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 [UCI]I804:11062-200000499922

석사학위논문

Hydroxy-2-naphthohydrazide 유사체의
합성 및 프리온 단백질 응집 저해 효과

Synthesis and anti-prion aggregation activity of

Hydroxy-2-naphthohydrazide analogues

김 예 은

한양대학교 대학원

2021년 8월
 석사학위논문

Hydroxy-2-naphthohydrazide 유사체의
합성 및 프리온 단백질 응집 저해 효과

Synthesis and anti-prion aggregation activity of

Hydroxy-2-naphthohydrazide analogues

지도교수 남 태 규

이 논문을 약학 석사학위논문으로 제출합니다.

2021년 8월

한양대학교 대학원

약학과

김 예 은
 목 차

그 림 목 차 ................................................................................................................................... ⅲ

표 목 차 ......................................................................................................................................... ⅳ

Scheme 목 차 .................................................................................................................................. ⅴ

약 어 ............................................................................................................................................... ⅵ

국문요지 ....................................................................................................................................... ⅷ

제 1 장 서론 .................................................................................................................................. 1

1.1 프리온 (Prion) ........................................................................................................... 1

1.1.1 프리온 단백질 (Prion protein) ........................................................................... 1

1.1.2 프리온 질병 (Prion disease) ............................................................................ 2

1.1.3 프리온 치료제의 개발 현황 ............................................................................ 4

1.2 연구 배경 ..................................................................................................................... 8

1.3 연구 목표 ................................................................................................................... 12

제 2 장 결과 및 토의 ................................................................................................................ 14

2.1 유도체 합성 ...................................................................................................... 14

2.1.1 NTG-G-014 유사체의 합성 ................................................................. 14

2.1.2 Hybrid 구조의 합성 .............................................................................. 24

2.2 PrP amyloid 형성 억제 효과 ........................................................................... 26

제 3 장 실험 방법 ...................................................................................................................... 29

3.1 기기 및 시약 ............................................................................................................. 29

ⅰ
 3.2 실험 방법 ................................................................................................................... 31

제 4 장 결 론 .............................................................................................................................. 53

제 5 장 참 고 문 헌 .................................................................................................................. 54

ABSTRACT ................................................................................................................................... 57

감사의 글 ...................................................................................................................................... 58

ⅱ
 그 림 목 차

Figure 1. PrP 구조 변화 ................................................................................................................. 2

Figure 2. PrPC의 구조 ..................................................................................................................... 4

Figure 3. PrPC를 타겟으로 하는 프리온 치료제 개발 전략 .................................................... 5

Figure 4. PrPC를 타겟으로 하여 anti-prion 활성을 보인 chemical scaffold의 구조 .............. 7

Figure 5. GN8, MC, CJP14, NPR-053의 구조 ................................................................................ 8

Figure 6. SGI-1027과 NTG-G-012, NTG-G-14의 구조 ................................................................ 8

Figure 7. 선행연구에서 발굴된 hydroxy-2-naphthohydrazide의 anti-prion 활성 ....................11

Figure 8. (a) NTG-G-014 구조 modification (b) SGI-1027과의 hybrid 합성 ........................... 12

Figure 9. NTG-G-014의 naphthalene 고리에서 C(1), C(4) 위치 .............................................. 15

Figure 10. PrP amyloid 형성 저해 효과 활성 평가 .................................................................. 26

Figure 11. PAFA assay를 통해 도출한 구조-활성 상관 관계 ................................................. 28

ⅲ
 표 목 차

Table 1. 인간 및 동물에서 발견되는 프리온 질병 ................................................................... 3

Table 2. PrPC를 타겟으로 하여 anti-prion 활성을 보인 chemical scaffold .............................. 6

Table 3. 중간체 1a, 2a, 3a의 합성조건 ....................................................................................... 16

Table 4. (thio)semicarbazide 유사체 G-81,83,86의 합성 조건 ................................................. 17

Table 5. reduced carbonyl 유사체 합성을 위한 leaving group 치환 반응 조건 .................... 22

Table 6. reduced carbonyl 유사체 합성을 위한 reduction 반응 조건 .................................... 23

ⅳ
 Scheme 목 차

Scheme 1. NTG-G-014의 절단 유사체 합성 ···························································································14

Scheme 2. (thio)semicarbazide 유사체의 합성 ·························································································16

Scheme 3. non-chloride 유사체의 합성 ······································································································17

Scheme 4. phenyl-based 유사체의 합성 ·····································································································18

Scheme 5. 4-hydroxynaphthalene 유사체의 합성 ····················································································19

Scheme 6. reduced carbonyl 유사체의 합성을 위한 시도 ··································································20

Scheme 7. 대체 조건을 이용한 reduced carbonyl 유사체의 합성을 위한 시도 ······················23

Scheme 8. hybrid 유사체의 합성 ··················································································································25

ⅴ
 약 어

AcOH Acetic acid

AFM Atomic force microscope
BEt3 Triethylborane
BH3 borane
BSE Bovine spongiform encephalopathy
CBr4 Carbon tetrabromide
CNS Central Nervous System
CJD Creutzfeldt-Jacob disease
Cs2CO3 Cesium carbonate
DCM Dichloromethane
DMF Dimethyl formamide
DMSO Dimethylsulfoxide
ER Endoplasmic Reticulum
EtI Ethyl iodide
Et2O Diethyl ether
FFI Familial fatal insomnia
EtOAc Ethyl acetate
EtOH Ethyl alcohol
GPI Glycophosphatidylinositol
GSS Gerstmann–Sträussler–Scheinker syndrome
LiAlH4 Lithium aluminum hydride
MsCl Methanesulfonyl chloride
HATU Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium
HBr Hydrobromic acid
HCl Hydrogen chloride
HRMS High resolution mass spectrometry
KHCO3 Potassium bicarbonate
KOH Potassium hydroxide
MeCN Acetonitrile

ⅵ
 약 어 (계속)
MeOH Methanol
mp Melting point
MgSO4 Magnesium sulfate
NaBH4 Sodium borohydride
NaH Sodium hydride
Na2CO3 Sodium carbonate
NaHCO3 Sodium bicarbonate
NaOH Sodium hydroxide
NaOMe Sodium methoxide
Na2SO4 Sodium sulfate
NH4Cl Ammonium chloride
PBr3 Phosphorous tribromide
PAFA Prion aggregate formation assay
PhSiH3 Phenylsilane
PMCA Protein misfolding cyclic amplification
PrP Prion protein
C
PrP Cellular prion protein
Sc
PrP Scrapie prion protein
SiO2 Silicon dioxide
SOCl2 Thionyl chloride
TEA Triethylamine
Tf2O Triflic anhydride
THF Tetrahydrofuran
TsCl p-toluenesulfonyl chloride
TSE Transmissible spongiform encephalopathy

ⅶ
 국문요지

Hydroxy-2-naphthohydrazide 유사체의 합성 및

프리온 단백질 응집 저해 효과

프리온 질병은 신경퇴행성 질환으로 중추신경계 조직에 스펀지 형태의 병리적

변형을 특징으로 한다. 정상 프리온 단백질 (PrPC)이 잘못 접힌 구조로 변형 (protein

misfolding)되면 병원성 및 전염성을 가지는 프리온 단백질 (PrPSc)로 전환된다.

형성된 PrPSc가 축적되면 insoluble한 amyloid가 형성되어 치매, 운동실조증 등의

신경병증을 일으키는 프리온 질병을 유발한다. 구조적으로 잘 분석되어 있지 않고

응집체 형성 경향이 높으며 단백질 가수분해효소에 대한 저항성을 가지는 PrPSc를

제어하는 방법은 어려움이 많기 때문에 PrPC를 타겟으로 하는 연구가 진행되었다.

다양한 전략 중에서도 PrPC를 안정화 시켜 PrPSc로의 변환을 억제하는 연구가

활발하게 진행되었지만 약물로서 최종 승인된 화합물은 아직 보고되지 않았다.

선행연구에서 발굴된 NTG-G-014는 misfolding된 단백질이 축적되어 발생하는

소포체 스트레스를 저해하기위해 합성된 library에서 발굴되었으며, Prion aggregate

formation assay 및 Protein misfolding cyclic amplification에서 prion 응집 저해 활성을

보였다. DNMT 저해제로 알려진 SGI-1027 또한 PrPSc로의 변환을 억제하였다. 본

연구에서는 두 물질을 유효 물질로 하여 NTG-G-014의 truncation 유도체,

naphthalene고리를 phenyl로 치환한 유도체, 기존 구조의 작용기를 치환한 유도체

9개를 합성하였고, SGI-1027과의 hybrid 유도체 2개를 합성하였다. 합성한 화합물의

prion 응집 저해 효과를 확인하기위해 10 μM 농도에서 PAFA를 진행하였고 그 결과

활성을 나타내는 5개의 유도체를 발굴하였고 이를 통해 구조-활성 상관관계를

도출하였다.

ⅷ
 제 1 장 서론

1.1 프리온 (Prion)

1.1.1 프리온 단백질 (Prion protein)

정상 프리온 단백질 (PrPC)은 GPI anchor을 통해 세포막에 연결되어있는 당단백질로

중추신경계에서 높은 발현을 보인다.1,2 PrPC는 이온 채널과 뉴런 흥분성 조절, 신호

전달 및 Cu2+ 및 Zn2+ 항상성 조절 등에 관여하는 것으로 추측하고 있으나 정확한

생리학적 역할은 밝혀지지 않았다.2

PrPC는 유전, 섭식, 의인성 감염 등의 원인뿐 아니라 알려지지 않은 원인으로 인해

병원성 및 전염성을 가지는 병원성 프리온 단백질 (PrPSc)로 변환될 수 있다.3,4 α-helix

구조의 비율이 높은 PrPC가 잘못 접히면 (protein misfolding) β-sheet 구조의 비율이 높은

PrPSc로 변환되는 것으로 이해되고 있으나 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았다

(Figure 1).4,5 PrPC는 β-sheet 구조 의 비율이 3%정도인 반면, PrPSc의 경우 43%로

이루어져있다.6 전염성 및 감염성이 있는 구조 이성체 PrPSc는 PrPC와 상호작용을 통해

PrPC를 PrPSc로 변환시키고 PrPSc가 응집되면 PrP amyloid가 형성된다.4,7 Insoluble한 PrP

amyloid는 세포 독성으로 인한 세포 사멸을 야기하여 치매, 운동실조증 등의 신경병증

증상을 유발 한다.8

1
 Figure 1. PrP 구조변화5

(a)정상 프리온 단백질 (PrPC) (b)프리온 질병을 유도하는 병원성 프리온 단백질 (PrPSc)

1.1.2 프리온 질병 (Prion disease)

프리온 질병은 전염성 해면상뇌증 (TSE)으로도 알려져 있으며 세포 사멸로 인해

뇌에 스폰지 형태의 구조를 가지는 치명적인 신경 퇴행성 질병 중 하나로 알려져

있다.9 프리온 질병은 인간뿐 아니라 동물에서도 발견되고 있다 (Table 1).10 인간에게

발생할 수 있는 프리온 질병은 Kuru, Gerstmann–Sträussler–Scheinker syndrome (GSS),

Familial fatal insomnia (FFI), Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) 등이 있으며 CJD는 대표적인

2
인간 프리온 질병으로 알려져 있다. 산발성 CJD (sCJD)는 CJD 발병 중 85-90%를

차지하고 있으며 체세포 돌연변이 또는 PrPC에서 PrPSc로의 자발적인 변환에 의해

발생하는 것으로 추측하고 있다.9,10 CJD 발병중 10~15%를 차지하는 유전성 CJD

(gCJD)는 PrPC를 암호화하고있는 PRNP 유전자의 변이로 인해 발생하는 것으로

알려져 있다.9 변종 CJD (vCJD)는 ‘광우병’으로 알려진 소에서 발생한 Bovine

spongiform encephalopathy (BSE)가 사람에게 전염되어 나타난 것으로 알려져 있으며,10

의인성 CJD (iCJD)는 의료 과정 중 전염되는 것으로 알려져 있다.9 이외에도 GSS,

FFI는 유전적인 원인에 의해, Kuru는 섭식으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다.9

Table 1. 인간 및 동물에서 발견되는 프리온 질병10

3
1.1.3 프리온 치료제의 개발 현황

PrPC는 Cu2+, Zn2+와 결합하는 charge cluster와 octapeptide repeat 부분을 포함하는

flexible한 N-terminal domain과 3개의 α-helix가 존재하는 globular C-terminal로

이루어져있으며 GPI anchor을 통해 세포막과 연결되어있다 (Figure 2).2,9 이에 반해

Figure 2. PrPC의 구조2,9

(a)NMR 구조로 추정한 PrP 3차 구조 (b)GPI를 통해 세포막에 연결되어있는 PrP 구조

PrPSc는 구조가 정확히 밝혀져 있지 않고4 응집체 형성의 경향이 높은 특성을

가진다.11 따라서 PrPSc를 타겟으로 하는 방법은 어려움이 많기 때문에 PrPC를

타겟으로 하는 연구가 진행되었다. 이 연구는 프리온 전환에 필요한 세포 특이적인

기질을 줄이거나 제거하는 다섯 가지 전략을 추구하였다 (Figure 3).11 이에 대한

4
전략으로 첫번째, PrP 유전자의 발현을 감소시키는 방법 두번째, PrP degradation을 촉진

Figure 3. PrPC를 타겟으로 하는 프리온 치료제 개발 전략11

시키는 방법 세번째, PrPC를 sequestration하는 방법 네번째, PrPC에 결합하여

5
안정화시키는 방법 마지막으로 PrPC가 유도하는 신경 독성 경로를 차단하는 방법이

있다. 컴퓨터를 사용한 방법과 생화학적, 생물리학적, 세포기반 assay를 결합함으로써

발견된 다양한 chemical scaffold (Figure 4)를 이용하여 PrPC를 타겟으로 하는 연구가

진행되었다 (Table 2).12 하지만 대다수의 화합물이 PrPC에 대한 affinity와 생물학적

활성 농도 사이에 일관성이 존재하지 않았고, 결합 특이성이 낮았으며, 재현성이

확보되지 않았다.12

Table 2. PrPC를 타겟으로 하여 anti-prion 활성을 보인 chemical scaffold12

이처럼 전세계적으로 프리온 치료제를 개발하기 위한 많은 시도가 진행중이지만

아직까지 치료제로서 승인된 화합물은 보고되지 않았다.

6
Figure 4. PrPC를 타겟으로 하여 anti-prion 활성을 보인 chemical scaffold의 구조

7
1.2 연구 배경

GN813, MC14, GJP1415, NPR-05316 (Figure 5)등을 포함하는 대부분의 화합물은 PrPC를

타겟 하는 방법 중에서 네번째 작용기전으로 설계되었다. SGI-1027 (Figure 6)은 유전자

Figure 5. GN8, MC, GJP14, NPR-053의 구조

Figure 6. SGI-1027과 NTG-G-012, NTG-G-14의 구조

8
발현의 epigenetic regulation에 관여하는 DNA methylation을 조절하여 종양 억제

유전자를 재활성시키고 암세포의 사멸을 야기하는 DNA methyltransferase (DNMT)

저해제로 알려져 있다.20 선행연구를 통해 이 화합물이 네번째 작용기전으로 anti-prion

활성을 보였음을 확인하였다.17 (1) 프리온에 감염된 신경모세포종 세포주에서 PrPSc의

수준이 농도의존적으로 감소하였고 0.5 μM에서 대부분 제거되었다. 이때 IC50 값은 50

nM로 측정되었는데 이전에 검사되었던 다른 anti-prion 화합물들과 비교했을 때 높은

효능을 보였다. (2) 정상 세포에서 프리온 감염을 예방 할 수 있는지 확인하기위한

assay에서 화합물의 농도가 1 μM일 때, scrapie prion이 접종된 신경모세포종 세포주에서

PrPSc의 증식이 억제되었다. (3) 재조합 인간 PrP를 사용한 PAFA assay에서 응집체

형성이 농도 의존적으로 감소하였다.

이와는 별도로 선행연구에서 구축된 소포체 스트레스 저해 물질 library는 다양한

요인에 의해 misfolding된 단백질이 소포체에 축적되면 단백질 및 지방 합성 등의

기능을 잃고 세포사멸을 야기하는 소포체 스트레스를 저해하기위해 합성되었다.18 그

중에서 NTG-G-012와 NTG-G-014 화합물이(Figure 6) anti-prion 활성을 보였다 (Figure

7).18 (a) 재조합 생쥐 PrP를 기질로 사용한 PAFA 반응에서 화합물의 농도를 100 μM로

처리하여 스크리닝을 진행하였다. 각 화합물마다 PrP amyloid의 형성 억제의 정도가

다르게 나타났는데 NTG-G-012와 NTG-G-012를 처리한 PAFA 반응에서 강력한 amyloid

형성 억제 능력을 보였고 AFM을 통해 amyloid가 형성되지 않은 것을 직접적으로

확인하였다. (b) 두 화합물이 PrPSc로의 변환 과정에 영향을 주는지 확인하기 위해

화합물의 농도를 10 μM로 처리하여 PMCA 반응을 진행하였다. 그 결과 vehicle만

9
처리된 음성대조군에 비하여 PrPSc의 증식이 매우 낮게 일어났고 음성대조군

화합물들의 경우 증식이 증폭되었다. 이를 통해 두 화합물이 PrPSc의 증식을 억제 할

수 있음을 확인하였다. (c) 프리온에 감염된 신경모 세포종 세포주에서 NTG-G-014를

처리한 경우 PrPSc의 수준이 농도의존적으로 감소하였고 10 μM농도에서 30%이하로

감소하였다. (d) 재조합 인간 PrP를 사용한 PAFA assay에서 amyloid의 형성을

억제한다고 밝혀진 SGI-1027을 양성대조군으로 사용하였다. 그 결과 vehicle만 처리한

음성대조군에서는 PrP amyloid가 형성되었고 두 화합물의 경우 amyloid 형성이

억제되었다.

10
Figure 7. 선행연구에서 발굴된 hydroxy-2-naphthohydrazide의 anti-prion 활성18

11
1.3 연구 목표

본 연구에서는 선행연구를 통해 anti-prion 활성이 있다고 보고되었던 NTG-G-014와

SGI-1027을 유효 물질로 하여 PrPC에서 PrPSc로의 변환을 억제하여 PrP 응집체 형성을

저해하는 물질을 합성하고자 하였다. 이를 위해 NTG-G-014를 modify 하였고 (Figure

8(a)) SGI-1027과의 hybrid구조를 합성하여 (Figure 8(b)) PAFA assay를 통해 amyloid 형성

저해 효과를 확인하였다.

Figure 8. (a) NTG-G-014 구조 modification (b) SGI-1027과의 hybrid 합성 (이어서)

12
Figure 8. (a) NTG-G-014 구조 modification (b) SGI-1027과의 hybrid 합성

13
 제 2 장 결과 및 토의

2.1 유도체 합성

2.1.1 NTG-G-014 유사체의 합성

NTG-G-014 화합물의 full length 구조가 활성에 어느정도 영향을 미치는지 확인하기

위해 amide 결합을 기준으로 오른쪽 부분이 제거된 analogue를 합성하였다. 이때

truncated 유사체 중에서도 어느 부분까지 활성에 영향을 주는지 확인하기 위해

nucleoplile의 종류를 달리하여 반응을 진행하였다 (Scheme 1).

Scheme 1. NTG-G-014의 절단 유사체 합성

14
 1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid를 출발 물질로 하여 Naphthalene 고리의 C(4) 위치의

hydroxyl group과 cayboxylic acid의 diethylation을 통해 화합물 1a를 얻었다 (62%). 이후

각각 hydrazine hydrate, ammonium hydroxide, hydroxyl amine과 친핵성 아실 치환 반응을

통해 G-89 (85%), G-90 (52%), G-91 (28%)을 합성하였다.

Figure 9. NTG-G-014의 Naphthalene 고리에서 C(1), C(4) 위치

Naphthalene 고리의 C(1), C(4)위치(Figure 9)의 작용기에 변화를 주었을 때,

metabolism에 영향을 줄 수 있는 sulfur를 oxygen으로 치환하였을 때 활성에 미치는

영향을 확인하기 위해 작용기의 종류를 다양화하였다 (Scheme 2). Table 3에 나타난

바와 같이 1,4-Dihydroxynaphthoic acid 1을 출발 물질로 하여 NaH, EtI를 2당량을

사용하여 diethylation을 통해 1a (62%), 3당량을 사용하여 triethylation을 통해 2a를

얻었다 (63%). 또한, 1-Hydroxy-2-naphthoic acid 3을 출발 물질로 하여 KHCO3, EtI를

1당량을 사용하여 monoethylation을 통해 3a를 얻을 수 있었다 (84%). 이렇게 얻어진

ester 화합물 (1a-3a)과 hydrazine hydrate의 친핵성 아실 치환 반응을 통해 hydrazide

화합물을 얻었다 (1b: 85%, 2b: 78%, 3b: 85%). 마지막으로 1b는 TEA 첨가 하에 4-

chlorophenyl isocyanate와, 2b 및 3b는 4-chlorophenyl isothiocyanate와 coupling 하여 각각

G-83 (58%), G-81 (90%), G-86 (79%)을 합성하였다 (Table 4).

15
 Scheme 2. (thio)semicarbazide 유사체의 합성

Table 3. 중간체 1a, 2a, 3a의 합성조건

SM Base (eq), EtI (eq) R1 Product R2, R3 Yield

1 NaH (2 eq), EtI (2 eq) R1=OH 1a R2=OH, R3=OEt 62 %

1 NaH ( 3eq), EtI (3 eq) R1=OH 2a R2=OEt, R3=OEt 63 %

3 KHCO3 (1 eq), EtI (1 eq) R1=H 3a R2=OH, R3=H 84 %

16
 Table 4. (thio)semicarbazide 유사체 G-81,83,86의 합성 조건

SM R2, R3 X Conditions Product Yield

TEA, EtOH
1b R2=OH, R3=OEt O 58 %
75 oC, 4 h

EtOH
2b R2=OEt, R3=OEt S 90 %
75 oC, 3.5 h

EtOH
3b R2=OH, R3=H S 79 %
55 oC, 2 h

Lipophilic한 chlorine이 활성에 영향을 주는지 확인하기 위해 chlorine이 없는

유사체를 합성하고자 하였다 (Scheme 3). 합성 경로는 scheme 2와 같으며 마지막으로

TEA 첨가 하에 1b와 phenyl isocyanate의 coupling을 통해 G-88을 합성하였다 (수율:

75%).

Scheme 3. non-chloride 유사체의 합성

17
 Naphthalene고리의 면적이 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 phenyl 고리로

치환된 analogue를 합성하였다 (Scheme 4). 출발 물질로 1,4-dihydroxybenzoic acid 4를

사용하여 scheme 2 와 같은 방식으로 반응을 진행하여 최종적으로 G-82를 얻었다

(80%).

Scheme 4. phenyl-based 유사체의 합성

Naphthalene 고리의 C(4) 위치의 (Figure 9) ethoxy group이 활성에 영향을 주는지

확인하기 위해 hydroxyl group으로 치환된 analogue를 합성하였다. (Scheme 5). 1을 출발

물질로 KHCO3, EtI를 각 1당량을 사용하여 monoethylation을 진행해 ester 화합물 5a를

얻었다 (72%). 이후 5a의 naphthol의 hydroxyl group을 benzyl bromide와 Cs2CO3를

이용하여 benzyl protected 화합물 5b를 얻었다 (77%). 이를 hydrazine hydrate와 친핵성

아실 치환 반응을 통해 hydrazide 화합물 5c를 얻었다 (76%). 이렇게 얻어진 5c를 수소

조건하에 palladium on carbon을 이용하여 benzyl deprotection을 진행한 후 4-chlorophenyl

18
isothiocyanate와 coupling reaction을 통해 G-87을 얻었다. G-87의 경우 실온에서 공기 및

빛에 민감하여 반응액 중에서 소량만 정제하였기 때문에 최종 수율을 기록하지

않았다.

Scheme 5. 4-hydroxynaphthalene 유사체의 합성

Naphthalene 고리의 C(1) 위치의(Figure 9) hydroxyl group과 intramolecular hydrogen

bonding을 할 수 있는 carbonyl group이 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위해

methylene으로 치환된 analogue를 합성하고자 하였다 (Scheme 6(a)). 1을 출발 물질로

diethylation을 진행한 후 lithium borohydride를 이용한 환원 반응을 통해19 alcohol 화합물

6을 얻었다 (69%).

19
 Scheme 6. reduced carbonyl 유사체의 합성을 위한 시도

다음으로 benzyl alcohol moiety를 leaving group으로 치환하기 위해 TsCl을 이용하여

tosylation, CBr4 및 PBr3를 이용하여 bromination, SOCl2 및 cyanuric acid를 이용하여

chlorination을 다양한 조건에서 시도하였지만 반응이 진행되지 않았다 (Table 5).

20
이러한 결과로 C(1) 위치의 hydroxyl group과 carbonyl group의 intramolecular hydrogen

bonding 형성이 반응에 영향을 미친다고 판단하였다. 따라서 1을 출발 물질로

diethylation을 진행한 후 C(1) 위치의 hydroxyl group에 benzyl protection을 진행하여 6a

중간체를 얻었다(56% for 2 steps). 다음으로 6a를 lithium aluminum hydride LiAlH4를

이용하여 reduction을 진행하였다 (94%). 이렇게 얻어진 benzyl protected hydrazide

화합물 6b를 이용하여 치환 반응을 시도하였다 (Scheme 6(b)). Methanesulfonyl chloride

(MsCl)를 이용하여 mesylation, TsCl를 이용하여 tosylation, PBr3 및 hydrobromic acid

(HBr)를 이용하여 bromination, triflic anhydride (Tf2O)를 이용하여 triflate를 도입하고자

하였으나 반응이 전혀 진행되지 않았다 (Table 5).

21
 Table 5. reduced carbonyl 유사체 합성을 위한 leaving group 치환 반응 조건

SM Product X Reagents Conditions Solvent Yield

6 6aa OTs TsCl, TEA rt, 3 h DCM No reaction3

6 6aa OTs TsCl, Cs2CO3 60 oC, 15 h MeCN No reaction2

6 6aa Br CBr4, PPh3 rt, 26 h THF No reaction3

6 6aa Br PBr3 40 oC, 2 h Benzene No reaction4

6 6aa Br PBr3 rt, 2.5 h THF No reaction4

6 6aa Cl DMF reflux, 1 h SOCl2 (neat) No reaction2

6 6aa Cl SOCl2 75 oC, 3 h Toluene No reaction2

Cyanuric acid,
6 6aa Cl rt, 3 h DCM No reaction2
DMF
6b 6ab OMs MsCl rt, 2 h Pyridine No reaction4

6b 6ab OTs TsCl, TEA rt, 3 h DCM No reaction2

6b 6ab Br HBr reflux, 4 h Toluene No reaction4

6b 6ab Br PBr3 rt, 3 h THF No reaction4

6b 6ab OTf Tf2O, pyridine rt, 3 h DCM No reaction1

1 SM이 소모되지 않음. 2 SM이 일부 소모되었으나 TLC의 reaction mixture lane이 매우 지저분함. 3

4
SM이 일부 소모되었으나 TLC의 product로 추정되는 물질을 찾을 수 없음. SM은 완전히

소모되었으나 product가 아닌 다른 물질이 형성됨.

Table 5에서 기술한 조건에서 반응이 진행되지 않아 다른 방법의 합성법을

고안하였다. Hydrazide를 먼저 합성한 후 carbonyl 그룹을 reduction하는 방향으로

반응을 시도하고자 하였다 (Scheme 7). 1을 출발 물질로 diethylation, 친핵성 아실

치환반응을 통해 1b를 얻고 (route (a)), diethylation, benzyl protection, 친핵성 치환반응을

통해 6c (39% for 3 steps)를 얻은 후 (route (b)) 각각의 carbonyl group을 reduction하여

22
6ac와 6ad를 각각 얻고자 하였다. 하지만 carbonyl reduction 반응이 진행되지 않아

6ac와 6ad는 얻을 수 없었다. 시도한 carbonyl reduction 반응 조건은 Table 6에

기술하였다.

Scheme 7. 대체 조건을 이용한 reduced carbonyl 유사체의 합성을 위한 시도

Table 6. reduced carbonyl 유사체 합성을 위한 reduction 반응 조건

SM Product Reagents Conditions Solvent Yield

1b 6ac BH3-THF reflux, 18 h THF No reaction2

1b 6ac LiAlH4 60 oC, 16 h THF No reaction2

6c 6ad LiAlH4 rt, 2 h THF No reaction3

6c 6ad Tf2O, NaBH4 rt, 1 h DCM/THF No reaction3

6c 6ad BH3-THF reflux, 19 h THF No reaction1

6c 6ad BEt3, NaOMe, PhSiH3 reflux, 2 d THF No reaction1

1 SM이 소모되지 않음. 2 SM이 일부 소모되었으나 TLC의 reaction mixture lane이 매우 지저분함. 3

SM이 일부 소모되었으나 TLC의 product로 추정되는 물질을 찾을 수 없음.

23
2.1.2 Hybrid 구조의 합성

프리온 응집 저해 활성을 나타낸 NTG-G-014와 SGI 화합물의 amide bond를 기준으로

각 화합물을 disconnection하고 어느 부분이 활성에 더 영향을 주는지 확인하기 위해

hybrid 구조를 합성하고자 하였다 (Scheme 8). 먼저 왼쪽 부분이 SGI-1027, 오른쪽

부분이 NTG-G-014인 analogue를 합성하기 위해 4-chloroquinoline 7과 ethyl 4-

aminobenzoate 8을 산촉매 하에 친핵성 방향족 치환반응을 진행하여 9를 얻었다

(89%).20 이어서 hydrazine hydrate와 친핵성 아실 치환반응을 통해 10을 얻고 (57%)

마지막으로 TEA 첨가 하에 4-chlrophenyl isothiocyanate와 coupling 반응을 통해 G-84를

합성하였다 (78%).

왼쪽 부분이 NTG-G-014, 오른쪽 부분이 SGI-1027인 analogue를 합성하기위해 1을

출발 물질로 diethylation을 진행하여 1a를 얻은 후 KOH를 사용하여 가수분해 반응을

통해 carboxylic acid 화합물 11을 얻었다 (93%). 다음으로 2-amino-4-chloro-6-

methylpyrimidine 12와 p-nitroaniline 13을 산촉매 하에 친핵성 방향족 치환반응을 통해

14를 얻었다 (64%).20 이렇게 얻어진 14를 산촉매, 수소 조건 하에 10 wt% Palladium on

carbon을 이용하여 reduction을 진행하여 15를 얻었다 (83%). 앞서 만들어진 11과 15를

HATU를 사용한 amide coupling을 진행하여 최종적으로 G-85를 합성하였다 (33%).

24
Scheme 8. hybrid 유사체의 합성

25
2.2 PrP amyloid 형성 저해 효과 활성

PrPSc가 축적되면 insoluble한 PrP amyloid가 형성되기 때문에 합성된 화합물들의 PrP

amyloid 형성 저해 효과를 확인하기 위해 PAFA를 진행하였다. Guanidine hydrochloride

(GdnHCl)을 사용하여 재조합 PrP의 변성을 유도하여 PrP amyloid가 형성되면

Thioflavine-T (ThT)가 amyloid에 결합하여 방출하는 형광을 기록하여 amyloid의 형성

유무를 확인하였다. 화합물을 10 μM로 처리하여 60시간이 지난 뒤 시작점과 끝점만

비교하여 amyloid의 형성이 억제되었는지 확인하였다 (Figure 10). Anti-prion 활성을 보

였던 NTG-G-014를 양성대조군으로 사용하였고 두 그룹으로 나누어서 진행되었다 (G-

81~86, G-87~G-91).

Figure 10. PrP amyloid 형성 저해 효과 활성 평가 (2회 반복 평균치)

(한양대학교 약학대학 류종석 교수님 연구실에서 수행함)

26
 이번 연구에서 진행한 PAFA를 통해 구조-활성 상관관계를 도출할 수 있었다

(Figure 11). (1) naphthalene 고리의 R1을 hydroxyl group에서 ethoxy group으로 치환 했을

때 (G-81), R2를 ethoxy group에서 hydrogen으로 치환했을 때(G-86) PrP amyloid의 형성이

증폭되었으나 R2를 hydroxyl group으로 치환했을 때(G-87) amyloid의 형성을 억제하였다.

이를 통해 R1이 ethoxy group일 때, R2가 hydrogen일 때 활성이 감소하며 R2가 hydroxyl

group일 때 G-014와 유사한 활성을 보였음을 확인하였다. 이를 토대로 R1 group의

hydroxyl group과 carbonyl group의 intramolecular hydrogen bonding을 통해 형성될 수 있는

tricyclic aromatic ring 구조가 활성을 높였다고 판단하였다. 또한 R2 group의 hydrogen

bonding을 할 수 있는 oxygen의 존재가 활성을 높이는 역할을 할 것이라고 판단하였

다. (2) naphthalene 고리를 phenyl 고리로 치환하였을 때(G-82) amyloid의 형성이 억제되

지 않았다. 따라서 hydrophobic한 고리의 면적이 작은 것이 활성을 감소시킨다고 판단

하였다. (3) thiourea구조를 urea구조로 치환하였을 때(G-83) G-014와 유사한 활성을 보였

으며, chloride가 hydrogen으로 치환되었을 때(G-88) 다소 약하지만 활성을 보였기 때문

에 metabolism에 영향을 줄 수 있다고 생각한 sulfur가 oxygen으로 치환되었을 때와

lipophilic한 chloride의 존재는 활성에 영향을 크게 미치지 않는다고 판단하였다. (4)

truncated analogues 중에서는 hydrazide구조를 유지하는 경우(G-89) 활성을 보였지만

amide 구조일 때(G-90), hydroxamic acid 구조일 때(G-91)는 활성을 나타내지 않았다. 이

결과에 대해서는 amide구조일 경우 길이가 굉장히 짧기 때문에 interaction에 큰 영향

을 미치지 못하며, oxygen보다 nucleophilic한 성질이 더 강한 nitrogen을 포함하는

hydrazide구조일 경우 binding site에서 강한 전기적 interaction을 할 수 있기 때문에 활

27
성을 높일것이라고 판단하였다. 또한 hydrazide 구조를 유지할 때 G-014보다는 다소

약하지만 활성을 보였기 때문에 이를 기준으로 오른쪽의 lipophilic한 부분보다는

naphthohydrazide moiety의 강한 전기적 interaction이 활성에 더욱 영향을 줄 것이라고

판단하였다. (5) amide bond를 기준으로 왼쪽 부분이 G-014인 경우(G-85) 활성을 보였지

만 왼쪽 부분이 SGI인 경우(G-84) 활성을 보이지 않았다. 따라서 G-014의 왼쪽 부분

이 활성에 영향을 미치는 부분이며 오른쪽의 side chain은 활성에 큰 영향을 미치는 부

분은 아니라고 판단하였다.

Figure 11. PAFA assay를 통해 도출한 구조-활성 상관 관계

28
 제 3 장 실험 방법

3.1 기기 및 시약

반응에 필요한 시약과 용매는 Sigma-Aldrich, TCI등의 commercial vendor로부터

구입하여 별도의 정제, 건조 과정없이 사용하였다. 반응 양상은 thin layer

chromatography (TLC)와 Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS)를 통해

확인하였다. TLC plate는 Merck 사의 GLASS-TLC SILICAGEL 60 F254를 사용하였고 TLC

spot의 확인은 254 nm, 365 nm의 UV를 사용하였다. 화합물의 정제 과정은 Merck사의

Silica gel 60 (230-400 mesh)을 이용하여 flash chromatography를 진행하거나 Biotage 사의

Isolera로 수행하였다. Mass spectrometry는 Waters 사의 Micromass® ZQ™ - Single

quadrupole mass spectrometer를 사용하여 low resolution mass spectrometry (LRMS)

확인하였고 high resolution mass spectrometry (HRMS)는 Agilent Technologies – Accurate-Mass

Q-TOF LC/MS를 사용하였다. 두가지 모두 질량 값 측정을 위한 이온화 방법으로서

electrospray ionization (ESI) 방법을 적용하였다. 화합물의 구조를 분석하기 위해 Bruker

사의 Avanced Ⅲ 400 FT-NMR spectrometer를 사용하여 1H-NMR, 13

C-NMR 스펙트럼을

측정하였다. NMR solvent는 Cambridge Isotope Laboratories 사의 CDCl3, Merck 사의

DMSO-d6을 사용하였으며 Signal의 상대적인 위치는 용매 내에 포함되어 있는

tetramethylsilane (TMS)를 기준으로 정하거나 NMR용매 peak를 기준으로 결정하였다.

29
Chemical shift는 표준물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, proton NMR의 multiplicity는

약자(s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, p = pentet, m =multiplet)로 기록하였으며

coupling constant (Hz), integration 순으로 기록하였다. Melting point는 KSP1N으로

측정하여, 보정하지 않은 온도를 기록하였으며, decomposition의 경우는 dec.으로

표시하였다.

30
3.2 실험 방법

Ethyl 4-ethoxy-1-hydroxy-2-naphthoate (1a)

1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid 1 (3.00 g, 14.20 mmol), DMF (25 mL) 용액에 NaH (1.1 g, 29.40

mmol)를 0 oC에서 가했다. 혼합물을 1시간 교반 후 EtI (2.4 mL, 29.4 mmol)를 0 oC에서

가했다. 이후 혼합물을 상온에서 22시간 교반 하였다. 반응 혼합물에 1 N HCl

수용액을 넣어 pH를 7로 맞춘 후 CH2Cl2 (100 mL)로 희석하고 유기층을 물 (50 mL×3),

brine으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를

flash column chromatography (SiO2, 0.7% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 1a

(2.38 g, 62%)를 밝은 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.9 (100% CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6) δ 11.60 (s, 1H), 8.28 (dd, J = 8.3, 0.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.72 (ddd, J =

8.3, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 7.65 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 7.03 (s, 1H), 4.43 (q, J = 7.1 Hz, 2H),

4.13 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz,

DMSO-d6) δ 170.14, 154.05, 146.38, 129.25 (d, J = 15.4 Hz), 126.84, 124.79, 123.24, 121.72,

104.47, 101.35, 63.73, 61.59, 14.61, 14.06 ppm; MS (ESI) m/z 261.0 [M+H]+.

31
4-Ethoxy-1-hydroxy-2-naphthohydrazide (1b, G-89)

화합물 1a (300 mg, 1.15 mmol), EtOH (16 ml) 용액에 hydrazine hydrate (6.48 mL, 104.02

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 17시간 30분 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 EtOAc (35 mL)로 희석하고 유기층을 물 (35 mL×3),

brine으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를

flash column chromatography (SiO2, 60% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 1b, G-

89 (241 mg, 85%)를 밝은 갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.4 (5% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400

MHz, DMSO-d6) δ 13.92 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 8.27 – 8.19 (m, 1H), 8.15 – 8.06 (m, 1H), 7.61

(dddd, J = 22.7, 8.2, 6.9, 1.3 Hz, 2H), 7.25 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.45 (t, J
13
= 7.0 Hz, 3H) ppm; C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169.16, 152.91, 145.93, 128.18, 127.94,

126.29, 125.38, 122.94, 121.51, 105.04, 100.49, 63.84, 14.66 ppm; MS (ESI) m/z 247.0 [M+H]+;

mp: 213.4~214.0 °C dec.

4-Ethoxy-1-hydroxy-2-naphthamide (G-90)

화합물 1a (91 mg, 0.35 mmol), EtOH (0.5 ml) 용액에 ammonium hydroxide (3.0 mL, 175

32
mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 50 oC에서 교반 하였다. 20시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL×4)로 추출하였다. 유기층을

무수 NaSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 4.8%

Hexanes in CH2Cl2 → 100% CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 G-90 (42 mg, 52%)를 흰색

고체로 얻었다. Rf = 0.5 (50% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14.42 (s, 1H),

8.52 (s, 1H), 8.25 (dd, J = 8.2, 0.7 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.63 (dt, J = 14.9,

7.0 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 4.19 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101

MHz, DMSO-d6) δ 173.27, 154.43, 145.72, 128.36, 126.23, 125.40, 123.05, 121.53, 105.57, 101.84,

63.94, 14.68 ppm; MS (ESI) m/z 232.2 [M+H]+; mp: 174.4~176.0 °C dec.

4-Ethoxy-N,1-dihydroxy-2-naphthamide (G-91)

Hydroxy amine hydrochloride (67 mg, 0.96 mmol), NaOH (69 mg, 1.73 mmol), H 2O (0.55 mL)

용액에 화합물 1a (100 mg, 0.38 mmol), dioxane (1 ml)용액을 dropwise 하였다. 이후

혼합물을 65 oC에서 교반 하였다. 20시간 후에 반응 혼합물을 상온으로 식히고 0.1 N

HCl 수용액을 넣어 pH를 7로 맞춘 후 EtOAc (20 mL)로 희석하고 물 (20 mL×5)로

추출하였다. 유기층을 무수 NaSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 Prep TLC

column chromatography (SiO2, 2.5% MeOH in CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 G-91 (23 mg,

28%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.4 (8% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ

13.75 (s, 1H), 11.74 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 8.29 – 8.17 (m, 1H), 8.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.61 (dtd, J

33
= 16.3, 6.9, 1.3 Hz, 2H), 7.12 (s, 1H), 4.15 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; 13C

NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.62, 152.98, 145.89, 128.20, 127.91, 126.33, 125.40, 122.89,

121.51, 104.28, 100.27, 63.82, 14.66 ppm; MS (ESI) m/z 248.04 [M+H]+.

Ethyl 1,4-diethoxy-2-naphthoate (2a)

1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid 1 (600 mg, 2.94 mmol), DMF (8.4 mL) 용액에 NaH (376 mg,

9.40 mmol)를 0 oC에서 가했다. 혼합물을 1시간 교반후 EtI (0.71 mL, 8.82 mmol)를

상온에서 가했다. 이후 혼합물을 상온에서 21시간 교반 하였다. 반응 혼합물을 EtOAc

(40 mL)로 희석하고 유기층을 brine (40 mL×4)으로 세척하였다. 유기층을 무수

MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 2%

EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 2a (533 mg, 63%)를 노란색 고체로 얻었다. Rf

= 0.4 (5% EtOAc in Hexanse); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.24 – 8.10 (m, 2H), 7.72 – 7.60

(m, 2H), 7.09 (s, 1H), 4.36 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 4.21 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.05 (d, J = 7.0 Hz, 2H),

1.44 (dt, J = 15.3, 7.0 Hz, 6H), 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.79,

150.63 (d, J = 0.9 Hz), 129.61, 128.86, 127.54, 126.88, 123.55, 122.35, 119.31, 104.52, 71.74, 64.04,
61.17, 15.70, 14.83, 14.41 ppm; MS (ESI) m/z 289.2 [M+H]+.

34
1,4-Diethoxy-2-naphthohydrazide (2b)

화합물 2a (300 mg, 1.04 mmol), EtOH (10 ml) 용액에 hydrazine hydrate (5.83 mL, 93.64

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 19시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 EtOAc (35 mL)로 희석하고 유기층을 brine (35 mL×4)으로 세척하였다.

유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography

(SiO2, 60% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 2b (224 mg, 78%)를 노란색 고체로

얻었다. Rf = 0.4 (5% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.41 (s, 1H), 8.18 (dt, J

= 7.2, 4.3 Hz, 1H), 8.13 – 8.06 (m, 1H), 7.67 – 7.57 (m, 2H), 6.97 (s, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.27 – 4.14

(m, 2H), 4.07 – 3.95 (m, 2H), 1.51 – 1.43 (m, 3H), 1.42 – 1.35 (m, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 275.0
[M+H]+.

Ethyl 1-hydroxy-2-naphthoate (3a)

1-Hydroxy-2-naphthoic acid 3 (1.5 g, 7.97 mmol), DMF (34 mL) 용액에 KHCO3 (1.12 g, 11.16

mmol)를 0 oC에서 가했다. 혼합물을 2시간 교반 후 EtI (0.29 mL, 3.57 mmol)를 상온에서

가했다. 이후 혼합물을 상온에서 24시간 교반 하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100

35
mL)로 희석하고 유기층을 포화 NH4Cl 수용액 (100 mL×4), 물, brine으로 세척하였다.

유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography

(SiO2, 100% Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 3a (1.45 g, 84%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf

= 0.8 (10% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 8.34 – 8.27 (m,

1H), 7.92 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.70 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 7.61

(ddd, J = 8.2, 6.9, 1.2 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.44 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz,

3H) ppm; MS (ESI) m/z 217.3 [M+H]+.

1-Hydroxy-2-naphthohydrazide (3b)

화합물 3a (202 mg, 0.93 mmol), EtOH (8 ml) 용액에 hydrazine hydrate (1.45 mL, 23.35

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 75 oC에서 교반 하였다. 8시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (40 mL×5)로 추출하였다. 유기층을

무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 1%

MeOH in CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 3b (150 mg, 80%)를 갈색 고체로 얻었다. Rf =

0.25 (0.5% MeOH in Hexanes/EtOAc (1:1)); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14.41 (s, 1H), 10.29

(s, 1H), 8.25 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.84 (dd, J = 12.4, 8.5 Hz, 2H), 7.66 – 7.58 (m, 1H), 7.58 – 7.50

(m, 1H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H) ppm; MS (ESI) m/z 203.1 [M+H]+.

36
Ethyl 5-ethoxy-2-hydroxybenzoate (4a)

2,5-dihydroxybenzoic acid 4 (250 mg, 1.62 mmol), DMF (8.4 mL) 용액에 NaH (143 mg, 3.59

mmol)를 0 oC에서 가했다. 혼합물을 1시간 교반 후 EtI (0.29 mL, 3.57 mmol)를 상온에서

가했다. 이후 혼합물을 상온에서 19시간 교반 하였다. 반응 혼합물에 1 N HCl

수용액을 넣어 pH를 7로 맞춘 후 EtOAc (45 mL)로 희석하고 유기층을 물 (45 mL×3),

brine으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를

flash column chromatography (SiO2, 0.5% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 4a

(143 mg, 57%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.8 (20% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6) δ 10.14 (s, 1H), 7.22 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 9.0, 3.2 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 9.0

Hz, 1H), 4.36 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.97 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.38 – 1.26 (m, 6H) ppm; 13C NMR (101

MHz, DMSO-d6) δ 168.70, 154.40, 150.89, 123.73, 118.40, 113.07, 112.65, 63.69, 61.37, 14.61,

13.96 ppm; MS (ESI) m/z 211.0 [M+H]+.

5-Ethoxy-2-hydroxybenzohydrazide (4b)

37
화합물 4a (835 mg, 3.97 mmol), EtOH (25 ml) 용액에 hydrazine hydrate (7.42 mL, 119.16

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 6시간 30분후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 EtOAc (35 mL)로 희석하고 유기층을 물 (50 mL×3)로

세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column

chromatography (SiO2, 40% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 4b (664 mg, 85%)를

옅은 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (5% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ

11.98 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 7.36 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 6.98 (dd, J = 8.9, 3.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.9

Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.96 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.29 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 196.9

[M+H]+.

Ethyl 1,4-dihydroxy-2-naphthoate (5a)

1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid 1 (500 mg, 2.45 mmol), DMF (12 mL) 용액에 KHCO3 (221 mg,

2.21 mmol)를 0 oC에서 가했다. 혼합물을 2시간 교반 후 EtI (0.22 mL, 2.70 mmol)를

상온에서 가했다. 이후 혼합물을 상온에서 20시간 교반 하였다. 반응 혼합물을 물 (40

mL)로 희석하고 EtOAc (40 mL×2)로 추출하였다. 추출한 유기층을 물 (40 mL×3)로

세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column

chromatography (SiO2, 7% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 5a (412 mg, 72%)를

진한 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.5 (20% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)

δ 11.43 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.27 (ddd, J = 8.3, 1.3, 0.7 Hz, 1H), 8.13 (ddd, J = 8.4, 1.2, 0.7 Hz,

38
1H), 7.70 (ddd, J = 8.3, 6.9, 1.4 Hz, 1H), 7.63 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 4.43 (q,

J = 7.1 Hz, 2H), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 233.1 [M+H]+.

Ethyl 1,4-bis(benzyloxy)-2-naphthoate (5b)

화합물 5a (70 mg, 0.30 mmol), THF (1.6 mL) / DMF (1.2 mL) (4 : 3) 용액에 Cs2CO3 (489 mg,

1.5 mmol)를 가했다. 혼합물을 1시간 교반 후 benzyl bromide (82 μL, 2.30 mmol)를 가했다.

이후 혼합물을 상온에서 2시간 교반 하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (25 mL)로 희석하고

포화 NH4Cl 수용액 (25 mL×2), 물 (25 mL×3), brine으로 세척하였다. 유기층을 무수

MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 100%

Hexanes → 1% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 5b (94 mg, 77%)를 노란색

고체로 얻었다. Rf = 0.35 (10% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 – 8.31 (m,

1H), 8.24 – 8.19 (m, 1H), 7.62 – 7.51 (m, 6H), 7.47 – 7.34 (m, 6H), 7.31 (s, 1H), 5.28 (s, 2H), 5.13
(s, 2H), 4.41 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 413.2 [M+H]+.

39
1,4-Bis(benzyloxy)-2-naphthohydrazide (5c)

화합물 5b (376 mg, 0.91 mmol), EtOH (11 ml) 용액에 hydrazine hydrate (5.1 mL, 81.97

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 70 oC에서 교반 하였다. 6시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로 세척하여 목적

화합물 5c (276 mg, 76%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (2% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (s, 1H), 8.29 – 8.22 (m, 1H), 8.18 – 8.11 (m, 1H), 7.72 – 7.53 (m, 6H),

7.52 – 7.35 (m, 6H), 7.15 (s, 1H), 5.34 (s, 2H), 5.04 (s, 2H), 4.59 (d, J = 4.0 Hz, 2H) ppm; MS (ESI)

m/z 399.2 [M+H]+.

4-Ethoxy-2-(hydroxymethyl)naphthalen-1-ol (6)

화합물 1a (100 mg, 0.38 mmol), THF (0.69 mL) / Et2O (0.69 mL) / MeOH (23 μL) (30 : 30 : 1)

용액에 lithium borohydride (0.19 mL, 0.58 mmol)를 dropwise 하였다. 이후 혼합물을 55
o
C에서 교반 하였다. 5시간 후에 반응 혼합물을 상온으로 식히고 EtOAc (10 mL)로

희석한 뒤 0.1 N HCl 수용액을 가하여 pH를 5로 맞추었다. EtOAc (15 mL×4)로

40
추출하고 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column

chromatography (SiO2, 15 → 17% EtOAc in Hexanes)로 정제하여 목적 화합물 6 (58 mg,

69%)를 옅은 갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (20% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6) δ 8.73 (s, 1H), 8.20 – 7.98 (m, 2H), 7.52 – 7.38 (m, 2H), 6.90 (s, 1H), 5.36 (s, 1H), 4.73

(s, 2H), 4.13 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.44 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ

147.22, 142.29, 126.18, 125.31, 124.76, 122.08, 121.84, 121.35, 105.44, 63.55, 59.36, 14.83 ppm;

MS (ESI) m/z 217.2 [M-H]+; HRMS (ESI): 계산치 C13H14O3 [M-H]+ 217.087, 측정치 217.0866.

Ethyl 1-(benzyloxy)-4-ethoxy-2-naphthoate (6a)

화합물 1a (742 mg, 2.85 mmol), THF (6 mL), DMF (2 mL) (3:1) 용액에 Cs2CO3 (2.79 g, 8.55

mmol)를 가한 뒤 benzyl bromide를 상온에서 천천히 가했다. 이후 혼합물을 상온에서

19시간 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (25 mL)로 희석하고 EtOAc (25 mL×3)로 추출한

뒤 유기층을 brine (25 mL×3)으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압

농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 3.8% EtOAc in Hexanes)로 정제하여

목적 화합물 6a (904 mg, 90%)를 투명한 오일로 얻었다. Rf = 0.35 (9% EtOAc in Hexanes);
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.21 (dt, J = 4.2, 2.7 Hz, 1H), 8.13 (dt, J = 6.1, 2.5 Hz, 1H), 7.70

– 7.62 (m, 2H), 7.56 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.47 – 7.35 (m, 3H), 7.14 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.34 (q, J

= 7.1 Hz, 2H), 4.24 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.48 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; MS
(ESI) m/z 351.2 [M+H]+.

41
(1-(Benzyloxy)-4-ethoxynaphthalen-2-yl)methanol (6b)

화합물 6a (774 mg, 2.21 mmol), THF (10 mL) 용액에 LiAlH4 (1.0 mL, 24.30 mmol)를

dropwise 하였다. 이후 혼합물을 상온에서 2시간 교반하였다. 반응물에 물 (1mL) → 1 N

NaOH 수용액 (2 mL) → 물 (1 mL) 를 가한 후 물 (25 mL)로 희석하고 EtOAc (30

mL×4)로 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하여 목적 화합물

6b (643 mg, 94%)를 투명한 오일로 얻었다. Rf = 0.1 (9% EtOAc in Hexanes); 1H NMR (400

MHz, DMSO-d6) δ 8.22 – 8.09 (m, 1H), 8.02 (dd, J = 7.7, 0.7 Hz, 1H), 7.60 – 7.35 (m, 7H), 7.04 (s,

1H), 5.23 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.69 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.21 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.48

(t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 331.2 [M+Na]+.

1-(Benzyloxy)-4-ethoxy-2-naphthohydrazide (6c)

화합물 6a (492 mg, 1.40 mmol), EtOH (10 mL) 용액에 hydrazine hydrate (7.88 mL, 126.4
o
mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 75 C에서 교반 하였다. 5시간 30분 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 물 (30 mL)로 희석하고 EtOAc (30 mL×3)로 추출하였다.

42
유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 EtOAc로 재결정하여 목적

화합물 6c (326 mg, 69%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (33% EtOAc in Hexanes); 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6) δ 9.48 (s, 1H), 8.22 – 8.17 (m, 1H), 8.12 – 8.07 (m, 1H), 7.67 – 7.52 (m, 4H),

7.42 (dt, J = 15.4, 7.1 Hz, 3H), 6.97 (s, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.56 (s, 2H), 4.23 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.48

(t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; MS (ESI) m/z 337.1 [M+H]+.

N-(4-Chlorophenyl)-2-(4-ethoxy-1-hydroxy-2-naphthoyl)hydrazine-1-carboxamide (G-83)

화합물 1b (50 mg, 0.20 mmol), EtOH (10 mL) 용액에 4-chlorophenyl isocyanate (77 mg, 0.50

mmol), TEA (60 μL, 0.43 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 75 oC에서 교반 하였다. 4시간

후에 반응 혼합물을 상온으로 식히고 반응 혼합물을 EtOAc (25 mL)로 희석하고 brine

(35 mL×3)로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를

flash column chromatography (SiO2, 1% MeOH in CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 G-83 (46

mg, 58%)를 갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.5 (5% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-

d6) δ 13.44 (s, 1H), 10.72 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.15 (d, J =

8.2 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39 – 7.27

(m, 3H), 4.21 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.48 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ

170.75, 155.36, 153.79, 146.05, 138.61, 128.71, 128.43 (d, J = 13.3 Hz), 126.54, 125.59, 125.23,

123.12, 121.61, 120.18, 104.79, 100.83, 63.97, 14.71 ppm; MS (ESI) m/z 399.9 [M+H]+; HRMS

(ESI): 계산치 C20H18ClN3O4 [M+H]+ 400.1059, 측정치 400.1098; mp: 200.8~201.8 °C dec.

43
N-(4-Chlorophenyl)-2-(1,4-diethoxy-2-naphthoyl)hydrazine-1-carbothioamide (G-81)

화합물 2b (85 mg, 0.31 mmol), EtOH (3.8 ml) 용액에 4-chlorophenyl isothiocyanate (105 mg,

0.62 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 3시간 30분 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로

세척하여 목적 화합물 G-81 (124 mg, 90%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.8 (4% MeOH in

CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18 (dd, J = 281.9, 141.9 Hz, 3H), 8.19 (d, J = 24.6

Hz, 2H), 7.49 (dd, J = 120.3, 56.3 Hz, 7H), 4.20 (d, J = 40.9 Hz, 4H), 1.50 (s, 6H) ppm; 13C NMR

(101 MHz, DMSO-d6) δ 150.11 (d, J = 6.6 Hz), 147.20, 138.14, 128.71 – 127.53 (m), 127.42 (d, J

= 10.0 Hz), 122.83, 122.02, 104.32, 71.91, 63.86, 15.45, 14.62 ppm; MS (ESI) m/z 444.3 [M+H]+;

HRMS (ESI): 계산치 C22H22ClN3O3S [M+H]+ 444.1143, 측정치 444.1154; mp: 210.1~210.5 °C.

N-(4-Chlorophenyl)-2-(1-hydroxy-2-naphthoyl)hydrazine-1-carbothioamide (G-86)

화합물 3b (146 mg, 0.72 mmol), EtOH (11 ml) 용액에 4-chlorophenyl isothiocyanate (184 mg,

1.08 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 55 oC에서 교반 하였다. 2시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로 세척하여 목적

44
화합물 G-86 (212 mg, 79%)를 흰갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.6 (0.5% MeOH in

EtOAc/Hexanes (1:1)); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.75 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.99 (d, J =

26.1 Hz, 2H), 8.30 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.91 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.72 – 7.32 (m, 7H) ppm; 13C NMR

(101 MHz, DMSO-d6) δ 181.13, 170.66, 159.62, 138.12, 135.96, 129.21, 127.73 (d, J = 42.3 Hz),

125.99, 124.43, 123.04, 117.78, 106.30 ppm; MS (ESI) m/z 372.1 [M+H]+; mp: 202.8~203.3 °C.

N-(4-Chlorophenyl)-2-(5-ethoxy-2-hydroxybenzoyl)hydrazine-1-carbothioamide (G-82)

화합물 4b (100 mg, 0.51 mmol), EtOH (6 mL) 용액에 4-chlorophenyl isocyanate (130 mg, 0.76
o
mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 60 C에서 교반 하였다. 3시간 50분 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로

세척하여 목적 화합물 G-82 (150 mg, 80%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.45 (5% MeOH in

CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.41 (s, 1H), 10.69 (s, 1H), 9.92 (s, 2H), 7.43 (dd, J =

34.8, 19.1 Hz, 5H), 7.07 (dd, J = 8.9, 2.7 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.99 (q, J = 6.9 Hz, 2H),

1.31 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 153.45, 150.83, 138.11, 129.39 –

129.20 (m), 129.39 – 127.23 (m), 121.87, 118.04, 114.77, 112.86, 63.69, 14.69 ppm; MS (ESI) m/z

366.2 [M+H]+; HRMS (ESI): 계산치 C16H16N3O3S [M+H]+ 366.0674, 측정치 366.0678; mp:

203.7~204.3 °C.

45
N-(4-Chlorophenyl)-2-(1,4-dihydroxy-2-naphthoyl)hydrazine-1-carbothioamide (G-87)

화합물 5c (90 mg, 0.26 mmol), MeOH (5 mL) 용액에 palladium on carbon (25 mg, 0.26

mmol)을 가했다. 이후 혼합물을 상온에서 교반 하였다. 14시간 30분 후에 반응

혼합물을 celite pad로 filtration 하고 filtrate를 감압 농축 하였다. 반응 혼합물을 EtOH

(2.5 mL) 에 녹인 후 4-chlorophenyl isothiocyanate (52 mg, 0.39 mmol)를 가했다. 이후

혼합물을 50 oC에서 교반 하였다. 1시간 후에 반응 혼합물을 상온으로 식히고 EtOAc

(15 mL)로 희석하고 brine (15 mL×3)으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로

건조하고 감압 농축하였다. 잔사 중에서 소량을 Prep TLC column chromatography (SiO2, 5%

MeOH in CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 G-87 를 진한 갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (5%

MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.01 (s, 1H), 10.89 (s, 1H), 9.96 (d, J = 19.0

Hz, 2H), 9.65 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.59 (ddd, J = 45.0, 26.2,

13.2 Hz, 4H), 7.40 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H); MS (ESI) m/z 388.2 [M+H]+.

2-(4-Ethoxy-1-hydroxy-2-naphthoyl)-N-phenylhydrazine-1-carbothioamide (G-88)

46
화합물 1b (30 mg, 0.12 mmol), EtOH (3.5 ml) 용액에 phenyl isothiocyanate (22 μL, 0.18 mmol),

TEA (17 μL, 0.12 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 50 oC에서 교반 하였다. 30분 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로

세척하여 목적 화합물 G-88 (35 mg, 75%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.33 (2% MeOH in

CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 10.98 (s, 1H), 9.93 (d, J = 54.1 Hz, 2H),

8.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.67 (dt, J = 14.7, 7.0 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 30.1,

22.7 Hz, 5H), 7.19 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 4.23 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.50 (t, J = 7.0 Hz, 3H) ppm; 13C

NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 181.23, 170.55, 153.75, 145.88, 139.11, 128.73, 128.36, 128.04,

126.53, 126.06, 125.16, 123.12, 121.60, 105.28, 101.48, 63.99, 14.72 ppm; MS (ESI) m/z 382.6

[M+H]+; mp: 172~172.5 °C.

Ethyl 4-(quinolin-4-ylamino)benzoate (9)

화합물 7 (509 mg, 3.11 mmol), 화합물 8 (514 mg, 3.11 mmol), EtOH (31 mL) 용액에 35%

HCl 2 drops을 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 3시간 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 Et2O로 세척하였다. filter

cake를 CH2Cl2 (40 mL), 물 (20 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3 수용액을 가하여 pH를

7로 맞추었다. 이후 유기층을 물(30 mL×4)로 세척하고 무수 MgSO4로 건조하고 감압

농축하여 목적 화합물 9 (810 mg, 89%)를 흰색 고체로 얻었다. Rf = 0.2 (60% EtOAc in

47
Hexanes); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.32 (s, 1H), 8.61 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 8.38 – 8.31 (m,

1H), 8.00 – 7.90 (m, 3H), 7.77 – 7.70 (m, 1H), 7.62 – 7.54 (m, 1H), 7.45 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.27

(d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.30 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H) ppm; [CAS no. 58519-43-0].

4-(Quinolin-4-ylamino)benzohydrazide (10)

화합물 9 (168 mg, 0.57 mmol), EtOH (3.4 ml) 용액에 hydrazine hydrate (0. 54 mL, 8.62

mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 30시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded EtOH로 세척하여 목적

화합물 10 (92 mg, 57%)를 옅은 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.25 (10% MeOH in CH2Cl2); 1H

NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.67 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.55 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.36 (d, J = 7.8

Hz, 1H), 7.91 (dd, J = 8.4, 0.8 Hz, 1H), 7.89 – 7.83 (m, 2H), 7.72 (ddd, J = 8.3, 6.8, 1.3 Hz, 1H),

7.56 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.2 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.46 (s, 2H)

ppm; [CAS no. 2243355-57-7].

48
N-(4-Chlorophenyl)-2-(4-(quinolin-4-ylamino)benzoyl)hydrazine-1-carbothioamide (G-84)

화합물 10 (92 mg, 0.33 mmol), EtOH (10 ml) 용액에 4-chlorophenyl isothiocyanate (84 mg, 0.50

mmol), TEA (69 μL, 0.50 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 40분

후에 반응 혼합물을 상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 ice-colded

EtOH로 세척하여 목적 화합물 G-84 (115 mg, 78%)를 옅은 노란색 고체로 얻었다. Rf =

0.1 (10% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.47 (s, 1H), 9.82 (s, 2H), 9.25 (s,

1H), 8.57 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 20.0, 8.2 Hz, 3H), 7.74 (ddd, J

= 8.3, 6.9, 1.2 Hz, 1H), 7.63 – 7.42 (m, 5H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 4.8 Hz, 1H) ppm;
13
C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 181.00, 165.52, 150.50, 148.75, 146.42, 144.61, 138.35, 129.59,

129.59 – 128.58, 128.58 – 124.75, 122.31, 120.37, 119.99, 119.51, 103.72 ppm; MS (ESI) m/z 447.9

[M+H]+; HRMS (ESI): 계산치 C23H18ClN5OS [M+H]+ 448.0993, 측정치 448.1002; mp:

226.5~227.2 °C.

4-Ethoxy-1-hydroxy-2-naphthoic acid (11)

49
화합물 1a (300 mg, 0.1.15 mmol), THF (10.5 mL) / H2O (10.5 mL) (1 : 1) 용액에 KOH (259 mg,

4.61 mmol)를 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 19시간 후에 반응

혼합물을 상온으로 식히고 감압 농축 한 후에, 1 N HCl을 가하여 pH를 2로 맞추었다.

CH2Cl2 (40 mL)로 희석하고 물 (40 mL×3)으로 세척하였다. 유기층을 무수 MgSO4로

건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 5% MeOH in

CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 11 (250 mg, 93%)를 옅은 갈색 고체로 얻었다. Rf = 0.25

(10% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.84 (s, 1H), 12.41 (s, 1H), 8.29 (d, J

= 7.9 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.76 – 7.69 (m, 1H), 7.68 – 7.60 (m, 1H), 7.08 (s, 1H), 4.16

(q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 6.9 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172.77, 154.55,

146.05, 129.07 (d, J = 9.3 Hz), 126.59, 124.80, 123.14, 121.68, 104.94, 102.20, 63.63, 14.65 ppm;

MS (ESI) m/z 233.0 [M+H]+.

6-Methyl-N4-(4-nitrophenyl)pyrimidine-2,4-diamine (14)

화합물 12 (300 mg, 2.09 mmol), 화합물 13 (289 mg, 2.09 mmol), EtOH (21 mL) 용액에 35%

HCl 1 drop을 가했다. 이후 혼합물을 환류 하에 교반 하였다. 3시간 후에 반응 혼합물을

상온으로 식히고 침전물을 filtration 후 filter cake를 Et2O로 세척하여 목적 화합물 14

(330 mg, 64%)를 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.45 (10% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6) δ 9.78 (s, 1H), 8.15 – 8.10 (m, 2H), 8.04 – 7.98 (m, 2H), 6.40 (s, 2H), 5.99 (s, 1H), 2.14

(s, 3H) ppm; [CAS no. 20719-42-0].

50
N4-(4-Aminophenyl)-6-methylpyrimidine-2,4-diamine (15)

화합물 14 (800 mg, 3.26 mmol), MeOH (65 mL) 용액에 palladium on carbon (177 mg, 1.66

mmol), AcOH 2 drops을 가했다. 이후 혼합물을 상온에서 교반 하였다. 3시간 후에 반응

혼합물을 celite pad로 filtration 하고 filtrate를 감압 농축 하였다. Filtrate를 EtOAc (30

mL)로 희석하고 포화 NaHCO3, Na2CO3 수용액을 가하여 pH를 8로 맞추고 EtOAc (40

mL×5) 로 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하여 목적 화합물

15 (585 mg, 83%)를 탁한 노란색 고체로 얻었다. Rf = 0.1 (10% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR

(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.35 (s, 1H), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.55 – 6.46 (m, 2H), 5.87 (s, 2H),

5.67 (s, 1H), 4.80 (s, 2H), 2.01 (s, 3H) ppm; [CAS no. 20719-43-1].

N-(4-((2-Amino-6-methylpyrimidin-4-yl)amino)phenyl)-4-ethoxy-1-hydroxy-2-naphthamide

(G-85)

화합물 11 (250 mg, 1.08 mmol), 화합물 15 (232 mg, 1.08 mmol), THF (23 mL) 용액에 HATU

(410 mg, 1.08 mmol)를 가했다. 이후 50 oC에서 교반 하였다. 3시간 후에 반응 혼합물을

51
상온으로 식히고 EtOAc (40 mL)로 희석하고 물 (45 mL×3)으로 세척하였다. 유기층을

무수 MgSO4로 건조하고 감압 농축하였다. 잔사를 flash column chromatography (SiO2, 7%

MeOH in CH2Cl2)로 정제하여 목적 화합물 G-85 (140 mg, 33%)를 갈색 고체로 얻었다. Rf

= 0.35 (10% MeOH in CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.50 (s, 1H), 10.45 (s, 1H),

10.19 (s, 1H), 8.29 (dd, J = 8.2, 0.6 Hz, 1H), 8.16 (dd, J = 7.7, 0.6 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.9 Hz, 2H),

7.73 – 7.60 (m, 4H), 7.47 (s, 3H), 6.08 (s, 1H), 4.26 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.50 (t, J = 7.0

Hz, 3H) ppm; 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169.30, 161.48, 156.76, 155.17, 154.18, 146.13,

135.26, 133.44, 128.72, 128.45, 126.55, 125.41, 123.13, 121.55 (d, J = 16.6 Hz), 106.42, 101.54,

96.59, 64.25, 19.31, 14.70 ppm; MS (ESI) m/z 430.1 [M+H]+; HRMS (ESI): 계산치 C24H23N5O3

[M+H]+ 430.1874, 측정치 430.191; mp : 293.5~294.3 °C dec.

52
 제 4 장 결론

본 논문에서는 선행연구를 통해 PrP 응집체 형성 억제 효과가 있다고 알려진 NTG-

G-014와 SGI-1027을 유효 물질로 하여 pharmacophore를 규명하기 위하여 두 화합물의

modification을 진행하였다. NTG-G-014의 기본 골격에 변화를 준 9종의 analogues를

합성하였고, SGI-1027과의 hybrid analogues 2종을 합성하였고, PAFA를 진행하여 구조-

활성 상관관계를 도출하였다. 스크리닝 결과 naphthalene 고리를 유지할 때, naphehtlene

고리의 C(1) 위치의 R1 group이 hydroxyl group을 유지할 때, C(4) 위치의 R2 group이

hydroxyl, ethoxy group일 때, truncated 구조가 hydrazide일 때, thiourea 및 urea 구조를

가질 때, chlorine을 유지할 때 anti-prion 활성이 좋은 것으로 나타났다. 이를 바탕으로

intrahmolecula hydrogen bonding을 할 수 있는 구조가 활성을 보인다고 판단할 수

있었다.

53
 제 5 장 참고 문헌

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56
 ABSTRACT

Synthesis and anti-prion aggregation activity of hydroxy-2-

naphthohydrazide analogues
Kim, YeEun

Dept. of Pharmacy

Graduate school of

Hanyang University

Prion disease is a neurodegenerative disease characterized by sponge-like form in CNS. When

PrPC is converted into misfolded structure, a pathogenic and infectious PrPSc is formed. The
accumulation of PrPSc produces insoluble PrP amyloid, causing prion diseases which is a symptom
of neurological abnormalities such as dementia and ataxia. PrPSc is a challenging target because of
its high aggregation propensity, poorly understood structure, and drug resistance. PrPC-directed drug
discovery approaches have thus been pursued. Among these approaches, binding and stabilization
PrPC to inhibit the conversion to PrPSc strategy has been actively conducted, but none of these
compounds were not approved for prion disease. NTG-G-014, which was discovered through
previous study to inhibit the ER stress caused by the accumulation of misfolded proteins, shows
anti-prion activity. SGI-1027 known as the DNMT inhibitor also inhibits the conversion to PrPSc. In
this study, with the two compounds as lead compound, we synthesized derivatives with truncated
side chain of NTG-G-014, modified derivatives of existing structure, and hybrid derivatives of SGI-
1027. PAFA was conducted at a concentration of 10 μM to confirm the inhibition of PrP amyloid
formation. As a results, five compounds shows anti-prion activity, leading to a considerably
reasonable structural-activity relationship (SAR).

57
 감사의 글

석사과정을 마치며 도움을 주신 분들께 감사 인사 드리고 싶습니다.

가장 먼저, 언제든 찾아뵐 때마다 조언을 아끼지않고 세심하게 가르쳐주신 남태규 교

수님, 열정 넘치는 지도와 따듯한 격려 덕분에 2년동안 많은 것을 배울 수 있었습니

다. 학생들의 말에 귀를 기울여 주시고 배려해주셔서 정말 감사드립니다. 어려운 내용

도 재미있고 열정적으로 강의를 해주신 하정미 교수님, 실험에 큰 도움을 주시고 친

근한 모습으로 다가와 주신 류종석 교수님께도 진심 어린 감사의 말씀을 올립니다.

처음 실험실에 와서 모든 것이 낯설 때 적응에 도움을 준 상원이오빠, 경표오빠, 실

험에 대해서 고민이 많을 때 열심히 알려준 휘상이오빠, 상황적으로 힘들 때마다 아

낌없이 도와주고 가장 많이 의지했던 서울이오빠에게 감사합니다. 진행하는 실험에

대해 같이 고민하고 조언을 해주신 김효신연구원님, 항상 웃는 얼굴로 응원해주고 도

움을 준 예진이, 랩장으로서 맡은 일을 열심히 해주는 소명이오빠, 알게 된지 오래는

되지않았지만 많이 친해진 동윤이에게 감사 인사를 드립니다. 어려운 일로 도움을 청

할 때마다 자기 일처럼 도와주신 의약화학 및 생약학 실험실 분들께 감사드립니다.

마지막으로 표현을 제대로 잘 한적은 없지만 멀리서도 힘이되어주고 늘 응원과 격

려를 아끼지 않은 가족들 정말 사랑하고 감사합니다.

2021년 8월

김예은

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