U.T. 1.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1. Introducción:
El laboratorio de Microbiología es aquel centro o establecimiento que realiza
determinaciones microbiológicas y parasitológicas sobre muestras de origen humano destinadas
tanto a la promoción de la salud como al diagnóstico.
El centro de trabajo debe ser un lugar seguro, eficiente y cómodo, no solo para el personal
de trabajo sino para cualquier visitante que acceda a él.
La norma ISO 15189 especifica que el laboratorio de microbiología clínica debe disponer de un
espacio suficiente, de forma que su carga de trabajo se pueda realizar sin comprometer su calidad
de trabajo y la seguridad de todo el personal de trabajo o visitantes, además se debe respetar la
privacidad del paciente, restringir el acceso a las distintas zonas del laboratorio y contar con un
lugar de almacenamiento que asegure la integridad de las muestras, reactivos, productos
químicos y todos los materiales necesarios.
En general se debe adoptar un diseño lo más general posible, su objetivo fundamental es
el aislamiento y cultivo de microorganismos patógenos. Esta actividad genera un riesgo para el
personal, es por ello que toda instalación debe cumplir como mínimo los criterios del nivel de
contención o bioseguridad II.

2. Terminología relacionada con Prevención de Riesgos Laborales y Protección Ambiental

Antes de definir las necesidades de un laboratorio, es preciso definir claramente conceptos
de interés como Contención, barreras primarias y secundarias, agente biológico… y distinguir
entre Seguridad biológica y Protección biológica.

A. El término Contención se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de
materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la
exposición del personal de los laboratorios, del resto del personal y del entorno a agentes
potencialmente infecciosos.
Se habla de contención primaria o barreras primarias para referirse a aquellas que
protegen al trabajador y a su entorno inmediato (técnicas microbiológicas y equipos de
protección).
Las barreras secundarias (contención secundaria) se refieren al diseño y construcción de
un laboratorio que contribuyen a la protección del propio personal del laboratorio, proporciona una
barrera para proteger a las personas que se localizan fuera del laboratorio y protege a las
personas y animales de la comunidad frente a posibles escapes accidentales de agentes
infecciosos. El director o jefe del laboratorio es el responsable de la seguridad, siendo obligación
de la gerencia del centro la provisión de la dotación necesaria.

B. Seguridad biológica (o “bioseguridad”) es el término utilizado para referirse a los principios,

técnicas y prácticas aplicadas con el fin de evitar la exposición no intencional a patógenos y
toxinas, o su liberación accidental.
La Seguridad Biológica o Bioseguridad se fundamenta en tres elementos denominados elementos
de Contención:
• Técnicas de laboratorio (barreras primarias). El elemento más importante para contener los
riesgos biológicos es el seguimiento estricto de las prácticas y técnicas estándar
microbiológicas. Como parte de estas prácticas está el desarrollo o adopción por parte de
cada laboratorio de un manual de operaciones (Manual de Seguridad Biológica) en el que
se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los
procedimientos que puedan minimizar esos riesgos.

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 • Equipo de seguridad (barreras primarias). Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o
aparatos que garantizan la seguridad (ej. las cabinas de seguridad biológica), como las
prendas de protección personal: los protectores de los ojos y de la cara (gafas de
seguridad, pantallas faciales), los protectores de las vías respiratorias (mascarillas,
máscaras), los protectores de manos y brazos (guantes, manguitos), los protectores de la
totalidad del cuerpo (batas)…
• Diseño y construcción de la instalación (barreras secundarias). La magnitud de las
barreras secundarias dependerá del tipo de agente infeccioso que se manipule en el
laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas donde tiene acceso el
público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación (autoclaves), el filtrado del aire
de salida al exterior, el flujo de aire direccional, etc.
C. Protección biológica (o “bioprotección”) se refiere a las medidas de protección de la institución y
del personal destinadas a reducir el riesgo de pérdida, robo, uso incorrecto, desviaciones o
liberación intencional de patógenos o toxinas.

3. Ley de Bioseguridad: Agentes Biológicos.

La legislación española aprobó en 1994 la llamada Ley de Bioseguridad o Ley 15/94. Esta
ley establece el régimen jurídico del uso confinado, la liberación voluntaria y comercialización de
organismos modificados o no genéticamente a riesgo de prever el riesgo para la salud pública y el
medio ambiente.
La clasificación de estos organismos se hace en función del alto o bajo riesgo hacia la población.
En esta ley de bioseguridad se define Agente Biológico a todo aquel microorganismo modificado o
no genéticamente capaz de originar cualquier infección, alergia o toxicidad.

En base a esta definición se clasifican en 4 grupos:

-Grupo 1: Aquellos microorganismos que es poco probable que causen enfermedad en el hombre.
Ej: Escherichia coli.
-Grupo 2: Aquellos microorganismos que causan enfermedad al hombre, pero es poco probable
que se propague, y si esto ocurriera existe profilaxis o tratamiento eficaz. Ej: Candida sp,
enterobacterias…
-Grupo 3: Aquellos microorganismos que causan enfermedad grave al hombre, presentan un
peligro para los trabajadores ya que existe riesgo de que se propague a la colectividad, aun así
existe profilaxis o tratamiento eficaz. Ej: Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis.
-Grupo 4: Aquellos microorganismos que causan enfermedad grave al hombre suponiendo un
serio peligro para los trabajadores con elevada probabilidad de que se propague a la colectividad
y no existe profilaxis o tratamiento eficaz. Ej: virus Ébola.

En relación a esta clasificación, aparecen los niveles de contención:

Los Niveles de Contención son cuatro y se designan en orden ascendente según el grado de
protección del personal, del ambiente y de la comunidad que proveen.
Nivel 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1, es decir, los
que no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los
antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o
centros docentes donde se emplean cepas no patógenas.
Nivel 2. Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora
habitual del hombre, son capaces de originar patología infecciosa humana de gravedad moderada
o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado y son los que con más frecuencia
se estudian en el Laboratorio de Microbiología Clínica.

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Nivel 3. Cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos que causan
patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y a veces producir la
muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de
aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la
correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad. En este grupo están: M.
tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Sólo pueden ser procesados por personal cualificado y
en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es decir, con aire
acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de
bioseguridad, etc.
Nivel 4. Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente
patógeno e infectocontagioso, exótico o no, que produce alta mortalidad y para el que no existe
tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta
contagiosidad. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación
infectados por microorganismos del grupo 4. En este grupo están los virus de la fiebre de Lassa,
virus Machupo, virus Ébola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de contención los
microorganismos del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4
(Mycobacterium multirresistente).
En general, la naturaleza infecciosa del material clínico es desconocida y al Laboratorio de
Microbiología suelen remitirse muestras muy diversas.
Excepto en casos excepcionales, el procesamiento inicial de las muestras clínicas y las pruebas
serológicas pueden realizarse de forma segura en un nivel 2, que es el recomendado para trabajar
con patógenos que se transmiten por vía sanguínea (virus de la hepatitis B, VIH, etc.), a lo que
habría que añadir las precauciones universales que deben ser tomadas con todas las muestras de
sangre y otros materiales potencialmente infecciosos.
4. Organización general de un laboratorio de Microbiología:
Los diferentes Decretos de Autorización de Laboratorios Clínicos de las Comunidades
Autónomas especifican que los laboratorios contarán al menos con las siguientes áreas
diferenciadas:
1. Áreas o departamentos generales:
-Áreas administrativas y despachos
El laboratorio de microbiología debe contar con estos espacios destinados a aspectos
administrativos incluyendo despachos para el personal facultativo, las razones para ello son, en
primer lugar, la cantidad de incidencias en la fase preanalítica debido al amplio espectro de
muestras que se procesan. En segundo lugar, por si se requiere información adicional del paciente
y de no tenerse el proceso analítico se vería interrumpido.
Se recomienda que éste área administrativa esté próxima al Lº, pero fuera de la zona de trabajo.
-Áreas de apoyo
Todo laboratorio debe contar con dependencias para el descanso del personal, servicios
sanitarios y vestuario.
-Áreas de extracción y toma de muestras
La mayoría de los laboratorios de microbiología clínica están alojados en hospitales y es
habitual que estén próximos a otros laboratorios clínicos, por ello, no es de extrañar que se
compartan recursos en la obtención de muestras sobre todo en lo que se refiere a personal y
espacio para las extracciones sanguíneas.
Es importante que este espacio esté bien iluminado y ventilado, dentro se coloca una camilla,
encimera con armarios y guardar en ellos el material básico, también una mesa con dos sillas por
si fuese conveniente entrevistar al paciente antes de la toma de muestra. Por último, debe haber
un pequeño lavamanos.

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-Áreas de recepción y siembras
Todo laboratorio de microbiología clínica debe disponer de un espacio específico para la
recepción de las muestras, con independencia del tamaño y de su integración en un espacio
común de laboratorios (usual en laboratorios de hospitales pequeños).
Algunas instituciones poseen un área centralizada para la recepción, que se puede compartir para
realizar algunas de las tomas de muestras de microbiología (por ejemplo, extracciones para
serología) pero que, no obstante, resulta ineficiente para todos los tipos de muestra, de ahí la
necesidad de disponer también de un área específica. Muchos laboratorios de microbiología
tienen centralizada el área de siembra y el preprocesamiento de las muestras, algo que,
conceptualmente, está ligado al proceso de recepción. Por esto, desde el punto de vista
arquitectónico, ambas funciones están integradas en una sola área o en áreas contiguas.

2. Áreas específicas
-Laboratorio de bacteriología general
La mayoría de las bacterias que se aíslan en un laboratorio de
microbiología clínico son agentes biológicos de grupo II, aunque
algunos están dentro del grupo III y todos pueden crecer en medios de
cultivo habituales. Este laboratorio debe estar separado del resto de
laboratorios y al ser la unidad de microbiología la que más muestras
procesa, suele estar próximo a las áreas generales.
El acceso debe estar restringido con señalización de riesgo biológico,
acceso restringido y medidas de protección obligatorias.
Las superficies interiores (suelos, paredes, techos, mesas y bancos) deben ser impermeables al
agua y resistentes a diferentes productos químicos.
Como mínimo debe haber un lavabo con grifos que se puedan accionar sin usar las manos,
también se recomienda que exista un lavador de ojos como equipo de emergencia.
El sistema de ventilación debe proporcionar una entrada de aire sin recirculación a áreas externas
del laboratorio.
Debe contar este laboratorio obligatoriamente con una cabina de seguridad biológica de clase I, II
o III. Un almacenamiento de seguridad para agentes biológicos y al menos un autoclave. Depende
de la carga de trabajo y tamaño, el laboratorio de bacteriología puede estar dividido en pequeños
laboratorios modulares que permite separar el trabajo de las diferentes muestras (exudados,
hemocultivos, urocultivos, coprocultivos).
-Laboratorio de micobacterias
La especie de micobacteria aislada más frecuentemente en bacteriología clínica es
Mycobacterium tuberculosis: es un agente biológico de grupo III por lo que los niveles de
contención de ese laboratorio serán tipo III. No se debe olvidar que las cepas extremadamente
resistentes de esta especie deben ser consideradas de grupo IV, por lo que ante la sospecha de
este tipo de cepas se debe elevar el nivel de contaminación a IV o bien derivar la muestra a un
laboratorio de referencia externo.
Como norma general trabajan en este tipo de laboratorios solo el personal especializado y
adiestrado en las técnicas que se utilizan para sembrar micobacterias, este personal deberá
someterse periódicamente a pruebas de detección de micobacterias en su organismo.
Este laboratorio debe estar separado físicamente del resto de laboratorios, la puerta
principal debe estar siempre cerrada y en el acceso debe estar colocada la señalización de riesgo
biológico, acceso restringido y personal autorizado.
Todo el aire que salga del laboratorio de microbiología debe pasar por normativa por filtros HEPA.
Este laboratorio debe contar con un lavabo cerca de la puerta de salida, entre el equipamiento
básico debe aparecer una cabina de seguridad clase II y unas centrífugas de seguridad biológicas,
el personal debe trabajar con el equipamiento habitual de guantes, batas y mascarillas.

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-Laboratorio de parasitología
La mayoría de parásitos que se diagnostican habitualmente en nuestro país están producidos por
agentes biológicos del grupo II, por tanto, no es necesario disponer de cabina de seguridad
biológica, pero si de una campana de extracción de gases para algunas técnicas de concentración
de parásitos en heces.
-Laboratorio de micología
La mayoría de los hongos que se aíslan en los laboratorios de nuestro país pertenecen al grupo II,
sin embargo, debido al aumento de viajes turísticos a zonas endémicas y al aumento de la
inmigración ha aumentado el aislamiento de los llamados hongos emergentes importados, algunos
de ellos pertenecen al grupo III y por tanto, las instalaciones deben estar dotadas con medidas de
seguridad suficientes.
-Laboratorios de virología
Hasta el año pasado en España la mayoría de los virus que se aislaban en los laboratorios eran
agentes biológicos de grupo II, muy rara vez del grupo III y hasta el momento actual no se ha
aislado ninguno del grupo IV. A raíz del Coronavirus esto ha cambiado. El Coronavirus está
incluido en el grupo II, pero se ha modificado la clasificación de manera que los Coronavirus del
síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV), Coronavirus del síndrome respiratorio agudo
grave 2 (SARS-CoV-2) y Coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) se
ubican en el grupo biológico III. Con lo que estos laboratorios deberán adoptar el nivel de
seguridad oportuno.
-Laboratorio de serología
La mayoría de ensayos o pruebas serológicas se realizan con muestras en las que potencialmente
existen agentes biológicos de los grupos II y III, por tanto, se debe disponer de los niveles de
protección adecuados y de un método válido de descontaminación y eliminación de los residuos
específicos de este laboratorio.
- Laboratorio de Microbiología Molecular
Se realizan, fundamentalmente, técnicas de amplificación, detección y secuenciación de ácidos
nucleicos de agentes biológicos clasificados en los grupos 2 y 3. En los laboratorios de referencia
existe la posibilidad de detección, mediante métodos moleculares, de agentes del grupo 4. En
general, se recomienda que el diseño del laboratorio de microbiología molecular para el
diagnóstico clínico cumpla con las medidas de protección mínimas correspondientes a un nivel de
contención 3. Las medidas de contención 4 son necesarias exclusivamente en los centros de
referencia e investigación donde se manipulan agentes biológicos del grupo 4. En el diseño del
laboratorio de microbiología molecular no sólo se ha de tener en cuenta la protección del operador
frente a los agentes biológicos, otro aspecto fundamental que debe cuidarse también es la
protección de la muestra frente a contaminantes (ácidos nucleicos) exógenos, que afectaría de
forma negativa el desarrollo de las técnicas moleculares.
Para algunos procedimientos (área de preparación de muestras y extracción de ácidos nucleicos,
área de amplificación) se debe disponer de cabinas de seguridad de clase II, siendo aconsejable
la utilización de cabinas de clase III para el estudio de agentes biológicos de los grupos 3 y 4.
3. Área de limpieza de material, esterilización y preparación de medios de cultivo:
En los laboratorios, se utiliza cada vez más material desechable de un solo uso y medios
de cultivo y reactivos comerciales preparados. El área de limpieza y esterilización de cada
laboratorio debe adaptarse, por tanto, a su protocolo de trabajo, que debe estar de acuerdo
además en lo que supone la esterilización de residuos, con el Plan de Gestión de Residuos del
Hospital y con la legislación vigente. Deben cumplir con el nivel de contención del laboratorio al
que pertenezca, como mínimo de 2.
En la actualidad, son muy pocos los laboratorios de microbiología que preparan medios de
cultivo de forma rutinaria, pero sí son más los que puntualmente pueden verse en la necesidad de
su preparación (falta de suministro, medios de uso esporádico y fácil preparación, etc.).

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4. Áreas de almacenamiento
Para garantizar la funcionalidad de todo el laboratorio de microbiología es necesario
disponer de áreas de almacenamiento que le permitan desarrollar con normalidad el trabajo diario.
No se trata de un área de trabajo, pero de forma obligatoria debe existir este espacio en el
laboratorio.
Se utiliza para almacenar medios de cultivo y reactivos, en general suele bastar con un espacio a
temperatura ambiente y sistemas de refrigeración de cámara fría (2-8 ºC).

Medios de cultivo y productos químicos

Por regla general se utilizan medios de cultivo ya preparados por casas comerciales, que
deben conservarse en cámaras de refrigeración a temperaturas entre 2-8 ºC.
Son también muy utilizados los medios deshidratados, los ingredientes de estos medios de cultivo
se disuelven por agitación y calentando ligeramente en agua destilada.
Como regla general y si no se establecen condiciones particulares, los medios deshidratados
deben almacenarse en lugar fresco, seco y sin que incidan la luz del sol directamente sobre ellos.

En cuanto a los reactivos y productos químicos deben estar correctamente etiquetados según
la normativa vigente, y para su almacenamiento se deben seguir unas recomendaciones:
- Reducir el stock al mínimo.
- Almacenamiento prolongado implica riesgo, ya que los productos pueden sufrir
transformaciones, por ejemplo, los recipientes que los contienen pueden ser atacados por los
productos que contienen.
- Es necesario establecer separaciones de sustancias incompatibles, es decir, tener en cuenta
el etiquetado y las características de peligrosidad y aislar los de características especiales.
- Se consideran productos y reactivos de características especiales las tóxicas, cancerígenas,
inflamable, explosivos...
- Cuando por sus características deben ser guardadas en frigoríficos o congeladores estos
deben ser antideflagrante (elimina o reduce el peligro de explosión). Es la puerta de estos
aparatos deben indicarse ``almacén de productos especiales´´ y no guardar alimentos ni
bebidas.
- En general las estanterías de almacenaje de estos productos deben ser metálicos. Los
envases más pesados se colocarán en las estanterías más bajas así como los ácidos y
bases. No se instalarán más de tres armarios en la misma habitación, a no ser que cada
armario estén separados a 3m entre sí.

5. Gestión de eliminación de residuos

En el laboratorio de microbiología se originan todo tipo de residuos. En cada área de
trabajo deben existir contenedores adecuados y diferenciados para la clasificación y segregación
de los diferentes grupos, con especial atención a los residuos de riesgo o específicos (grupo III y
IV). El personal del laboratorio debe saber, que los elementos básicos en el manejo racional de
éstos, son la minimización, la segregación y la eliminación controlada.
La esterilización por autoclave ha sido la forma más común de tratar los residuos infecciosos
generados en el laboratorio.
Pero en la actualidad es habitual transferir los residuos a empresas autorizadas. En este caso el
tiempo de almacenamiento de los residuos en el laboratorio (almacenamiento intermedio), una vez
llenos y cerrados los contenedores, no debe ser de más de 24 horas. Para que el almacenamiento
intermedio de los residuos del grupo III y IV sea lo más seguro debe existir en el laboratorio una
zona acotada y específica para este fin.
Determinados residuos químicos (como los colorantes) no se deben eliminar a la red, sino que
deben ser eliminados en unos contenedores especiales que se entregan o son recogidos por la
empresa gestora de residuos.

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6. Material de laboratorio utilizado en Microbiología
Matraz de Erlenmeyer:
El matraz o frasco de Erlenmeyer es un frasco transparente de
forma cónica con una abertura en el extremo más estrecha, generalmente
prolongado con un cuello cilíndrico. Por su forma es útil para realizar
mezclas por agitación y para la evaporación controlada de líquidos;
Además, su abertura estrecha permite la utilización de tapones, lo
que es útil en microbiología para almacenar medio de cultivo y esterilizarlo
en autoclave.
El matraz Erlenmeyer no se suele utilizar para la medición de líquidos ya
que sus medidas son imprecisas.

Probeta
La probeta es un instrumento volumétrico, que permite medir
volúmenes superiores y más rápidamente que las pipetas, aunque con
menor precisión. Está formado por un tubo generalmente transparente
de unos centímetros de diámetro, y tiene una graduación, desde 0 ml
hasta el máximo de la probeta indicando distintos volúmenes. En la
parte inferior está cerrado y posee una base que sirve de apoyo,
mientras que la superior está abierta (permite introducir el líquido a
medir) y suele tener un pico (permite verter el líquido medido).

Vaso de precipitados
Un vaso de precipitados es un simple contenedor de líquidos,
usado muy comúnmente en el laboratorio. Son cilíndricos con un
fondo plano; se los encuentra de varias capacidades, desde 1 ml.
hasta de varios litros. Normalmente son de vidrio (Pyrex en su
mayoría) o de plástico. Suelen estar graduados, pero esta
graduación es inexacta por la misma naturaleza del artefacto. Es
recomendable no utilizarlo para medir volúmenes de sustancias, ya
que es un material que se somete a cambios bruscos de
temperatura, lo que lo descalibra y en consecuencia nos entrega una
medida errónea de la sustancia. Debido a que su graduación es
inexacta, es comúnmente usado para transportar líquidos hacia otro
recipiente como a una probeta o a un tubo de ensayo por un
embudo. Son resistentes a los cambios bruscos de temperatura.
Tiene múltiples usos en el laboratorio de microbiología: calentar medios de cultivo, preparar
colorantes, disolver, etc.

Pipeta
La pipeta es un instrumento volumétrico de laboratorio que
permite medir alícuotas de líquido con bastante precisión. Suelen
ser de vidrio, aunque también de plástico. Está formado por un tubo
hueco transparente que termina en una de sus puntas de forma
cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas)
indicando distintos volúmenes.

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Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta
Se utilizan para pipetear pequeñas cantidades de líquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamaño y color según la micropipeta. Existen varios
tamaños: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de 20-200 µm y de 200-1000 µm….

Tubos de ensayo
Consiste en un pequeño tubo de vidrio con un extremo abierto
(que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se
utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas.
En microbiología los utilizaremos para preparar inóculos, realizar
algunas pruebas bioquímicas, contener medios de cultivo sólidos,
líquidos y semisólidos…

Placas petri
La placa de Petri es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la
misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima
y cerrar el recipiente. Se utiliza en los laboratorios principalmente para el cultivo de bacterias y
otros microorganismos, cubriendo el fondo con distintos
medios de cultivo (por ejemplo agar) según el
microorganismo que se quiera cultivar. Si se quieren observar
colonias, durante el tiempo de incubación del microorganismo
sembrado en la placa esta se mantiene boca abajo, es decir,
apoyada sobre la tapa. De este modo, el agar queda en la
parte superior y al condensarse el vapor de agua que
generan los microorganismos por su metabolismo, cae sobre
la tapa, evitando que los microorganismos se diluyan,
manteniéndose fijos al sustrato y formando colonias.

Balanza digital
Las balanzas digitales son instrumentos de pesada que
utilizan la acción de la gravedad para la determinación de la
masa. Se compone de un único receptor de carga (plato) donde
se deposita el objeto para pesar. La balanza digital resulta un
equipo imprescindible en laboratorios de microbiología, utilizadas
para pesar medios de cultivo y otros reactivos.

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Mechero Bunsen
Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15 cm de la
llama del mechero (zona aséptica).
En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de
la llama.
Antes de comenzar a trabajar se
procurará disponer de todo el
material necesario para el
procesamiento de la muestra
Tomar las medidas necesarias para
evitar la contaminación de las
muestras o/ y cultivo por
microorganismos ambientales.
Gradillas

Baño María
El baño María es un método empleado en las
industrias y en el laboratorio de microbiología, para
conferir temperatura uniforme a una sustancia
líquida o sólida o para calentarla lentamente,
sumergiendo el recipiente que la contiene en otro
mayor con agua que se lleva a o está en ebullición.
En Microbiología lo utilizamos para refundir medios
de cultivo, atemperar muestras y calentar diferentes
preparaciones.
Incubadora o estufa de incubación
La Incubadora es un equipo con funciones específicas
que permite controlar, según su diseño, temperatura y humedad
para crear un ambiente adecuado apto para la reproducción y
desarrollo de organismos vivos. Algunas de las aplicaciones
más comunes son los cultivos microbiológicos, micológicos y
virales, entre otros.

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Frigorífico o cámaras refrigeradas
Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como
microorganismos. Generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.
Congeladores
Se utilizan para la conservación de reactivos y
microorganismos a temperaturas inferiores a 0ºC, llegando a -80ºC
(los más frecuentes son -20º, -40º y -80º).

Centrífuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo
que permite la separación de los distintos componentes de la
muestra mediante la precipitación en el fondo del tubo de las
partículas en suspensión.

Portaobjetos
Las láminas portaobjetos son láminas de vidrio de cerca de 1 mm. de espesor sobre las
cuales los objetos pueden ser observados microscópicamente bajo una cubierta de vidrio. Es un
material imprescindible en microbiología, puesto que en ellos se realizan las tinciones gram, de
esporas, de cápsulas, flagelos…
Portaobjetos excavados
Para aplicaciones diagnósticas en las que se requiere
visualizar células o partículas en suspensión.

Hilo y asa de siembra

Sirven para realizar las diferentes técnicas de siembra e inoculación en los diferentes
medios de cultivo. Recordar que siempre deben ser flameadas antes y después de su uso.
(excepto si son de plástico, en cuyo caso son de un solo uso y desechables).

Asa Digrasky
Por su peculiar forma es muy útil para extender determinadas
muestras sobre la superficie de un medio de cultivo en placa.

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Autoclave
Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de
laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura, evitando con las altas presiones
que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del autoclave es que
coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y
temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de
algunas formas acelulares, tal como los priones, que pueden
soportar las temperaturas de autoclave. Los autoclaves funcionan
permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero
restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103
kPa (1 atm), lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura
de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta
temperatura y presión es de 15-20 minutos. Ciertos materiales no
pueden ser esterilizados en autoclave, como el papel y muchos
plásticos (a excepción del polipropileno).

Campana Durham
Son pequeños tubos de vidrio que se introducen boca abajo en el
interior de tubos de ensayo. Sirven para detectar la producción de gas,
producto de diferentes procesos metabólicos: fermentaciones,
reducciones…

Jarras de anaerobios
Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de
oxígeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.

Contador de colonias
Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y una lupa, nos
permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento.

Balanzas

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Cucharas y espátulas
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.
Frascos de toma de muestras

Vórtex
Agitador de viales.
Cabinas de seguridad biológica (CSB)
Son cámaras de circulación forzada que, según sus
especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de
protección. Imprescindibles en un Laboratorio de Microbiología
Clínica.
Es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases,
las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biológica.
La campana extractora de gases es un recinto ventilado que
captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los
productos químicos. Es un equipo muy útil en la contención del
riesgo químico, NO ofrece protección frente a riesgos biológicos.
Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a
través de un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo. Estas
cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, nunca al operador
(no son recomendables en un Laboratorio de Microbiología Clínica).
Las cabinas de Seguridad Biológica son recintos ventilados diseñados para limitar a máximo el
riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos (aerosoles, etc.). Estos equipos
proporcionan una zona de trabajo que minimiza la probabilidad que una partícula transportada por
el aire pueda escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar al operario y a la zona que le
rodea. Además, algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula.
Una cabina nunca es un sustituto de una técnica microbiológica adecuada.
Clasificación: según el nivel y tipo de protección las hay de clase I, II y III.

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 Elección del equipo

Microscopía
La mayoría de agentes infecciosos no son observables a simple vista, por lo que se realizan
tinciones y se utilizan métodos de microscopía específicos haciendo el análisis más rápido y
eficaz. La caracterización microscópica es parte del protocolo de identificación del
microorganismo. Los microscopios recomendados para la observación de microorganismos son el
óptico de campo claro (el más utilizado) y el de fluorescencia.

Microscopio óptico
• Utiliza luz visible que atraviesa la muestra y diferentes
lentes de aumento
• El aumento depende de estas lentes:
• Objetivo→ hasta 100X
• Ocular→ 10X
• Permite visualizar: parásitos, hongos y bacterias pero no
virus (100.000X sin fluorescencia)
• No se diferencian estructuras subcelulares
• Se mejora con aceite de inmersión
• El contraste se consigue mediante los colorantes
• Para células vivas → NO TINCIÓN

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7.- Control de crecimiento bacteriano
1. Terminología relacionada con el control de crecimiento bacteriano
El control bacteriano es necesario para prevenir la transmisión de infección, contaminación y
putrefacción, pero, como veremos más adelante no siempre es necesario matar a los microbios,
algunas situaciones requieren que simplemente se inhiba su crecimiento o que metabólicamente
no se reproduzcan.
Antes de desarrollar los métodos físicos y químicos que se usan para controlar el crecimiento
microbiano, vamos a definir los términos más importantes relacionados con este control.
-Esterilización: Se define como la destrucción total de las formas de vida que hay en un objeto o
material incluidas esporas.
Por esporas se entiende las formas de resistencia de las células vegetativas, en su interior no
hay actividad metabólica, permanece en estado inerte y cuando tienen lugar condiciones
ambientales favorables la espora da lugar a la célula vegetativa que ya es activa
metabólicamente.
Las temperaturas requeridas para la esterilización son empleando calor húmedo: 121ºC/15´ y
empleando calor seco 170ºC/+2h.
-Desinfección: Es el proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los patógenos,
pero no necesariamente se destruyen esporas o virus.
Normalmente la desinfección se consigue aplicando un compuesto químico denominado
desinfectante, que se aplica sobre el objeto o material.
Los desinfectantes suelen inhibir o reducir el crecimiento bacteriano, pero no esteriliza.
Este término se suele utilizar cuando hablamos del uso de soluciones químicos sobre superficies
o la eliminación de patógenos del agua.
-Antisepsia: Es la desinfección química de la piel, mucosas u otros tejidos. Es un término que se
aplica específicamente al tratamiento de heridas. Agua y jabón, no agua oxigenada.
-Germicida: Es un agente químico que mata rápidamente los microorganismos pero no
necesariamente las esporas. En concreto se habla de bactericidas si mata bacterias, fungicida si
mata hongos y viricidas si mata los virus. No asegura la esterilización porque no destruye las
formas de resistencia, sí las formas vegetativas.
-Bacteriostasis: Es la situación que inhibe el crecimiento y multiplicación bacteriana pero sin
llegar a matar a las bacterias, de tal modo que si se elimina el agente bacteriostático se reanuda el
crecimiento de las bacterias. Lo que hace es ralentizar el metabolismo.
-Desgerminación: Es la eliminación pasajera de organismos de la piel mediante limpieza
mecánica o empleo de antisépticos. Como cuando te duchas.
-Higienización: Se trata de la reducción del número de patógenos que hay en un objeto hasta
niveles aceptables para la salud pública mediante lavado mecánico o utilizando agentes químicos.

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2. Métodos físicos empleados para el control del crecimiento bacteriano
Los métodos físicos son aquellos que aplicando la acción de determinados fenómenos físicos
influyen en el desarrollo de los microorganismos o bien modifican su actividad fisiológica, en
general son técnicas esterilizantes o bacteriostáticas.

Existen métodos físicos para controlar el crecimiento de las bacterias:

A. CALOR: Es el método más aplicado para destruir los microorganismos. Es el agente de
esterilización más eficaz, económico y fácil de controlar. El calor mata a los microorganismos
al desnaturalizar sus enzimas, pero siempre hay que tener en cuenta el diferente grado de
resistencia que las bacterias presentan al calor, estas diferencias pueden expresarse a través
de una serie de conceptos:
• Número de microorganismos → A mayor número de microorganismos, mayor intensidad de
tratamiento.
• Naturaleza de los microorganismos → Las formas vegetativas son más sensibles que las
formas de resistencia o esporas.
• Rango de temperatura → A mayor temperatura mayor rapidez y eficacia.
• Tiempo de actuación → Es el resultado de sumar tres tiempos. Tiempo de penetración, es
el tiempo necesario para alcanzar la temperatura de esterilización. Tiempo de calefacción, es el
tiempo requerido para que la temperatura programada destruya los microorganismos. El tiempo de
seguridad es aquel que hay que dejar pasar antes de desechar el material.
• Tiempo de muerte térmica (TMT) → tiempo más corto necesario para destruir los
microorganismos de una suspensión, a una temperatura y unas condiciones definidas.
• Punto de muerte térmica (PMT) → Es la temperatura más baja requerida para matar a
todos los microorganismos de una suspensión líquida en 10 minutos. En el autoclave 70-75ºC.
• Tiempo de reducción decimal (TRD) → determina el grado de resistencia al calor de las
bacterias, es decir, el tiempo expresado en minutos en el que se destruyen el 90% de la población
de las bacterias a una determinada temperatura.

Existen dos tipos de calor: calor seco y calor húmedo.

Las técnicas que aplican el CALOR SECO son las siguientes:

- Flameado: Consiste en someter directamente a la llama de un mechero de gas el material que
se vaya a esterilizar. El flameado debe realizarse siempre antes y después de usar el material.
Con objetos metálicos se someten a la llama hasta que adquieran un color rojo intenso. Es un
método de esterilización que acaba con la bacteria y las esporas.
- Incineración: Consiste en quemar el material ignífugo en hornos crematorios.

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 - Calor seco por aire caliente: En los grandes hospitales se instalan estufas especiales donde los
objetos para esterilizar pasan sobre una cinta transportadora a través de una zona de aire a
180-190ºC o debajo de radiadores infrarrojos que alcanzan temperaturas máximas de 280ºC.
Para material de vidrio y porcelana se utiliza el horno Poupinel, consiste en carbonizar la
materia orgánica a elevadas temperaturas y tiempo prolongado.

Las técnicas que utiliza el CALOR HÚMEDO son las siguientes:

- Ebullición: Consiste en hervir el material en agua a una temperatura de 100ºC. Se eliminan
las formas vegetativas de bacterias patógenas, virus, hongos y en algunos casos sus esporas
prolongando el tiempo unos minutos. En el laboratorio utilizamos el baño maría y se repite
varias veces el proceso. Hay que tener en cuenta que algunos virus y esporas necesitan
temperaturas de ebullición durante más de 20 horas para ser destruidos.
- Tindalización: Consiste en someter durante tres días el material que queremos esterilizar a
temperaturas discontinuas de entre 55 - 95ºC durante 30 minutos. Su objetivo es eliminar
células vegetativas y sus esporas en un periodo de tres días. A temperatura de reposo la
espora germina y entre 55-95ºC matamos la célula. Se utiliza en la industria.
- Vapor saturado a presión: Se trata del autoclave. El vapor de agua difunde a través del
material, si hay presencia bacteriana este vapor de agua consigue que se coagule el
protoplasma de cualquier forma de vida. El programa general del autoclave es 121ºC/15´
aplicando una presión de una atmósfera. Se utiliza para esterilizar medios de cultivo,
instrumentos, soluciones, jeringas, equipos de transfusión e incluso ropa, siempre y cuando
soporten esas temperaturas.
- Vapor fluente: Se emplea también el autoclave, la diferencia con el proceso anterior es que
la llave de purga queda abierta, liberando el vapor de agua y vaciando la presión. Se utiliza
para medios de cultivo que tienen que esterilizarse a una temperatura máxima de 100ºC, no
llegamos a 121ºC.
- Pasteurización: Tratamiento clásico al que se somete la leche. Consiste en someterla a
62,8ºC/30´, matando las formas vegetativas pero no las esporas. Actualmente las grandes
industrias alimentarias modifican esta temperatura y la elevan a 72ºC/15seg. Esto se llama
pasteurización rápida a elevada temperatura. La leche también se puede esterilizar mediante
el proceso UHT ``ultra high temperature´´ pudiendo ser conservada sin refrigeración.

B. FILTRACIÓN: Paso de líquido o gas a través un material filtrante con poros lo suficientemente
pequeños para retener microorganismos. En el frasco receptor se crea un vacío que ayuda a la
gravedad aspirando el líquido a través de un filtro. Se usa para algún cultivo, enzima, vacunas y
algún antibiótico, todos ellos sensibles al calor. En los últimos años los filtros de membranas más
utilizados en la industria y laboratorios ésteres de celulosa o polímeros de plástico.

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 C. RADIACIÓN: Dependiendo de la intensidad, longitud de onda y su duración, las radiaciones
tienen efectos desiguales sobre las células. Hay dos tipos de radiaciones esterilizantes:
- Ionizantes: Rayos gamma y los haces de electrones de elevada energía. Tiene una longitud
de onda más corta que las no ionizantes, y por ello transportan más energía. Los rayos
gamma provienen del cobalto radiactivo y los haces de electrones, provienen de electrones
acelerados hasta alta energía en máquinas especiales. En su conjunto, el principal efecto de
estas radiaciones es la ionización del agua, que forma radicales hidroxilo (OH) altamente
radiactivo.
- No ionizantes: Mayor longitud de onda, transportan menos energía. Las más importantes
son las radiaciones UV que lesionan el ADN de las células, formando enlaces entre timidinas
adyacentes en las cadenas de ADN. La longitud de onda para matar los microorganismos
está en torno a 260nm. Estas longitudes son absorbidas de forma específica por el ADN
celular. La utilización principal de este tipo de radiaciones es para controlar los
microorganismos del aire (habitaciones de hospitales, quirófanos). La desventaja de la luz
UV es la baja penetración, de modo que para eliminar los microorganismos deben estar
expuestos directamente a la radiación.
D. BAJAS TEMPERATURAS: El efecto sobre los microorganismos depende de la especie en
particular y la intensidad de aplicación, 2-7ºC temperatura normal de refrigeración. Ralentiza
la actividad metabólica de los microorganismos, de tal manera que no se reproducen ni
sintetizan productos (acción bacteriostática).
E. DESECACIÓN: Los microorganismos necesitan agua para crecer y reproducirse. La
desecación o ausencia de agua hace que los microorganismos dejen de crecer, pero pueden
mantenerse viables durante muchos años. Cuando vuelven a disponer de agua recuperan la
capacidad crecimiento y división. La resistencia a la desecación depende de la especie de
microorganismo.
F. PRESIÓN OSMÓTICA: Usar altas concentraciones de sales y/o azúcares para conservas los
alimentos. Basada en los efectos de la presión osmótica en células. Con estas
concentraciones de sal o azúcar se crea un ambiente hipertónico que hace que el agua salga
de la célula bacteriana. A medida que el agua sale de la célula, la membrana plasmática se
encoje y separa de las paredes celulares (plasmólisis), la célula detiene su crecimiento, pero
no muere inmediatamente.

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3. Métodos químicos para controlar el crecimiento bacteriano
Se basan en la acción de algunos productos químicos sobre los microorganismos.
Desafortunadamente son pocos los agentes químicos que aseguran la esterilidad, la mayoría sólo
desinfectan.
Las características generales de estos productos químicos son:
• Deben tener un poder germicida lo más elevado posible, y un amplio espectro de acción, a
ser posible a baja concentración.
• No tóxicos para personas ni animales, y a poder ser, tampoco para las plantas.
• Alto poder de penetración y ser soluble en agua.
• Económicos y fáciles de adquirir.
• Estables en composición y difusión.
Principales agentes químicos:
La mayoría son desinfectantes y/o antisépticos, pocos esterilizantes.
• Fenol y derivados fenólicos: El fenol ya no se utiliza como antiséptico y rara vez como
desinfectante, puesto que irrita la piel y tiene un olor desagradable. A bajas concentraciones se
utiliza en comprimidos para el dolor de garganta debido a su efecto como anestésico local, pero
no tiene ninguna acción antimicrobiana. Los derivados del fenol contienen una molécula de fenol
en su estructura que ha sido alterada químicamente para reducir su capacidad irritante o aumentar
su actividad antibacteriana en acción con un jabón o detergente. La acción de estos derivados
fenólicos es sobre la membrana plasmática inactivando enzimas o desnaturalizando proteínas. Se
utilizan como desinfectantes porque mantienen su actividad en presencia de compuestos
orgánicos, son estables y perduran largos periodos de tiempo donde su aplicación. Las más
utilizadas son cresoles y el hexaclorofeno.
• Clorhexidina: Se utiliza para la desinfección de la piel y mucosas, combinado con un
detergente o alcohol para el lavado de manos de los cirujanos y como preparación preoperatoria
del paciente. La piel no lo absorbe y no se a registrado toxicidad. Lesiona la membrana plasmática
de las bacterias pero no ejerce ningún efecto sobre las esporas.
• Halógenos: En particular el Yodo ( I ) y el Cloro (Cl) son los halógenos más eficaces como
antimicrobianos, tanto solos como en combinación con compuestos orgánicos e inorgánicos. El
Yodo es uno de los antisépticos más antiguos y eficaz, es efectivo contra muchas bacterias y sus
esporas, la mayoría de los hongos y algunos virus. Se utiliza en forma de tintura (sustancia
mezclada con alcohol). El cloro en forma de gas o en combinación con otras sustancias químicas
es también un desinfectante muy utilizado. Se utiliza sobre todo para desinfección de aguas cuya
acción germicida se debe al ácido hipocloroso que se forma al añadirlo al agua. Es un fuerte
agente oxidante que impide el correcto funcionamiento de las enzimas, un grupo destacado
derivado del cloro son las cloraminas, se componen de cloro y amoniaco, se usan como
desinfectantes, antisépticos e higienizantes, y liberan cloro durante largos periodos de tiempo.

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• Metales pesados y sus componentes: La plata, el mercurio y el cobre son germicidas y
pueden ser utilizados como antisépticos. La capacidad de los metales pesados de mostrar
actividad antimicrobiana a bajas concentraciones se conoce como acción oligodinámica, este
efecto se produce por la acción de los iones metálicos pesados sobre los microorganismos
La plata se utiliza como antiséptico en soluciones al 1% de nitrato de plata. Los compuestos
inorgánicos de mercurio como el cloruro mercúrico son los desinfectantes de uso más antiguo, el
uso actual está restringido debido a su toxicidad. Los compuestos orgánicos del mercurio como el
mercurocromo y mertiolato son menos irritantes y menos tóxicos se utilizan sobre la piel y
mucosas como antisépticos, su principal inconveniente es que su acción desaparece cuando se
realiza un lavado sobre la zona. El cobre en forma de sulfato cúprico se utiliza para destruir las
algas verdes que crecen en depósitos, piscinas, peceras... es decir, se utiliza como alguicida.
• Alcoholes: Destruyen eficazmente bacterias y hongos, pero no esporas ni virus desnudos.
Su acción está basada en la desnaturalización de las proteínas pero también puede alterar
membranas disolviendo los lípidos que le componen, tiene la ventaja de evaporarse con rapidez y
no dejar residuos, antes de poner una inyección se suele aplicar un algodón empapado en etanol
y simplemente se realiza un barrido de microorganismos de la zona sin embargo no son
adecuados para limpiar heridas, ya que producen la coagulación de una capa de proteínas sobre
la piel, bajo la cual puede haber crecimiento bacteriano. El alcohol más utilizado es el etanol al
70% (en solución). El isopropanol es otro alcohol muy utilizado como antiséptico y desinfectante.
El metanol no es de uso tópico.
• Agentes tensioactivos: Son agentes tensioactivos los detergentes y jabones en general,
disminuyen la tensión superficial entre moléculas de un líquido. Los jabones se utilizan para
eliminar de forma mecánica los microorganismos de la piel mediante frotamiento, más que acción
desinfectante tiene una acción de higienización: jabón de manos…
• Compuestos de amonio cuaternario: Se consideran agentes tensioactivos, en concreto
detergentes catiónicos, es decir, su capacidad limpiadora se debe a la parte de la molécula
cargada positivamente denominada catión derivan del ión amonio tetravalente → NH4+. Son
fuertemente bactericidas contra las gram + y algo menos fuerte a las bacterias gram -, sin
embargo, no destruyen esporas ni al bacilo de la tuberculosis. Un compuesto de amonio muy
utilizado es el cloruro de benzalconio, es inoloro, incoloro, insípido, muy estable, soluble y no
tóxico. Se utiliza para limpiar superficies.
• Ácidos orgánicos y sus derivados: La mayoría se utilizan como conservantes para controlar
el crecimiento de los hongos, por ejemplo, el ácido sórbico se utiliza en los quesos para inhibir el
crecimiento de los hongos, de la misma forma el ácido benzoico se utiliza en bebidas refrescantes.
La actividad de estos ácidos orgánicos no está relacionada con su acidez, sino con su capacidad
de inhibir la actividad enzimática.

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• Aldehídos: Este grupo se encuentra entre los antimicrobianos más eficaces. Dos de los
más utilizados son el formaldehido y glutaraldehido. El formaldehido tiene un gran poder
desinfectante, aunque se usa más el formol, se utiliza frecuentemente para conservar muestras
biológicas, cadáveres e inactivar bacterias y virus para preparar vacunas. El glutaraldehido se
utiliza para esterilizar instrumentos clínicos y preparado en soluciones al 2% destruye bacterias, al
bacilo de la tuberculosis y muchos virus en sólo 10 minutos.
• Esterilizantes químicos gaseosos: Son sustancias químicas que se utilizan en cámara
hermética. El gas adecuado para esta técnica es el óxido de etileno, su función es desnaturalizar
proteínas consiguiendo eliminar bacterias y sus esporas (esterilizante). Se suele mezclar con
dióxido de carbono o nitrógeno porque sino es tóxico y explosivo. Todo material que se quiera
esterilizar con este gas debe estar expuesto a el de 4-18h, debido a su capacidad de esterilizar sin
necesidad de calor su uso se ha visto muy extendido.
Agentes oxidantes: Este grupo ejerce su actividad oxidando componentes celulares de las
bacterias. Los más utilizados son el ozono y el peróxido de hidrógeno (H2O2). El ozono es una
forma de oxígeno altamente activa que se genera por descargas eléctricas de alto voltaje, es un
potente esterilizador y se utiliza sobre todo para esterilizar agua. El peróxido de hidrógeno es un
antiséptico que se encuentra en la mayoría de los botiquines, no se debe utilizar sobre heridas
abiertas, porque se descompone rápidamente en agua y oxígeno gaseoso por acción de la enzima
catalasa, presente en las células humanas. El peróxido de hidrógeno se utiliza sobre todo para
desinfectar objetos inanimados que en cuyo caso es esporicida.

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