde embryonale
stamcel.
 Embryo’s inplanten in fostermoeder. Zelfde zoals hierboven.
- Pharming
o Lactoferrine: bij behandeling van bepaalde infectie
o Menselijk lactoferrine gekoppeld aan een signaalsequentie voor
melkproteïnen en daarvoor promotor gebruikt die enkel actief is in
melkklieren van de koe zodanig dat koe enkel in melkklieren het eiwit gaat
produceren en gaat uitscheiden in de melk.

Detectie recombinante eiwitten

Detectie van eiwitten in oplossing: hoeveel eiwit en hoe zuiver ik dit?
- Methode van Bradford = Coomassie
o Eiwit toevoegen aan coommassie in een zuur milieu. Door associatie
veranderen spectrofotische eigenschappen. Bruine kleur -> blauwe kleur.
Meten bij bepaalde golflengte.
o Eiwitten moeten minstens 3kDa groot zijn.
o Nadelen:
 Geeft een niet volledig lineaire standaardcurve
 De binding van coommassie met eiwit is afhankelijk van bepaalde
aminozuren. Eiwitten rijk aan arginine binden beter dan andere
eiwitten. Naargelang eiwit kan je andere standaardcurve bekomen.
 Detergenten mogen best niet aanwezig zijn aangezien ze coomassie
gaan percipiteren
 Eiwitten soms niet oplosbaar in coomassie
- Bicinchoninic adic (BCA) eiwitassay
o Eiwit zal Cu2+ reduceren naar Cu1+. Cu1+ gaat interageren met 2 BCA-moleculen
en vormt complex. Dit complex is purper gekleurd.
o Voordelen
 Wel compatibel met meeste detergenten
 Lineair bereik is beter
 Variatie tussen eiwitten onderling is veel kleiner.
  Hogere gevoeligheid
o Nadelen
 Als er stoffen aanwezig zijn die koper gaan reduceren, krijg je vals
signaal/valse kleuring
 Als er stoffen aanwezig zijn die koper kunnen cheleren, gaan deze de
kleurreactie afremmen
 Vrije AZ’n kunnen interageren met BCA -> realiseren kleuring.
- Fluorescamine methode
o Kan interageren met aminogroepen, wat voor fluorescentie zorgt = maat voor
hoeveelheid eiwit.
 Werken met buffers die geen vrije aminogroepen bevatten
Polyacrylamide geleketroforese: vaak zijn de eiwitten niet in zuivere vorm aanwezig. Dan is
het niet aangeraden om Bradford of DCA toe te passen.
- Systeem waarbij men eiwitten gaat scheiden volgens grootte.
- 2 mogelijkheden
o Onder natieve condities: eiwitten hebben oorspronkelijke opvouwing
o Onder denaturerende condities: meestal gebruikt. Eiwit volledig ontvouwen
en door toevoeging van SDS wordt molecule negatief geladen -> scheiden
volgens grootte
- Toepassingen
o Kijken naar de zuiverheid van het mengsel
o Moleculair gewicht inschatten
o Nagaan of er degradatie optreedt. Zijn er afbraakproducten te zien?
SDS polyacrylamide gelectroforese
- Eiwitten opnemen in een buffer met
o Reducerend reagens: gaat zwavelbruggen verbreken
o SDS: bindt op eiwitten en daarbij krijgen eiwitten volledige negatieve lading
door de fosfaatgroepen. -> SDS mantel.
o Kan gescheiden worden over polyacrylamide gel. Negatief geladen eiwitten
gaan migreren naar positieve pool.
o Eiwitbanden zijn niet zichtbaar met blote oog -> zichtbaar maken door
kleurstoffen.
 Coomassie Briljant Blue R-250: kleurstof die op welbepaalde AZ’n
binden. Als gel gelopen is, in kleurstof leggen. Ganse gel ziet dan
volledig blauw. Vervolgens gel ontkleuren met methanol en azijnzuur
-> kleurstof dat niet gebonden is wegwassen.
 Zilverkleuring: zilvernitraat gaat binden op eiwitten. Vervolgens zilver
dat gebonden is reduceren tot elementair zilver door middel van
formaldehyde. Hierdoor krijg je bruine neerslag.
Techniek is veel gevoeliger.
Het is echter niet duidelijk of eiwit van interesser er wel inzit. Hiervoor
gaat men western blotting gebruikt
Biotechnologie les 11
Western blotting
- Eerst polyacrylamide lopen, vervolgens eiwitten transfereren naar een membaan
(meestel nylon of nitrocellulosemembraan). Dit membraan bevat polaire groepen
waarop eiwitten aspecifiek kunnen binden.
- Positieve en negatieve pool aanleggen. Door aanwezigheid van SDS zijn eiwitten
negatief geladen en worden dus aangetrokken door positieve pool -> transfer van
eiwitten vanuit gel tot op membraan.
- Vervolgens neemt men mebraan waarop zich de verschillende eiwitbanden
bevinden. Men gaat membraan blokkeren = een neutraal eiwitmengsel = serum
albumine/melkpoeder brengen op membraan om alle niet bezette plaatsen op te
vullen. Blokkering omdat we in volgende stap antilichaam gaan gebruiken die gen van
interesse gaat herkennen en binden. Moest blokkering niet gebeurt zijn, kan
antilichaam aspecifiek binden op membraan.
- Op antilichaam enzyme koppelen dat bepaald substraat kan omzetten in gekleurd
product ofwel producten gebruiken zoals luminol: zal door peroxidase omgezet
worden in ander product waarbij licht wordt gecrëerd -> lichtsignaal detecteren.
- Meestal gebruikt men een primair antilichaam dat eiwit herkent. Vervolgens tweede
antilichaam dat eerste antilichaam herkent. Dit tweede is gekoppeld met enzyme. Dit
doet men om economische redenen. Koppeling van enzym op antilichaam is
bijzonder duur. Antilichamen kopen waarop geen enzym zit en 1 antilichaam kopen
waarop je enzyme koppelt -> veel goedkoper.
- Derde mogelijkheid: sec antilichaam koppelen aan biotine. Biotine heeft zeer hoge
affiniteit voor streptamidine. Dit heeft 4 bindingsplaatsen voor biotine. Zo kun je 3
enym-moleculen bekomen waardoor gevoeligheid met factor 3 verhoogt.

Zuivering recombinante eiwitten

Chromatografische technieken
- Ionenuitwisselingschromatografie: eiwitten scheiden op basis van lading
o Hoge resolutie: mooi gescheiden pieken
o Principe: kolom met allemaal positief geladen groepen. Hierop kan je eiwitten
binden die negatief geladen zijn. Ook omgekeerd mogelijk. Dit doe je in lage
zoutconcentraties. Als binding gerealiseerd is eiwitten van kolom elueren
door zoutconcentratie te verhogen of door de pH te veranderen (netto lading
is hiervan afhankelijk).
- Hydrofobe interactiechromatografie: scheiden op basis van het hydrofobe karakter
o Principe: eiwitten laten binden op kolom in hoge concentratie zout en elueren
in lage concentratie zout.
o Ideale vervolgstap op ionenchromatografie.
- Affiniteitschromatografie = eiwitten scheiden op basis van de mogelijke binding met
een ligase.
o 2 voorwaarden
 je moet ligand hebben dat kan bindne met eiwit
 ligand moet gekoppeld kunnen worden op kolom
 o principe: eiwitten over kolom brengen in conditie die meest optimaal is om
binding te realiseren. Alle niet gebonden moleculen zullen weggewassen
worden
Vervolgens conditie zodanig wijzigen zodat binding verbroken wordt.
o Liganden:
 Concanavaline A = lectine dat mannoses kan binden -> eiwitten
zuiveren die suikerstructuren dragen: geglycoliseerde eiwitten. Alle
niet geglycoliseerde eiwitten ben je meteen kwijt
 Benzamidine
 Proteïne A en proteïne G: gebruikt om antilichamen te zuiveren.
 Antilichamen zelf. Je moet beschikken over antilichaam dat eiwit van
interesse herkent. Geeft hoogste efficiënteie. Geft in theorie enkel
eiwit van interesse. Indien er geen antilichaam beschikbaar is, zou je
eiwit kunnen koppelen aan bepaalde tag: aan C-terminus/ N-terminus
aantal AZ’n aanhangen die herkent kunnen worden door bepaald
antilichaam dat commerieel beschikbaar is.
Nadeel: stretch van AZ’n zit vast aan eiwit -> kan invloed hebben.
 Geïmmobiliseerde metaalionen: matrix die men kan gebruiken om
eiwitten te zuiveren die stretchen bevatten van histidines/(cysteïnes).
Histidines gaan binden ter hoogte van nikkel. Op die manier selectief
bepaalde eiwitten zuiveren. Histidine-stretch kan je aanbrengen waar
je wil.
- Size exclusion chromatografie/gelfiltratie:
o Kolom die allemaal bolletjes bevat bestaande uit dextraan die poriën bevatten
van wel bepaalde diameter. In poriën kan je kleine eiwitten binnenbrengen,
de grote passen hier echter niet in.
o Grote eiwitten komen dus als eerst van kolom.
o Techniek van lage capaciteit: je moet eiwitten in heel dunne laag aanbrengen
bovenaan de kolom.
o Toepassingen
 Moleculair gewicht bepalen adhv geijkte gelfiltratie kolom.
 Eiwitten ontzouten/zuiveren van andere kleine moleculen.
 Monomeren scheiden van dimeren en trimeren (ENKEL HIER)
Mogelijke onzuiverheden
- Microbiële onzuiverheden
o Gevolgen
 Kan patiënt infecteren.
 Eiwitproduct kan worden afgebroken
o Om dit te vermijden eindproduct steriliseren door filtratie doorheen een 0,22
um filter. Men gaat eiwitten produceren in zo steriel mogelijke
omstandigheden.
- Virale onzuiverheden
o Ofwel van besmet serum ofwel van dierlijke cellen waarmee je werkt.
 - Pyrogenen
o Exotoxines
o Endotoxines
 Lal-test: lysaat van bloedcellen van tekenkrab. In extract zit
proenzyme dat door endotoxine geactiveerd word. Coaguline kan
klonteren. Als er klontervorming optreedt, is het preparaat
gecontamineerd.
- Nucleïnezuren
- Andere proteïen
- Chemische contaminanten
Excipiënten in parenterale formulaties van biotech producten
- Anti-adsorptie en anti-aggregatiemiddelen
o Eiwitten kunnen deels ontvouwen en hun hydrofobe delen exposeren naar de
buitenkant toe. Dit vooral ter hoogte van interfase: het contact met de lucht
en glasrand van beker/fles, alsook de naald die er men zou instoppen.
Vervolgens kunnen eiwitten met elkaar aggregeren, kunnen loskomen van
interfase, kunnen grotere aggregaten vormen en kunnen neerslaan.
o Toevoegen albumine: gaat aan interfases plakken
o Aminozuren toevoegen: interfereren met fysische krachten die nodig zijn om
aggregatie te realiseren.
o Toevoegen surfactants (SDS) heeft lange hydrofobe staart die kan binden met
hydrofobe delen eiwit waardoor eiwit niet gaat aggregeren.
- Anti-oxidanten
o Eiwitten kunnen oxideren door contact met zuurstof -> lucht vervangen door
gas
o In aanwezigheid van zware metalen wordt ascorbinezuur proaxidans
- Bewaarmiddelen
- Osmotische stoffen om toniciteit aan te passen. Zouten/suikers toevoegen.
o Kunnen aggregatie veroorzaken,…
o Compatibel met eiwit???
Vriesdooien: om eiwitten lange tijd te kunnen bijhouden (minimum 2 jaar). Dit is niet
mogelijk in waterige oplossing.
- Water onttrekken uit eindapparaat door sublimatie
o Temperatuur doen dalen waardoor vloeibare fase wordt omgezet in vaste
fase
o Primaire droging = druk laten dalen, temperatuur blijft gelijk. Al het niet
gebonden water gaat verdwijnen.
o Secundaire droging= temperatuur lichtjes laten opvoeren, druk blijft weer
gelijk. Van vaste vase -> gasfase = sublimatie. Water dat gebonden is wordt
verwijderd.
- Voor elke eiwit apart geoptimaliseerd.
o Bij primaire droging toch potje lichtjes verwarmen waardoor bovenaan een
gasfase wordt gecrëerd. Bovenaan bevindt zich condensor die op zeer lage
temp staat waardoor damppartikels hiertegen gaan condenseren -> ijslaag op
condensor. Hoe meer warmte, hoe meer sublimatie.
 Gevaar: condensor kan niet volgen -> dampdruk gaat toenemen. Kans
bestaat vloeistof gaat neervallen terug op product = collapse.
o Traag invriezen en snel ontdooien -> zo creëer je grote kristallen die minder
makkelijk eiwit kunnen beschadigen.
o Zouten kunnen precipitatie veroorzaken. Hoe meer zout, hoe lager activiteit.