1. Въведение във ФА.

Хроматографски методи на анализ: Колонна

Фармацевтичният анализ е обобщен термин хроматография,Тънкослойна хроматография
– процес или поредица от процеси, които (ТСХ / TLC), Газово-течна хроматография (ГТХ
могат да се използват за идентифициране, / GLC), Газова хроматография (ГХ / GC),
количествено определяне, разделяне, Високоефективна течна хроматография
пречистване и уточняване на структурата на (ВЕТХ / HPLC), Течна хроматография (ТХ / LC),
даденото съединение, съдържащо се във Капилярна електрофореза (КЕ / CE).
фармацевтични продукти. Електрохимични методи: Потенциометрия,
Компонентите, които се подлагат на анализ, Кондуктометрия,Полярография.
обикновено са активни фармацевтични Радиохимични методи: Йонизационен
съставки (API), помощни вещества, метод, Течно-сцинтилационен метод,
замърсители или лекарствени метаболити. Радиометрични методи, които включват
Видове фармацевтичен анализ: радиометрично титруване,
Качествен анализ: фармацевтичния анализ, радиохроматография, радиоимуноанализ и
при който се определя каква съставка или метод на изотопно разреждане.
вещество присъства в неизвестна проба или Термални методи: Диференциален
съединение. Например идентифициране на термален анализ (DTA),Термогравиметричен
конкретната съставка, елемент или анализ (TGA), Диференциална сканираща
функционална група, присъстваща в калориметрия (DSC).
пробата. Идентификация означава Основни приложения на фармацевтичния
потвърждаване на идентичността на анализ: Идентифициране и количествено
аналита или аналитите в дадената проба. определяне на API в субстанция и / или
Количествен анализ: фармацевтичен изходен материал (суровина), междинни
анализ, имащ за цел измерване на точната продукти и сродни вещества в хода на
концентрация на анализирано вещество в синтеза на лекарства, лекарства в различни
дадена проба. Също се нарича количествено етапи от изследване и разработване на
определяне или определяне на лекарствени продукт, за контрол на
количествено съдържание. качеството на лекарствени продукти, за
Методи във фармацевтичният анализ: определяне на примеси и разпадни
Класически методи: Гравиметрия – измерва продукти в хода на производство и
се масата на пробата след процес на съхранение на лекарствени продукти, API,
утаяване. Обемни методи за анализ – помощни вещества, примеси, контаминанти
обемът на пробата се определя след и метаболити при изследване на стабилност,
химичната реакция (неутрализация, метаболити в биологични проби,
окисление, редукция, образуване на съдържащи лекарства, определяне на
комплекс и утайка и др.) в разтвора на различни токсини, наркотични вещества и
пробата. отрови в биологични среди.
Оптични методи: Рефрактометрия,
Поляриметрия. 2. GMP, GLP. Аналитична документация.
Методи, базирани на абсорбция на Фармакопеи и стандартизационни
лъчението: UV и видима документи.
спектрофотометрия, Атомно абсорбционна Европейската фармакопея (Ph. Eur.) е единен
спектрофотометрия, ИЧ-спектроскопия. справочник и указател за контрола на
Методи, базирани на емисия на лъчения: качеството на лекарствата. Използването на
Атомно-емисионна спектроскопия, официалните стандарти, които съдържа,
Молекулярна флуоресцентна предоставя научната основа за контрола на
спектроскопия, Пламъкова фотометрия, качеството през целия жизнен цикъл на
Масспектрометрия, ЯМР спектроскопия. продукта. Тези стандарти са правно
обвързващи. Ph. Eur. стандартите за качество
са задължителни във всички държави -
страни по конвенцията. Подготовка Ph. Eur.
се подготвя от Европейската фармакопейна
комисия (EPC), разположена в Страсбург.
Настоящото издание на Ph. Eur. е десето
издание. Ph. Eur. включва монографии,
които определят задължителните стандарти
за активни вещества, помощни вещества и
препарати. Европейската фармакопея се
прилагат еднакво за материали, използвани
в хуманната или ветеринарната медицина.
Британската фармакопея BP се изготвя от
фармакопейния секретариат, работещ в
сътрудничество с лабораторията BP,
британската комисия по фармакопея (BPC) и
нейните експертни консултативни групи
(EAG) и консултативни групи.
Разработването на фармакопейни стандарти
е съвместно със съответните индустрии,
болници, академични среди,
професионални органи и правителствени
източници, както във Великобритания, така
и извън нея. Лабораторията предоставя
аналитична и техническа подкрепа на
Британската фармакопея. Основните й
функции са: Разработване на нови
фармакопейни монографии.
(GMP): Система за осигуряване на
качеството, гарантираща че лекарствените
продукти се произвеждат, съхраняват и
контролират постоянно в съответствие с
регулационните стандарти. Система,
включваща всички фактори, имащи
отношение към качеството на лекарствения
продукт: човешки, технически и 3. Валидиране на аналитичните методи. ICH.
административни. Основана на “принцип на
четирите М”: Men – персонал, непрекъснато
обучение; Materials – суровини,
компоненти, опаковки, етикети, реагенти и
т.н.; Machinery – помещения, технически
средства, оборудване; Methods – хармонизация,
производствен процес, контрол, валидация,
документация.
Концепцията за GMP е относно
оптимизиране на техниката и продукти и да разработят насоки за ICH.
технологичните процеси, включително
пакетиране и контрол на оборудването;
модернизиране на производствените
процеси и пакетиращата техника; развитие в
организацията на производство.
Управления на качеството: система за
осигуряване на качеството, включваща
изискванията на GMP и адекватен качествен
контрол. Включва изисквания за подходяща
инфраструктура, включва организационната
структура, включително персонал със
съответната квалификация и компетентност;
начина на работа и средствата; системни
дейности, необходими за осигуряване на
гаранции, че продуктът ще отговаря на
изискванията за качество - “осигуряване на
качеството”.
Добра лабораторна практика (GLP): система
от правила, обхващаща условията за
планиране процесите на организиране,
извършване, проследяване и
документиране на лабораторните
изпитвания.
Представлява експеримент или комплекс от
експерименти, при които изпитваното
вещество се подлага на анализ с цел
получаване на данни за неговите свойства и
безопасност за човешкото здраве и околната
среда. Извършва се в база, която включва
персонал, помещения, съоръжения и
апаратура необходими за изпитванията. На
изследване подлежи всяко вещество от
синтетичен или природен произход или
смес от вещества – изпитвано вещество
Аналитични параметри.
Международният съвет за хармонизация на
техническите изисквания за фармацевтични
продукти за хуманна употреба
(Международна конференция по
ICH) обединява
регулаторните органи и фармацевтичната
индустрия, за да обсъдят научни и
технически аспекти на фармацевтичните
Хармонизирането на регулаторните
изисквания започва в Европа, през 80-те
години. Организация на ICH: Одитори,
Събрания (Асаблея), Управителен комитет
на ICH, Комитет за управление на MedDRA –
медицински речник за регулаторни дейност,
ICH Секретариат, ICH Координатори, работни
групи.
Насоки за качество: Постиженията на
хармонизация в областта на качеството
включват основни етапи като провеждането
на проучвания за стабилност, определяне на
съответните прагове за изпитване на
примеси и по-гъвкав подход към
фармацевтичното качество въз основа на
управлението на риска от Добра
производствена практика (GMP).
Q1A – Q1F Стабилност: Q1A (R2) Изпитване
за стабилност на нови лекарствени вещества
и продукти. Q2 Аналитично валидиране.
Q3A - Q3E примеси. Q4A - Q4B Фармакопеи.
Q5A - Q5E Качество на биотехнологичните
продукт. Q6A- Q6B Спецификации. Q7 Добра
производствена практика. Q8
Фармацевтично развитие. Q9 Управление на
риска за качеството. Q10 Фармацевтична
система за качество. Q11 Разработка и
производство на лекарствени вещества. Q12
Управление на жизнения цикъл. Q13
Непрекъснато производство на лекарствени
вещества и лекарствени продукти. Q14
Разработване на аналитична процедура.
Валидиране на аналитичните процедури:
целта е да се докаже, че използваните
аналитични методики са подходящи за
предназначението си.
Методики, подлежащи на валидиране:
Изпитвания за примеси, за които се изисква
да са в границите за съдържание спрямо
разтвор за сравнение. Изпитвания за
примеси, чието съдържание се определя
количествено. Изпитвания за идентичност.
Количествени определяния. Изпитване за
доказване на безопасност на ЛП върху тест
системи.
Аналитични параметри:
Правилност (точност): близост на
съответствие между намерената и на разделянето, коефициент на задържане,
действителната стойност. Определя се като
се намира „степента на възвръщане“ или
аналитичния добив.
Прецизност: близост на съответствие на
резултатите от отделни измервания.
Повторяемост: прецизността при напълно
повтарящи се условия. Вътрешна
прецизност: прецизността в самата
лаборатория в различни моменти, дадени от
различни изпълнители. Възпроизводимост:
прецизността от различни лаборатории.
Специфичност: отразява изключване
влиянието върху резултатите за прецизност.
Специфичността е способността да се оцени
аналита в присъствието на компоненти,
които се очаква да присъстват. Обикновено
това са примеси, разпадни продукти,
матрица и т.н. Специфичността често може
да бъде изразена като степен на зависимост
на резултатите от теста, получени чрез
анализ на проби, съдържащи добавени
примеси, разпадни продукти, свързани
химични съединения или плацебо съставки
в сравнение с резултатите от теста без
добавени вещества.
Присъстващи компоненти:
Граница на откриваемост: най-малката
определяема граница.
Граница на количествено определяне: най-
малкото количеството, което може да бъде
определено с приемлива правилност и
възпроизводимост.
Линейност: зависимост между сигнала и
количеството на пробата.
Обхват: интервалът между минималната и
максималната концентрации, за който е
доказано, че аналитичната методика
притежава правилност, възпроизводимост и
линейност.
Изпитването за пригодност на системата е
неразделна част от много аналитични
процедури. Тестовете за пригодност на
системата представляват неразделна част от
хроматографските методи и се използват за
осигуряване на адекватни характеристики
на хроматографската система. Ефективност
степен на разделяне, относително
задържане и факторът на симетрия са
параметрите, които обикновено се
използват при оценяване на работата на
колоната.
4. Тестове за идентичност на ЛП. Физични и
физикохимични методи. Физикохимични
константи. Рефрактометрия и индекс
поляриметрия.
Има три основни типа аналитични техники:
Регресионен анализ. Методи за групиране.
Модели на множество уравнения.
Аналитичните техники са методите,
използвани за качествено и количествено
определяне на концентрацията на
съединение чрез използване на различни
техники като титруване, спектроскопия,
хроматография и гравиметричен анализ.
Фактори, при разработване на аналитичен
метод: структура и физикохимични свойства
на лекарствената молекула; избор на
режимът на откриване (напр. UV откриване);
подготовка на пробата, която може да
включва центрофугиране, обработка с
ултразвук и филтруване; видът на
разтворителя, той трябва да бъде прозрачен
и да не се намесва в анализа, стабилност на
приготвения разтвор, подвижната фаза,
стационарна фаза и режим на елуиране в
случай на хроматографско елуиране. Тези
фактори и много други трябва да бъдат
разгледани, оптимизирани и разработеният
метод след това се валидира и прилага за
анализ.
Чистота: Винаги се фиксира най-високо
постижим стандарт (съдържание),
независимо от различните методи за
производство на лекарството по отношение
на неговите стандарти за чистота, видове
примеси и променящ се модел на
стабилност.
Устойчивост (или стабилност) е свойството
на дадена система да запазва основните си
характеристики при относително малка
промяна на даден параметър.
Описание на лекарствената
субстанция/лекарствената форма: Тестове за
идентичност, Физически константи,
Количествен анализ, Граничен тест, Условия
за съхранение.
Идентичност на лекарствената молекула:
определяне на физико-химични константи;
хроматографски тестове; химичните тестове.
Физико-химичните константи по същество
включват: точка на топене; точка на кипене;
(показател) на пречупване;
относителна плътност; специфично оптично
въртене; поглъщане на светлина;
вискозитет; специфична повърхност;
способност на набъбване; инфрачервена
абсорбция.
Хроматографските тестове са специфични
тестове чрез тънкослойна хроматография
(TLC) на чисто лекарство или неговото
присъствие в многокомпонентна система.
Температурата на топене е температурата,
при която даден материал преминава от
твърдо в течно агрегатно състояние. Важен
критерий за чистотата на дадено вещество.
Ако при фиксирано налягане се нагрява
вещество в кристална форма, процесът на
топене започва и свършва при една
определена температура. Твърдите
вещества в аморфно състояние нямат
фиксирана температура на топене. Точката
на топене има определен диапазон -
диапазон на стапяне.
Точката на кипене е важен параметър, който
установява чистотата на дадено вещество.
Зависи от барометричното налягане, и то
трябва да се има предвид. Тк се коригира
към нормалното барометрично налягане.
Плътност: масата на единица обем от
веществото. Определя се с пикнометър или
аерометър.
Индекс на пречупване - стандарт за течности
и масла. Индексът на пречупване е стойност,
изчислена от съотношението на скоростта на
светлината във вакуум към тази във втора
среда с по-голяма плътност. Индексът на
пречупване е число, което показва колко
пъти по-бавно от светлинната вълна би била
в материала, отколкото е във вакуум.
Специфично оптично въртене:
Фармакологичната активност е свързана с
молекулната конфигурация.
Вискозитет– измерител на течливостта,
„гъстота“ или съпротивление при изливане.
Обикновенно се изразява с единици cSt
(сантистокс). Измерванията на вискозитета
се използват като метод за идентифициране
на различни на течности.
Сулфатната пепел се определя чрез двойно
нагряване с концентрирана сярна киселина.
По този начин металите остават като
сулфиди, които са стабилни при нагряване.
Загуба при сушене: отразява нетното тегло
на лекарственото вещество, което се суши
при определена температура при
атмосферно или понижено налягане за
определена продължителност с конкретно
количество вещество.
Рефрактометрията е аналитичният метод за
измерване на коефициента на пречупване
на веществата, за да се оцени техният състав
или чистота. Рефрактометърът е друга, перпендикулярна равнина). Такава
инструментът (основно на Аббе), използван
за измерване на коефициента на
пречупване. Рефрактометрията е метод за
анализ на лекарството, основан на
определяне показателя на пречупване на
изпитваното вещество.
Индексът на пречупване зависи от
температурата и дължината на вълната на
светлината, при които се извършва
определянето. В разтворите индексът на
пречупване също зависи от концентрацията
на веществото и естеството на разтворителя.
Определянето се извършва при температура
(20 ± 0,5) ̊С и дължината на вълната на D-
линията на натриевия спектър (589,3 nm).
Поляриметрия: измерването и 5. Тестове за чистота на ЛП: методи за
интерпретацията на поляризация на
напречни вълни, най-вече електромагнитни
вълни, като радио или светлинни вълни.
Обикновено поляриметрията се извършва
върху електромагнитни вълни, които са
преминали през или са били отразени,
пречупени или дифрактирани от някакъв
материал, за да се характеризира този обект.
Поляриметрия е физико-химичен
изследователски метод основан на
измерване: 1) степента на поляризация на
светлината и 2) оптична активност, т. е.
въртене равнината на поляризация на
светлината, когато тя преминава през
оптично активни вещества, които
отклоняват равнината на поляризация на
светлината надясно или наляво – оптично
активни вещества.
Поляриметрия - измерване степента на
поляризация на светлината и ъгъла на
въртене на равнината на поляризация на
светлината, когато тя преминава през
оптично активни вещества. Тези вещества са
в състояние да въртят посоката на трептене
на поляризираната светлина около
определен ъгъл.
Ако на пътя на лъча се постави оптично
устройство, наречено поляризатор, то след
преминаването през поляризатора
електричното поле на лъча трепти само в
една равнина (магнитното поле също, но в
светлина се нарича плоскополяризована.
Въртенето на равнината надясно се
означава с “+“ или с “d-”, а наляво — със знак
“–“ или с “l-”. IUPAC препоръчва означенията
d-, l- или dl- пред наименованието вече да се
избягват.
Оптичното въртене е въртенето на равнинно
поляризирана светлина, когато светлинният
лъч е насочен през определени материали.
Специфичното въртене дава ъгъла на
въртене на равнинно-поляризираната
светлина от определено съединение при
определена температура.
изпитване на примеси, изпивания за
съдържание на примеси, стандартни
разтвори.
Примесите на лекарственото вещество,
получени в производствения процес, са
описани във фармакопеята или в съответния
стандарт и те трябва да са качествено
охарактеризирани.
Тестове за определяне на границите за
съдържание на примеси: Граничните тестове
са количествени или полуколичествени,
специално предложени за идентифициране
и контрол на неизменно малки количества
примеси, които се предполага, че присъстват
във фармацевтично вещество. Необходимо
и важно е да се разработи индивидуалният
тест по такъв начин, че да се избегнат
възможни грешки. Това може да бъде
постигнато, като се вземат предвид
следните три основни фактора:
Специфичност на тестовете. Тестът,
използван като граничен тест, трябва да е
изключително селективен за следи
нежелано вещество. Чувствителност:
Степента на чувствителност, определена в
граничен тест, варира в широки граници
според стандарта, определен от
фармакопеята. Лекарствена стабилност:
Стабилността на фармацевтичния продукт се
определя като способността на продукта,
при определено съхранение, да запази
своята ефикасност, свойства и които въртят равнината на плоско-
характеристики през целия срок на годност.
Препоръчителният срок на годност за
лекарствен продукт обикновено е 3-5
години. През това време концентрацията на
лекарството не трябва да намалява.
Според Eur. Ph. има органични примеси;
неорганични примеси; летливи примеси,
вода и остатъчни разтворители; специални
групи.
Аналитични техники: най-често
хроматографски методи: HPLC с различни
техники за откриване - UV / VIS, RI, MS,
флуоресценция, ELSD, MALS, CADGC, TLC,
HPTLC, главно в областта на билките, рядко
UV или химически реакции.
LC-тест за сродни вещества обикновено тест
за пригодност на системата, за да се осигури
адекватно разделяне на примесите. Тъй като
референтните вещества често не са налични,
подход за избягване на този проблем е
генерирането на необходимия примес чрез
„in situ разграждане“ на активния принцип.
Първата монография, в която се използва „in
situ окисление“ за провеждане на теста за
LC-пригодност, е монографията за Сaptopril.
Тестът за сродни вещества описва частично
йодометрично окисление на Captopril до
Сaptopril-disulphide. Полученият разтвор
съдържа Captopril и неговия димер и може
да се използва за определяне на
разделителната способност в HPLC-теста за
сродни вещества. Последният пример обаче
показва колко внимателно трябва да се
избират условията на реакцията.
Други контролирани примеси: неорганични
вещества - контролират се от общи тестове
като сулфатирана пепел; тежки метали;
летливи вещества; остатъчни разтворители;
ДНК-реактивни (мутагенни) примеси.
За хигроскопичен (чувствителен на влага)
продукт, може да се наложи да се тества за
съдържание на влага. За течен продукт - тест
за рН и микробиологични тестове могат да
се включат. За крем, гел, маз – може да се
включи тест за вискозитет.
Оптични изомери - двойка изомери с
еднакви физико-химични характеристики,
поляризованата светлина с един и същ по
размер ъгъл, но в противоположни посоки.
Равни части лявовъртящ и дясновъртящ
изомер - рацемична смес (рацемат).
Молекулите на оптичните изомери са
пространствени изомери, отличаващи се
помежду си както предмет и огледалния му
образ или както лявата спрямо дясната ръка.
IUPAC е възприет терминът “хиралност”. В
химията енантиомер е един от два
стереоизомера, които са огледални образи
един на друг, без да са идентични, така както
лявата ръка е огледална на дясната.
Енантиомерите имат еднакъв по стойност,
но противоположен по знак ъгъл на въртене
на равнината на плоско-поляризованата
светлина.
Ако старшинството на заместителите около
стерео (*) центъра намалява по посока на
часовниковата стрелка, конфигурацията се
означава с буквата R (лат. rectus - десен); ако
намалява по посока, обратна на
часовниковата стрелка — с буквата S (лат.
sinister - ляв).
Определяне на енантиомерната чистота
чрез газова хроматография, или ЯМР
спектроскопия и HPLC.
6. Тестове за количествено определяне на взаимодействат стехиометрично, т.е. с равен
ЛП. Приложение на обемни методи: брой молове еквиваленти.
киселинно-основен, Методи на титруване: директно, остатъчно,
комплексообразователен, ОР и утаечен. косвено (с участва спомагателен реактив).
Принципни положения, механизъм, Изисквания към аналитичните реакции: при
обработка на данните и оценка на протичането им реагиращите вещества да си
резултатите. взаимодействат в строго стехиометрични
Задачата на количествения анализ е да се отношения; реакциите да протичат бързо и
определят точните количествени практически докрай; да позволяват точно и
съотношения, в които се намират отделните сигурно установяване на крайната точка.
компоненти, влизащи в състава на Класификация на титриметричните методи:
изследваното вещество, чийто качествен Киселинно-основен или неутрализационен
състав е предварително установен. Всяко (определяния, базирани на киселинно-
количествено определяне се състои от три основни взаимодействия), Утаечен
основни етапа: претегляне на определено (прилагат се реакции, водещи до
количество от пробата за анализ; химическо получаване на малко разтворими
взаимодействие между определяния съединения), Комплексообразувателен –
компонент и съответния реактив; физично най-голямо приложение намират
измерване. Според характера на физичното комплексообразувателни процеси между
измерване методите за количествен анализ метални йони и
се делят на три групи: Определяне на етилендиаминотетраоцетната киселина
количеството на продукта на реакцията – (EDTA). Окислително-редукционен –
тегловен анализ; Определяне на основава се на ОРП, при които става
количеството на изразходвания реактив – преразпределение на електрони между
титриметричен анализ, при който към окислител и редуктор.
разтвора на изследваното вещество се Киселинно-основното титруване във водна
прибавя на порции разтвор на реактива, среда се използва за количествено
т.нар. титруване, докато реакцията протече определяне на неорганични и органични
докрай. Крайната точка на титруването може съединения с киселинни и основни
да се определи визуално с помощта на свойства. Киселините се титруват със
подходящ индикатор или инструментално – стандартен разтвор на основа, а основите –
потенциометрично, амперометрично, със стандартен разтвор на киселина.
спектрофотометрично и т.н. Измерване на Крайната точка на титруването
някакво характерно свойство на системата, (еквивалентното взаимодействие на
изменящо се пропорционално на стандартния разтвор с протолита) се
количеството на интересуващия ни определя визуално или инструментално – с
компонент. помощта на рН-метър. Визуалното
Титриметричният анализ е най-достъпният и установяване на края на титруването се
често използван метод на количествения основава на промяната на цвета на
анализ. Отличава се с бързина, точност и индикатор. Киселинно-основните
широк обхват. Титриметричният анализ се индикатори са слаби протолити, чиито
основава на това, че в химическите реакции киселина и основа са с различен цвят.
веществата си взаимодействат в строго Интервалът между две стойности на рН, в
определени стехиометрични съотношения. които индикаторът преминава от едната в
Титруване – към разтвор на определяното другата форма, се нарича интервал на
вещество се прибавя реактив със строго превръщане.
определена концентрация до момента, в Количественото определяне на
който веществото и реактивът си функционалните производни на
карбоксиловите киселини - естери, лактони,
лактами, най-често се извършва чрез
хидролизно разграждане. Хидролизата
може да протече във водна среда при
нагряване. В алкална или кисела среда
процесът е осапунване. Отделената в
резултат на хидролизата киселина или
излишъкът от прибавения точно определен
обем разтвор за титруване, се титрува.
Неводните среди са особено подходящи за
анализ на лекарства, които са малко
разтворими във вода или проявяват слабо
изразен киселинно-основен характер.
Недостатъци на неводните среди са:
сравнително скъпи и трудно достъпни,
неприятна дразнеща миризма,
необходимост от предварително
пречистване, тъй като присъствието на
примеси с киселинно-основни свойства, вкл.
и вода, затруднява установяването на
крайната точка и води до получаването на
по-високи резултати.
Ледената оцетна киселина е един от най-
широко използваните разтворители за
определяне на слаби незаредени бази. Тя
има силно изразен протон-донорен
характер, поради което засилва базичния и
отслабва киселия характер на протолитите.
Като стандартен разтвор за титруване се
използва разтвор на перхлорна киселина в
оцетна киселина.
Ледената оцетна киселина е подходяща
среда за редица бази, които са във вид на
хидрохлориди (BH+ .Cl- ). Преди титруване
към разтвора на хидрохлорида в ледена
оцетна киселина се прибавя разтвор на
живачен (II) ацетат.
Утаечен анализ – аргентометрия и
тиоцианометрия В утаечния анализ се
използват реакции, при които се получават
практически неразтворими вещества.
Изисквания към аналитичните реакции:
утайката да се отделя бързо и да не се
образуват преситени разтвори; да е
възможно установяване края на титруването
с помощта на подходящ индикатор или по
друг начин.
Комплексометрия е титруване, при което се
използват като титранти разтвори на
аминополикарбонови киселини и техни
соли, наречени комплексони.
Комплексоните притежават способност да
образуват устойчиви, добре разтворими във
вода безцветни комплекси в
стехиометрично отношение 1:1 с редица
метали (Zn, Mg).
Реакциите на окисление и редукция се
извършват с преразпределение на
електрони между две редокс-системи, при
което се променя степента на окисление на
елементите или йоните. Окислително-
редукционните процеси протичат с
различна скорост. В обемния анализ
намират приложение само тези ОРП, които
протичат достатъчно бързо. За ускоряване
на реакциите се използват следните
възможности: прибавят се катализатори;
повишава се температурата на титруваната
проба; прилага се остатъчно титруване. С
помощта на редоксиметричното титруване
могат да се определят както окислители,
така и редуктори. За установяване на края на
титруването – първата излишна капка от
титранта, се използват следните
възможности: Собствено оцветяване на
разтвора; Подходящи индикатори –
окислената и редуцирана форма имат
различен цвят.
7. Атомно-емисионна спектрофотометрия.
Атомната спектрофотометрия e метод за
определяне на концентрацията на
определени метални йони чрез измерване
на интензитета на излъчване или поглъщане
на светлина при определена дължина на
вълната от атомната пара на елемента,
генериран от веществото, например чрез
въвеждане на разтвор на веществото в
пламък. При атомноемисионната
спектрометрия концентрацията на елемент
във веществото се определя чрез измерване
на интензивността на една от емисионните
линии на атомната пара на елемента,
генериран от веществото. Определянето се
извършва при дължината на вълната,
съответстваща на тази линия на емисия.
Апаратурата се състои основно от атомен
генератор на елемента, който трябва да
бъде определен (пламък, плазма, дъга и
др.), монохроматор и детектор. Ако
генераторът е пламък, водата R е избраният
разтворител за приготвяне на тест и
референтни разтвори, въпреки че могат да
се използват и органични разтворители, ако
се вземат предпазни мерки, за да се
гарантира, че разтворителят не пречи на
стабилността на пламъка.
Основни цели на атомно-емисонната,
атомно-абсорбционната и атомно-
флуоресцентната спектроскопия: Да се
превърне всеки тип проба в атомни пари в
газова фаза с малка или никаква обработка
на пробите; Атомизирането да важи за
всички елементи при всички концентрации;
Аналитичният сигнал да е функция на
концентрацията на отделните елементи, т.е.
да липсва матричен ефект; Да се осигуряват
точни и възпроизводими резултати;
Източникът за генериране на атомни пари да
бъде надежден за работа и лесен за
използване и поддържане.
Определенията при атомната
спектрофотометрия се извършват чрез
сравнение с референтни разтвори с
известни концентрации на елемента, като се
използват: Метод на директното
калибриране (Метод I); Метод на
стандартните добавки (Метод II).
Източници на атомни пари: Пламък – днес
главно два вида пламък намират широко
приложение за аналитични приложения –
ацетилен-въздух и ацетилен-азотен оксид.
Изборът на пламък зависи от няколко
фактора: вида на веществото за анализ, вида
на матрицата и дали ще се използва
емисионен, абсорбционен или
флуоресцентен метод. При използване на
ацетилен-въздух, температурата е по-ниска
и благоприятства образуването на
неутрални атоми, а при пламък обогатен на
гориво, образуването на странични оксиди е
възможно да се сведе до минимум. Когато
обаче елементът показва тенденция към
образуване на трудно разложими оксиди, за
препоръчване е използването на по-високо
температурния пламък ацетилен-диазотен
оксид. Този пламък има зона с висока
концентрация на радикалите СN и NH, което
води до силно редукционна област,
инхибираща образуването на трудно
разложими оксиди. Недостатък е, че при
някои вещества нараства йонизацията.
Спектралните характеристики на пламъците
показват наличие на емисии от С, CH, OH, NH
радикали. За повечето атомно-
абсорбционни определяния те не са от
съществено значение. Но при атомно-
eмисионните определяния трябва да се
внимава, за да няма припокриване на тези
излъчвания с линиите на излъчване на
анализираното вещество.
Етапи и процеси при образуване на атоми:
Транспортиране на разтвора – включва
движението на разтвора до пулверизатора.
Пулверизация – използва се пневматичен
пулверизатор. Аерозолен транспорт – има за
задача само най-фините капчици да
достигнат до пламъка, а всички по-едри да
кондензират и отстраняват. Десолватация –
процес на превръщането на аерозолните
капки в частици от соли. Изпарение –
превръщане в пламъка на солевите частици
в пари. Тук се проявяват редица сериозни
пречения (напр. фосфати при излъчване на
Са, Аl). Преченията могат да се отстранят при
подходяща обработка на пробите.
Установяване на равновесие на изпарените
видове за емисионните се изискват
възбудени неутрални атоми. Измерване на
атомна емисия, абсорбция или
флуоресценция. При пламъковата
емисионна спектрофотометрия след
образуването на неутрални атоми в основно
състояние следва възбуждане на атомите и
измерване на характеристично лъчение.
Наблюдаваните спектрални линии са
получени от енергетични преходи,
включващи най-външните електрони.
Преходите от най-ниското разрешено
възбудено ниво до основното състояние се
наричат резонансни, а получените при тях
спектрални линии – резонансни линии.
Резонансна линия на Na e 589.0 nm, на Ca –
422.7 nm, на Zn – 213.8 nm.
Пламъкова фотометрия е метод приложим
най-вече при алкалоземните метали.
Преминалата през филтъра светлина попада
върху чувствителен детектор, като
полученият фототок е право
пропорционален на съдържанието на
анализирания метал. Този метод намира
приложение в практиката в различни
обекти, тъй като е бърз и несложен за
изпълнение. С помощта на пламъкова
фотометрия се определят калий и натрий
във води, в кръв и урина и т.н.
8. Атомно-абсорбционна
спектрофотометрия.
Възможност за определяне на над 70
елемента. Възможност за количествено
определяне въз основата на закона на Беер.
Минимален матричен ефект – броят на
атомите, намиращи се във възбудено
състояние е незначителен в сравнение с
броят им в основно състояние. Затова
атомните преходи, съпроводени с аналитични показатели за количествено
абсорбция на енергия, се срещат рядко. Това
се изразява в чистота на спектрите на
поглъщане и минимална вероятност за
спектрални влияния. Възможност за
определяне на различни по състав проби –
твърди, течни и газообразни; Широк обхват
на приложение – в медицината,
токсикологията, контрола на храни и
хранителни добавки, рудодобива.
Източници на атомно абсорбционни
измервания: Кухо-катодни лампи – Катодът
на лампата е изработен от един елемент
(или сплав на интересуващия ни елемент), а
в спектъра се наблюдава и ивица,
отговаряща на газа, изпълващ лампата (най-
често неон). Като алтернатива може да се
използва друг газ (аргон), ако ивицата на
неона припокрива линията на изследвания
елемент. Когато лампата работи при
относително слаб ток, ширината на линията
на атомната емисия е почти същата като
абсорбционния профил на свободни атоми в
източник пламък. Освен основни линии,
повечето елементи имат и вторични по-
малко чувствителни линии. Те са полезни
при анализ на разтвори, чиито
концентрации са твърде високи, а
разреждане не може да се извърши или е
нежелателно. Кухо-катодните лампи са
едноелементни и многоелементни. По-
интензивна абсорбция и по-висока
селективност имат едноелементните, а
многоелементните намират по-голямо
приложение като източник при рядко
определяеми елементи.
Безелектродни разрядни лампи –
представляват запоени в кварцов съд
количество от елемента или негова сол с
инертен газ. Съдът се поставя в цилиндър,
върху който е поставен резонатор. Когато се
приложи радиочестотно поле, енергията му
йонизира инертния газ и възбужда
металните атоми до излъчване на техния
характеристичен спектър. Използваемият
период на безелектродните разрядни лампи
е по-дълъг от този на кухо-катодните лампи
и при тяхното използване се постигат добри
определяне.
Интензитетът на светлината It от кухо-
катодна лампа, преминала през пламъка,
следва закона на Беер-Ламбер: It = I0(10-abc),
където I0 е лъчението от източника, което
може да се абсорбира от атомите на
пробите. В реалните случаи тази
пропорционалност не се постига, поради
следните фактори: 1. Източникът може да не
е спектрално чист, което води до наличие на
компонент в лъчението, който не се
абсорбира - Iau. 2. Атомите на определяемия
елемент могат да емитират при същата
дължина на вълната, където се извършва и
абсорбция – Ie. 3. Матрицата на пробата
може да предизвика загуби от разсейване –
Is. 4. Матрицата на пробата може да
индуцира абсорбционна загуба във фона –
Iba. Следователно уравнението придобива
вида: It = Io (10-abc) + Iau + Ie - Is – Iba
Неабсорбируемото лъчение се отстранява с
използване на кухо-катодна лампа като
източник на лъчение. Основен проблем е
влиянието на матрицата, което води до
разсейване или абсорбция на фона. Най-
използваният подход за намаляване
влиянието на тези фактори е включването на
втори непрекъснат източник – деутериева
лампа.
ААС се използва за анализ на разнообразни
материали, съдържащи концентрации в
следи (ppm) или в по-значителни количества
от неорганични вещества. Тук се включват
лекарства за хуманната и ветеринарната
медицина, храни, биологични проби за
клинично-лабораторни изследвания,
нефтопродукти, руди, вода, въздух. Основно
предимство на метода е лесната подготовка
(или липсата на такава) на пробата за
анализ. Главен недостатък е, че в определен
интервал от време, се определя само един
елемент и за всеки елемент е необходим
отделен светлинен източник.
9. Електрохимични методи за анализ –
потенциометрия.
Потенциометрията е инструментален метод
за анализ, основан на определяне на
равновесния потенциал на индикаторния
електрод (заменя цветния индикатор),
потопен в разтвор, чрез измерване с
потенциометър на електродвижещо
напрежение, което представлява разликата
между потенциала на индикаторен и
сравнителен електрод, изграждащи един
галваничен елемент.
Изискванията за протичане на
потенциометрията са: реакцията да протича
бързо и индикаторния електрод трябва да
има висока химическа устойчивост, да е
свързан с концентрацията на аналита с
уравнението на Нернст, да е обратим по
отношение на концентрацията на аналита.
При потенциометрията се използват
различни видове апаратура: лампи,
автоматични машини с подаване на титрант
с постоянна скорост или с рН-стати, или
потенциометър на Pogendorf.
Потенциалната разлика, която отговаря за
равновесното състояние метал-разтвор на
негова сол се нарича електроден потенциал
и се прилагат: директно определяне на
концентрацията на даден йон в разтвора и
определяне на еквивалентната точка при
потенциометрично титруване.
При директната потенциометрия
концентрацията на аналита се определя по
уравнението на Нернст, чрез измерване на
потенциала на галваничен елемент, след
калибриране със стандартни разтвори чрез
рН-метрия или йонометрия.
Всяко титруване може да се регистрира
потенциометрично чрез подходяща двойка
от индикаторен и сравнителен електрод.
При киселинно-основно титруване-
водороден или стъклен електрод, при
окислително редукционно - платинов
електрод, при утаечното - сребърен
електрод, при комплекс.–йон-селективен.
Определянето на еквивалентната точка при
титруване се извършва по следния начин:
компенсационен метод, титруване до
потенциал на еквивалентния пункт или чрез
графичен метод.
10. Спектрофотометрия в UV и видимата
област.
При поглъщане на УВ-светлина от
молекулите на дадено вещество се
наблюдават електронни абсорбционни
спектри: налице е преход на валентния
електрон от заеманото от него ниво на
енергетично по-високо ниво.
УВ-областта се дели на две подгрупи:
областта между 100 и 200nm се нарича
далечна или вакуумна, а тази между 200 и
400nm близка УВ-област. За да бъдат
регистрирани преходи в далечната област се
работи в условия на вакуум, тъй като
кислородът и азотът от въздуха поглъщат в
тази област. При обикновени условия се
регистрират само електронни преходи след
200nm.
N→V преход: преминаване на електрон от
свързваща орбитала към по-висока от същия
тип.
N→Q преход: преминаване на електрон от
несвързваща орбитала към свързваща.
Съществено условие за поглъщане в УВ-
областта е наличието на хромофори: проста
функционална група, която съдържа сложна
връзка или неподелена електронна двойка,
която е отговорна за поглъщането на
лъчение с характеристични величини λ и ɛ.
Ауксохроми: съдържат несвързващи
валентни електрони и не показват
абсорбция над 220nm, но поглъщат силно в
далечната УВ-област. Ауксохромите оказват
влияние върху положението и интензитета
на хромофорните ивици: батохромно
(червено отместване – отместване на
ивиците към по-големи дължини на
вълната), хипсохромно (синьо отместване –
отместване на ивиците към по-малките
дължини на вълната), хиперхромен ефект
(увеличаване на интензитета на ивиците) и
хипохромен ефект (намаляване на
интензитета на ивиците).
UV/Vis спектроскопията се използва във
фармакопейния анализ: УВ-тестове за
идентичност, УВ-тестове за чистота, УВ-
тестове за количествено определяне.
УВ-тест за идентичност: сравнява се
спектъра на изследваното вещество с този
на стандарта, отчитат се абсорбционните
максимуми при определени дължини на
вълната, определяне на специфичната
абсорбируемост на изследваната
субстанция, като стойността и трябва да
попада в определения по фармакопеята
интервал, определяне на съотношението на
величините на абсорбциите при различни
абсорбционни максимуми, като получената
стойност трябва да попада в определения по
фармакопеята интервал.
УВ-тест за чистота: измерване на величините
на абсорбция при фиксирани дължини на
вълните с лимитиране на стойностите –
приложимо при наличие на примеси или
разпадни продукти, в чийто спектър се
наблюдава добре изразен батохромен
ефект.
Количественото определяне с помощта на
Ув-спектроскопията:
1. Непосредствено сравняване на
поглъщането на анализираната проба с това
на разтвора с познатата концентрация на
определяното вещество. Определя се
съдържанието на ЛВ по метода на единични
стандарт (C=Aпробата.Cстандарт.b.p/A стандарт.а).
След което се определя съдържанието на
веществата спрямо предварително
определена или предоставена във
фармакопейната статия специфична
абсорбируемост.
2. По метода на калибрационната права се
приготвя стандартна серия от разтвори в
нарастваща концентрация при
предварително определени обхват на
метода , точност и възпроизводимост, и
разтвор от изследваното вещество.
11. Инфрачервена спектроскопия.
Атомите на веществата не са фиксирани, а се
движат непрекъснато. В молекулите
движенията на атомите са ограничени от
взаимодействията помежду им през
химичните връзки. Тези движения могат да
се класифицират на:
Транслационни – съответства на движенията
на цялата молекула в пространството, като
положенията на атомите са фиксирани.
Ротационни преходи – междуатомните
разстояния остават постоянни, но цялата
молекула се върти спрямо три взаимно
перпендикулярни оси, минаващи през
центъра на масата и.
Всички останали движения на атомите могат
да се класифицират като трептения, при
които относителното разположение на
атомите се мени, докато средното
положение и ориентация на молекулата
остават фиксирани.
Инфрачервената област от
електромагнитния спектър се разделя на 3
подобласти: близка (NIR), средна (MIR) и
далечна (FIR). Честотите на ивиците,
съответстващи на основните трептения на
атомите в молекулите на органичните
съединения, са разположени в средната
инфрачервена област (4000-400 см-1),
поради което тя има най-голямо значение
при изучаване на фармакологично АВ.
Общият вид на спектъра при честоти под
1400 см-1 е характерен за дадено
съединение, откъдето идва и названието
„област на пръстовите отпечатъци“.
При облъчване на дадено вещество с
инфрачервена светлина, молекулите
поглъщат енергия, която предизвиква
трептения с изменение или на дължината на
връзките, или ъглите между тях и не се
наблюдава транслационно или ротационно
движение. Трептенията на атомите в
молекулата са различни и се отнасят към два
основни типа: валентни (stretching –
изменение на дължината на връзките без
отклонения от междуядрената ос, и се делят
на симетрични и асиметрични) и
деформацинни (bending – трептения, при
които атомите се изместват от
междуядрената ос и се променя валентния
ъгъл). При сложните молекули са възможни
няколко типа деформационни трептения. За
водата и някои функционални групи е
характерно ножичното трептене, а за други
вещества – махалното трептене. Възможни
са и извънравнинни деформационни
трептения.
Инфрачервените абсорбционни спектри
могат да се приложат за провеждане на
структурен анализ, ако се познават
характеристичните честоти на атомните
групи в инфрачервената област.
Поради големите си характеристични ивици,
ИЧ-спектрите се използват за
идентифициране както на чисти вещества,
така и на вещества влизащи в състава на
различни смеси. Това се извършва по
няколко начина: идентифицирането става
като спектъра на ЛВ се сравни със спектъра
на известно вещество, за което се
предполага, че има еднаква структура с тази
на определяното вещество; ако веществото
е неизвестно, първо се извършва
функционален анализ на спектъра му и той
се сравнява с този на вещество, видът на
което е установен чрез функционален
анализ; идентифицирането на чисти
вещества може да стане и чрез т.н.
диференциални спектри, с помощта на
стандарт.
ИЧ-спектрите могат да бъдат получени за
проби намиращи се в твърда. Течна или
газова фаза.
1. Спектри на течности: Изследваната
течност се разтваря в подходящ разтворител
и се поставя в кювета. Често използвани
разтворители са: сероводород,
тетрахлорметан и хлороформ. Изследваното
вещество трябва да има достатъчно добра
разтворимост в съответния разтворител и
ивиците му да са извън областта на
интензивно поглъщане на разтворителя.
2. Спектри на твърди проби: Най-
разпространените методи за получаване на
спектри са: изготвяне на таблетка (1мг от
пробата се смесва с около 100мг KBr и се
пресова) или изготвяне на суспензия
(изготвя се проба в нуйол или флуоролуб в
разглобяема кювета за суспензии).
3. Спектри за газове: използват се специални
газови кювети.
12. Ядреномагнитна резонансна
спектроскопия, масспектрометрия.
Спектроскопията на ядреномагнитния
резонанс се основава на взаимодействието
на електромагнитни излъчвания от
радиочестотната област с химични
съединения, което води до транспортиране
на кванти енергия за преминаване от едно
енергетично ниво на друго. ΔE=h.ν
Изменените на енергията е свързано с
магнитните свойства на ядрата.
Ядрата на повечето изотопи са положително
заредени сфери, въртящи се около оста си.
Този въртящ заряд генерира магнитно поле.
Магнетизма на ядрото се измерва с
величината магнитен момент (µ) – векторна
величина пропорционална на импулса на
въртене (р).
При нормални условия без външно влияние,
ядрените спинове са напълно произволни
по ориентация. Когато се постави в силно
магнитно външно поле, взаимодействието
между ядрените спинове и положеното
магнитно поле се квантува, в резултат на
което са разрешени само определени
ориентации на ядрените магнитни моменти
спрямо оста (z), на външно магнитно поле Н0.
Явлението се обуславя от магнитните
свойства на атомните ядра. Такива
притежават атомните ядра на 1H, 13C, 19F, 31P.
При тях спиновото число е различно от 0.
За ЯМР-спектроскопията важно значение
имат проекциите на векторите на импулса
на въртене и магнитния момент по посока на
оста z.
При прилагането на външно магнитно поле с
напрегнатост Н0, двата магнитни вектора ще
си взаимодействат и ядрото ще придобие
енергия, което показва, че при прилагане на
външно магнитно поле, енергията на ядрото
ще зависи от магнитното квантово число.
Разликата в енергиите на две съседни нива
се изчислява с уравнението на Бор: ΔE=h.ν
Възникването на ЯМР-спектър на което и да
е съединение най-непосредствено е
свързано с разликата на енергиите на двете
съседни енергетични нива.
ЯМР – превеждане на ядрото от едно
енергетично ниво на друго по-високо ниво.
Честотата, която предизвиква преходите
между енергетичните нива на дадено ядро
се нарича резонансна честота.
Основните характеристики на сигналите на
ЯМР-спектри са химично отместване,
интензитет и мултиплетност.
Химично отместване: определя
положението на сигнала на резонанса в
зависимост от електронното обкръжение на
изследваното ядро. Неговата стойност се
измерва чрез използване на еталонни
вещества. Сигналите на еталоните служат
като начало, спрямо което се измерва
положението на сигналите на изследваното
вещество. Най-широко приложение намира
тетраметилсилана – летлив, инертен и
разтворим в голям брой органични
разтворители. Отчитането на протоните
спрямо тетраметилсилана се извършва
спрямо три скали, където при първите две
химичното отместване се изразява в ppm, а
при последната в херци. При δ скалата
химичното отместване се приема за 0 за
тетраметилсилан, а за всички протони имат
положителен знак. Химичното отместване
при δ се дефинира като безразмерна
величина и се изразява в ppm.
Фактори, влияещи на химичното
отместване:
1. Електроотрицателността на заместителите
в близост до групата. Електроотрицателните
заместители изтеглят електронната
плътност, вследствие на което протоните в
съседство са по-слабо екранирани и техните
сигнали се проявяват в по-слабо поле, т.е.
имат по-голямо δ.
2. Н0 индуцира несиметрични магнитни
моменти за сметка на циркулиращите
електрони на връзката. Ефектът може да
бъде и силен и слаб, и да предизвиква както
екраниране, така и дезекраниране. Тези
ефекти се предават чрез пространството и се
наричат анизотропни. Те са характерни за π-
връзките.
Спин-спиновото взаимодействие се
получава при взаимно влияние на
магнитните моменти на различните ядра в
молекулите на изследваните вещества.
Осъществява се чрез най-близките валентни
електрони. Сигналът на протона, който
взаимодейства с n еквивалентни магнитни
ядра се разцепва и броят на компонентите
се определя чрез: M=n+1
Спин-спиновото взаимодействие се
характеризира с константа на свързване или
константа на спин-спиновото
взаимодействие (j). Тя е величина,
изразяваща енергията на взаимодействие
между ядрата и се определя от разстоянията
на отделните компоненти на мултиплетите.
Не зависи от приложеното магнитно поле, а
само от вътрешномолекулните фактори
(природа на взаимодействащите ядра,
характера на свързване между тях).
Площта на сигнала на резонанса е
пропорционална на броя на ядрата,
определящи даден сигнал. Посредством
интегрална крива се използва за определяне
броя на протоните в съответните групи на
молекулите и за измерване на концентрация
при количествено определяне. Основен
недостатък при количественото определяне
е ниската чувствителност.
Масспектрометрията е метод, който се
основава на деструкция на образеца от
изследваното вещество при бомбардиране с
електрони и по-точно на директното
измерване на отношението на масата към
броя положителни или отрицателни
елементарни заряди на йоните (m/z) в
газовата фаза. Измерва се в единица за
атомна маса или в далтони и протича във
вакуум.
Апаратурата се състои от: система за
пробовъвеждане, йонен източник, йон
преносна система – интерфейс, филтър и
детектор.
Йонизирането на молекулите става чрез:
• Електронен удар – до получаване на
молекулен йон, т.е. йонизацията протича
без разкъсване на молекулите.
• Химична йонизация – с
предварително йонизиран газ.
• Йонизация чрез бомбардиране с
бързи атоми – с атоми на инертни газове.
• Йонизация чрез лазерна десорбция
върху матрицата.
• Електроспрей
 • Химична йонизация при атмосферно
налягане.
Разделянето на йоните е в зависимост от
отношението на масата към заряда в
магнитното поле. Прави се анализ на масите
с магнитни спектри – с единично
фокусиране, може също с масспектрометри
с двойно фокусиране. Анализ се прави на
масите при прелитане. Използва се за
разделяне квадруполен масфилтър – работи
на принципа път на стабилност.
Orbitrap: е анализатор, който се състои от
два външни електрода и централен
електрод, които му позволяват да действа
както като анализатор, така и като детектор.
Йоните, влизащи в анализтора, са захванати
чрез електродинамично притискане, като
обикалят около централния електрод и
между двата външни електрода. Различни
йони осцилират при различни честоти, което
води до тяхното отделяне. Чрез измерване
на честотите на трептене, предизвикани от
йоните върху външните електроди, се
снемат спектри чрез детекция на тока.
Масспектрометрията се използва за:
Определяне на маси и структурни формули
на органични вещества, идентифициране на
вещества, определяне на количествено
съдържание на вещества и за количествено
определяне на лекарствени и токсични
вещества и техни метаболити в биологични
среди.
13. Хроматографски методи – обща теория.
Хроматографски параметри, тестове за
пригодност.
Хроматографията е метод за разделяне и
анализ на смеси от органични съединения,
основан на различното разпределение на
компонентите им между две фази, едната от
които неподвижна, а другата е в движение
по отношение на първата, при многократно
повтарящи се актове на сорбция и
десорбция. Възможността за разделяне на
смеси от органични съединения на основата
на различната им адсорбция от адсорбент в
динамични условия е открита от руския
ботаник М. Цвет. Най-същественото
предимство на хроматографските методи
пред повечето от другите съвременни
аналитични подходи е предварителното
разделяне на компонентите на
анализираната смес, което до голяма степен
улеснява следващото им идентифициране.
Поради своята универсална разделителна
способност хроматографските техники
намират извънредно голямо приложение в
аналитичната практика. Те се
характеризират с висока специфичност и
чувствителност, поради което са подходящи
за разделяне на близки по свойства
вещества в ниски концентрации. Фазата,
която се движи през колоната или слоя
сорбент, се нарича подвижна фаза. Тя е газ
или подходящо подбрана течност. Фазата,
която не е в движение, се нарича
неподвижна фаза. В случаите когато
подвижната фаза има постоянен състав по
време на анализа, елуирането е
изократично. В съвременната апаратура се
предвижда възможност за непрекъснато
изменение на състава на подвижната фаза
по време на анализа. В този случай се говори
за градиентно елуиране.
Хроматографското разделяне може да се
осъществи на основа на различни
механизми, в зависимост от обекта на
анализа и от избрания за тази цел сорбент.
Адсорбционната хроматография се
реализира в случаите, когато като
неподвижна фаза се използва адсорбент, а
разделянето на компонентите на
анализираната смес става поради различия
във физическата им адсорбция. Зоните от
молекули, които взаимодействат по-силно с
адсорбционните центрове, се придвижват
по-бавно през слоя адсорбент, докато тези,
които взаимодействат по-слабо, се елуират
за по-кратко време. В много случаи
сорбентът представлява инертен твърд
материал, на чиято повърхност е нанесен
тънък слой течност. Молекулите на
анализираните съединения се разтварят в
този течен слой в зависимост от
специфичната си разтворимост, което води
до различна скорост на придвижване на
зоните им. Този вариант се означава като
разпределителна хроматография.
Ако използваната неподвижна фаза е твърд
порест материал с определен диаметър на
порите, разделянето на молекулите става в
зависимост от техните размери. Тези от тях,
чиито размери са по-големи от диаметъра
на най-големите пори, преминават през
сорбента бързо, а по-малките се забавят
поради проникване през порите.
Хроматографското разделяне на основата на
такъв механизъм се означава като гел-
хроматография.
При йонообменната хроматография като
сорбент се използва материал, на чиято
повърхност има функционални групи,
способни да обменят йони. Йоните от
изследваната проба се обменят с йоните на
сорбента, като скоростта на движение на
зоната на всеки от тях ще зависи от силата на
взаимодействието му с йонните центрове на
повърхността на частиците на материала.
Поради универсалната си разделителна
способност хроматографските техники се
използват широко в аналитичната практика.
Те имат висока специфичност и висока
чувствителност. Използват се за успешно
разделяне и анализиране на близки по
структура и в ниски концентрации
компоненти в смес – идентифициране, тест
за чистота (анализ на сродни вещества) и
количествен анализ.
Сорбентът в хроматографската система
съдържа „активни центрове“, върху които се
осъществява разпределението. Поради
големия брой активни центрове, актовете на
сорбция и десорбция се осъществява
милиарди пъти. По този начин и най-малки
разлики в структурата и свойствата на
компонентите от сместа усилват значително
разликите в задържането, което води до
ефективното им разделяне. Компонентите,
взаимодействащи по-силно със сорбента, се
задържат по-дълго време в него и се
регистрират по-късно от детектора.
Тестове за установяване на
хроматографските системи: служат за
квалификация на аналитичните
инструменти, валидиране на аналитичните
методи, като тестове за пригодност на
системата и за качествен контрол.
Степен на разделяне: Rs = (t2 – t1) / ½(W1 + W2)
Целта е да се потвърди ефективността на
хроматографската система – в състояние е да
раздели близки по структура вещества
(лимитира се стойността на степента на
разделяне).
Шесткратно инжектиране на стандартен
разтвор и статистическа обработка на
получените резултати – определя се
относителното стандартно отклонение SR,
което в повечето случаи не бива да
надвишава 2.0%.
Класификация:
Газова хроматография
Течна хроматография:
Планарна
Колонна: Отворена колонна
хроматография и HPLC.
14. HPLC.
Подвижната фаза, поставена в съд, се
подава чрез помпата за високо налягане.
След това елуентът преминава през
инжектора, където се внася пробата за
анализ. Пробата прониква през
хроматографската колона, където става
разделянето на веществата, съдържащи се в
изследвания разтвор. Разделените
компоненти един след друг преминават
през детектора, чийто сигнал се записва под
формата на хроматограма.
Най-широко приложение намира UV-
детекторът. Подвижните фази, използвани в
течната хроматография, не поглъщат в UV-
областта на спектъра, затова когато
преминават през детектора не дават сигнал,
т.е. описва се т.нар. базова линия на
хроматограмата. Обратно, хроматографски
разделените вещества много често поглъщат
UV-светлина, която се регистрира от
фотодиода.
Детектори, използвани във ВЕТХ: UV-VIS
детектор – универсален с чувствителност
ng/ml. Основен недостатък е
необходимостта от използване на UV-
неактивни разтворители. Рефрактометричен
детектор – универсален с ниска
чувствителност. Основен недостатък е
необходимостта от прецизен температурен
контрол. Електрохимичен детектор –
селективен с чувствителност pg/ml. Основен
недостатък е възможна адсорбция на
компонентите на пробата и необходимостта
от използването на електрохимично
неактивни разтворители. Флуоресцентен
детектор - селективен с чувствителност
pg/ml. Характеризира се с ограничен обхват
на приложение. Масспектрален детектор -
селективен с чувствителност ng/ml. Основен
недостатък – изисква летливост, работи при
висока температура и не използва
неорганични буфери.
Като сорбент във ВЕТХ най-напред е
намерил приложение силикагелът с
използване на неполярна подвижна фаза.
При анализ в такава система, наречена
система с нормални фази, полярните
вещества имат дълго време на задържане,
докато неполярните вещества напускат
колоната много бързо. Понастоящем много
по-разпространен вариант на
хроматографско разделяне е това,
протичащо между т.нар. обърнати фази
(reversed phase, RP). В този случай се
използва модифициран силикагел, на
повърхността на който химически са
свързани различни по дължина
въглеводородни радикали. Подвижната
фаза е полярен разтворител, най-често
метанол, ацетонитрил или техни смеси с
вода.
ВЕТХ с йонни двойки представлява вариант
на ВЕТХ с обърнати фази. При нея се
използват същите модифицирани с повишаване в стойността на тези параметри
алкилови радикали сорбенти, а в
подвижната фаза е прибавено йонно
органично съединение, с което
противоположно заредените йони на
изследвания компонент образуват йонна
двойка. Последната има поведение на
неутрална частица с нови хроматографски
свойства. Този механизъм на
хроматографско разделяне се прилага при
анализ на смеси, съдържащи киселини,
основи и др. вещества, притежаващи заряд.
Основни параметри във ВЕТХ:
Oбщо време на задържане - tr –това е
времето в мин., необходимо за
преминаване на веществото през
хроматографската колона от момента на
инжектирането му до достигането до
детектора.
Мъртво време на задържане - to – времето,
необходимо за преминаване на едно
инертно (незадържащо се) вещество от
единия до другия край на хроматографската
колона.
Чисто време на задържане (t’r) – определя
се като разлика между общото и мъртво
време на задържане.
Капацитетен фактор - к΄ - представлява
характеристика на хроматографския пик и
определя положението му в
хроматограмата. Той е специфична величина
за дадено вещество и зависи от свойствата
на хроматографската система (вид на
подвижната и неподвижната фаза,
температура, качество на запълване на
колоната и др.). Капацитетният фактор може
да служи за идентифициране на
анализираните вещества.
Относително задържане (селективност) – α –
определя се като отношение на
капацитетните фактори на две разделени
вещества. Този параметър е критерий за
хроматографско разделяне. Очевидно два
хроматографски пика са добре разделени
когато α>1.
Степен на разделяне Rs – отношение на
разстоянието между върховете на два пика и
средната им ширина. Полученият израз
показва, че степента на разделяне зависи от
трите основни параметъра к΄, N и α. Всяко
води до подобряване степента на
разделяне.
Симетрия на пика – S – измерва се на
разстояние от основата, равно на 5 % от
общата му височина, с помощта на
уравнението: S = A/B. В идеалния случай А=В
или симетрията е равна на 1.0.
В хроматографията е прието един
символичен активен център, в който се
извършва разделянето, да се нарича
“теоретична тарелка”. Броят на тарелките,
които се съдържат в една хроматографска
колона, определя ефективността й, като
колкото по-голям е той, толкова по-тесен и
по-висок е хроматографският пик, т.е.
толкова по-добро е разделянето на
веществата, подлагани на анализ.
При определяне ефективността на една
хроматографска система трябва да се вземе
под внимание и дължината на колоната. За
да бъде дефинирана по недвусмислен
начин, ефективността на една
хроматографска система се определя чрез
броя теоретични тарелки за единица
дължина.
Влошаването на разделителната способност
на една система се изразява с размиването
на хроматографските ивици, които се
движат надлъжно през колоната. Основно
значение имат няколко фактора: вид на
частиците и тяхната опаковка, дифузионни
процеси и скоростта на подвижната фаза.
LC:
Течната хроматография намира широко
приложение във фармацията, като
Европейската фармакопея препоръчва този
метод във всички свои статии като подход за
качествен и количествен анализ,
определяне на примеси, установяване на
компoнентен състав. Качествен анализ-
идентифициране чрез свидетел – състои се в
това, че непосредствено след анализа на
определяното вещество се извършва
хроматографиране при същите условия на
друго вещество, за което се предполага, че
се съдържа в изследваната проба.
Съвпадението във времената на задържане
на двата компонента служи като качествена
характеристика. За количествена оценка на
анализираните вещества с помощта на ВЕТХ
най-голямо приложение намират методът
на стандартната права, методът на
вътрешния стандарт и методът на единичния
стандарт.
15. ТСХ и газова хроматография.
Тънкослойната хроматография (ТСХ) е
широко използвана в аналитичната
практика за качествено доказване
(идентификация) на вещества, при
провеждане тестове за чистота, както и за
проследяване хода на химичните реакции.
Този хроматографски метод притежава
редица предимства: висока чувствителност,
възможност за определяне на малки
количества компоненти в сложни смеси,
експресност, непосредствена визуална
представа за разделяните вещества и най-
вече простота на изпълнението. ТСХ се
състои в разделяне на веществата върху
тънък слой от сорбента, закрепен върху
плака. В долния край на плаката, върху т.нар.
стартова линия, с помощта на капилярна
пипета се накапват последователно
изследваната смес и т.нар. свидетели
(стандартни разтвори). Те представляват
чисти вещества, за които се предполага, че
се съдържат в изследваната проба. След
това плаката се изсушава, поставя се в
стъклена вана (камера) като долният край на
плаката се потапя в разтворител (нивото на
разтворителя е малко по-ниско от стартовата
линия). Под действието на капилярни сили
подвижната фаза се изкачва нагоре по
тънкия слой, преминава през старта и
достига до една експериментално избрана
или зададена от фармакопейната статия
височина, наречена фронт. В процеса на
движение на разтворителя, компонентите
на изследваната смес, а също и свидетелите,
се придвижват с различна скорост. Затова
при завършване на този процес, който се
нарича проявяване (развиване), те се
оказват на различни височини. В момента
когато подвижната фаза достигне линията на
фронта, плаката се изважда от камерата и
подвижната фаза се отстранява на въздуха
или при загряване. След това се установява
местоположението на отделните
хроматографски зони като безцветните
петна се маркират (визуализират). Най-
лесно се маркират петната на цветните
съединения и на тези, притежаващи
собствена флуоресценция.
Преобладаващата част от веществата, които
се разделят чрез ТСХ обаче са безцветни,
което налага тяхното визуализиране. За тази
цел в практиката се използват следните
методи: Гасене на флуоресценция: повечето
органични съединения поглъщат светлина в
широка UV-област, в т.ч. и при 254 nm и 360
nm и затова гасят флуоресценцията на
индикатори за посочените дължини на
вълните. В този случай разделянето се
извършва с помощта на адсорбент,
съдържащ флуоресцентен индикатор и
проявената плака се наблюдава на UV-лампа
при 254 nm. На зелено флуоресциращия
слой се наблюдават тъмни петна.
Друг начин за проявяване на петната е
напръскване на хроматограмата с разтвор от
реактиви, които позволяват да се открият
голям брой съединения от различен тип.
Такива реактиви са: конц. сярна киселина,
която още на студено дава тъмни петна с
много органични съединения (овъгляване);
конц. сярна киселина, съдържаща азотна
киселина и други окислители; наситени
хлороформени разтвори на антимонови
хлориди; бромфлуоресцеин – за откриване
на ненаситени съединения и такива, които
лесно реагират с брома; йодни пари или
етерен (спиртен) разтвор на йод; реактив на
Драгендорф, разтвор на нинхидрин и др.
За идентифициране на веществата в ТСХ се
използва величината Rf (reference to the
front) представлява отношение на
разстоянията от старта до центъра на
петното (а) и от старта до фронта (b). Rf = a/b
Най-често използваните сорбенти в ТСХ са
силикагел, диалуминиев триоксид,
кизелгур, целулоза, полиамиди и др.
Силикагелът се получава чрез подкисляване
на натриев силикат. Образуваната при това
силициева киселина поликондезира като
губи вода, образувайки при това
силоксанови мостове (Si-O-Si). Получената
при това пихитиеста маса се нарича гел. При
изсушаване и стриване на гела се получава
силикагел, чиято повърхност е покрита със
силно полярните силанолови групи (Si-OH),
които играят ролята на активни центрове.
Изборът на подходяща подвижна фаза в ТСХ
е от важно значение за успешното
разделяне на веществата. За тази цел е
необходимо на първо място да се има
предвид полярността на веществата,
подлежащи на разделяне. Ако те съдържат
полярни групи, то трябва да се очаква силно
взаимодействие между тях и полярните
силанолови групи на силикагела. На
практика това означава, че тези вещества ще
останат върху стартовата линия. В такъв
случай подвижната фаза трябва да се
модифицира като към неполярния
разтворител се добави малко по-полярен,
който да блокира силното действие на
силаноловите групи. В случай че веществата
са силно неполярни, ще стане обратното - те
ще се задържат незначително и ще се
придвижват заедно с фронта на подвижната
фаза. За да се увеличи задържането на
такива вещества е необходимо да се
използва силно неполярен разтворител.
Един твърде достъпен критерий за
хроматографските качества на
разтворителите представлява тяхната
диелектрична константа. Колкото по-малка е
тази стойност, толкова по-неполярен е
разтворителят и обратно.
ТСХ се прилага и като регламентиран в
Европейска фармакопея метод за
определяне на онечиствания в лекарствени
субстанции. Обикновено за количеството на
онечистващото вещество се поставя
граница, която не трябва да се превишава,
като обичайно тази граница е 1%.
При провеждане на определянето се
приготвят два разтвора: разтвор за
изследване, който съдържа анализираното
вещество, в което се търси примес и разтвор
на стандартна субстанция на същото
вещество със сто пъти по-малка
концентрация. От двата разтвора се нанасят
еднакви обеми на две стартови точки.
Плаката се проявява и петната се маркират.
Ако при изследвания разтвор се появи
допълнително петно, то се дължи на
онечистване. Това петно се сравнява по
големина и интензитет с петното от
стандартния разтвор. Количеството на
онечистващото вещество е в границите на
1% когато неговото петно е по-малко или
съизмеримо с това на стандартния разтвор.
В случай, че се получат няколко петна,
сумата от големината и интензитета им не
трябва да бъде по-голяма от големината и
интензитета на петното от стандартния
разтвор.
Денситометрията е полуколичествен метод
за аналитично охарактеризиране, съчетаващ
условия от ТСХ и спектрални резултати. В
хода на определянето се отчита
намалението в интензитета на светлината,
което е правопропорционално на
концентрацията на вещество. Интензитетът
на отразената светлина или интензитетът на
флуоресценцията е обект на детекция от
съответното устройство в общата схема на
денситометъра.
Газовата хроматография е хроматография,
при която подвижната фаза е газ или пари
(газ-носител). Най-често като газ-носител се
използват аргон, водород, хелий или азот,
като в някои случаи се използват и редица
спомагателни газове според вида на
детектора.
Когато неподвижната фаза е адсорбент
(въглен, силикагел) хроматографията се
нарича газ-адсорбционна. Когато върху
инертен твърд носител е нанесен течен
филм се използват две названия – газ-течна
или газ-разпределителна. В газ-течната
хроматография като неподвижна фаза,
нанесена върху твърд носител, се използват
силиконови масла, полиетиленгликоли с
различни молекулни маси, висококипящи
наситени въглеводороди и др.
Както течната неподвижна фаза и нейният
твърд носител, така и различните видове
адсорбенти трябва да отговарят на
определени условия. Преди всичко те
трябва да имат голяма повърхност и да не
реагират с веществата, които подлежат на
разделяне.
Принципното устройство на газов
хроматограф е следното: от бутилка под
налягане посредством блок за регулиране и
измерване и предпазител се пропуска
непрекъснато с постоянна скорост газ-
носител през хроматографската колона,
поставена в термостат. Изследваната проба,
която подлежи на разделяне, се въвежда в
предварително нагрятата колона във вид на
течност или газ. Ако изследваните вещества
не притежават летливост до 450°С, то те се
обработват по възможност до съответни
естерни или алкилни производни, които
имат по-добра летливост при температура
150 до 450°С. Вследствие на различната
способност да се разпределят между
неподвижната и подвижната фаза,
веществата от изследваната проба се
придвижват от газа носител и се разделят в
хроматографската колона на зони от чисти
вещества. Фракциите на отделните вещества
след напускане на хроматографската колона
преминават през детектор.
Функцията на хроматографския носител е да
задържа стационарната фаза. Един
използван вид носител е морският
диатомит, който представлява скелети на
малки едноклетъчни водорасли (диатоми) и
се състои основно от аморфен хидратиран
силициев диоксид. Този материал има
предимствата на висока порьозност и
голяма повърхност.
Трите най-употребявани детектори в
газовата хроматография са тези, използващи
топлопроводност, пламъкова йонизация и
електронно захващане. Първият е най-
старият тип, който измерва топлинната
проводимост, различна за различните
газове. Този детектор е сигурен, прост,
недеструктивен и умерено чувствителен.
Другите два типа са свързани с промени в
електричния ток – електроните се
произвеждат в пламък чрез изгаряне на
пробата или чрез нейното облъчване с
радиоактивен източник. Пламъково-
йонизационният детектор (ПЙД) има широк
линеен обхват и висока чувствителност. Той
се състои от пламък водород-въздух,
поляризиран в електрично поле. Пламъкът
запалва и йонизира горливите компоненти
на пробата, когато газът-носител минава
през него, след което йоните се събират на
електродите, пораждайки ток. Детекторът с
електронно захващане използва афинитета
на определени функционални групи към
свободни електрони. Газът-носител
преминава през клетка, съдържаща един
бета-източник (електрони от ядрено
делене), който йонизира газа-носител. Бета-
частиците йонизират молекулите на
носителя и пораждат електрони, които
мигрират към анода. Един електрон-
захващащ вид, елуиран от колоната, ще
реагира с електроните, като образува йон
или неутрална молекула, която се изнася
бързо от клетката.
С помощта на газова хроматография се
определят голям брой вещества, които са
летливи. Методът се прилага и при
определяне наличие на остатъчни
разтворители и пестициди най-често в
продукти от растителен произход. Няколко
класа съединения могат да бъдат атакувани
с дериватизиращи реактиви, съдържащи
хлор или флуор, не само за да се направят
продуктите по-летливи и по-малко сходни,
така че да не дават “опашки”, но също и за
да се осигури по-голяма чувствителност към
захващане на електрони. След подходяща
химическа обработка (дериватизация)
много нелетливи вещества се превръщат в
летливи и също се определят с помощта на
този високоефективен метод (линкомицин,
витамини А и Е, етери, нискомаслени
компоненти, масла и др).
Хиралната ВЕТХ почива главно на три
подхода: Хирална неподвижна фаза;
Хирална компонента в подвижната фаза; вещество. Тези инклузионни комплекси се
Предварителна подготовка на пробата със образуват при взаимодействието на
съответстващ хирален реагент. липофилната част от анализираното
Хроматографските методи са едни от най- вещество със сърцевината на
често използваните подходи за анализ на циклодекстрините чрез Ван дер Ваалсови и
стереохимичната чистота на лекарствата. хидрофобни сили, както и чрез водородни
Механизмът на разделяне и връзката между връзки със свободните хидроксилни групи
структура и селективност при разделяне са на глюкозните мономери.
най-добре изучени при газовата
хроматография, високоефективната течна
хроматография и тънкослойната
хроматография. Разделянето чрез хирални
колони спада към директните методи, които
се базират на образуването на преходен
комплекс между хиралния селектор и
енантиомерите от аналита. В зависимост от
вида на колоната, този комплекс може да
възникне благодарение на водородни
връзки, йонни връзки, Ван дер Ваалсови
сили, дипол-дипол и/или π- π
взаимодействия. Йонните връзки
взаимодействат силно, на дълго разстояние
и с двата енантиомера от йонизирания
разтвор, докато водородните и π- π – връзки
действат на близко разстояние и осигуряват
стереоселективността. Първият използван
вид колона за хирално разделяне е
полизахаридната. Изградена е от
полимерите на глюкоза, целулоза или
амилоза, чиито три хидроксилни групи са
предварително дериватизирани с
изоцианатни производни. Чрез
полизахаридна хирална фаза са разделени
рацематите на НСПВС от групата на
производни на пропионовата киселина. Този
тип колони осъществяват временно
взаимодействие на енантиомерите
посредством водородни връзки с
карбонилната или амидна група от
карбамата и π- π – връзка с фениловия
радикал. Друг вид колона е
циклодекстриновата. Тя представлява
циклична структура на олигозахарид,
изграден от различен брой глюкозни
мономери, в чиито център се сформира
кухина с хидрофобни отнасяния, в която се
помества анализираното съединение и
образуват инклузионен комплекс.
Свободните хидроксилни групи на
глюкозата могат да бъдат дериватизирани с
различни заместители с цел подобряване на
хиралните им способности към дадено