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Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
Autoinmunidad

CIENCIA TRASLACIONAL

Eliminación in vitro de células B autorreactivas de pacientes con

artritis reumatoide mediante células T del receptor de antígeno
quimérico universal
Bo Zhang ,1,2,3Yan Wang,2Yeshuang Yuan,3sol jiaqi,2Lulú Liu,1Dan Huang,1
Jinhu,1,3Min Wang,3,4Shengjie Li,1canción wei,1Huachen,4Demin Zhou,2
3,4
Zhang Xuan

editor de manejoJosef ABSTRACTO

Smolen
► El material adicional se publica
únicamente en línea. Para verlo,
visite la revista en línea (http://
dx.doi.org/10.1136/
annrheumdis-2020-217844).
Para afiliaciones numeradas, consulte el
final del artículo.
Correspondencia a
Profesor Xuan Zhang,
Departamento de Reumatología e
Inmunología Clínica, Peking Union
Medical College
Mensajes clave
ObjetivosLas células B autorreactivas desempeñan un papel crucial
en la patogénesis de la artritis reumatoide (AR), y se ha sugerido que
► La terapia con células T con receptor de antígeno
las terapias de reducción de células B que utilizan anticuerpos, como
quimérico (CAR-T) se ha mostrado prometedora en el
el rituximab, son eficaces en el tratamiento de la AR. Sin embargo, el
tratamiento dirigido de enfermedades autoinmunes, pero
agotamiento transitorio de las células B con rituximab se asocia con
es limitada debido a desafíos prácticos relacionados con la
importantes desafíos de seguridad relacionados con la supresión
heterogeneidad y complejidad de las enfermedades
global del sistema inmunológico y, por lo tanto, aumenta los riesgos
autoinmunes.
de infección y desarrollo de cáncer. Para abordar los problemas
► Con el objetivo de abordar los problemas selectivos y
selectivos y persistentes asociados con la terapia de la AR,
persistentes asociados con las terapias para enfermedades
desarrollamos una estrategia terapéutica personalizada que emplea
autoinmunes sistémicas, ejemplificadas por las de la
células T receptoras de antígeno quimérico (células CAR-T) de
artritis reumatoide (AR), desarrollamos
isotiocianato antifluoresceína universal (FITC) combinadas con
un enfoque dirigido y personalizado que empleó
epítopos peptídicos antigénicos marcados con FITC para eliminar
células CAR-T universales con isotiocianato

Protegido por derechos de autor.

Hospital, Academia China de
Ciencias Médicas y Facultad de
Medicina de la Unión de Pekín,
Beijing 100730, China;
zxpumch2003@sina.com y el profesor
Demin Zhou, Laboratorio Estatal Clave
de Ciencias Naturales y
Medicamentos Biomiméticos, Facultad
de Ciencias Farmacéuticas, Universidad
de Pekín, Beijing 100191, China;
deminzhou@bjmu.edu.cn
BZ, YW e YY contribuyeron por
igual.
Recibido el 3 de mayo de 2020
Revisado el 27 de agosto de 2020
Aceptado el 30 de agosto de 2020
subconjuntos de células B autorreactivas que reconocen estos
antifluoresceína (FITC) combinadas con péptidos
antígenos en la AR.
inmunodominantes RA marcados con FITC para
MétodosPara un estudio de prueba de concepto, se seleccionaron
eliminar específicamente varios tipos de subconjuntos
cuatro epítopos peptídicos citrulinados derivados de autoantígenos
de células B autorreactivas.
citrulinados, a saber, vimentina citrulinada, colágeno tipo II
► Como prueba de concepto, demostramos que las células
citrulinado, fibrinógeno citrulinado y tenascina-C, y un péptido
CAR-T anti-FITC podrían redirigirse específicamente y matar
ciclocitrulina-1 como ligandos para atacar células B autorreactivas. ;
células de hibridoma y subconjuntos de células B
Se construyeron y aplicaron células T diseñadas que expresaban un
autorreactivas derivadas de pacientes con AR mediante el
CAR anti-FITC fijo como un sistema de células CAR-T universal para
reconocimiento de los epítopos peptídicos citrulinados
eliminar específicamente estas células B autorreactivas específicas de
marcados con FITC correspondientes.
proteínas mediante el reconocimiento de los epítopos peptídicos
► Se demostró que este sistema era altamente específico
autoantigénicos marcados con FITC antes mencionados.
para las células B autorreactivas con epítopo peptídico
positivo, y la citotoxicidad de las células CAR-T dependía
ResultadosDemostramos que las células CAR-T anti-FITC podrían
estrictamente de la presencia de los péptidos de una
redirigirse específicamente y matar células de hibridoma generadas
manera dependiente de la dosis, lo que subraya la
por inmunización con péptidos antigénicos y subconjuntos de
especificidad y promete efectos específicos de Este
células B autorreactivas de pacientes con AR mediante el
enfoque.
reconocimiento de los correspondientes epítopos peptídicos
► Este estudio proporciona una dirección atractiva para el
citrulinados marcados con FITC. Además, la citotoxicidad de las
tratamiento preciso y personalizado de la AR según los
células CAR-T dependía de la presencia de los péptidos y se producía
perfiles de autoantígenos de cada paciente y
de forma dependiente de la dosis. ConclusionesEl enfoque descrito
probablemente pueda aplicarse a otras enfermedades
aquí proporciona una dirección para enfoques precisos y
autoinmunes sistémicas. Más estudios de eficacia y
personalizados para tratar la AR y probablemente pueda aplicarse a
seguridad justifican la exploración.
otras enfermedades autoinmunes sistémicas.

© Autor(es) (o su(s) Se cree que desencadena las reacciones inmunes

empleador(es)) 2020. No
reutilización comercial. Ver
derechos y permisos. Publicado
por BMJ.
Citar:Zhang B, Wang Y, Yuan Y,et
al. Ann Rheum DisPublicación
electrónica antes de la impresión: [
Por favor incluyaDía mes año].
doi:10.1136/
annrheumdis-2020-217844
INTRODUCCIÓN
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune
sistémica común caracterizada por autoanticuerpos contra
antígenos citrulinados, que generalmente provocan inflamación
crónica en las articulaciones sinoviales y destrucción de las
articulaciones.1Actualmente, el mecanismo patogénico y la
etiología de la AR aún no están claros, pero la citrulinación de
proteínas se ha demostrado desde hace mucho tiempo.
características de la AR.1–3La aparición de
anticuerpos antiproteína citrulinada (ACPA) en el
suero es uno de los marcadores serológicos más
específicos de la AR y está asociado con el desarrollo
y el proceso de la enfermedad. Se han descrito
varias proteínas diana de ACPA.4–8
El tratamiento tradicional para la AR inhibe parcialmente la
producción de autoanticuerpos al suprimir sistémicamente el sistema
inmunológico, pero puede provocar efectos adversos graves.

Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844 1


Autoinmunidad
efectos, como un mayor riesgo de infección.9 10Se han desarrollado varios
productos biológicos específicos para abordar este problema.9Se ha demostrado
que la aplicación de rituximab, un anticuerpo humano específico contra CD20
con capacidad de reducir las células B que expresan CD20 a un nivel casi
indetectable, es terapéuticamente eficaz en la AR.11 12Se ha informado una
disminución en los niveles séricos de ACPA y del factor reumatoide en pacientes
con AR tratados con rituximab, lo que indica que los plasmablastos de vida corta
son la principal fuente de autoanticuerpos en la AR y se dirigen al CD20.+Los
precursores de células B también podrían reducir el CD20 secretor de
autoanticuerpos-plasmablastos indirectamente.13Sin embargo, la ausencia total
transitoria de células B aumenta el riesgo de infección de los pacientes y, en
ocasiones, induce la incapacidad de producir una respuesta de recuerdo a un
antígeno protector.14 15
La terapia con células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) se
ha mostrado prometedora en el tratamiento de enfermedades
autoinmunes, lo que se atribuye a su especificidad e inducción de una
remisión autoinmunitaria duradera.9 16De manera similar al tratamiento de
tumores, el tratamiento de enfermedades autoinmunes con células CAR-T
diseñadas se basa en la eliminación dirigida de células B autoantigénicas,
que se definen por su reactividad contra autoantígenos específicos, sin el
riesgo de inmunosupresión general.17Se han realizado varios estudios para
investigar la aplicación de las células CAR-T en enfermedades autoinmunes.
16-19Por ejemplo, unas células CAR-T diseñadas que expresaban el
autoantígeno Dsg3 específico del pénfigo vulgar persistieron y eliminaron
específicamente las células B autorreactivas que expresaban receptores de
células B (BCR) anti-Dsg3.18Sin embargo, la extensión de la aplicación de
esta metodología a la AR y otras enfermedades autoinmunes sistémicas es
limitada ya que un CAAR o CAR se dirige a un solo tipo de célula, lo que no
es eficaz contra los diversos tipos de linfocitos autorreactivos presentes en
pacientes con AR.
Con el objetivo de abordar los problemas selectivos y persistentes asociados
con la terapia de la AR, nuestro objetivo fue desarrollar una estrategia
terapéutica personalizada utilizando un sistema de células CAR-T universal que
permite apuntar a múltiples BCR mediante células T que expresan un único scFv
combinado con péptidos autoantígenos conocidos para eliminar específicamente
varios tipos de subconjuntos de células B autorreactivas con un mayor nivel de
BCR que reconoce epítopos de proteínas citrulinadas. Nuestro enfoque incluye
tres pasos clave: (1) identificar los tipos de linfocitos autorreactivos presentes
mediante la detección de los niveles de autoanticuerpos contra los principales
péptidos epítopos de un paciente determinado; (2) preparar células CAR-T
universales (CAR-T)20y mediadores; y (3) eliminar específicamente las células B
autorreactivas correspondientes redirigiendo los CAR-T a las células B específicas
de autoantígeno unidas por los péptidos epítopos principales. Los mediadores se
generan mediante la conjugación de un péptido positivo para autoanticuerpos
con moléculas bioortogonales, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC),21 22
que puede ser reconocido únicamente por CAR-T y células B autorreactivas
específicas para este péptido.
Como prueba de concepto, demostramos que los CAR-T anti-FITC
podrían ser redirigidos específicamente mediante epítopos peptídicos
citrulinados marcados con FITC a las correspondientes células de
hibridoma o células B autorreactivas de pacientes con AR con altos niveles
de autoanticuerpos contra los péptidos. Este enfoque permite eliminar
varios subconjuntos de células autorreactivas específicas en un paciente
con AR determinado según su perfil individual. Más importante aún,
nuestro trabajo abre un nuevo campo de tratamiento dirigido a
enfermedades autoinmunes sistémicas.
RESULTADOS
Diseño y caracterización de péptidos antigénicos asociados
a AR y células CAR-T universales.
Primero diseñamos y sintetizamos péptidos antigénicos asociados a la RA para su
reconocimiento específico por parte de las células B patógenas de la RA. Nosotros
2 Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844
Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
se centró en los autoantígenos citrulinados, que generalmente aparecen
mucho antes de la aparición de los síntomas de la AR y han sido bien
identificados como objetivos con potencial terapéutico. Cuatro epítopos
peptídicos citrulinados derivados de autoantígenos citrulinados, a saber,
vimentina citrulinada (cVIM),7colágeno citrulinado tipo II (cCOII),4
fibrinógeno citrulinado (cFib)6y tenascina-C citrulinada (cTNC-5),8
fueron seleccionados como ligandos para apuntar a células B
autorreactivas debido a sus asociaciones bien identificadas y
estudiadas con la AR. Además, un derivado cíclico de un péptido de
filagrina citrulinado, denominado péptido ciclocitrulina (CCP-1),1 23
También fue seleccionado debido a su amplia y bien documentada
aplicación en la clínica para la detección de ACPA (tabla
complementaria en línea S1).
Los CAR-T anti-FITC universales se aplicaron como un sistema de células
CAR-T universal en este estudio.21Las células T diseñadas que expresan un
CAR anti-FITC fijo podrían redirigirse a varios tipos de células B
autorreactivas mediante el reconocimiento de péptidos autoantígenos
marcados con FITC.figura 1A). Para construir este CAR, el clon 4M5.3 del
fragmento variable monocatenario (scFv) anti-FITC fusionado con una
secuencia CAR de segunda generación se subclonó en un vector lentiviral (
figura 1B) y luego se transducen en células T humanas como se describió
anteriormente.21 22La eficiencia de transducción fue generalmente de ~40%
a 50%, medida por citometría de flujo (figura complementaria en línea S1).
En la incubación de células T transfectadas con el anticuerpo IgG anti-ratón
y el péptido FITC simultáneamente o con un anticuerpo conjugado con FITC
no relacionado seguido de un anticuerpo secundario, encontramos que
casi todas las células T que expresan scFv se unen a FITC (figura 1B), lo que
indica que el scFv estaba plegado correctamente en la superficie celular y
Protegido por derechos de autor.
era accesible al ligando conjugado con FITC.
Los CAR-T anti-FITC reconocieron y mataron células de hibridoma
uniéndose con un péptido antigénico conjugado con FITC
correspondiente
Para detectar si las células CAR-T anti-FITC pueden ser redirigidas por
un péptido antigénico conjugado con FITC, primero diseñamos un
modelo in vitro para detectar la citotoxicidad de las CAR-T anti-FITC en
células de hibridoma generadas por inmunización con un péptido
antigénico en la presencia del correspondiente péptido marcado con
FITC. Dos de los cinco péptidos analizados, cFib y cCOII, se
seleccionaron como antígenos y se inyectaron por vía subcutánea en
ratones BALB/c. Después de tres rondas de detección de cada
péptido, se identificaron y clonaron dos cepas de células de hibridoma
que producían los títulos más altos de un anticuerpo específico. La
expresión de BCR para cada cepa de hibridoma se verificó utilizando
un anticuerpo IgG anti-ratón, y se encontró que las cepas de
hibridoma para Fib (2-2) y COII (6-1) tenían una mayor expresión de
BCR que las otras cepas (figura 2A). La disponibilidad y especificidad
de los péptidos FITC antigénicos para estas células de hibridoma se
midieron incubando estas células de hibridoma con un péptido
antigénico marcado con FITC o con un péptido simulado y luego
teñiéndolas con un anticuerpo secundario anti-FITC conjugado con
aloficocianina (APC). Las células de hibridoma teñidas con los péptidos
FITC antigénicos correspondientes mostraron una tinción de APC
significativamente mayor en comparación con la de las células
tratadas con el péptido FITC simulado y la tinción de APC se
correlacionó positivamente con la expresión de BCR (figura 2B).
Tras la validación de la unión bifuncional de los péptidos FITC
antigénicos, a continuación evaluamos la capacidad de estos mediadores
para redirigir las células CAR-T para matar células de hibridoma mediante
el reconocimiento del péptido FITC antigénico correspondiente in vitro. Los
CAR-T anti-FITC lisaron eficazmente células de hibridoma específicas de Fib
o COII en diversas proporciones efector-objetivo (E:T) en presencia de
 Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
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Figura 1Representación esquemática de la eliminación universal de células B autorreactivas mediada por CAR-T. (A) Se incluyeron tres pasos clave en esta metodología: (1) identificar
los tipos de autoanticuerpos de un paciente determinado mediante ELISA; (2) preparar CAR-T anti-FITC universales y péptidos positivos para autoanticuerpos marcados con FITC y (3)
eliminar las células B autorreactivas correspondientes mediante citotoxicidad CAR-T mediada por péptidos. (B) generación y caracterización de CAR-T anti-FITC. La segunda
generación de automóviles anti-FITC se construyó con un vector lentiviral. La expresión y función de los coches en células T humanas se evaluó mediante tinción con IgG anti-ratón
conjugada con APC y péptido marcado con FITC (CCP-1) simultáneamente. La función de los automóviles se detectó mediante tinción primaria con un anticuerpo irrelevante marcado
con FITC y un anticuerpo secundario conjugado con APC. Se determinó el porcentaje de células doble positivas. Los datos son representativos de al menos tres experimentos
independientes. APC, aloficocianina; CAR-T, células T receptoras de antígeno quimérico; FITC, isotiocianato de fluoresceína.

Protegido por derechos de autor.

el péptido FITC antigénico correspondiente y actuó de manera dosis
dependiente. Los efectos citolíticos óptimos se detectaron en una
proporción E:T de 20:1 debido a la alta eficiencia y especificidad observadas
en esta proporción (figura 3A). Este efecto también se verificó mediante
citometría de flujo, en la que el porcentaje de células positivas para FITC-
Fib disminuyó solo en presencia del péptido FITC-Fib, no en presencia de
un péptido FITC simulado o un control no peptídico, lo que indica la alta
selectividad de este enfoque (figura 3B). En particular, cuando incubamos
células de hibridoma Fib y COII junto con CAR-T anti-FITC, encontramos
que, en comparación con cada péptido solo, los péptidos FITC-Fib y FITC-
COII juntos indujeron aumentos significativos en la citotoxicidad y la
liberación de citocinas.figura 3C), lo que sugiere el potencial de este
sistema universal de células CAR-T para matar más de una cepa de células
B secretoras de anticuerpos. Además, la formación selectiva de agregados
fue visible sólo en los cocultivos de CAR-T anti-FITC y células de hibridoma
con el péptido FITC antigénico correspondiente, pero no en aquellos que
contenían ninguno de los controles (figura 3D). En conjunto, estos
resultados indicaron que las células de hibridoma que secretan
anticuerpos específicos podrían ser eliminadas de manera específica y
dependiente de la dosis mediante células CAR-T unidas por el péptido
antigénico correspondiente.
Las células CAR-T anti-FITC mataron preferentemente a las células diana
secretoras de anticuerpos sobre las células que expresan FcγR en presencia de
un anticuerpo específico
Teniendo en cuenta que las células que expresan FcγR que anclan
complejos inmunes de anticuerpos/péptidos específicos también pueden
convertirse en objetivos para estas células CAR-T, a continuación
evaluamos los posibles efectos fuera del objetivo de este enfoque contra
células Raw264.7 derivadas de macrófagos en presencia de un anticuerpo.
La expresión de CD64 (FcγRI) se validó por primera vez mediante citometría
de flujo (figura S2A complementaria en línea). Se encontró que la
citotoxicidad contra Fib(2-2) no se redujo significativamente incluso en
presencia de una cantidad igual de un anticuerpo monoclonal anti-cFib. El
la toxicidad inducida por complejos cFib/anticuerpo contra células
Raw264.7 fue indetectable excepto que estaba presente una enorme
cantidad de anticuerpos (más de una décima parte de cFib); a pesar de la
gran cantidad de anticuerpos, la toxicidad contra las células Raw264.7 fue
significativamente más débil que contra las células diana (figura
complementaria en línea S2B). De acuerdo con la observación del ensayo
de citotoxicidad, cuando incubamos células Fib(2-2) y Raw264.7 con CAR-T,
la reducción en las células Raw264.7 se observó solo cuando la
concentración de anticuerpos alcanzó un nivel extraordinariamente alto
(en línea). figura complementaria S2C). En particular, estos efectos fuera
del objetivo podrían reducirse aún más bloqueando FcγR con un
anticuerpo irrelevante (figura complementaria en línea S2B,C). En general,
estos resultados sugirieron la especificidad y los efectos específicos
prometedores de este enfoque.
Las células CAR-T anti-FITC reconocieron y destruyeron células B secretoras
de anticuerpos anti-COII de ratones con artritis inducida por colágeno (CIA)
in vitro mediante la unión con un péptido antigénico conjugado con FITC
Habiendo validado la efectividad y especificidad de esta metodología en un
modelo de hibridoma, a continuación buscamos determinar si esta
metodología podría usarse para eliminar grupos de células secretoras de
anticuerpos específicos mediante la aplicación de péptidos antigénicos
conjugados con FITC apropiados. Se empleó CIA debido a su amplia
aplicación en estudios de AR y su capacidad de activarse con una sola
proteína COII.24Se seleccionaron como ligandos potenciales tres epítopos
peptídicos identificados derivados de la región del fragmento 11 de CNBr
de la proteína COII bovina, denominada P1-P3.25–27
(tabla complementaria en línea S2). La capacidad de estos péptidos para
redirigir los CAR-T anti-FITC a células B secretoras de anticuerpos anti-COII
se determinó primero utilizando células de hibridoma generadas mediante
la inmunización de ratones DBA/1 con la proteína COII bovina. El análisis de
unión por citometría de flujo demostró que los seleccionados

Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844 3

 Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
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Figura 2Evaluación de la unión y especificidad de los péptidos antigénicos para sus células de hibridoma. (A) comparación de los niveles de expresión de BCR específicas de
antígeno en diferentes cepas de hibridoma monoclonal. La expresión de BCR en células de hibridoma se evaluó mediante tinción única con un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado
con PE. (B) evaluación de la capacidad de unión del péptido antigénico a sus células de hibridoma. Las células de hibridoma se incubaron primariamente con el péptido antigénico
marcado con FITC correspondiente y luego se tiñeron con anticuerpos anti-FITC-APC. Las células tratadas con un péptido simulado marcado con FITC con secuencia aleatoria se
utilizaron como control negativo. Los resultados mostrados representan los hallazgos de tres experimentos. APC, aloficocianina; BCR, receptores de células B; FITC, isotiocianato de
fluoresceína; PE, ficoeritrina.

Los péptidos exhibieron diferentes afinidades de unión para cada una de
las tres cepas de células de hibridoma, lo que explica los diferentes niveles
de citotoxicidad específica inducida por las células CAR-T.figura 4A y figura
complementaria en línea S2).
La destrucción específica de células diana específicas de COII se midió
mediante un ensayo ELISPOT específico de COII para la secreción de anticuerpos.
Se aislaron células B de los esplenocitos de DBA/1 inmunizado con COII.
ratones con el título de anticuerpos anti-COII más alto (figura
complementaria en línea S3A) y estimulados con COII. Como antes, se
verificaron las afinidades de unión de los péptidos antigénicos conjugados
con FITC a las células B estimuladas (figura 4By figura complementaria en
línea S3B). Luego, las células B estimuladas se cocultivaron con CAR-T anti-
FITC en presencia de péptidos antigénicos conjugados con FITC en placas
ELISPOT recubiertas con COII. Específico de COII

4 Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844

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figura 3Caracterización de la citotoxicidad mediada por péptidos antigénicos de CAR-T anti-FITC in vitro. (A) actividad citotóxica de CAR-T anti-FITC contra células de
hibridoma en presencia de péptido antigénico marcado con FITC o péptido simulado marcado con FITC en la concentración indicada y en las proporciones efector-
objetivo (E:T). La actividad citolítica se determinó midiendo la cantidad de lactato deshidrogenasa liberada en el medio de cultivo. (B) evaluación de la eliminación
selectiva de células de hibridoma diana mediante citometría de flujo. Se incubaron células de hibridoma Fib (2-2) con FITC-CAR-T en presencia de cFib marcado con
FITC o péptido simulado durante 24 horas, y las células cultivadas se lavaron y tiñeron con un exceso de 100 veces de péptido cFib marcado con FITC para detectar las
células Fib (2-2) restantes. (C) Evaluación de la citotoxicidad simultánea y la liberación de citocinas de CAR-T anti-FITC contra dos tipos de células de hibridoma. Se
incubaron células de hibridoma Fib (2-2) y COII (6-1) con ani-FITC CAR-T en una proporción de 1:1:20 en presencia de cFib, CoII o ambos marcados con FITC,
respectivamente. durante 24 horas. La citotoxicidad y los niveles de IL-2 en los cultivos se determinaron mediante el método basado en lactato deshidrogenasa y
ELISA, respectivamente. Para A – C, los datos se presentan como la media ± SEM derivada de muestras por triplicado (n = 3). Se muestran resultados representativos
de uno de tres experimentos. Los valores de p mostrados se determinaron mediante ANOVA unidireccional (prueba de comparación múltiple de Dunnett) en
comparación con los del grupo no tratado con péptidos para B y el grupo tratado con dos péptidos para C. (D) características morfológicas de la activación de CAR-T
dependiente del péptido antigénico marcado con FITC. Se demostró la posición media del pozo para cada grupo y el aumento original fue de 10 veces. Los datos son
representativos de tres experimentos independientes. *P≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001 y ****p≤0.0001. ANOVA, análisis de varianza; CAR-T, células T receptoras de
antígeno quimérico; FITC, isotiocianato de fluoresceína; SEM, SE de la media.

Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844 5

 Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
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Figura 4Evaluación de la citotoxicidad CAR-T mediada por péptidos inmunodominantes contra anticuerpos anti-COII que secretan células B de ratones con artritis inducida por colágeno (CIA). (A)
comparación de la afinidad de unión y la citotoxicidad mediada por péptidos de CAR-T para cada subconjunto de células de hibridoma específico de COII. Las células de hibridoma se tiñeron con cada
péptido inmunodominante marcado con FITC y anticuerpo anti-FITC-APC. Las afinidades de unión de cada péptido a diferentes células de hibridoma se determinaron mediante el porcentaje de
células positivas para péptidos. La citotoxicidad de los CAR-T inducida por péptidos inmunodominantes se midió mediante incubación de células de hibridoma y CAR-T anti-FITC en una proporción de
1:20, y se detectó la liberación de LDH como se describió anteriormente. Los datos son representativos de tres experimentos independientes y se muestran como la media ± SEM derivada de
muestras por triplicado (n = 3). Véase también la figura complementaria en línea 3. (B – C) Anticuerpos anti-COII anti-FITC CAR-T específicos que secretan células B de ratón CIA in vitro mediante la
unión con los péptidos antigénicos conjugados con FITC correspondientes. Se inmunizaron ratones DBA/1 con COII bovino emulsionado de CFA y se volvieron a exponer a COII de IFA 21 días
después. (B) Análisis de unión del péptido inmunodominante conjugado con FITC a células B aisladas de ratones DBA/1 con el título de anticuerpo anti-COII más alto. Las células B se aislaron y
estimularon con COII durante 5 días antes del análisis, y las células B aisladas de ratones no tratados se utilizaron como control negativo. véase también la figura 4B complementaria en línea. (C)
Muerte in vitro de células B productoras de anticuerpos mediante CAR-T anti-FITC. Izquierda: las células B estimuladas del panel B se cocultivaron con CAR-T durante 2 días, y las células secretoras de
anti-COII se enumeraron mediante el ensayo ELISPOT; derecha: cuantificación de manchas específicas de COII formadas por células B secretoras de anti-COII después del cocultivo con CAR-T anti-
FITC y citotoxicidad de los CAR-T. Los datos se muestran como la media ± SEM derivada de muestras por triplicado (n = 3), y el valor de p se determinó mediante la prueba t de Student no apareada
de dos colas. *P≤0.05, **p≤0.01. APC, aloficocianina; CAR-T, células T receptoras de antígeno quimérico; FITC, isotiocianato de fluoresceína; SEM, SE de la media. células T receptoras de antígenos
quiméricos; FITC, isotiocianato de fluoresceína; SEM, SE de la media. células T receptoras de antígenos quiméricos; FITC, isotiocianato de fluoresceína; SEM, SE de la media.

6 Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844


Se detectaron células B productoras de anticuerpos después de 2 días de
cocultivo con CAR-T en presencia de péptido FITC simulado, mientras que
la producción de anticuerpos disminuyó significativamente en presencia de
péptidos antigénicos conjugados con FITC. Esta observación fue
consistente con un ensayo de citotoxicidad (figura 4C). En general, estos
resultados indican que estos péptidos seleccionados tienen el potencial de
redirigir los CAR-T para matar las células B específicas de COII.
Eliminación in vitro de células B autorreactivas específicas de pacientes
con AR con péptidos específicos de autoanticuerpos
Finalmente evaluamos el potencial terapéutico de este sistema de células
CAR-T in vitro con muestras de pacientes con AR. Se tomaron muestras de
sangre de pacientes con AR establecida y se aislaron el suero y las células B
purificadas para su análisis. Para determinar qué tipos de células B
autorreactivas estaban presentes en ciertos pacientes, primero analizamos
los autoanticuerpos en el suero mediante ELISA directo. Encontramos
diferentes tipos de anticuerpos positivos para autoantígeno presentes en
estos pacientes: en comparación con los donantes sanos, el primer
paciente con AR (RA-1) tenía títulos más altos de autoanticuerpos contra
CCP-1 y cFib, y RA-2 mostró solo CCP-1- anticuerpos específicos; Los
distintos títulos altos de autoanticuerpos contra cVIM, CCP-1 o cTNC5 en
RA-3 y RA-4 se encontraron como se indica (figura 5A). Al teñir las células B
purificadas de estos pacientes, se observó un porcentaje significativamente
mayor de la población positiva para el péptido en las células tratadas con el
péptido FITC que en las células tratadas con el péptido FITC simulado (
figura 5By figura complementaria en línea S3). Claramente, la presencia de
células B autorreactivas específicas en pacientes se asoció con la
producción de los autoanticuerpos correspondientes, y estas células
podrían ser atacadas por el péptido autoantígeno inmunodominante
correspondiente.
Luego exploramos la citotoxicidad y especificidad de los CAR-T para
estas células B autorreactivas. Las células B purificadas y estimuladas de
RA-1 y RA-2 se incubaron con CAR-T en presencia de los correspondientes
péptidos específicos de anticuerpos. Los CAR-T anti-FITC lisaron eficiente y
específicamente células B autorreactivas específicas de péptidos en
presencia de péptido sérico positivo marcado con FITC, pero demostraron
una actividad citolítica mínima con el péptido FITC simulado. Las células B
autorreactivas específicas de péptidos no fueron lisadas en presencia de
péptidos séricos negativos (NP) irrelevantes y células T no transducidas, y
la citotoxicidad pudo bloquearse mediante la adición de un exceso de
moléculas de FITC libres.figura 5C,D). Los niveles secretados de citoquinas
fueron consistentes con los resultados de la actividad citolítica (figura 5E).
En conjunto, estos datos mostraron que los CAR-T mataron de manera
eficiente y específica las células B autorreactivas de los pacientes a través
de la citotoxicidad de las células CAR-T mediada por péptidos epítopos
antigénicos.
DISCUSIÓN
La terapia CAR-T se ha mostrado prometedora en el tratamiento objetivo de
enfermedades autoinmunes debido a su alta eficiencia, focalización y
durabilidad, pero está en gran medida limitada por desafíos prácticos debido a la
heterogeneidad y complejidad de las enfermedades autoinmunes.9A medida que
se ha identificado un número cada vez mayor de autoantígenos junto con sus
epítopos antigénicos, cada vez es posible eliminar individualmente las
principales poblaciones de células B autorreactivas con conjuntos personalizados
de péptidos inmunodominantes según las circunstancias personalizadas. Como
prueba de concepto, aquí diseñamos un escenario específico y personalizado
que empleó CAR-T anti-FITC universales combinados con péptidos
inmunodominantes marcados con FITC para eliminar subconjuntos de células B
específicas de autoantígeno que reconocen antígenos citrulinados presentes en
la AR.
Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844
Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
Autoinmunidad
Los estudios iniciados en un modelo de células de hibridoma utilizando
los péptidos antigénicos marcados con FITC correspondientes mostraron
que los péptidos antigénicos marcados con FITC podían redirigir los CAR-T
anti-FITC a las células de hibridoma y que exhibían efectos de citotoxicidad
de una manera dependiente de la dosis, verificando la aplicabilidad y
selectividad de esta metodología. Además, descubrimos que los CAR-T anti-
FITC podrían eliminar simultáneamente más de una cepa de células de
hibridoma de una manera dependiente de la presencia del péptido
antigénico marcado con FITC correspondiente, abordando potencialmente
el problema de la heterogeneidad en la terapia de la AR utilizando CAR- Ts.
Se evaluó si este enfoque tuvo un efecto fuera del objetivo
significativo utilizando un modelo celular in vitro. No se detectó
citotoxicidad contra células FcγR+Raw264.7 excepto cuando se
añadió una cantidad excesiva de anticuerpo específico. Sin
embargo, los CAR-T anti-FITC se dirigieron preferentemente a las
células de hibridoma en una amplia gama de concentraciones de
anticuerpos, mientras que no redujeron las células que expresan
FcγR incluso en presencia de enormes cantidades de anticuerpos
específicos. Estos resultados fueron consistentes con un estudio
previo con células CAAR-T,18implicando que la toxicidad fuera del
objetivo parece insignificante e improbable; esta toxicidad se
atribuye a ciertos autoanticuerpos, ejemplificados por ACPA, que
generalmente tienen una avidez baja y comprenden sólo una
pequeña fracción de la IgG total.28 29Se podrían aplicar
numerosos enfoques, incluida la optimización de la dosis de
péptido FITC y el bloqueo previo de FcγR mediante
inmunoglobulina intravenosa, para abordar aún más este posible
Protegido por derechos de autor.
problema de seguridad. El potencial terapéutico de este enfoque
para el tratamiento de la AR se confirmó preliminarmente en
pruebas ex vivo utilizando células B autorreactivas de pacientes
con AR. Según un estudio serológico, descubrimos que los cuatro
pacientes con AR analizados mostraban diferentes tipos de
autoanticuerpos específicos contra paneles de péptidos, lo que
destaca la necesidad de una eliminación celular precisa y
adaptada a las condiciones locales. En la caracterización primaria
del suero autorreactivo de pacientes dados a péptidos
inmunodominantes, se observó que los péptidos positivos para
anticuerpos marcados con FITC inducían con éxito la lisis de las
células B autorreactivas correspondientes en presencia de CAR-T
anti-FITC.
La principal limitación de este estudio piloto es que solo mostró la eliminación
específica in vitro de células B autorreactivas y carecía de evidencia sustancial
para demostrar los efectos terapéuticos de este enfoque in vivo. En teoría, esta
estrategia podría eliminar directamente las células B autoantigénicas que
expresan altos niveles de un BCR específico y puede afectar indirectamente a las
células plasmáticas secretoras de autoanticuerpos de vida corta o larga que se
reponen a partir del conjunto de células B de memoria. Aún queda por explorar
la consecuencia de la aplicación a largo plazo de CAR-T sobre la diferenciación de
las células plasmáticas y la secreción de anticuerpos. Una cuestión adicional es la
estabilidad in vivo del mediador derivado del péptido. Optimización estructural
de los ligandos dirigidos específicos de antígeno bifuncionales,30–32como el
dominio inmunogénico conjugado que comprende péptidos antigénicos y
fragmentos de anticuerpos para un aumento en el peso molecular del mediador,
podría ser factible para abordar estos problemas. Para la evaluación de los
efectos terapéuticos in vivo se deben considerar otros factores, como un
régimen de administración a largo plazo, una cantidad suficiente para alcanzar
un BCR específico y un formato inyectable para evitar la proteólisis. Además,
dados los abundantes estudios que han revelado la consiguiente reducción de
las respuestas humorales con la vacunación secuencial y los tratamientos con
rituximab,33 34También es importante evaluar la seguridad de este enfoque en
términos del impacto en la defensa inmune del huésped y las respuestas de
recuerdo de la vacunación.
7
 Ann Rheum Dis: publicado por primera vez como 10.1136/annrheumdis-2020-217844 el 30 de septiembre de 2020. Descargado dehttp://ard.bmj.com/el 3 de octubre de 2020 en Auckland University Technology.
Autoinmunidad

Protegido por derechos de autor.

Figura 5Eliminación dirigida de células B autorreactivas específicas de pacientes con AR mediante citotoxicidad de células CAR-T mediada por péptidos inmunodominantes. (A) identificación de
autoanticuerpos que reconocen péptidos inmunodominantes en los sueros de determinados pacientes con AR. Los péptidos biotinilados se inmovilizaron en placas recubiertas previamente con
neutravidina y los niveles de autoanticuerpos que reconocían los péptidos inmovilizados se determinaron mediante detección de TMB. Cada símbolo representa un donante individual, los datos se
muestran como la media ± SEM derivada de muestras por triplicado (n = 3). (B) evaluación de la unión de péptidos positivos para anticuerpos a células B autorreactivas. Se aislaron células B de RA-1
mediante separación magnética y se estimularon ex vivo durante 5 días antes del ensayo. (C) Evaluación de la eliminación dirigida de células B autorreactivas específicas mediante citometría de
flujo. Las células B purificadas y estimuladas de RA-1 y RA-2 se incubaron con CAR-T anti-FITC en una proporción de 1:20 en presencia de péptidos positivos para anticuerpos en las concentraciones
indicadas. Las células cultivadas se lavaron y se tiñeron con un exceso de péptidos cultivados para detectar las células B autorreactivas correspondientes restantes. El porcentaje disminuido de la
población de células positivas para péptidos causada por la citotoxicidad mediada por células CAR-T se indica como un marco rojo y se compara con el del control negativo. La viabilidad de las
células cultivadas, que se calculó como 100 × (1 - citotoxicidad%), donde el% de citotoxicidad se demostró en el panel D, se indica entre paréntesis. (D) Evaluación de la citotoxicidad y (E) secreción
de citoquinas (IFN-γ e IL-2) de células CAR-T anti-FITC contra las células B autorreactivas específicas en C. El grupo tratado con cFib del péptido negativo (NP) en suero para RA-2 se denomina NP
(cFib). Los datos se muestran como la media ± SEM derivada de muestras por triplicado (n = 3), y los valores de p se determinaron mediante ANOVA unidireccional (prueba de comparación múltiple
de Dunnett) y se compararon con el grupo de células T no transducidas (D) y el modelo simulado. grupo (panel E). *P≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001 y ****p≤0.0001. ANOVA, análisis de varianza; CAR-
T, células T receptoras de antígeno quimérico; FITC, isotiocianato de fluoresceína; AR, artritis reumatoide; SEM, SE de la media. Análisis de variación; CAR-T, células T receptoras de antígeno
quimérico; FITC, isotiocianato de fluoresceína; AR, artritis reumatoide; SEM, SE de la media. Análisis de variación; CAR-T, células T receptoras de antígeno quimérico; FITC, isotiocianato de
fluoresceína; AR, artritis reumatoide; SEM, SE de la media.

8 Zhang B,et al. Ann Rheum Dis2020;0:1–9. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217844


En conclusión, presentamos una plataforma versátil novedosa que
proporciona un enfoque preciso y personalizado para el tratamiento
de la AR. Verificamos preliminarmente la viabilidad de este enfoque y
aún quedan por realizar más estudios de eficacia y seguridad. A la luz
de la identificación emergente de autoantígenos y el desarrollo de
análisis genéticos y proteómicos, se podrían personalizar y aplicar
varias combinaciones de péptidos epítopos para eliminar
específicamente los linfocitos autorreactivos patógenos según análisis
serológicos y ómicos. Creemos que un sistema de células CAR-T tan
universal proporciona una dirección para enfoques precisos y
personalizados para tratar la AR y probablemente pueda aplicarse a
otras enfermedades autoinmunes sistémicas.
Afiliaciones de autor
1Departamento del Centro de Investigación Médica, Hospital de la Facultad de Medicina de la Unión
de Pekín, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Beijing,
China
2Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Naturales y Biomiméticos, Facultad de Ciencias
Farmacéuticas, Universidad de Pekín, Beijing, China
3Centro de Inmunología Clínica y Centro de Epigenética, Hospital de la Facultad de Medicina de la
Unión de Pekín, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín,
Beijing, China
4Departamento de Reumatología e Inmunología Clínica, Hospital de la Facultad de Medicina de la Unión
de Pekín, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Beijing,
China
AgradecimientosAgradecemos sinceramente a los miembros de Xunyao Wu por su útil y revelador
debate. También agradecemos a todos los donantes que participaron en este estudio.
ColaboradoresBZ, YW, LL y DH diseñaron el estudio; BZ, YW, YY, JS, LL y DH
realizaron los experimentos y analizaron los datos; JH y MW contribuyeron a la
recopilación y recopilación de datos, análisis e interpretación de datos; WS, SL y HC
hicieron comentarios; BZ, DZ y XZ escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los
autores revisaron el manuscrito.
FondosEste estudio fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (81788101, 81630044, 81803419, 91753202, 81821004), el Fondo de
Innovación de Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas
(CIFMS2016-12M-1–003, 2017–12 M- 1-008, 2017-I2M-3–011, 2016–12 M-1-008), el Fondo
Juvenil PUMC (2017350001), el Fondo de Desarrollo de la Salud de Beijing Capital
(2020-2-4019) y una subvención del Centro de Investigación de Epigenética Médica , Academia
China de Ciencias Médicas (2017PT31035).
Conflicto de interesesNinguno declarado.
Participación del paciente y del públicoLos pacientes y/o el público no participaron en el diseño, la
realización, la presentación de informes o los planes de difusión de esta investigación.
Consentimiento del paciente para publicación.No requerido.
Aprobación de éticaTodos los estudios aquí reportados fueron aprobados por la Junta de Revisión
de Ética del Hospital PUMC, Academia China de Ciencias Médicas (CAMS).
Procedencia y revisión por paresNo encargado; Revisado externamente por pares.
Declaración de disponibilidad de datosLos datos están disponibles previa solicitud razonable. Todos los datos
relevantes para el estudio se incluyen en el artículo o se cargan como información complementaria en línea.
ID ORCID
Bo Zhanghttp://orcid.org/0000-0002-9652-1120 Zhang
Xuanhttp://orcid.org/0000-0001-8775-1699
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