EXTRACCIÓN DE β-GLUCANO A PARTIR DE RESIDUOS DE LEVADURA

PRODUCIDOS EN LA ELABORACIÓN DE CERVEZA Y DISEÑO DE UN PRODUCTO

NUTRACÉUTICO.

Proyecto de grado
por
STIVEN FERNANDO GUARÍN SÁNCHEZ

ANDRÉS FELIPE SASTOQUE HERNÁNDEZ

Presentado a la Oficina de Estudios de Pregrado de

Universidad de los Andes
en cumplimiento parcial de los requisitos para grado de

INGENIERÍA QUÍMICA

Asesor

LUIS HUMBERTO REYES BARRIOS, PhD

Co-Asesor
OSCAR ALBERTO ALVAREZ SOLANO, PhD

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2019
Extracción de β-glucano a partir de residuos de levadura producidos en la elaboración de cerveza y
diseño de un producto nutracéutico.

Copyright © 2019 Stiven Fernando Guarín Sánchez & Andrés Felipe Sastoque Hernández
 ABSTRACT

Spent brewer’s yeast is a by-product that could be used in different ways. However, since it has not
been adequately exploited, most of it ends up in wastewater disposal contaminating water sources or
becoming in cattle food, product with few economic values. Thus, in this study, β-glucan extraction
was evaluated using an acid/base methodology (Pengkumsri et al., 2016). As raw material it was used
the yeast residue that comes from the brewing process. Different factors of the methodology were
changed, such as the type of acids in the hydrolysis, the incubation times in the autolysis and the drying
methodology. For each case, a sample of β-glucan was extracted to be characterized by
thermogravimetry analysis, spectrophotometry, scanning electron microscopy and infrared
transmission with Fourier transform spectroscopy. The above was in order to determine the optimal
factors that increase the recovery and purity of β-glucan in the acid-base extraction methodology. It was
obtained that the best incubation time in the autolysis was 72 hours, the acid that should be implemented
in the hydrolysis is the hydrochloric acid and the type of drying that has the best recovery and purity of
β-glucan is the air drying. Later, with the β-glucan extract obtained, a standardized static in vitro
digestion study was carried out to evaluate its properties as a nutraceutical product. In this digestion test
it was demonstrated that the β-glucan could pass through the gastric fluids without any significant
weight loss and its purity remains almost intact with respect to the initial conditions.

Key words: β-glucan, autolysis, hydrolysis, drying, nutraceutical, recovery, purity, digestion.

iii
 RESUMEN

La levadura procedente del proceso de producción de cerveza es un co-producto que puede ser utilizado
de diferentes maneras; sin embargo, dado que no ha sido adecuadamente explotado, gran parte termina
en aguas residuales contaminando fuentes hídricas naturales o convirtiéndose en alimento para ganado,
producto que cuenta con poco valor comercial (Zechner-Krpan, y otros, 2010). Así, en el presente
estudio se analizó y se evaluó la extracción de β-glucano mediante la metodología ácido-base
(Pengkumsri, y otros, 2016) tomando como materia prima el residuo de levadura que deja la producción
de cerveza. Se variaron diferentes factores de la metodología de extracción, tales como los ácidos
utilizados en la hidrólisis, los tiempos de incubación en la autolisis y los tipos de secado implementados.
Para cada caso se extrajo una muestra con β-glucano la cual se caracterizó mediante pruebas de
termogravimetría, espectrofotometría, microscopia electrónica de barrido y espectroscopia de
transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier, con el fin de determinar los factores óptimos que
aumentan la recuperación y pureza de β-glucano. Se obtuvo que el mejor tiempo de incubación en la
autolisis fue de 72 horas, el ácido que se debe implementar en la hidrólisis es el ácido clorhídrico y el
tipo de secado que presenta la mejor recuperación y pureza de β-glucano es el que se realiza al aire. Por
otra parte, con el extracto de β-glucano obtenido se realizó un estudio de digestión in vitro estática
estandarizada debido a que con dicho extracto se desarrolló un producto nutracéutico. En dicha prueba
de digestión se demostró que el β-glucano puede pasar por los fluidos gástricos sin ninguna pérdida de
masa y su pureza se mantiene casi intacta con respecto al momento de la ingesta.

Palabras clave: β-glucano, autolisis, hidrólisis, secado, nutracéutico, recuperación, pureza, digestión.

iv
 TABLA DE CONTENIDO

ABSTRACT..................................................................................................................................... iii
RESUMEN ...................................................................................................................................... iv
TABLA DE CONTENIDO................................................................................................................ v
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... vii
LISTA DE TABLAS ...................................................................................................................... viii

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
1.1. β-glucano .............................................................................................................................. 1
1.1.1. Estructura y tipos de β-glucano ...................................................................................... 2
1.1.2. Levadura y β-glucano .................................................................................................... 3
1.2. Proceso de extracción ............................................................................................................ 4
1.3. Suplemento alimenticio ......................................................................................................... 5
1.3.1. Digestión del β-glucano en el estómago y absorción en el intestino ................................ 5
2. OBJETIVOS.............................................................................................................................. 6
2.1. Objetivo General ................................................................................................................... 6
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................................ 6
3. METODOLOGÍA...................................................................................................................... 7
3.1. Recolección y preparación de materia prima .......................................................................... 7
3.2. Proceso de extracción ácido-base de β-glucano...................................................................... 7
3.2.1. Autolisis ........................................................................................................................ 7
3.2.2. Hidrólisis ....................................................................................................................... 8
3.2.3. Secado ........................................................................................................................... 8
3.3. Pruebas de medición ............................................................................................................. 9
3.3.1. Termobalanza ................................................................................................................ 9
3.3.2. Termogravimetría (TGA) ............................................................................................... 9
3.3.3. Microscopía electrónica de barrido (SEM) ..................................................................... 9
3.3.4. Espectroscopia de transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) ......... 10
3.3.5. Espectrofotometría ....................................................................................................... 10
3.4. Simulación básica de digestión in vitro estática estandarizada.............................................. 11
3.5. Lotes ................................................................................................................................... 12
3.5.1. Lote 1 .......................................................................................................................... 12
3.5.2. Lote 2 .......................................................................................................................... 12
3.5.3. Lote 3 .......................................................................................................................... 12
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................. 13
4.1. Lote 1 (Tipos de ácido) ....................................................................................................... 13

v
 5.1.1. Recuperación y pureza ................................................................................................. 13
4.2. Lote 2 (Tipos de secado) ..................................................................................................... 14
4.2.1. Recuperación y pureza ................................................................................................. 14
4.2.2. Caracterización de las muestras.................................................................................... 21
4.2.3. Digestión in vitro estática estandarizada ....................................................................... 23
4.3. Lote 3 (Tiempos de incubación) .......................................................................................... 24
4.3.1. Recuperación y pureza ................................................................................................. 24
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 27
6. REFERENCIAS ...................................................................................................................... 28
ANEXOS ........................................................................................................................................ 30

vi
 LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de β-glucano según las ramificaciones. .......................................................... 2
Figura 2. Tipos de β-glucano. ............................................................................................................ 2
Figura 3. División de la pared celular de la levadura. ......................................................................... 3
Figura 4. Proceso general de extracción de β-glucano. ....................................................................... 7
Figura 5. Diagrama del proceso de la autolisis. .................................................................................. 7
Figura 6. Diagrama del proceso de la hidrólisis. ................................................................................. 8
Figura 7. Contenido p/p de β-glucano de las muestras hidrolizadas con ácido acético y ácido
clorhídrico. ...................................................................................................................................... 14
Figura 8. Contenido p/p de β-glucano de las muestras secadas usando distintos métodos. ................. 16
Figura 9. FTIR del control de β-glucano. ......................................................................................... 16
Figura 10. Estructura molecular del (1,3) β-glucano y el (1,6) β-glucano. ......................................... 17
Figura 11. FTIR de las muestras de β-glucano secadas por a) pulverización, b) al aire, c) con horno y
por d) liofilización. .......................................................................................................................... 18
Figura 12. TGA del a) control de β-glucano y de las muestras de β-glucano secadas por b)
pulverización, c) al aire, d) con horno y por e) liofilización. ............................................................. 20
Figura 13. SEM y EDS para el control de β-glucano. ....................................................................... 21
Figura 14. SEM para las muestras de β-glucano secadas por a) pulverización, b) al aire, c) con horno y
por d) liofilización. .......................................................................................................................... 22
Figura 15. Comparación de pureza de las muestras de β-glucano antes y después de la digestión. ..... 24
Figura 16. Contenido p/p de β-glucano de las muestras usando distintos tiempos de incubación en la
autolisis. .......................................................................................................................................... 25
Figura 17. FTIR para las muestras de β-glucano con tiempos de incubación de 24, 48 y 72 horas. .... 26
Figura 18. Curva de humedad para la materia prima. ........................................................................ 30
Figura 19. Curva de humedad para la muestra extraída en la hidrólisis con ácido acético. ................. 30
Figura 20. Curva de humedad para la muestra extraída en la hidrólisis con ácido clorhídrico. ........... 31

vii
 LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Parámetros para determinar la cantidad de β-glucano. ........................................................ 11
Tabla 2. Compuestos para preparar la solución electrolítica. ............................................................ 11
Tabla 3. Registro de pérdida de peso para el lote 1. .......................................................................... 13
Tabla 4. Registro de pérdida de peso para el lote 2. .......................................................................... 15
Tabla 5. Eliminación de humedad para distintos tipos de secado. ..................................................... 15
Tabla 6. Registro de pérdida de peso en la digestión para los diferentes tipos de secado. .................. 23
Tabla 7. Registro de pérdida de peso para el lote 3. .......................................................................... 24

viii
 1. INTRODUCCIÓN

La cerveza es una de las bebidas más producidas y consumidas en la sociedad, con más de 5.000 años
de antigüedad. Para el año 2016 China alcanzó una producción de 406 millones de hectolitros de
cerveza, Estados Unidos 221, Brasil 133 y México 105, con un crecimiento anual de aproximadamente
el 8%, según datos de Statista (Huffington Post, 2018). Para el caso de Colombia, Bavaria S.A. reporto
en su informe de sostenibilidad del año 2018 una producción total de 24’845.524 hectolitros, esto sin
contar el mercado artesanal que representa un gran porcentaje en las ventas cerveceras (Bavaria S.A. ,
2018). Ahora bien, es importante destacar que el proceso de elaboración de cerveza deja una cantidad
significativa de subproducto de levadura, por ejemplo, Bavaria S.A. para el año 2018 produjo
40’809.553 toneladas de desecho de levadura (Bavaria S.A. , 2018). Actualmente las empresas
productoras de cerveza disponen la levadura principalmente para la producción de concentrado para
animales o lo desechan en aguas residuales contaminando fuentes hídricas naturales. Por otra parte, el
β-glucano es un polisacárido de glucosa que se encuentra en la levadura y que tiene una variedad de
usos, dentro de ellos se destaca su uso como fibra de suplemento nutricional que mejora el sistema
inmune (Chan, Chan, & Sze, 2009).

Hasta el momento se han desarrollado investigaciones de extracción de β-glucano de diferentes fuentes

primarias, donde se destacan los hongos y los cereales que poseen la mayor cantidad de β-glucano
(Pizarro, Ronco, & Gotteland, 2014). Se han realizado estudios de extracción ácido-base para distintas
cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae bajo cultivo controlado y sin tratar, donde se encontraron
valores de β-glucano presente del 3,4% (±0,3%) con una pureza del 39% (±3,0%) (Pengkumsri, y otros,
2016). No obstante, en dicho estudio solo se desarrolló un tipo de secado y no se tuvo en cuenta las
implicaciones que esto puede tener en la caracterización física y química del β-glucano obtenido, siendo
un factor fundamental a la hora de implementar un producto (Zechner-Krpan, y otros, 2010).

1.1. β-glucano

El β-glucano es un carbohidrato que está formado por la unión de moléculas de glucosa a través enlaces
glucosídicos 1→3 lineales (Chan, Chan, & Sze, 2009). Este compuesto es un componente importante
de la pared celular de la levadura, hongos y bacterias y también de algunos cereales como el trigo y la
avena (Volman, Ramakers, & Plat, 2007). Es uno de los polisacáridos más abundantes en la tierra
(Chaiyasut, y otros, 2018).

El β-glucano cuenta con distintas propiedades que lo hace un producto de interés. Por una parte, actúa
como agente estabilizante, espesante y emulsionante, por lo que es útil en la industria de alimentos en
la fabricación de sopas, salsas y bebidas (Chaiyasut, y otros, 2018). También, se han determinado sus
efectos beneficiosos frente diversas enfermedades y trastornos como el cáncer colorrectal, la
enfermedad coronaria, los niveles de glucosa en la sangre y la resistencia a la insulina (Chaiyasut, y
otros, 2018). De igual manera, se conoce que el β-glucano es un potente inmunomodulador con efectos
sobre la inmunidad (Volman, Ramakers, & Plat, 2007). Así, la extracción de β-glucano y el estudio de
su potencial valor terapéutico merecen una investigación más a fondo. Esto debido a que este no es un
compuesto costoso, es abundante y tiene un buen margen de seguridad con base a registros históricos
(Chan, Chan, & Sze, 2009).

La mayoría de los β-glucanos son carbohidratos no digeribles y al ser consumidos, son fermentados en
diferentes grados por la flora microbiana intestinal. Es por esto que se ha especificado que sus
propiedades inmunomoduladoras pueden atribuirse en parte a un efecto dependiente de los microbios

1
dentro del cuerpo. Sin embargo, los β-glucanos pueden unirse directamente a receptores específicos de
células inmunes, lo que sugiere un efecto inmunomodulador microbiano independiente (Chan, Chan, &
Sze, 2009).

1.1.1. Estructura y tipos de β-glucano

Dependiendo de la procedencia del β-glucano, estos pueden tener diferentes estructuras moleculares.
Por un lado, la pared celular de β-glucanos de levadura y de hongos en general está compuesta por
ramas de moléculas de glucosa unidas mediante enlaces glucosídicos β-1,3 y por algunas ramas unidas
con enlaces β-1,6 (Figura 1). Las paredes celulares de la avena y de la cebada contienen β-glucanos no
ramificados con residuos de 1,3 y 1,4 glucopiranosil unidos por enlaces β (Figura 1). Los β-glucanos
de origen bacteriano son residuos no enlazados de 1,3 glucopiranosil unidos por enlaces β (Volman,
Ramakers, & Plat, 2007).

β-glucano de cereal β-glucano de levadura

Figura 1. Clasificación de β-glucano según las ramificaciones. Tomado de: (Volman, Ramakers, & Plat, 2007)

Además de las diferencias en el tipo de enlace y ramificación, los β-glucanos pueden variar en
solubilidad, masa molecular, estructura terciaria y en otras propiedades moleculares dependiendo su
procedencia de obtención (Figura 2). Todas estas características pueden influir en sus efectos de
inmunidad en humanos (Pizarro, Ronco, & Gotteland, 2014). Por un lado, se ha sugerido que un mayor
grado de complejidad estructural del β-glucano está asociado a un mayor efecto inmunomodulador y
anti-cáncer (Chan, Chan, & Sze, 2009). También, se ha indicado recientemente que los β-glucanos de
alto peso molecular proveniente de hongos activan directamente los leucocitos o glóbulos blancos
(células sanguíneas ejecutoras de la respuesta inmunitaria), mientras que los β-glucanos de bajo peso
modulan la respuesta de las células cuando son estimuladas por citoquinas (proteínas que coordinan la
respuesta del sistema inmunológico) (Volman, Ramakers, & Plat, 2007).

2
 Procedencia Estructura Descripción

Bacterias (1,3) β-Glucano

Cadenas lineales de (1,3) β-Glucano con

Hongos
ramificaciones cortas de (1,6) β-Glucano

Cadenas lineales de (1,3) β-Glucano con

Levadura
ramificaciones largas de (1,6) β-Glucano

Cereal (1,3) β-Glucano lineal / (1,4) β-Glucano

Figura 2. Tipos de β-glucano. Tomado de: (Volman, Ramakers, & Plat, 2007) (Stewart, 2018)

1.1.2. Levadura y β-glucano

Las levaduras son microorganismos unicelulares del reino fungi. Estos hongos poseen una pared celular
que es una envoltura rígida y está situada entre la membrana plasmática y el medio externo. Dicha pared
es esencial para proteger la célula del exterior y para permitir el intercambio de sustancias necesarias
para la célula. De la pared celular se distinguen esencialmente dos capas (Figura 3): la fibrilar (quitina)
y la homogénea (β-glucanos). Dichas capas están envueltas en glicomanoproteinas, las cuales miden la
adhesión de la levadura a las células huésped. Debajo de la pared celular se encuentra la membrana
plasmática, que energiza la entrada de nutrientes y modula el pH intracelular y extracelular.

Glicoproteína

Manoproteína

β-glucano

Quitina

Manoproteína

Membrana plasmática

Figura 3. División de la pared celular de la levadura. Tomado de: (Stewart, 2018)

Algunos estudios in vitro y en animales han demostrado que el 1,3 β-glucano conseguido de la levadura
y de los hongos pueden mejorar la capacidad de respuesta o el funcionamiento de las células
inmunitarias, sin embargo, estos estudios se han llevado a cabo un número limitado de veces en
humanos (Volman, Ramakers, & Plat, 2007). Por su lado, el β-glucano de la cepa de levadura S.
cerevisiae puede inducir a la producción de TNF-α (citosina liberada por células del sistema inmunitario
que intervienen en la inflamación, la apoptosis entre otras patologías), y también activa las células
mononucleares y los neutrófilos in vitro (Chaiyasut, y otros, 2018). El β-glucano provoca el
funcionamiento de las células inmunes de un huésped y la citotoxicidad en células cancerígenas
(Chaiyasut, y otros, 2018).

3
Adicionalmente, estudios realizados con levaduras de S. cerevisiae revelan que la pared celular
representa de un 10 a 25% total de materia seca de levadura y de dicha pared celular entre el 85 al 90%
son polisacáridos y el restante son proteínas. Dicho esto, se encuentra tres tipos de polisacáridos en la
pared celular de la levadura: polímeros de manosa o manano-proteínas, hasta un 50% de la materia seca,
polímeros de glucosa o β-glucano (1,3/1,6) se encuentran hasta un 55% de la materia seca, y en menor
proporción polímeros de N-acetil-glucosamina o quitina en un 6% de materia seca. Resumiendo, se
puede recuperar entre el 4 al 12% de materia seca de levadura en β-glucano (López R. , 2007).

1.2. Proceso de extracción

En la actualidad, existen distintas técnicas para la recuperación del β-glucano; sin embargo, es
importante escoger un adecuado método de extracción con el fin de conservar la estructura, la calidad
y la funcionalidad del β-glucano (Chaiyasut, y otros, 2018). Usualmente, la extracción de β-glucano de
levadura S. cerevisiae consiste en dos pasos principales: lisis de la célula de la levadura, que es el
proceso donde se da la separación de la pared celular del citoplasma; y extracción del β-glucano, donde
se extrae el producto a través de la pared celular insoluble. Por su parte, la lisis de la célula puede ser
química (utilizando hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido acético o ácido cítrico), física
(utilizando sonicación o alta presión) o enzimática (autolisis) (Chaiyasut, y otros, 2018). A
continuación, se explicarán los fundamentos de la autolisis y de la hidrólisis ácido-base debido a que
fueron las técnicas utilizadas en esta investigación para la extracción de β-glucano.

En una lisis enzimática o autolisis, se auto digieren los compuestos intracelulares (como los péptidos,
los aminoácidos, ácidos grasos, y nucleótidos y los biopolímeros de la pared celular como los glucanos
y las mano proteínas) debido a la acción de las propias enzimas de la célula de la levadura. Esta puede
ocurrir cuando la célula está sometida a diferencias de presión osmótica extracelular e intracelular. En
un proceso de autolisis se distinguen 4 grandes pasos. Primero, se degradan las endoestructuras celulares
(debido a causas externas como presión osmótica) liberando enzimas proteasas de las vacuolas en el
citoplasma. Luego, dichas proteasas son inhibidas por inhibidores citoplasmáticos que al degradarse
liberan las enzimas activadas. Posteriormente, a causa de las enzimas los componentes poliméricos
intracelulares se hidrolizan y los productos de esta hidrólisis se acumulan sobre la pared celular.
Finalmente, los productos de la hidrólisis se liberan de la levadura cuando sus masas moleculares se
vuelven lo suficientemente pequeñas como para poder atravesar los poros existentes en la pared celular
(Volman, Ramakers, & Plat, 2007).

Dado que en la autolisis se obtiene grandes cantidades de celulosa provenientes de las paredes celulares,
para extraer el β-glucano es necesario hacer un rompimiento de estas biomoléculas. Para esto se realiza
un proceso de hidrólisis acido-base, donde una molécula de agua se divide en un ion hidroxilo (OH -) y
un protón (H+) que es inmediatamente hidratado para formar hidronio (H3O+), ocasionado que el
hidrógeno de ésta se una al oxígeno del extremo de la molécula y el ion de hidroxilo (OH -) se una al
resto de la misma, causando un rompimiento entre las cadenas de β-glucano. De este modo se simplifica
la molécula de celulosa en varios componentes de β-glucano y así pues este polisacárido pueda ser
analizado y cuantificado más fácilmente (Schiavone, y otros, 2014). En adición, es importante
reconocer que la hidrólisis acido-base se puede dar en 4 escenarios diferentes:

• Hidrólisis ácido fuerte-base fuerte: En este caso no se produce casi hidrólisis, al no ser los cationes
y aniones muy reactivos, dado que son débiles. El pH en este caso será neutro.
• Hidrólisis ácido débil-base fuerte: En este caso la debilidad del ácido (y por ende del anión) generará
iones hidroxilo, mientras que el catión, siendo fuerte, no reaccionará. El pH resultante será básico.

4
• Hidrólisis ácido fuerte-base débil: Caso contrario al anterior, la debilidad de la base (y por ende del
catión) generará iones hidronio (hidroxonio), mientras que los aniones no reaccionarán. El pH
resultante será ácido.
• Hidrólisis ácido débil-base débil: La alta reactividad de tanto los cationes como los aniones, por lo
que habrá un equilibrio mayor o menor en la reacción y se producirán tanto iones hidroxilos como
hidronios. El pH de esta reacción será neutro.

1.3. Suplemento alimenticio

Los β-glucanos tienen diferentes aplicaciones en el mercado dependiendo de su procedencia y

características propias, se puede usar como espesante, para mejorar la calidad sensorial de bebidas,
como materia prima para la generación de mermeladas, entre otras. Sin embargo, dentro del mercado
se destaca su implementación como fibra suplementaria en la industria nutraceútica dada su riqueza
nutricional que se puede extender hasta el uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades tales
como asma, cáncer, artritis y problemas intestinales, además, de normalizar los niveles de colesterol
(López & Vivanco, 2015). Lo anterior se debe a que esencialmente el β-glucano es un modificador de
respuesta biológica que activa el sistema inmunitario, específicamente los macrófagos y neutrófilos, los
cuales son la primera línea de defensa del sistema inmunológico que se encarga de aniquilar bacterias,
virus y otros patógenos. No obstante, puede existir la posibilidad de sobreestimular el sistema
inmunitario y causar el efecto contrario, por esta razón se recomienda manejar dosis de 100 mg a 200
mg por día (Lehne, y otros, 2005).

1.3.1. Digestión del β-glucano en el estómago y absorción en el intestino

Para la implementación de un suplemento alimenticio es necesario realizar un estudio sobre el paso del
producto de β-glucano por el estómago para asegurar su llegada al intestino. Allí, las moléculas de
β-glucano grandes son absorbidas por los macrófagos en la pared intestinal y luego se activan, por lo
que se abren camino a los ganglios linfáticos y la médula ósea. Los β-glucanos se dividen en fragmentos
más pequeños de glucano en la médula ósea, donde se enlazan con los receptores específicos en las
células inmunes (neutrófilos y eosinófilos), las cuales son entonces activadas y estimuladas (Chan,
Chan, & Sze, 2009).

5
 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General

Evaluar, analizar y proponer factores de operación para la metodología de extracción ácido-base de

β-glucano a partir del residuo de levadura que deja la producción de cerveza y diseñar un producto
nutracéutico a partir del extracto.

2.2. Objetivos específicos

1. Evaluar el porcentaje de recuperación y pureza de β-glucano que se puede obtener a partir de la

metodología de extracción ácido-base cambiando variables del proceso (tiempo de incubación en
la autolisis, tipo de ácido en la hidrólisis y método de secado).

2. Caracterizar la morfología de las partículas de β-glucano obtenidas mediante la metodología de

extracción ácido-base y secadas con diferentes métodos.

3. Analizar el producto nutracéutico obtenido a partir de un estudio de digestión in vitro estandarizado

estático.

6
 3. METODOLOGÍA

3.1. Recolección y preparación de materia prima

Se utilizó el desecho de levadura líquida proveniente del proceso de producción de cerveza de la

empresa MoonShine para la obtención y análisis de β-glucano. En dicho proceso se usaron 190 gramos
de levadura SafAle S-04 (Fermentis, 2016) para la producción de aproximadamente 400 litros de
cerveza tipo IPA, cuyo proceso de fermentación duró 8 días a temperatura de 21°C. Para su recolección
se realizó una purga de la levadura del fermentador cilindro-cónico de acero inoxidable al final del
proceso, la cual fue almacenada en un recipiente de 1 litro previamente sanitizado con desinfectante
Star San de la empresa Distrines. Se le llama materia prima al residuo de levadura que ya pasó por un
proceso de centrifugación de 4000 rpm durante 10 minutos, esto se hace con el fin de retirar la mayor
cantidad de agua posible.

3.2. Proceso de extracción ácido-base de β-glucano

Para el proceso de extracción de β-glucano se siguió una metodología de extracción ácido-base

(Pengkumsri, y otros, 2016), la cual se basa en pasar la materia prima por un proceso de autolisis,
hidrólisis y finalmente por un proceso de secado, tal como se muestra en la figura 4.

Figura 4. Proceso general de extracción de β-glucano.

3.2.1. Autolisis

En la figura 5 se presenta el proceso detallado que se realizó para la autolisis.

Figura 5. Diagrama del proceso de la autolisis.

7
 3.2.2. Hidrólisis

En la figura 6 se presenta el proceso detallado que se realizó para la hidrólisis.

Figura 6. Diagrama del proceso de la hidrólisis.

3.2.3. Secado

Para el caso de estudio se realizaron diferentes tipos de secado. A continuación, se muestra cómo se
implementó cada tipo de secado en el proceso experimental (Zechner, y otros, 2010).

• Secado al aire

Se recogió el pellet resultado del proceso de hidrólisis, para posteriormente ser lavado con 3 veces de
etanol absoluto. Preparada la muestra se prosiguió a hacer un montaje de filtrado al vacío con un
embudo Büchner, un kitasato y un papel filtro que recogía la muestra filtrada. Terminada la filtración
se dejó secar la muestra a temperatura ambiente para posteriormente ser recogida y molida con la ayuda
de un mortero hasta obtener sólidos que pasaran por un tamiz de 0,5 mm.

8
• Secado por pulverización

Dado que el pellet obtenido en la hidrólisis era insoluble en cualquier tipo de disolvente fue necesario
hacer una mezcla heterogénea y sonicarla. Para esto se preparó una mezcla a 1,5% (p/v) de pellet sobre
agua destilada y se pasó por un sonicador que operaba con ciclos de 20 segundos de sonicación con 40
segundos de descanso en un tiempo total de sonicación de 15 minutos y amplitud de onda del 36%
(sonicador marca Sonics de amplitud máxima del 40%). Preparada la mezcla heterogénea se continuó
con la utilización del equipo de secado por pulverización (marca LABCONCO) con una entrada de aire
de 195°C y una temperatura de salida de 155°C. En este caso no se utilizó el mortero ya que el sólido
obtenido pasaba por un tamiz de 0,5 mm.

• Secado con horno

Para el secado con horno se tomó el pellet obtenido al final de la hidrólisis, se colocó en una caja de
Petri y se dejó secando en un horno durante 3 días a 30°C, para posteriormente ser recogido y molido
con la ayuda de un mortero hasta obtener solidos que pasaran por un tamiz de 0,5 mm.

• Secado por liofilización

Para la liofilización se congeló el pellet obtenido en la hidrólisis en un ultracongelador a una

temperatura de -80 °C durante 1 hora, posteriormente se introdujo a un liofilizador que operaba a una
temperatura de -20 °C y se dejó durante 2 semanas hasta obtener un sólido completamente seco que
finalmente fue molido hasta pasar por un tamiz de 0,5 mm.

3.3. Pruebas de medición

Durante el proceso experimental se emplearon diversas pruebas de medición que permitieron

determinar factores relevantes sobre el caso de estudio. A continuación, se muestra el desarrollo
experimental para cada prueba de medición realizada. Todas las pruebas se desarrollaron con el
β-glucano molido obtenido al final del proceso de secado, a menos que se indique lo contrario.
3.3.1. Termobalanza

Se usó una termobalanza XM 60 (marca Precisa) que operaba a una temperatura de 107°C para
determinar el porcentaje de humedad contenido en la materia prima, también, al pellet obtenido
finalizado el proceso de hidrólisis para los métodos en los cuales se usó ácido clorhídrico y ácido
acético.
3.3.2. Termogravimetría (TGA)
Se usó un equipo termogravimétrico SDT Q600 (marca TA Intruments) con una velocidad de
calentamiento de 10 °C/min y temperatura de alcance máxima de 650 °C.
3.3.3. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Se usó un microscopio LYRA3 (marca TESCAN) para tener imágenes de alta resolución sobre la
estructura de la partícula obtenida de β-glucano, además, con este se realizó un análisis EDS para ver
la composición química de la partícula. Para poder analizar la partícula en el microscopio se hizo una
preparación previa a la muestra, la cual consistió en hacer un recubrimiento de una capa muy fina de
oro sobre la muestra a analizar.

9
 3.3.4. Espectroscopia de transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR)

Para la espectroscopia de transmisión de infrarrojo con transformada de Fourier se utilizó un equipo

ALPHA Eco-ATR (marca BRUKER). Para la prueba de medición se usó un rango espectral de 500 a
4000 cm-1 a 4 cm-1 de resolución, además todos los resultados fueron normalizados.
3.3.5. Espectrofotometría

Para determinar la cantidad de β-glucano presente en las muestras extraídas fue necesario realizar
mediciones de absorbancia en un espectrofotómetro UV-Vis (Cary 50). Para esto se utilizó el kit
enzimático brindado por Megazyme (Megazyme, 2018) el cual contaba con 6 reactivos.

• Reactivo uno: Preparación de GlucazymeTM (exo-1,3-β-glucanasa, endo-1,3-β-glucanasa,

β-glucosidasa y quitinasa en suspensión).
• Reactivo dos: Buffer GOPOD (buffer, ácido p-hidroxibenzoico y azida de sodio).
• Reactivo tres: Sustancia enzimática GOPOD (glucosa oxidasa más peroxidasa y 4-aminoantipirina).
• Reactivo cuatro: Solución estándar de D-glucosa.
• Reactivo cinco: Control de β-glucano fúngico.
• Reactivo seis: Control de almidón.

Para la medición de β-glucano se agregó 20 mg (±0,1 mg) de la muestra molida junto con 0,4 mL de
hidróxido de potasio (2M) en un tubo Falcon, que posteriormente se dispuso en un beaker con baño de
hielo para ser agitado en un Shaker durante 30 minutos a 120 rpm. Terminado el tiempo de agitación,
se agregó 1,6 mL de buffer de acetato de sodio (1,2 M y pH 3,8) y 40 µL de Glucazyme al tubo.
Consecutivamente se mezcló en un baño de hielo por 2 minutos y luego se transfirió a un baño de agua
con temperatura de 40°C y se incubó por 16 horas. Finalizada la incubación se retiró el tubo, se agregó
10 mL de agua destilada y se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos a una temperatura de 15°C.
Seguidamente, se transfirió 0,1 mL de la fase liquida obtenida en la centrifugación a un tubo de ensayo,
4 mL del reactivo tres y se incubó por 20 minutos a 40°C. Finalmente, se realizó una medición de
absorbancia sobre la muestra obtenida con una longitud de onda de 510 nm.

Es importante destacar que el proceso anteriormente mencionado se realizó para cada una de las
muestras a evaluar, el control de β-glucano y el control de almidón. Adicionalmente, junto con las
mediciones que se realizaron se tenía un blanco (0,1 mL de buffer de acetato de sodio 200 mM y pH
5,0 más 4 mL de reactivo tres) y un estándar (0,1 mL de D-glucosa más 4 mL de reactivo tres), que
también fueron incubados por 20 minutos a 40°C para después ser medido junto con las demás muestras
y controles.

Dicho lo anterior se utilizó la ecuación 1 (Megazyme, 2018) para determinar la cantidad de β-glucano
presente en cada una de las muestras analizadas según el valor de absorbancia obtenido.

p 12,04 100 1 162

β − glucano (% ) = ∆E ∗ F ∗ ∗ ∗ ∗ (Ecuación 1)
p 0,1 𝑊 1000 180

Todos los parámetros asociados a la ecuación 1 se muestran en la tabla 1 con su respectiva descripción.

10
 Tabla 1. Parámetros para determinar la cantidad de β-glucano. Tomado de: (Megazyme, 2018)

Parámetro Descripción
ΔE Lectura de absorbancia contra reactivo en blanco.

Absorbancia D-glucosa estándar dividida por absorbancia de la

F
muestra.
12,04
Corrección de volumen (0,1 mL tomado de 12,04 mL).
0,1
100 Factor para presentar β-glucano como porcentaje del peso de la
𝑊 muestra.
1
Conversión de µg a mg.
1000

W Peso de la muestra analizada en mg.

162 Factor para convertir de D-glucosa libre a anhidro D-glucosa como
180 ocurre en el β-glucano.

3.4. Simulación básica de digestión in vitro estática estandarizada

Teniendo en cuenta que con el β-glucano obtenido al final del proceso de secado se planea desarrollar
una fibra suplementaria que se maneje en la industria nutracéutica, se realizó un estudio básico de
digestión humana con el fin de analizar su paso por el fluido gástrico. Para dicha prueba, se empastilló
el β-glucano seco y molido en capsulas de gelatina vacías con dosis de 50 mg. Por otro lado, se realizó
la simulación del fluido gástrico mediante un método estandarizado de digestión in vitro estático para
alimentos (Minekus, y otros, 2014). En primer lugar, el método propone preparar una solución
electrolítica que básicamente consiste en mezclar los elementos mostrados en la tabla 2 y posteriormente
diluirlos en agua destilada hasta completar un volumen total de 500 mL, dicha disolución será llamada
solución electrolítica.
Tabla 2. Compuestos para preparar la solución electrolítica. (Minekus, y otros, 2014)

Compuesto químico Molaridad Volumen agregado (mL)

KCl 0,5 6,9
KH2PO4 0,5 0,9
NaHCO3 1 12,5
NaCl 2 11,8
MgCl2(H2O)6 0,15 0,4
(NH4)2CO3 0,5 0,5

Por otro lado, se utilizó pepsina de mucosa gástrica porcina de 3200 U/mg para preparar una solución
de actividad enzimática de 25000 U/mL. Por otra parte, se preparó CaCl2 0,3 M. Ya con las sustancias
preparadas se agregó en un beaker 60,8 mL de la solución electrolítica, 3,2 mL de pepsina, 0,4 mL de
CaCl2, 15,6 mL de agua destilada y se mezcló. Adicionalmente, se agregó HCl 1 M hasta ajustar el pH
de la mezcla a 3.
Ya para el montaje experimental se tomó la pastilla previamente preparada, se introdujo en una bolsa
de té vacía (para después recuperar la muestra fácilmente) y se dispuso en el beaker con la mezcla

11
realizada. El beaker se colocó en un shaker a 37 °C con agitación de 80 rpm durante 2 horas. Finalizada
las dos horas se retiró la bolsa de té y se abrió para recuperar la muestra de β-glucano que quedó después
de la simulación del proceso de digestión, a las muestras recuperadas se les tomó el peso final para
determinar el porcentaje de pérdida de peso en la digestión y adicionalmente se realizaron pruebas de
espectrofotometría para ver si se alteró la cantidad de β-glucano presente en la muestra.
Nota: Como se mencionó anteriormente el proceso de digestión realizado es una experimentación
básica que solo buscó evaluar la resistencia del β-glucano en una simulación de líquido gástrico, es
decir, que para la aplicación del producto en la industria nutracéutica son necesarios más estudios de
digestión humana donde se tengan en cuenta otros órganos pertenecientes al sistema digestivo.
3.5. Lotes

Para el proceso experimental se realizaron 3 lotes en los cuales se cambiaron algunos factores de la
metodología de extracción con el fin de analizar diferentes aspectos que fueron relevantes sobre la
obtención de β-glucano. Asimismo, para cada lote se realizaron pruebas de medición específicas
dependiendo de lo que se quería evaluar. A continuación, se muestra el objetivo, las variables alteradas
en el proceso de extracción y las pruebas de medición que fueron desarrolladas para cada uno.
3.5.1. Lote 1

El objetivo de este lote fue analizar el tipo de ácido que se debía utilizar en la hidrólisis entre ácido
clorhídrico y ácido acético con el fin de ver cual presentaba los mejores resultados de recuperación y
pureza para seguir con su implementación en los lotes posteriores. Así pues, se realizó todo el proceso
de extracción antes mencionado con 5 réplicas para cada caso con una materia prima inicial de 6 g,
además, todas las muestras fueron secadas con horno. A cada una de las muestras se le tomo el registro
de peso para determinar el valor de recuperación (teniendo en cuenta el contenido de humedad según
las pruebas en la termobalanza) y se realizaron pruebas de espectrofotometría para evaluar la pureza de
cada caso.
3.5.2. Lote 2

El objetivo de este lote fue analizar la recuperación, pureza, morfología de las partículas y la evaluación
de la digestión para las muestras de β-glucano obtenidas por diferentes tipos de secado. Para esto, se
realizó todo el proceso de extracción (con el ácido seleccionado en el lote 1) donde terminada la
hidrólisis se realizó secado al aire, con horno, liofilización y por pulverización. Así pues, se hicieron 4
muestras por duplicado con una materia prima inicial de 75 g. A cada una de las muestras ya secas y
molidas se les realizó pruebas de TGA, SEM, FTIR y espectrofotometría, además, cada una se pasó por
la simulación de digestión.
3.5.3. Lote 3

El objetivo de este lote fue analizar la pureza y la caracterización química del β-glucano obtenido
cambiando el tiempo de incubación en la autolisis, donde se implementó un tiempo de incubación de
24, 48 y 72 horas (3 muestras con duplicado). El resto del proceso de extracción se desarrolló
normalmente (con el ácido seleccionado en el lote 1) con secado al aire para todas las muestras, se tomó
una materia prima inicial de 75 g para cada caso. A cada una de las muestras ya secas y molidas se le
realizó pruebas de FTIR y espectrofotometría.

12
 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Lote 1 (Tipos de ácido)

5.1.1. Recuperación y pureza

En la tabla 3 se observan los resultados de pérdida de peso después del proceso de extracción tanto para
ácido acético como para ácido clorhídrico. Dado que fueron 5 réplicas para cada uno, se muestra el
promedio y una desviación estándar.
Tabla 3. Registro de pérdida de peso para el lote 1.

Pérdida de peso con respecto al Acumulación de pérdida de peso

peso inicial de la materia prima (%) (%)

Proceso Ácido clorhídrico Ácido acético Ácido clorhídrico Ácido acético

Finalizada la autolisis 23,2 ± 1,1 23,3 ± 1,2 23,2 ± 1,1 23,3 ± 1,2

Hidrolisis - Finalizado el
46,7 ± 1,5 45,8 ± 1,0 69,9 ± 1,3 69,1 ± 1,3
tratamiento con NaOH

Hidrolisis - Finalizado el
7,0 ± 1,1 6,5 ± 0,9 76,9 ± 1,5 75,6 ± 1,4
tratamiento con HCl

Se utilizaron las curvas de humedad (ver anexos) para conocer el peso seco de la materia prima y de los
extractos finalizada la hidrólisis, con el fin de realizar los cálculos de la recuperación. Por un lado, se
determinó que el peso seco de la materia prima corresponde al 29,53%. Por otro lado, se encontró que
los pellets obtenidos al final de la hidrólisis con ácido clorhídrico y ácido acético tienen un porcentaje
de humedad del 94,5% y 92,9%, respectivamente. No obstante, eliminar por completo el porcentaje de
humedad contenido en el extracto es una tarea difícil y también varía dependiendo del tipo de secado.
Dado que para este caso se utilizó solo secado con horno para todas las muestras, se registró que este
elimina el 92% de humedad total existente en la muestra.
Así pues, utilizando la información anterior, se obtuvo que se recupera el 6,2% (±0,4%) del peso de
materia prima seca inicial en muestra seca con β-glucano para el ácido clorhídrico y 6,8% (±0,4%) para
el ácido acético. De esta manera, por ejemplo, si se comienza con 100 g de materia prima seca se
obtendrá alrededor de 6,2 g de muestra seca con β-glucano si se hidroliza con ácido clorhídrico y 6,8 g
si se hidroliza con ácido acético. Es importante notar que no existe diferencia significativa en la
recuperación utilizando hidrólisis con ácido clorhídrico o ácido acético.
Sumado a lo anterior, se realizaron pruebas de espectrofotometría para determinar la pureza de las
muestras extraídas utilizando los dos ácidos. Así, en la figura 7 se muestra el contenido promedio de
β-glucano en las muestras del lote 1 extraídas usando hidrolisis con ácido acético y ácido clorhídrico.
Se puede observar que el contenido promedio de β-glucano en las muestras hidrolizadas con ácido
clorhídrico es de 25,0 g β-glucano/100 g muestra, el cual es mayor al de las muestras hidrolizadas con ácido
acético (15,2 g β-glucano/100 g muestra). También se observa que las muestras hidrolizadas con ácido acético
carecen de precisión, mostrando una desviación estándar de ±14,4 contrario a las de ácido clorhídrico
con una desviación estándar de ±3,1. Comparado con el control (43,0 g β-glucano/100 g muestra), las muestras
extraídas tanto con ácido clorhídrico como con ácido acético son menos puras. Esto se atribuye al

13
desgaste de la pared celular de la levadura durante la fermentación en la producción de cerveza
(Acevedo, y otros, 2015).

Figura 7. Contenido p/p de β-glucano de las muestras hidrolizadas con ácido acético y ácido clorhídrico.

Posteriormente, usando el valor de la cantidad recuperada y de la pureza de las muestras extraídas, se

determinó que la cantidad neta promedio de β-glucano puro en las muestras es de 1,6% y 1,0% para las
muestras hidrolizadas con ácido clorhídrico y con ácido acético, respectivamente.
Según estudios realizados a la levadura S. cerevisiae, los β-glucanos 1-3/1-6 comprenden entre el 4 y
el 12% de la materia seca de su célula (López R. , 2007). Sumado a esto, y como ya se había
mencionado, la composición de polisacáridos, la estructura y el grosor de la pared celular de la levadura
depende y cambia según las condiciones medioambientales impuestas en el fermentador donde se
realiza su crecimiento (López R. , 2007). Según un estudio donde se evaluó la composición de la pared
celular de la levadura S. cerevisiae bajo distintas condiciones de crecimiento, la cantidad de β-glucanos
disminuyó en un radio promedio de 0,75 en los diferentes medios probados para la fermentación
(Aguilar-Uscanga & Francois, 2003).
Así pues, se hizo un cálculo teniendo en cuenta la cantidad máxima de β-glucano que se podía extraer
de la levadura tratada en comparación a la que se extrajo en el proceso experimental. Para el método
realizado con ácido clorhídrico se obtuvo un rendimiento de 26,7% y con el de ácido acético 16,7%.
Por esta razón, se usó ácido clorhídrico para el desarrollo de los lotes 2 y 3.

4.2. Lote 2 (Tipos de secado)

4.2.1. Recuperación y pureza

En la tabla 4 se muestra el resumen de pérdida de peso en cada paso de la extracción del lote 2. Al igual
que el caso anterior se muestra el promedio y la desviación estándar de cada paso en la extracción.

14
 Tabla 4. Registro de pérdida de peso para el lote 2.

Pérdida de peso con respecto al peso Acumulación de

Proceso
inicial de la materia prima (%) pérdida de peso (%)
Finalizada la autolisis 23,0 ± 1,0 23,0 ± 1,0
Hidrólisis - Finalizado el
46,9 ± 0,8 70,0 ± 1,3
tratamiento con NaOH
Hidrólisis - Finalizado el
7,2 ± 0,7 77,1 ± 1,5
tratamiento con HCl

Tal como se mencionó en el análisis del lote 1, se sabe que el pellet obtenido al final de la hidrólisis con
ácido clorhídrico tiene un porcentaje de humedad del 94,5% y necesita ser secado. Para este caso si se
realizaron todos los tipos de secado mencionados en la metodología, obteniendo los resultados
mostrados en la tabla 5.
Tabla 5. Eliminación de humedad para distintos tipos de secado.

Secado Eliminación de humedad total posible (%)

Horno 92,2
Pulverización 94,1
Aire 91,0
Liofilización 93,6

Como se puede evidenciar ningún tipo de secado logra eliminar el 100% de la humedad existente en la
muestra. Así pues, el secado que elimina la mayor cantidad de humedad es el que se hace mediante
pulverización, el cual registro un 94,1% de eliminación de humedad total. Para este caso, se obtuvo que
se recupera el 9,2% (±0,5%), 9,7% (±0,4%), 7,9% (±0,5%) y el 10,6% (±0,4%) del peso de materia
prima seca inicial en muestra seca con β-glucano para los secados con horno, pulverización, aire y
liofilización, respectivamente. Como se puede evidenciar es un poco más alto que el registrado
anteriormente en el lote 1, esto se puede deber a que se trató con mayor cantidad de materia prima
inicial y que los errores experimentales fueron menores.

Posteriormente, con el fin de determinar la influencia del método de secado en la pureza, se realizó la
medición del contenido p/p de β-glucano a las muestras del lote 2. Las barras de color azul de la figura
8 corresponden a la cantidad p/p promedio de β-glucano en las muestras secadas usando los diferentes
métodos y la de color naranja a la cantidad p/p de β-glucano del control (43,0 g β-glucano/100 g muestra).
Puede observarse que la extracción que resultó en la mayor pureza es la que utilizó secado al aire, con
la cual se obtuvieron 38,3 g β-glucano/100 g muestra. La extracción que resultó en la pureza más baja fue la
que utilizó liofilizado como tipo de secado, donde se obtuvieron 13,1 g β-glucano/100 g muestra.

15
 Figura 8. Contenido p/p de β-glucano de las muestras secadas usando distintos métodos.

Teniendo en cuenta los resultados mostrados, se determinó que para el caso de secado con horno,
pulverización, aire y liofilización la cantidad neta promedio de β-glucano puro en las muestras es de
2,4%, 1,7%, 3,0% y 1,4% respectivamente.

Al igual que para el lote anterior, se hizo un cálculo de rendimiento para los secados con horno,
pulverización, aire y liofilización, obteniendo un valor de 40,0%, 28,3%, 50,0% y 23,3%
respectivamente. Dicho esto, se puede evidenciar que el método de extracción con el cual se recupera
la mayor cantidad de β-glucano neto es el que utiliza secado al aire.

Adicionalmente, se realizó un análisis de FTIR a las muestras de β-glucano secadas por los distintos
métodos y al control de β-glucano de levadura al 43,0% con el fin de tener un mejor entendimiento de
las moléculas de β-glucano extraídas mediante la autolisis y la hidrólisis, además, de corroborar su
pureza (Figura 9 y 11). Esta técnica se aplicó en la región de los 4000 a los 500 cm-1. En la figura se
divide con una línea la región de diagnóstico, que esta sobre los 1500 cm-1 y la de huella dactilar, por
debajo de los 1500 cm-1.

Figure 9. FTIR del control de β-glucano.

16
El espectro de control del β-glucano mostró un pico en los 3300cm-1, lo cual corresponde al grupo
funcional –OH. Debido a que este grupo suele estar rodeado de hidrógenos de otras moléculas de
β-glucano, se presenta una señal amplia. Esto corresponde al sistema de puentes de hidrógeno intra e
intercelulares de la estructura helicoidal del β-glucano (Hromádková, y otros, 2003). Los grupos –OH
de la molécula del β-1,3-glucano y del β-1,6-glucano pueden ser observados en la figura 10.

Figure 10. Estructura molecular del (1,3) β-glucano y el (1,6) β-glucano. Tomado de: (Cecchini, Bevilacqua, Giannini, &
Morassut, 2016)

Los picos mostrados alrededor de los 2900cm-1 corresponden al grupo CH con hibridación de carbono
SP3, grupo que conforma la estructura cíclica de la molécula del β-glucano. Como era de esperarse, no
se encuentran enlaces CH con una hibridación diferente debido a que no hay enlaces dobles o triples.

Los siguientes picos que se encuentran en la región de diagnóstico están en el rango de 1750 a 1500
cm-1. Estos corresponden a la presencia de bandas de amida que conciernen a el contenido de proteína
residual presente en el glucano (Hromádková, y otros, 2003).

Utilizando la región de la huella dactilar, puede comprobarse que en su mayoría el espectro FTIR del
control y de todas las muestras analizadas mediante los distintos tipos de secado fueron característicos
del β -1,3-D-glucano, y esto es debido a que esta molécula conforma del 30 al 45% de la pared celular,
mientras que el β-1,6-D-glucano solo compone del 5 al 10% de ella, por lo tanto se esperaba que en los
extractos se encontrara mayormente β -1,3-D-glucano (López R. , 2007). La región de huella dactilar
para esta molécula contiene la vibración de los grupos CC y COC a la frecuencia de 1150 cm -1; dos
bandas parcialmente superpuestas entre los 1010 y 1050 cm-1 que se atribuyen a anillo y al estiramiento
del grupo C-OH; y las bandas a los 820 y 880 cm-1 que corresponde al enlace β-glucosidico y su
deformación (Zechner-Krpan, y otros, 2010).

En la figura 11 se puede observar el resultado de las pruebas FTIR de las muestras de β-glucano
sometidas a diferentes tipos de secados. Cada recuadro muestra la comparación entre las muestras y el
control. En general se observa que las curvas espectrales de las muestras secadas por pulverización,
liofilización y con horno comparten gran cantidad de picos con el control, por lo que se puede afirmar
que poseen una estructura molecular muy parecida (β -1,3-D-glucano). Lo anterior indica que la
metodología de extracción mediante autolisis e hidrólisis con ácidos y base fue buena y que el tipo de
secado no afecta significativamente a la estructura molecular del β-glucano.

La diferencia más notoria entre las muestras y el control es la intensidad de los espectros. Sin embargo,
esto puede deberse a los diferentes tamaños de partícula y la distribución de tamaño de las muestras
(Hromádková, y otros, 2003). Sin embargo, para corroborar dicha hipótesis, las muestras fueron
sometidas a microscopía electrónica de barrido para determinar su tamaño de partícula. Como se
observa en los recuadros de la figura 11, la intensidad de los espectros se organiza de la siguiente
manera: Secado al aire < Secado por liofilización < Secado por pulverización < Secado con horno

17
(Debido al ruido en el espectro de la muestra secada al aire del lote 2, se utilizó el resultado de la muestra
de 48 horas de incubación del lote 3 que también fue secada al aire para realizar la comparación).

Es importante recalcar que los polisacáridos son susceptibles a la formación de enlaces hidrógeno
durante el secado de un medio acuoso. La parte más sensible es la región de estiramiento del grupo
hidroxilo, el cual puede sufrir de cambios en la posición máxima del pico a frecuencias más bajas,
incremento en la intensidad del espectro, amplitud de la banda y distorsión en su simetría (Hromádková,
y otros, 2003).

La frecuencia típica en la que el grupo OH suele absorber el espectro es la región de los 3650 a
3500 cm-1 (Hromádková, y otros, 2003). Sin embargo, todas las muestras evidencian el pico amplio en
3300 cm-1, lo que evidencia la formación de dichos puentes de hidrógeno. La muestra secada con horno
evidencia un incremento de la intensidad de este pico, por lo que se especula que este tipo de secado
lleva a la formación de mayor cantidad de enlaces hidrógeno que en las otras muestras. Por otro lado,
no se observa distorsión en las bandas para este grupo.

a) b)

c) d)
Figure 11. FTIR de las muestras de β-glucano secadas por a) pulverización, b) al aire, c) con horno y por d) liofilización.

El resultado de FTIR para la muestra secada al aire no evidencia la misma similitud que las otras
muestras con el espectro del control de β-glucano. Es probable que esto sea debido a que cuando se
separó la muestra de β-glucano del papel filtro (luego de haber realizado el secado), quedaron restos de
celulosa del papel en la muestra. Debido a lo anterior, la prueba por FTIR muestra ruido en los datos.

18
Esto puede deducirse debido a que los espectros FTIR de las muestras del lote 3 con las que se analizó
el tiempo de incubación, que también fueron secadas al aire pero que se separaron del papel filtro antes
del secado al aire, mostraron picos muy similares a los del blanco.

No obstante, si se observa detenidamente el espectro de la muestra secada al aire de la figura 11 b), se

evidencian algunos picos importantes de la molécula de β-glucano como el grupo CH con hibridación
de carbono SP3 a los 2900cm-1 y una gran similitud en la región de la huella dactilar, por lo que se
especula que también se tiene β -1,3-D-glucano (Hromádková, y otros, 2003).

Por otro lado, la figura 12 a) muestra el análisis termogravimétrico y derivativo termogravimétrico del
control de β-glucano. De acuerdo a dicha figura, se evidencia que la muestra tiene 4 etapas de pérdida
de peso a medida que avanza la temperatura. La primera ocurre antes de los 100 ℃, y esto corresponde
al agua superficial que no está unida a la estructura del β-glucano. Por encima de los 125 ℃ puede
encontrarse otra caída de peso, la cual puede atribuirse a la eliminación de agua unida al β-glucano.
Posterior, hay una gran caída de 250 ℃ la cual corresponde a la degradación térmica de la molécula. La
cuarta etapa sucede después de los 425 ℃ y va hasta los 650 ℃; esta corresponde a la carbonización de
la muestra (Kagimuraa, A. da Cunhaa, Theisa, & Malfattib, 2015).

En la etapa de perdida de agua, la muestra perdió aproximadamente 8% de su peso y en la perdida por

degradación térmica de la molécula se perdió 75% del peso total. Cabe destacar que la muestra es
térmicamente estable al tener caídas bien definidas y solo una degradación.

Se realizaron también análisis termogravimétricos para cada una de las muestras de β-glucano secadas
utilizando los diferentes métodos y sus resultados también se exponen en la figura 12. La primera
observación que puede realizarse es que existe la misma caída por pérdida de agua que la que tiene el
control de β-glucano. De igual manera, la caída drástica por descomposición de la molécula empieza
en 250 ℃; sin embargo, la caída de peso para las muestras analizadas es menos drástica, razón por la
cual las funciones del peso derivativo muestran un pico menos intenso.

Dado que en los análisis de FTIR se concluyó que las muestras solo contienen los grupos funcionales
correspondientes a la molécula de β-glucano, se descarta que la razón del cambio en la temperatura de
descomposición de la molécula sea debido a contaminantes restantes del proceso de extracción.

Se puede especular que el cambio de temperatura en la caída correspondiente a la degradación del

β-glucano de las muestras pudo haberse debido a los diferentes tamaños de partícula. Lo anterior debido
a que, a mayor tamaño, más energía debe aplicarse a la muestra para lograr que toda la partícula tenga
la misma temperatura. De esta manera, como las muestras secadas por los diferentes métodos
presentaron tamaños de partícula más grandes que el control de β-glucano, la caída de degradación de
la molécula y con ello el pico derivativo correspondiente va a estar a una temperatura mayor.

Por otro lado, las cuatro muestras de análisis de secado muestran un pequeño pico en la curva del peso
derivativo aproximadamente a los 240℃. Como se vio en el análisis del FTIR, el secado de una muestra
en un medio acuoso resulta en la creación de puentes de hidrógeno en la molécula (Hromádková, y
otros, 2003), y estos hacen que los compuestos de la muestra posean mayor resistencia a la ebullición.
Así, en el TGA de la figura 12, la formación de los puentes de hidrógeno contribuye a la disminución
de la pendiente de la caída por degradación de la molécula de β-glucano. Esto debido a que los puentes
de hidrogeno hace la muestra mas estable y menos suseptible a la dergadacion termica.

19
 a)

b) c)

d) e)
Figure 12. TGA del a) control de β-glucano y de las muestras de β-glucano secadas por b) pulverización, c) al aire, d) con
horno y por e) liofilización.

20
 4.2.2. Caracterización de las muestras

Es sabido que la actividad inmunológica del β-glucano depende de las dimensiones de las partículas de
la muestra y que esta puede mejorar al reducirse el tamaño de las partículas y de la aglomeración de las
partículas. También, se sabe que las dimensiones de las partículas del β-glucano dependen del método
de secado, y con esto de la actividad biológica (Zechner-Krpan, y otros, 2010).

Así, con el fin de analizar la morfología de las partículas de β-glucano según el tipo de secado, se llevó
a cabo la técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM) a cada una de las muestras. También, se
utilizó la técnica de espectrometría de dispersión de energía de rayos X (EDS) para determinar los
átomos presentes en cada partícula.

En la figura 13 se observa la microestructura de algunas partículas del control de β-glucano junto a los
resultados del EDS, mientras que en la figura 13 se observan partículas de las muestras sometidas a los
distintos tipos de secado. Debido a que los resultados del EDS de todas las muestras y del control fueron
aproximadamente iguales, solo se muestra el resultado del control de β-glucano.

Figure 13. SEM y EDS para el control de β-glucano.

21
Las partículas del control de β-glucano son pequeñas y granulares ya que vienen en forma de polvo con
un diámetro aproximado de 95 μm. Estas partículas no son totalmente regulares y tienen bordes
redondos. En trabajos pasados se determinó la dimensión de la célula de levadura nativa usando
microscopia de luz, donde se encontró un valor de 6,52×8,8 µm (Zechner-Krpan, y otros, 2010). Dada
la aglomeración del β-glucano extraído de cada célula, las imágenes SEM del control muestran
partículas considerablemente más grandes que el tamaño de la célula. A pesar de ello, se observan
agrupaciones definidas y separadas entre sí, factor que puede favorecer a la potenciación del sistema
inmunológico (Zechner-Krpan, y otros, 2010).
Sumado a lo anterior, el análisis de EDS muestra que las partículas de la muestra están compuestas de
carbono y oxígeno, lo que concuerda con el análisis de FTIR donde todos los principales grupos
funcionales están compuestos por estos dos átomos. Puede pensarse que los átomos de nitrógeno no
aparecen en el análisis debido al bajo porcentaje en peso que representan en las partículas que es
aproximadamente de 0,78% (Zechner-Krpan, y otros, 2010).

a) b)

c) d)
f

Figure 14. SEM para las muestras de β-glucano secadas por a) pulverización, b) al aire, c) con horno y por d) liofilización.

22
Las partículas resultantes del secado por pulverización muestran una forma cilíndrica, alargada,
definida, con bordes afilados y con un diámetro promedio de 105 μm. Es importante resaltar que antes
de realizar la pulverización, la muestra fue sometida a sonicación, lo que contribuye a la producción de
un fino polvo con aglomeración en pequeñas cantidades y en grupos definidos.
Las partículas resultantes del secado al aire y con horno tienen forma similar. Ambas muestras tienen
partículas con forma laminar, irregular, comprimidas y de gran aglomeración de β-glucano. La
diferencia de estas muestras es el tamaño de las partículas, debido a que las del secado al aire son muy
grandes con un diámetro promedio de 725 μm mientras que las del secado con horno tienen un diámetro
promedio de 96 μm.
La liofilización resultó en partículas irregulares, tridimensionales, con bordes afilados y grandes con
tamaño de partícula promedio de 510 μm. Se evidencia una gran aglomeración de β-glucano en las
partículas de la muestra.
Así, el tamaño de partícula de las muestras se organiza de la siguiente manera: Secado con horno
< Secado por pulverización < Secado por liofilización < Secado al aire. Es importante observar que las
muestras de secado con horno y secado por pulverización tienen un tamaño de partícula similar y que
la muestra de secado por pulverización es la que presenta aglomeraciones más pequeñas y definidas.
A pesar de que es imposible definir la actividad biológica de los extractos de β-glucano sin realizar
pruebas inmunológicas, las muestras pueden ser relacionadas basados en el tamaño de partícula y la
estructura. De esta manera, se puede concluir que las partículas secadas con pulverización presentan las
mejores características físicas (partícula pequeña y poca aglomeración) para potenciar el sistema
inmunológico. Se puede recomendar que en algún trabajo futuro se prueben distintos tipos de molienda
con el fin de lograr un tamaño de partícula más pequeño.
Con respecto a la hipótesis de la relación entre la intensidad entre el espectro FTIR y el tamaño de las
muestras, se puede corroborar que a mayor tamaño de partícula menor es la intensidad en los picos
analizados en el FTIR.
4.2.3. Digestión in vitro estática estandarizada

Después de someter las muestras con β-glucano a la simulación de digestión in vitro se obtuvieron los
valores mostrados en la tabla 6 que permiten determinar la pérdida de masa.
Tabla 6. Registro de pérdida de peso en la digestión para los diferentes tipos de secado.

Masa antes de la Masa después de la

Muestra
digestión (mg) digestión (mg)
Horno 50,1 48,3
Pulverización 49,6 47,1
Aire 49,4 47,6
Liofilización 50,8 48,2

Como se puede observar no hubo pérdidas significativas en el proceso de digestión. Dicho esto, se
puede garantizar que más del 95% de muestra con β-glucano llega al intestino.
Posteriormente, con el fin de evaluar si la pureza de las muestras de β-glucano se podían ver alteradas
por el paso por el estómago, se realizaron pruebas de espectrofotometría para determinar el contenido
promedio de β-glucano en las muestras luego de pasar por la simulación de digestión. Así, se observan
los resultados obtenidos en la prueba de espectrofotometría en la figura 15, antes (barras azules) y
después (barras naranjas) del proceso de digestión para cada muestra con su respectivo tipo de secado.

23
 Figure 15. Comparación de pureza de las muestras de β-glucano antes y después de la digestión.

Puede observarse que las barras naranjas muestran un valor ligeramente más pequeño que el de su barra
azul correspondiente. Esto se debe a que las condiciones de pH y enzimáticas del estómago humano no
logran romper significativamente el β-glucano, por lo cual este llegara al intestino sin cambiar
significativamente su pureza. Dicho esto, se puede decir que no hay alteración significativa del
β-glucano por el paso digestivo.
4.3. Lote 3 (Tiempos de incubación)

4.3.1. Recuperación y pureza

Al igual que los lotes anteriores se realizó un registro de pesos para probar si el tiempo de incubación
en la autolisis (24, 48 y 72 horas) afectaba el porcentaje de recuperación de muestra seca con β-glucano.
Se obtuvieron los resultados mostrados en la tabla 7 con su respectivo promedio y desviación estándar.
Tabla 7. Registro de pérdida de peso para el lote 3.

Pérdida de peso con respecto al peso

Acumulación de pérdida de peso (%)
inicial de la materia prima (%)

Proceso 24 horas 48 horas 72 horas 24 horas 48 horas 72 horas

Finalizada la autolisis 23,4 ± 0,8 23,6 ± 0,4 22,9 ± 0,5 23,4 ± 0,8 23,6 ± 0,4 22,9 ± 0,5
Hidrólisis - Finalizado
el tratamiento con 47,7 ± 1,0 46,8 ± 1,1 46,9 ± 1,1 71,1 ± 1,3 70,4 ± 0,6 69,8 ± 1,0
NaOH
Hidrólisis - Finalizado
7,3 ± 0,5 7,1 ± 0,6 6,8 ± 0,6 76,4 ± 1,8 76,7 ± 1,1 76,9 ± 1,6
el tratamiento con HCl

24
Terminado el secado al aire para las muestras que se incubaron a 24, 48 y 72 horas se obtuvo que el
10,2% (±0,5%), 9,9% (±0,4%) y 9,0% (±0,5%) del peso seco de materia prima inicial se recupera en
muestra seca con β-glucano, respectivamente. Como se puede observar no hay una diferencia
significativa de perdida ni de recuperación entre las muestras (las pequeñas diferencias se deben
mayormente a errores experimentales).

Finalmente, se calculó la pureza en unidades g β-glucano/100 g muestra de cada una de las muestras del lote
3 mediante una prueba de espectrofotometría. En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos.

Figura 16. Contenido p/p de β-glucano de las muestras usando distintos tiempos de incubación en la autolisis.

En la gráfica, la barra de color naranja muestra el control de β-glucano (que tiene 43,0 g β-glucano/100 g
muestra) y las azules la cantidad de β-glucano obtenido en las muestras incubadas durante distintos tiempos
en la autolisis. La muestra de 24 horas de incubación resultó en la menor cantidad p/p de β-glucano con
35,9 g β-glucano/100 g muestra. La de 48 horas de incubación fue la que se pareció más a el control de β-
glucano, con 38,3 g β-glucano/100 g muestra. La muestra que mostró la mayor cantidad de β-glucano fue la
de 72 horas de incubación, con 61,02 g β-glucano/ 100g muestra.

Dicho lo anterior, se determinó que, para las muestras incubadas durante 24, 48 y 72 horas en promedio
se recuperó 3,7%, 3,8% y 5,5% de β-glucano neto, respectivamente. Asimismo, se realizó el cálculo de
rendimiento para las muestras que fueron incubadas 24, 48 y 72 horas, obteniendo valores de 61,7%,
63,3% y 91,7%, respectivamente. Así pues, se puede evidenciar que la incubación que presenta la mayor
cantidad de recuperación neta de β-glucano es la que se desarrolla durante 72 horas.

En la figura 17 se muestran los espectros FTIR de las muestras para los diferentes tiempos de incubación
secadas al aire. Es evidente que cada una de ellas tiene una gran similitud a el espectro del
β-glucano puro, mostrando casi los mismos picos (el análisis detallado de los picos se puede ver en la
discusión del lote 2). Dado esto, puede concluirse que el tiempo de incubación en la autolisis no afecta
la pureza de las muestras de β-glucano. Cabe recalcar que la intensidad del espectro del control es mayor
al de las muestras analizadas, y esto, como ya se mencionó antes, se debe a que el tamaño de partícula
del control fue más pequeño (Hromádková, y otros, 2003). Por su lado, el tamaño de partícula de las
tres muestras analizadas fue casi igual y por eso muestran aproximadamente la misma intensidad.

25
Figura 17. FTIR para las muestras de β-glucano con tiempos de incubación de 24, 48 y 72 horas.

26
 5. CONCLUSIONES

Se determinó que el ácido más favorable implementado en el proceso de hidrólisis es el ácido

clorhídrico debido a que los resultados obtenidos en la recuperación de muestra con β-glucano tienen
una pureza más alta según las pruebas de espectrofotometría en comparación a las muestras tratadas
con ácido acético. Por otra parte, se comprobó que el mejor tipo de secado para la metodología de
extracción es el que se realiza con aire, aunque su eliminación de humedad total posible no sea la más
alta, presenta el mayor grado de pureza obtenida para el β-glucano. Asimismo, se determinó que el
tiempo de incubación en la autolisis si es un factor determinante en la obtención de β-glucano, donde
se encontró que para un tiempo de incubación de 72 horas la cantidad de β-glucano conseguido al final
del proceso de extracción aumenta significativamente. A través del análisis de FTIR y TGA se logró
determinar que las muestras de β-glucano extraídas no resultaron con contaminación. Usando
microscopia electrónica de barrido se determinó el tamaño de partícula de las muestras concluyendo
que la muestra con menor tamaño de partícula es la secada con el horno y pulverización, siendo estas
las que favorecen el potenciamiento del sistema inmunológico.
Por otra parte, se concluyó que el extracto de β-glucano obtenido (1,3/1,6) puede tener aplicabilidad en
el mercado nutraceútico dadas sus propiedades inmunomoduladoras. Usando la simulación de digestión
in vitro estática estandarizada se comprobó que el β-glucano ingestado soporta los fluidos gástricos y
por ende llega al intestino donde puede ser absorbida por los macrófagos en la pared intestinal. No
obstante, se dejó abierto el estudio para realizar más pruebas que permitan la implementación real del
producto en el mercado nutraceútico, tales como control de sanidad en el proceso de extracción, pruebas
microbiológicas, indicadores de deterioro del extracto, peligros químicos asociados, caracterización de
perfiles sensoriales, entre otros.

27
 6. REFERENCIAS

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Methods.

29
 ANEXOS
Curvas de humedad
En la figura 18 se puede observar el porcentaje de humedad presente en la materia prima de donde se
realizó la extracción de β-glucano. Se obtuvo que la cantidad de humedad presente en la materia prima
corresponde al 70,47% del peso inicial de la muestra.

Figura 18. Curva de humedad para la materia prima.

En la figura 19 se puede observar el porcentaje de humedad presente en la muestra finalizada la

hidrólisis con ácido acético. Se obtuvo que la cantidad de humedad corresponde al 92,99% de la muestra
extraída con ácido acético.

Figura 19. Curva de humedad para la muestra extraída en la hidrólisis con ácido acético.

30
En la figura 20 se puede observar el porcentaje de humedad presente en la muestra finalizada la
hidrólisis con ácido clorhídrico. Se obtuvo que la cantidad de humedad corresponde al 94,52% de la
muestra extraída con ácido clorhídrico.

Figura 20. Curva de humedad para la muestra extraída en la hidrólisis con ácido clorhídrico.

31