Lucía Alba Ordoñez

TEMA 7: VIRUS CON GENOMA ARNss +

Picornaviridae, Togaviridae, Coronaviridae y Flaviviridae

¿CÓMO LLAMAMOS A LAS RNA

POLIMERASAS?

Replicasa: Enzima que copia el genoma

de RNA para producir más moléculas de
genoma.

Transcriptasa: Enzima que utiliza una

molécula de RNA (-) como molde para
producir ARNm.

Virus de RNA (+)→ El genoma es RNA (+),

se replica a RNA (-), que sirve de molde
para generar RNA (+). Este último
proceso puede ser transcripción o
replicación, ya que el mRNA y el genoma son RNA (+).

Virus de RNA (-)→ El genoma de RNA (-) se copia, pero la diferencia es que uno puede usarse de
mensajero, el que tiene caperuza y cola de poliA, en este caso sería transcripción, y el otro no
puede usarse, se usaría de genoma y sería replicación.

1. FAMILIA PICORNAVIRIDAE

Se denomina así porque es una familia de virus pequeño (pico) y con genoma de RNA. Virus de
esta familia:

- Poliovirus, de los primeros en manipularse en cultivos con líneas celulares in vitro.

- Virus de la fiebre aftosa, no infecta humanos, pero si algunos animales. Fue el primer
virus animal descubierto.
- Rinovirus, del resfriado. Cuidado, algunos resfriados son coronavirus.
- Virus de la hepatitis A

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Son fáciles de manipular, pues solo necesitan su genoma y los ribosomas celulares para generar
partículas virales. Son virus citoplasmático.

Permitieron descubrir la ARN polimerasa dependiente de ARN: Fue un experimento bioquímico,

en el que se incubaron células susceptibles de ser infectadas por el virus polio. Luego, se hacen
extractos de las células infectadas, con su control sin infectar. Se añaden nucleótidos, uno de
ellos radioactivo. En presencia de actinomicina (inhibe crecimiento de RNA pol celular) se
observa que se generaba RNA. Este RNA se generaba por síntesis consecuencia de la RNA pol
proveniente del virus de la polio. Al inhibir la transcripción, no se debería generar ARN. Sin
embargo, se detectó ARN radiactivo, cosa que no ocurre sin el virus. Por tanto, se concluye que
este codifica una ARN polimerasa que no depende de ADN.

También son los causantes de otros hallazgos, como la descripción del procesamiento
proteolítico en el poliovirus (que se secuenció por completo). Se observó que su ARN(+)
codifcaba un gran polipéptido precursor que se autoprocesa por actividad proteasa para generar
ahora sí las diferentes proteínas funcionales.

Se consiguió traducir in vitro el ARN de un virus aportándole los ribosomas celulares. Además,
el ADNc correspondiente a la retrotranscripción del genoma completo y su transfección en
células generaba partículas virales: primera síntesis de un virus animal infeccioso. También se
describió una estructura terciaria del ARN de estos virus que hace que los ribosomas puedan
traducir el mensajero.

Descripción del mecanismo del inicio de la traducción interna de un mRNA eucariótico (1988).
En ocasiones algunos mensajeros eucariotas pueden ser traducidos en ausencia de caperuza, se
reconoce una secuencia que contiene el virus. Se ha usado para hacer traducción in vitro para
cosas con interés en biotecnología.

1.1. Genoma de Picornavirus

Posee genoma ARNss +. El 90% de su genoma es codificante (con una sola ORF), el resto son dos
regiones no traducidas UTR en ambos extremos, que forman estructuras secundarias y son
esenciales en la replicación, traducción y transcripción. Tiene una proteína Vpg en el extremo 5’
(importante a la hora de la replicación) y una cola poliA en el 3’( estabiliza el mensajero mientras
se traduce) y no tiene caperuza.

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La 5'UTR (entre la Vpg y AUG) está constituida por

unas estructuras secundarias (hoja de trébol)
implicadas en la replicación y unas estructuras
secundarias implicadas en la traducción,
denominadas IRES (internal ribosome entry site).
IRES (Internal Ribosome Entry Site): implicado en
traducción. Estas estructuras 2º son la secuencia de
entrada del ribosoma independiente de caperuza.
Permite al ribosoma iniciar la traducción en ausencia
de caperuza.

El 3’UTR (desde el STOP hasta poliA) está constituido

por una estructura secundaria (pseudonudo)
implicado en la replicación. Tiene una estructura
secundaria pero no en forma de trébol, sino en
pseudonudo. Implicado en la síntesis de la cadena
negativa leyendo 3’ a 5.

La replicación va hacia la izquierda (leyendo de 3’ a 5’) y la traducción hacia la derecha (leyendo

de 5’ a 3’). La replicación y la traducción ocurren a la vez.

Se traduce una única poliproteína de gran tamaño no activa que tiene que autoprocesarse. Para
el autoprocesamiento de la poliproteína, hay dos proteasas, la 2A y la 3C. Tanto la traducción
como la replicación tienen lugar asociadas a vesículas membranosas en el citoplasma

1.2. Ciclo del poliovirus

En su ciclo viral encontramos las siguientes etapas: adsorción ,entrada y liberación del ARNss(+),
traducción de una única poliproteína, procesamiento proteolítico de la proteína, replicación del
ARNss(+), ensamblaje, encapsidación y salida.

Por tanto, el ARNss(+) se necesita en altas cantidades pues actúa como molde para mRNA, para
producir poliproteína, como molde para producir ARNss(-) y como genoma para la progenie. El
ARNss(-), aunque imprescindible, se requiere en menor cantidad ya que solo se usa como molde
para producir ARNss(+).

1. Adsorción y entrada de poliovirus. Liberación del RNA.

En la adsorción y entrada del poliovirus, una proteína de la cápsida

reconoce un receptor específco (CD155), presente en células del
sistema nervioso. Tras la interacción, un cambio conformacional en
la proteína vírica, se pierde la proteína VP4 y se expone un dominio
de VP1 hacia el interior de la célula eucariota, formándose un poro
hidrofóbico en la membrana celular que permite la entrada de RNA
(la cápsida no entra). Igualmente puede entrar la cápsida por
evaginación no endosomática (no se considera un endosoma
porque el pH no varía posteriormente), y luego introducir el ARN
desde esa vesícula al citoplasma.

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El receptor de la célula interacciona con una subunidad del poliovirus, el cual tiene 4 tipos de
proteínas en la cápsida. VP2 (proteína principal que forma la cápsida, está por fuera), VP1 Y VP4
están dentro. el receptor interacciona con VP2 hay un cambio conformacional en esta proteína
de forma que se pliega y permite que VP4 se suelte y VP1 hidrofóbica entra en contacto con la
membrana celular y se integra en esta, formando un canal hidrofóbico que permite que el RNA+
penetre en el citoplasma. En este proceso VP4 se pierde.

2. Inicio de la Traducción

(Los mensajeros eucariotas son

monocistrónicos y requieren de un
extremo 5’ con caperuza para iniciar
la traducción. Los mensajeros
procariotas no necesitan tener
caperuza y son policistrónicos, en un
único mensajero se codifican varias
pautas abiertas de lectura y la
traducción se empieza por las
secuencias shine dalgarno (SD). Se
generan varias proteínas con un
único mensajero.)

Para la traducción en una célula eucariota se necesita: un mensajero, cola polyA, UGA y que
suceda el ensamblaje de las subunidades implicadas en la traducción. El eID4G- reconoce la cap
y se ensamblan los factores de traducción con la subunidad pequeña del ribosoma. Luego se
localiza el UAG al cual el tRNA met es complementario y se inicia la síntesis.

Pero en el caso del poliovirus, no tienen caperuza como tal, tienen la proteína Vpg, por lo que
el procedimiento varía. Como no hay cap no se necesita ese factor eIF4G para iniciar la traducción
porque la subund pequeña del ribosoma y el RNAt reconoce el codón de inicio sin necesidad de
nada más. Esta estructura de IRES permite que la subunidad pequeña del ribosoma inicie la
traducción sin caperuza. Así no depende de la maquinaria de la célula, solo de los ribosomas.

La estructura secundaria del IRES actúa de caperuza permitiendo ensamblar todos los factores
de traducción.↳ Posteriormente, la actividad proteasa de la poliproteína naciente rompe uno de
los factores de traducción (eIF4G) de la célula provocando la inhieición de la traducción celular,
pero no del virus. De hecho, el poliovirus también inhiee la transcripción celular porque la
actividad proteasas actúa además sobre otros factores de transcripción. 3

Así tenemos que en el poliovirus, la traducción se inicia por el IRES. El ribosoma se transloca
desde dicha secuencia hasta el AUG iniciador y traduce la poliproteína en sentido 5’ -3’. Los dos
primeros aminoácidos son metionina y glicina. 23

El virus de la polio inhibe la traducción celular y estimula la traducción viral, ya que la proteasa
2A hidroliza el factor de traducción eIF4G.Además inhibe la transcripción celular, ya que la
proteasa 3C inactiva los FT celulares TFDIII y TFIIC.

3. Unión a la membrana y procesamiento de precursores P1, P2 y P3.

Una vez producida la 1º parte de la poliproteína, se produce la hidrólisis de la Met inicial (se
libera un OH) y miristilación de la 2ª Gly (se le une un ácido mirístico). El ácido graso(14C) se
inserta en la membrana.

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Cuando se genera la proteasa 2A, se corta la poliproteína resultando

en un P1 anclado a la membrana, y el resto del péptido naciente (P2
y P3) en el citoplasma. Posteriormente se genera la proteasa 3C, que
corta entre 2C y 3A liberando P2 y P3. El ribosoma encuentra el
codón de terminación y termina de traducir P3.

4. Procesamiento sucesivo

La proteasa 3C es la que luego hace la mayoría de procesos

proteolíticos. P1, P2 y P3 sufren procesamiento proteolítico por 3C
en el citoplasma.

En P1 se encuentran las proteínas estructurales de la cápsida. En P2

y P3 están las proteínas catalíticas (ARN polimerasa, ATPasa, Vpg…).

El procesamiento de las proteínas estructurales VP0 en VP4 y VP2 lo

cataliza el RNA viral durante el ensamblaje de la cápsida.

5. Replicación del genoma

Debe generarse por replicación más ARNss(+) que ARNss(-), ya que el primero tiene más
funciones, el segundo solo sirve para generar más ARNss(+).

1. Vpg (3B) poliuridilado actúa de cebador e hibrida

con una molécula del genoma de ssRNA (+). Vpg
(3B) cuando todavía forma parte del precursor
3AB es capaz de uridilizarse (se añaden UTP),
uniendo poli-U de forma covalente al extremo C
terminal de la proteína. Esta cola de poli-U es
complementaria a la cola de poli- A del genoma
del virus. Mediante complementación de este
precursor se une a la molécula del genoma
(hibridan) y se inicia la síntesis.
2. Síntesis de ssRNA (-): RNA polimerasa (producto
de 3D) copia en dirección 5’- 3’ usando el
genoma de molde(lee 3-5). Este RNA (-)
sintetizado no se traduce y solo sirve de
molécula intermediaria para generar muchas
más moléculas de genoma y mRNA. El híbrido de
RNA (+) y RNA (-) se desestabiliza y se separa.
3. La Proteasa 3C corta 3A-3B dejando a Vpg que
queda unida covalentemente al extremo 5’ de la nueva molécula de RNA. 3A se recicla
en la membrana y 3B (Vpg) se queda unida a la molécula de RNA (-).
4. Síntesis de la cadena ssRNA (+): El RNA (-) sirve de molde para sintetizar más mRNA. Una
molécula sirve para sintetizar muchos mRNAs. Se ha seleccionado un mecanismo de
copia que permite que a partir de una molécula de RNA (-) se inicien simultáneamente
la síntesis de muchas moléculas de RNA (+). El mecanismo de iniciación de la copia por
la RNA polimerasa es relativamente complejo. Por tanto, se observa que efectivamente
se consigue generar más ARNss(+) que (-).

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Su polimerasa no posee actividad correctora por lo que la tasa de mutación y generación de

cuasiespecies es elevada.

Si hay ribosomas pegados al RNA, la replicación no progresa, y por lo tanto, replicación y

traducción no pueden transcurrir de forma simultáneaHay una competición o selección a la
hora de decidir si hay traducción o replicación de genoma. Si iniciaran simultáneamente
habría una colisión de la RNA polimerasa con el ribosoma. . Existen mecanismos que evitan
que ambos procesos ocurran simultáneamente.

6. Ensamble de la cápsida

El precursor P1 dijimos que queda anclado en la membrana y genera las proteínas estructurales.
Antes de que la proteasa corte y separa las 3 proteínas, hay un ensamblaje de este precursor
estructuralmente, una conformación que le permite generar subunidades estructurales que se
denominan 5S. El ensamblaje de 6 unidades estructurales 5S forman la cápsida. Mientras se
sintetiza el péptido se está plegando, ayudado por chaperonas. Se cortan todas las subunidades
menos VP4 y VP2 que quedan unidas covalentemente, se denomina VP0. La cápsida se
constituye de 6 unidades estructurales 5S ensambladas.. Todo este proceso está asistido por
chaperonas celulares. Cuando se encapsida el genoma termina la maduración de esta, se separa
VP2 y VP4 y se constituye el virión infectivo.

7. Encapsidación

Debe existir una regulación del proceso de encapsidación del genoma, en qué momento se deja
de replicar para encapsidar. Cuando hay baja concentración de proteína estructural, el virus se
pone a funcionar la maquinaria de replicación y se copian las moléculas del genoma a ARN- y de
este a más de ARN+. Aumentan los niveles de proteína en general, incluido las de la cápsida,
hasta que se alcanza una alta concentración, que es cuando se promueve la encapsidación.

Existe una señal que indica cuando el RNA debe ser encapsidado en la procápsida, esta es la
cantidad de proteína estructural, es decir, la cantidad de precursor P1 que se ha sintetizado. Baja
[P1]: Promueve la replicación y la traducción, no se encapsida el ARN +, Alta [ P1]: Inhibe la acción
de la RNA polimerasa y se promueve la encapsidación, tampoco traducción.

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Por ultimo, el virus se libera.

2. FAMILIA TOGAVIRIDAE

Son virus con envuelta lipídica con glicoproteínas E1 y E2, 1 molécula

de ssRNA (+) en nucleocápsida icosaédrica. La principal diferencia
con picornavirus es que tienen ARN suegenómicos (genera varios
mensajeros), regulando temporalmente una expresión temprana y
una tardía.

Virus de esta familia: Alphavirus (Rubeola y virus de artrópodos),

Rubvirus (Semliki Forest Virus (SFV), Encefalitis equina).

2.1. Genoma de Togavirus

Poseen una molécula de ARNss(+) de mayor tamaño que el picornavirus que tiene una caperuza
(no tiene IRES) y cola poliA.

En la replicación genera un ARNss(-), que puede ser usado como molde para crear nuevas copias
de ARNss(+) o bien para generar un ARNss(+) suegenómico a partir de un “promotor”
intermedio. Tanto en los extremos del genómico como del subgenómico tenemos regiones UTR.
Tenemos por lo tanto 3 secuencias no codificantes (5’ UTR, central y 3’ UTR), tango genómicos
como subgenómicos. El resto (90%) es codifcante y posee dos ORF, una para el genómico que
contiene 4 proteínas tempranas o catalíticas (complejo replicasatranscriptasa) y otra para el
subgenómico que contiene 4 proteínas tardías o estructurales. Se generan en forma de
poliproteínas que serán autoprocesadas.

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Los RNAs subgenómicos son fragmentos de RNA de tamaño inferior al del genoma pero que no
se replican. No son reconocidos por la RNAP y sólo pueden ser traducidos a proteínas
estructurales.El ARN subgenómico no puede ser replicado, solo traducido.

El inicio de la traducción empieza en 5’ y se encuentra el codón de STOP hacia la mitad. Sin

embargo, la RNA pol es capaz de reconocer una secuencia en el RNA (-) a modo de “promotor”,
y la RNA pol viral es capaz de generar el RNA subgenómico. La RNA pol se genera de la traducción
de la parte izquierda genoma (5’). Solo cuando se genera este se puede replicar y transcribir.

Producción de ARN suegenómicos

La caperuza es reconocida por los factores de traducción eucariotas, al igual que cualquier
ARNm. El ribosoma se une y encuentra el AUG. Empieza a traducir hasta el primer STOP y genera
un polipéptido P123, con las proteínas nsP1, 2, y 3. La nsP1 porta la información para sintetizar
su caperuza, y para la replicación. La nsP2 tiene actividad proteasa, lleva a cabo el procesamiento
de la poliproteína para liberar las tres mencionadas. La nsP3 tiene que ver con la patogénesis y
la infectividad, pero no está muy bien determinado.

Con cierta frecuencia, se ignora el primer codón STOP: el ribosoma sigue traduciendo hasta que
encuentra otro STOP. Se genera una poliproteína más grande que ahora tiene además la nsP4,
que una vez procesada es la ARN polimerasa. Esto permite modular la cantidad de ARN que hay
en la célula. La ARN polimerasa es muy sensible, basta que haya muy pocas unidades de esta
para que se repliquen y generen muchos ARN genómicos y subgenómicos.

Esta RNA pol reconoce el genoma y empieza la síntesis de la cadena (-), pero también es capaz
de reconocer una secuencia “promotora” o de unión a RNA, en esta cadena , lo cual permite
transcribir el RNA subgenómico, que da lugar a un péptido de tamaño completo que se
autoprocesa por la proteasa y da lugar a las proteínas estructurale .Del ARN subgenómico salen
las proteínas de la cápsida y envuelta (estructurales), que se glicosilan y disponen en la
membrana plasmática, de forma que sean recogidas por la cápsida al salir y llevarse la envuelta.

4 proteínas tempranas (replicación y

transcripción).

- nsP1: adicción del cap,

replicación, asociación a mb.
- nsP2: proteasa, NTPasa.
- nsP3: función desconocida.
- nsP4 (RNAP): consecuencia
de la supresión de un codón
de stop.

• 4 tardías estructurales:

- C (autoproteasa),
- E2 (entrada)
- E3 (RE),
- 6K y E1 (fusión).

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2.2. Ciclo Togavirus

1. Entrada por endocitosis ácida mediad por receptor

2. Traducción del mRNAs 49S y procesamiento.

3. Replicación del ssRNA (+) y síntesis de ssRNA 49S negativo.

4. Transcripción del Mrna subgenómico (Mrna 26S).

5. Traducción del Mrna 26S (tardío). Inhibición de la traducción celular y del Mrna temprano.
6. Ensamblaje de proteínas estructurales en la cápsida y empaquetamiento del genoma.

7. Adquisición de envuelta. 8. Salida

3. FAMILIA CORONAVIRIDAE

Genoma ssRNA (+) policistrónico ,poseen el genoma más grande de las familias de este tema. El
ciclo se complica un poco más porque genera de 9 a 11 ARN subgenómicos.

Covid-19

En la envuelta del virión se encuentra la glucoproteína S (espícula) que reconoce el receptor

ACE2 (células del epitelio del sistema respiratorio). Las glucoproteínas M y E son proteínas
transmembrana de la envuelta implicadas en la capacidad infectiva y en el ensamblaje de los
viriones. Por último, está la proteína N asociada al ARN genómico en el interior de la cápsida,
tiene función estructural y de evasión del interferón y ARNi.

SARS Y MERS

2/3 con genes cartalíticos (replicación y transcripción) + 1/ 3 proteínas estructurales y accesorias

en RNA subgenómicos.

3.1. Ciclo del Coronavirus

1. Adsorción y entrada

El virus reconoce su receptor especifico ACE2, se une y la entrada se realiza por endocitosis. El
endosoma baja el pH, se fusiona envuelta y membrana, se libera el ARN y este va a los ribosomas.
Se generan 2 precursores. Del segundo sale la ARN polimerasa, responsable de crear los ARN
subgenómicos.

Todas las proteínas estructurales del coronavirus son de los ARN subgenómicos. Los genómicos
dan lugar únicamente a los dos precursores mencionadosLos ARN genómicos dan lugar a los
precursores, todo lo demás surge de los subgenómicos. El primero se produce por la llegada
hasta el primer STOP. Para el segundo, el ribosoma sigue el mismo procedimiento, pero antes de
llegar al STOP, con cierta frecuencia, se desliza en una región rica en A y U provocando un cameio
de ORF. Este cambio de pauta de lectura hace que el STOP no se lea y se genere un precursor
más grande que contiene la información del primero y nuevas proteínas.

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En los genomas de SARS y MERS, la parte final codifica diferentes proteínas estructurales. El
principio codifica proteínas catalíticas (nsP1-nsP16), de las que destacan: proteasas nsP3 y nsP5,
la ARN polimerasa nsP12, la helicasa nsP13 que permite la replicación y las exo y endonucleasas
nsP14 y ns P15 respectivamente. Estas dos últimas son únicas del coronavirus, las otras familias
de este tema no las poseen. Esto le proporciona actividad correctora de pruebas: corrige los
nucleótidos mal colocados. Por ello la tasa de errores (y por tanto mutaciones) disminuye de 30
a 40 veces respecto a los que no tienen esta actividad. Parece que los ARN subgenómicos del
coronavirus si pueden ser replicados en SARS y MERS, a diferencia del togavirus. La replicación
de estos subgenómicos permite aumentar su cantidad para tener más proteínas estructurales.

3.2.Neutralización y antivirales:

Para el tratamiento de coronavirus, en concreto para el Covid-19, se usan antivirales y técnicas

como:

-Inhibidor del receptor AC2, pero puede desencadenar la respuesta infamatoria. Igualmente, no
se recomienda usar a la vez antiinfamatorios en personas de edad avanzada debido a que la
presión arterial se eleva.

- Cloroquina o hidroxicloroquina es un fármaco que consigue mantener el pH de los endosomas

alto, de forma que no se produce la fusión de envuelta y membrana lipídica. Evita también la
respuesta infamatoria.

- Lopinavir y remdesivir. Parecen tener actividad contra las proteasas del coronavirus el primero,
y contra la ARN polimerasa el segundo.

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- Interferón β. El interferón es una respuesta generalizada del organismo como defensa para
eliminar cualquier virus (respuesta no especifca, sin anticuerpos ni inmunología, es respuesta
relacionada con la infamación). Muchos virus han desarrollado una respuesta para bloquear el
interferón. Con este interferón β se consigue mejor respuesta, aunque con muchos efectos
secundarios, hace falta controlar las dosis.

-Rieavirina, que es un análogo de nucleósido que se incorpora durante la elongación del genoma
e impide que se añadan más nucleótidos.

4. FAMILIA FLAVIVIRIDAE

Son responsables de patologías humanas como la fiebre amarilla, dengue, encefalitis, zika... Este
último pasó de monos a humanos y tuvo más incidencia en países tropicales. Generaba
microcefalia en fetos en desarrollo y síndrome de Guillain-Barré. El genoma del flavivirus es el
único de las 4 familias estudiadas que no posee cola poliA. Es más grande que el genoma de
picornavirus, pero menor que el de togavirus.

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