GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CÓDIGO DE

DOCUMENTO:
CAMPO
DCIV-GUI-2019-V1-008

CIENCIAS DE LA VIDA Y LA
DEPARTAMENTO:
AGRICULTURA
CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología
PERÍODO MAYO 2022 –
ASIGNATURA: Inmunología NIVEL: 6
LECTIVO: AGOSTO 2023
DOCENTE: Dra. Marbel Torres, Ph.D. NRC: 9777-13371 PRÁCTICA N°: 8
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
LABORATORIOS DE DOCENCIA
PRÁCTICA
TEMA DE LA PRÁCTICA: ELISA INDIRECTO CASERO
INTRODUCCIÓN:
La técnica de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada en
la biotecnología debido a su alta sensibilidad, especificidad y rapidez. Esta técnica se basa en la detección de
antígenos o anticuerpos específicos presentes en una muestra biológica utilizando anticuerpos o antígenos marcados
con enzimas que pueden ser detectados mediante reacciones químicas o de fluorescencia. Además, por su fácil
estandarización, manejo y variedad de antígenos disponibles, ha desplazado notablemente a otras técnicas como el
radioinmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-DNAcd (conocido también como prueba de Farr), ya que
no utiliza radionúclidos, lo que hace que sea una técnica accesible y de bajo riesgo.
La técnica de ELISA es utilizada en la investigación biomédica y en el diagnóstico clínico para detectar y medir la
cantidad de antígenos o anticuerpos en enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, alergias y cáncer
de manera rápida y precisa. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio de diagnóstico
de autoinmunidad es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos específicos
presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anticuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier
isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Los anticuerpos anti-Fc
están unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Los antígenos utilizados en las placas de ELISA
pueden ser nativos, recombinantes (antígeno completo o epítopo específico) o sintéticos (epítopo específico).
Esto permite el diagnóstico temprano de enfermedades y el monitoreo de la eficacia de los tratamientos. Además,
se utiliza en la producción de proteínas recombinantes y en la detección de proteínas en alimentos y bebidas. La
técnica de ELISA es relativamente fácil de realizar y puede ser automatizada, lo que la hace una herramienta valiosa
en la producción en masa.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

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OBJETIVOS:
1. Desarrollar un ELISA indirecto para detección deL antígeno Salmonella.
2. Evaluar los resultados obtenidos

MATERIALES:
REACTIVOS:
Buffer de lavado: PBS-Tween 0,05%
Buffer de sensibilización: Carbonato- Bicarbonato de sodio 0,05M a INSUMOS: Pipetas desechables, Tubos de
pH 9,6 50ml, Tubos de 15ml, Cajas Petri plásticas,
Buffer de bloqueo: PBS-leche descremada 5% Viales de 2ml, 500ul, Gradillas de tubos de
Buffer de dilución de anticuerpo primario y secundario: PBS-leche 15ml; 50ml, cajas puntas de micropipetas
descremada 2,5%. 1000ul, 200ul, 10ul, placas de Elisa
Anticuerpo primario: IgY de gallinas inmunizadas
Anticuerpo secundario conjugado a enzima: rabbit antichicken IgY
conjugado a HRP
Sustrato: TMB
EQUIPOS: Incubadora, juegos micropipetas, pipeteador automático, pipetas multicanal, lector Elisa

MUESTRA: Anticuerpos anti Salmonella, Antígeno de Salmonella

INSTRUCCIONES:
- Vacunación previa de acuerdo al MSP para el manejo de animales y muestras biológicas.
- Mandil y medidas de precaución.
- Manejo de desechos biológicos.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
1. Preparación del antígeno.

Antígeno
Sembrar la bacteria Salmonella enteritidis en medio de cultivo Incubar el cultivo durante 24h a 37ºC en agitación
Colocar el tubo a 65ºC por 30 minutos (baño maría) y a 0ºC en baño de hielo y cuantificar la concentración de
proteínas.

Figura 1. Salmonella enteritidis

2. Sensibilización de placa con el antígeno.

Diluir Salmonella en buffer de sensibilización (Carbonato-Bicarbonato 0.05M a pH 9.6).
Colocar 100uL de cada uno en las columnas correspondientes de la placa de acuerdo al diseño de placa.

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Figura 2 Plan de placa para ELISA

Cubrir la placa e Incubar la placa una noche a 4ºC, luego lavar la placa tres veces (PBS–Tween 0,05%)

Figura 3. Fijación del antígeno a la placa

3. Bloqueo.
Colocar 200uL de la solución de bloqueo (PBS- Leche 5%) e incubar a 37ºC por una hora Lavar la placa tres veces
con (PBS –Tween 0.05%).

Figura 4. Bloqueo de placa con PBS-leche 5%

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4. Anticuerpo primario.
Realizar diluciones seriadas del anticuerpo utilizando como diluyente PBS – Leche 2,5%. Colocar 100uL de cada
dilución, cubrir la placa e incubar durante 2h a 37ºC
Luego Lavar la placa tres veces con (PBS – Tween 0.05%).

Figura 5. Unión antígeno-anticuerpo primario

Figura 6. Plan de placa para ELISA

5. Anticuerpo secundario (conjugado).

Realizar una dilución de 1/30 000 del anticuerpo secundario en PBS – Leche 2,5% (dilución recomendada por la casa
comercial).
Colocar 100uL de la dilución en toda la placa.
Cubrir la placa e incubar durante 1h a 37ºC y Lavar la placa tres veces (PBS – Tween 0.05%).

Figura 7. Unión anticuerpo secundario

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Figura 8. Plan de placa para ELISA

6. Sustrato.
Colocar 50uL del sustrato ABTS de Peroxidasa en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente por 15 minutos
protegido de la luz. Leer la absorbancia de la placa a una longitud de onda de 405nm en el espectrofotómetro.

Figura 9. Reacción enzima sustrato

Determinación de Cut off

Para la determinación del valor de Cut off, utilizar la fórmula Cut off = X + 3 (SD(X)), Donde X representa a los
valores de absorbancia de los controles negativos

Figura 10. Interpretación Cut off

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Figura 11. Gráfica Cut off

RESULTADOS OBTENIDOS:
1. Capacitación en técnicas de Elisa casero indirecto
2. Resultados negativos y positivos.

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CONCLUSIONES:
Obtención de absorbancias de muestras para detección de anticuerpos producidos en animales

RECOMENDACIONES:
Los tiempos de incubación, cantidades de las micro pipetas, cuidado en el momento de lavar

FIRMAS

Firmado electrónicamente por:

MARBEL TORRES ARIAS
Firmado electrónicamente por:
BLANCA FABIOLA
NARANJO PUENTE

F: ………………………………… F: ………………………………… F: ……………………………………

Nombre: Marbel Torres, PhD Nombre: Blanca Naranjo Nombre: Patricia Jiménez, PhD
Docente Coordinador de Área de Jefe de Laboratorios Multidisciplinarios
Conocimiento

Links de videos:

1. Introducción a ELISA https://www.jove.com/es/v/5061/the-elisa-method

2. Principio de ELISA indirecto
3. https://www.youtube.com/watch?v=KrGC0ZgIDI8&t=316s
4. Explicación ELISA indirecto
5. https://www.youtube.com/watch?v=5gHb3Ua3rvg
6. Ejemplo de Ensayo ELISA Indirecto
7. http://www.abnova.com/abvideo/Indirect-ELISA.html

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