Bakteriorodopszin

A mitokondriumban, a kloroplasztiszban és a baktériumok

sejtmembránjában a proton elektrokémiai potenciált bonyolult, sok
fehérjéből álló elektrontranszfer rendszerek állítják elő.
Létezik-e olyan egyszerű molekula, amely egymaga képes protont pumpálni,
és ezzel p-t előállítani?
Bacteriorodopszin a Halobacterium salinarum bíbor membránjában

CP

követelmények:

transzmembrán fehérje

aktív centrum a bejövő

energia fogadására és
tárolására

a két oldal elszigetelése a

rövidzár elkerülésére
• EC és CP félcsatornák
• különbség a hidrofobicitásban

EC
Bacteriorodopszin a Halobacterium salinarum bíbor membránjában

CP

követelmények:

a hozzáférés átkapcsolása
• konformációváltozás

irreverzibilis működés
• szabadentalpiát kell
disszipálnia

EC
 A bíbor membrán és a bakteriorodopszin szerkezete és
összetétele
bíbor membrán
A BR expresszió kezdetén kb.
500 nm átmérőjű, kör alakú
membrándarabok, melyek később
összeolvadhatnak nagyobb,
szabálytalan alakú darabokká.
A BR trimerjei hexagonális 2D
kristályrácsot alkotnak
Bakteriorodopszin:
248 aminosav, 7 transz-
membrán -hélix
mind-transz retinál kovalensen d=62Å
kötve a K216-hoz protonált Schiff
bázissal
~10 lipid molekula / BR
Molekulasúly: 24 kD
A bíbormembrán lipidösszetétele

Polárosak:
6-7 foszfolipid,
2-3 szulfoglikolipid,
apoláros:
1 squalene / BR molekula

PGS és S-TGA-1 máshol nincs a

baktérium sejtmembránjában

Az energiaátalakító membránok-
ban általában nagy a
fehérje/lipid arány és a
kettősréteget nem képző lipidek
aránya

Krebs és Isenbarger, BBA 1460, 15-26, 2000

Trimer és rács összetétel

5 kcal/mol energianyereség a trimer cytoplasmic

kialakulásával, és további
energianyereség a kétdimenziós rács
kialakulásával

protein  protein a trimeren belül (a

távolság < 4Å):
van der Waals hélix-hélix kölcsönhatás: extracellular

B  D’, E’
protein  protein a rácson belül
(trimerek között, nagyobb tovolságra):
hosszútávú elektrosztatikus
kölcsönhatás a 2 <  < 80 membrán
határfelületen a hélixek és hurkok
között

Krebs and Isenbarger, BBA 1460, 15-26, 2000

Trimer és rács összetétel

5 kcal/mol energianyereség a trimer

kialakulásával, és további
energianyereség a kétdimenziós rács
Luecke, BBA 1460, 133-156, 2000
kialakulásával
Specifikus protein-lipid
kölcsönhatások is
stabilizálják mind a
trimert, mind a rácsot
Lipid hidrofób láncok
láthatók a fehérje
felszínén lévő árkokban.
Lipid fejcsoportok
felületi és a hurkokban
lévő oldalláncokkal
hatnak kölcsön.
Az S-TGA-1 kizárólag a kettős lipid membrán külső felében található, mind
a trimeren belüli, mind a trimerek közötti üregekben. Ezért nagyon
valószínű, hogy specifikus lipid-fehérje kölcsönhatásokban vesz részt, ami
szintén a szerkezetet stabilizálja.
 A retinál kromofór

A kiterjedt -elektron rendszer az oka

az erős abszorpciós sávnak

A retinál protonált Schiff bázisa oldatban a D212 D85

közeli UV-ben abszorbeál.

Az abszorpciós sávnak a látható R82

tartományba való hangolása
(maximum 570 nm-nél) annak
köszönhető, hogy az oldatbeli közeli
elleniont a fehérjében egy távoli,
diffúz ellenion váltja fel (opsin
eltolódás).
(570 nm ~ 210 kJ/mol)
570 = 63000
 A retinál kromofór geometriája

A fényadaptált BR mind-
transz retinált tartalmaz.
Átmeneti dipólmomentuma
69o –os szöget zár be a
membrán normálisával.

fény

A fényelnyelés 13-cisz formába

való izomerizációt eredményez.
Az átmeneti dipólmomentum
iránya alig változik (67o), de a
lizin oldallánc és a retinál
közepe elmozdul.

Heyn et al., BBA 1460, 60-74, 2000

A BR atomi felbontású szerkezete – 3D kristályok a köbös lipid fázisban

D96N BR

Pebay-Peyroula et al., BBA 1460, 119-

132, 2000

Luecke, BBA 1460, 133-156, 2000

A protontranszferben résztvevő aminosavak
1C3W.PDB, 1.55Å

A transzportált proton forrása:

a Schiff bázis 96
Az elsődleges protonakceptor:
D85-
A protonleadó csoport: R82+, 216
E204(H), E194-, kötött víz
Az elsődleges donor: D96(H) 85

82

194
204
A retinál kötőhely szerkezete 1C3W.PDB, Luecke et al., J. Mol. Biol.
291, 899, 1999, 1.55Å

A protonált Schiff bázis diffúz

ellenionja a negatív D85-ből és
D212-ből, valamint a pozitív
R82-ből áll.
A 402-es vízmolekula a Schiff
bázissal, a D85-tel és a D212- 216
vel létesít hidrogénhíd-kötést.
A 401-es vízmolekula pedig a
D85-tel.

85
402
212
401

82
Hidrogénkötések láncolata az extracelluláris félcsatornában. A Schiff-
bázis és a protonleadó csoport környéke protonaffinitásának kapcsolata
1C3W.PDB, 1.55Å
Töltött és poláros molekulák,
valamint vízmolekulák lánca köti
össze a Schiff bázis környékét 216
az extracelluláris felszínnel.
85
A D85 protonfelvétele jelen-
tősen eltolja a retinál abszorp-
ciós sávját. Tehát a D85 pro-
tonáltsági állapota spektrosz- 212
kópiailag könnyen mérhető.
A D85 és a protonleadó csoport
82
pH titrálása, azaz pK-ja
kapcsolódnak egymáshoz. A
D85 protonálása elősegíti az
extracelluláris protonleadást, 194
illetve a protonleadás
stabilizálja a D85 protonált 204
formáját.
A citoplazmatikus félcsatorna hidrofób szerkezete

1C3W.PDB, 1.55Å

A Schiff bázis protondonorját,

42
a D96-ot, egy hidrofób „hordó”
veszi körül. Emiatt a pK-ja nagy,
tehát a kiinduló állapotban
protonált. A vízmolekulák és
poláros oldalláncok hiánya a 96
citoplazmatikus oldalon megaka-
dályozza a protonvezetést
ebben az irányban. 219
A kiinduló állapotban a Schiff
bázisnak nincs összeköttetése
(nem kommunikál) a 502
citoplazmatikus félcsatornával. 501

216
A G hélixen lévő „-dudor” megzavarja a hidrogénkötést és a hélix
tengelyét 15o –kal elfordítja
1C3W.PDB, 1.55Å
Ez elősegíti, hogy a 215-ös és
216-os (mely a retinált is köti)
aminosavak peptid oxigénje
vízmolekulákat koordináljon.
Korábbi elképzelés: Ez a 502 217
szerkezeti elem „csuklóként”
215
működhet a fotociklus 501
(protontranszport) során, és a G
hélix további elfordulása 182
megnyithatja a citoplazmatikus 213
félcsatornát a vízmolekulák és a 216
protonvezetés számára.
Röntgenkrisztallográfiás
szerkezetek fotociklus
intermedierekre: A -dudor és
környezete nem változik, annak
ellenére, hogy a G hélix elfordul.
 citoplazmatikus oldal F
A protontranszfer dinamikája –
a fotociklus B C
G D
A E

Luecke, BBA 1460, 133-156, 2000

extracelluláris oldal
 A fotociklus spektroszkópiai jellemzése

Differenciaspektrumok egy lézerimpulzus után mérve kapuzott optikai

sokcsatornás analizátorral. Vad típusú bakteriorodopszin.

100 ns – 1.5 s
 A fotociklus spektroszkópiai jellemzése

Differenciaspektrumok egy lézerimpulzus után mérve kapuzott optikai

sokcsatornás analizátorral. Vad típusú bakteriorodopszin.

2.5 s - 150 s
 A fotociklus spektroszkópiai jellemzése

Differenciaspektrumok egy lézerimpulzus után mérve kapuzott optikai

sokcsatornás analizátorral. Vad típusú bakteriorodopszin.

250 s – 2.5 ms
 A fotociklus spektroszkópiai jellemzése

Differenciaspektrumok egy lézerimpulzus után mérve kapuzott optikai

sokcsatornás analizátorral. Vad típusú bakteriorodopszin.

4 ms – 600 ms
Az időfelbontásos differenciaspektrumokból nyerhető információ
Mátrix algebrai módszerekkel meghatározható a fotociklus intermedierek
spektruma. Ezután az intermedierek spektrumainak lineáris kombinációival
illesztve a mért differenciaspektrumokat, kiszámítható az intermedierek
időbeli fejlődése, kinetikája.

spektrumok kinetikák

(E204Q mutáns bakteriorodopszin)

Az időfelbontásos differenciaspektrumokból nyerhető információ
A kinetikákhoz reakciósémák illeszthetők. Ezzel meghatározhatók az
egymást követő intermedierek közötti átmenetek.
Egy példa:
h
BR  K  L1  M1  M 2  N  O  BR

L2

A szaggatott vonal egy

egyszerűbb modell
kevésbé jó illeszkedé-
sét mutatja, a piros
vonal a fenti modell
illeszkedését.
Az időfelbontásos differenciaspektrumokból nyerhető információ

A sémában szereplő sebességi állandók hőmérsékletfüggése megadhatja

az intermedierek szabadentalpiáját és a köztük lévő átmenetek átmeneti
szabadentalpiáját, azaz energiagátját. Szintén megmutatja, hogy mely
lépések során történik meg a szabadentalpia raktározása.
Ehhez az Eyring egyenletet kell használni:
G H TS
k BT  k BT k BT  k H 1 S kB
k e  e k BT
 ln     ln
h h T kB T kB h
Tehát ln(k/T) –t ábrázolva (1/T) függvényében az egyenes meredeksége
megadja az aktivációs entalpiát, a tengelymetszete pedig az aktivációs
entrópiát.
A sebességi állandók pH függése információt szolgáltat a protonleadás
és protonfelvétel lépéseiről, és az ebben szereplő csoportok pK-járól.
A pontmutánsok és a vad típusú fehérje fotociklusának összehasonlítása
bizonyítékokat szolgáltat egyes aminosavak szerepére vonatkozóan a
fotociklus és a protontranszfer különböző részfolyamataiban.
Az első lépés – energetikai megfontolások
 Az első lépés – energetikai megfontolások

ps

A rövid élettartamú szinglet gerjesztett állapotba való abszorpciós

átmenet izomerizációt okoz a C13=C14 kettős kötés körül, kb. 60%
hatásfokkal. A K intermedier 3 ps alatt jön létre.
A K-ban tárolt energia (az elnyelt foton 210 kJ/mol-jához képest): kb.
50 kJ/mol, ami 500 mV proton elektrokémiai potenciállal egyenértékű. A
szokásos p a membrán két oldala között: 200 mV.
/(Faraday szám: F = NAe ≈ 0,1 kJ/(mol mV) /
További lépések – szerkezetváltozások, a proton transzportja

A kromofórban és a retinált
kötő „zsebben” felhalmozó-
dott feszültség relaxációja
A fotoizomerizáció megvál-
s
toztatja a Schiff bázis –
D85 geometriát
Fourier transzformációs
infravörös spektrosz-
kópiával nyert bizonyíték
van a Schiff bázishoz közeli
vízmolekulák hidrogénköté-
sének megváltozására is.
 LM

182
216
10-100 s

85

82

Protontranszfer a Schiff bázisról a

D85-re, az R82 elfordulása, extra-
celluláris protonleadás, a Schiff bázis
hozzáférhetőségének megváltozása. 204

Az M alállapotai: kinetikus bizonyíté- 1C3W.PDB, Luecke et al., J. Mol. Biol. 291,

kok, protonleadásra vonatkozó ada- 899, 1999, 1CWQ.PDB, Sass et al., Nature
tok, FTIR, neutron- és röntgen- 406, 649-653, 2000
diffrakció, spektrumváltozás
 MN

96

ms

219
O-215

A késői M állapotban egy „csatorna”

látszik kialakulni vízmolekulák rész-
vételével, a D96 és a Schiff bázis
között, ami elősegítheti a proton-
transzfert. Az F219 elmozdul az
útból.
Az N állapot fennállása alatt a G és F hélixek kissé elfordulnak, és ezzel a
fehérje megnyílik a citoplazmatikus felszín felé. A D96 így protont vehet
fel a vizes fázisból.
 NO

A D96 protonfelvétele a vízből

ms
összekapcsolódik a retinál
visszaizomerizációjával.
A reizomerizációt az egyelőre
még protonált D85 is katalizálja.
Az O állapotban a protonleadó
csoport még nem nyerte vissza a
protonját.
 O  BR

Belső protonátadási lépés a

10 ms
D85-ről a protonleadó
csoportra
A hidrogénkötések hálózatának
visszaállítása a Schiff bázisnál
és az extracelluláris
félcsatornában
A kezdeti fehérjekonformáció
visszaállítása

Ez a lépés gyakorlatilag megfordíthatatlan. Ez biztosítja a vektoriális

transzmembrán protontranszfer egyirányú voltát..
 A fotociklus és protontranszport
citoplazmatikus oldal F lépések összefoglalása
Balashov, BBA 1460, 75-94, 2000
B C A séma figyelembe veszi az extracelluláris pro-
G tonkoncentrációt. Alacsony pH-n a protonlea-
D dás lelassul, és csak a ciklus végén történik meg.
A E
XH: a protonleadó csoport
(vízmolekula klaszter, ld.
később) protonált formája

5+2 5

4 4

3 1
3 2

X-: deproto-
nált protonle-
extracelluláris oldal adó csoport
Kötött vízmolekula-csoportok szerepe a protontranszportban

a: A fotociklus egyszerűsített
modellje a protonleadó klaszter
feltüntetésével
b, c: szerkezet. A piros gömbök a
kristályszerkezetben látható víz
oxigénmolekulái. A zöld és kék
foltok a vízmolekula-klaszterek
molekulamodellezéssel kapott
elhelyezkedését mutatják.
d: Fourier-transzformációs
infravörös (FTIR) differencia-
spektrumok a fotociklus lézer-
impulzussal való gerjesztése után
eltelt idő függvényében. Piros
abszorpciónövekedés: a D85
protonfelvétele a Schiff-bázistól.
Kék „völgy”: a kék színnel jelölt
vízmolekula-klaszter proton-
vesztése. Tehát ez a protonált
klaszter a protonleadó csoport,
mely 3 oldallánccal (E194, E204,
R82) és 3 peptidcsoporttal létesít
hidrogénhidat.
Garczarek és Gerwert, Nature 2005
Az alapállapot és az M állapot szerkezete
a: alapállapot, b: M állapot. A vízmolekulák oxigénatomja a kristályszerkezetben látható, a
molekulák térbeli elhelyezkedése (a H atomok helye) molekulamodellezés eredménye.
Az M állapotban hiányzik a felső klaszterből a W401 és a W402, az alsó klaszterből a H3O+.
Innen történhetett a protonleadás. A felső és alsó klaszterek közötti kapcsolatot az R82
oldallánc elfordulása közvetíti.
Az M állapotban az elfordult R82 és a hiányzó vízmolekulák miatt nincs protonvezető csatorna
az extracelluláris oldalról visszafelé, a Schiff bázishoz. Ez elősegíti a protonpumpa egyirányú
működését.
Mechanisztikus és energetikai megfontolások

1. A fényelnyelést követő retinál izomerizáció mechanikus feszültséget hoz létre, és

hidrogénkötések felszakadásához is vezet a felső vízmolekula-klaszterben. 2 H-kötés
felszabadulása kb. 50 kJ/mol energiát jelent, ami épp a K formában tárolt energiával egyenlő.
2. A klaszterben átrendeződő H-kötések lecsökkentik a Schiff bázis pK-ját, és megnövelik a
D85 pK-ját, ezért a Schiff bázis átadja a protonját a D85-nek.
3. Az elektrosztatikus környezet megváltozása miatt az R82 átfordul az alsó vízmolekula-
klaszter felé, és hozzájárul a protonált vízmolekula-klaszter szolvatálásához. Ettől a klaszter
pK-ja 9.5-ről 5.8-ra csökken, és ezért protont ad le a külső vizes fázisba. Ez pH7 esetén
spontán reakció, szabadentalpia disszipációval jár. Ha van transzmembrán p, annak
növekedéséhez járul hozzá (energiaátalakítás).
4. 2. lépésben deprotonált Schiff bázis konformációváltozás eredményeképpen átfordul a
citoplazmatikus oldal felé. Itt is átrendeződnek a H-kötések, új vízmolekulák lépnek be,
lecsökken a D96 pK-ja és kialakul egy protonvezető csatorna, melyen keresztül a D96 át tudja
adni a protonját a Schiff bázisnak.
5. A citoplazmatikus oldal kinyílása nyomán vízmolekulák szolvatálják a D96-ot. A retinál
reizomerizációjának eredményeképpen a D96 pK-ja az eredeti értékre nő fel, és protont vesz
fel. Transzmembrán p esetén energiaraktározó lépés.
6. Az utolsó lépés előtt a fehérjekonformáció visszaalakulása azt eredményezi, hogy a D85
pK-ja újra lecsökken, a protonleadó csoporté megnő. A kettejük közötti protontranszfer nagy
szabadentalpia disszipációval jár, és a fő oka a teljes fotociklus egyirányú voltának.