POLSKIE I I TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

Advances in Biochemistry
TOM 42, NR 3,1996

Gratulacje jubileuszow e 223

Polaryzacja komórki i cytoki-
n e z a ....................................................227
Kompleksy chromatynowe . . . . 238
Kinazy MAP i A P - 1 ....................... 244
Cytoplazmatyczna męskosteryl-
ność u r o ś lin .................................. 253
Ekspresja mtDNA drożdży . . . . 259
Roślinny łańcuch oddechowy . . 268
Sterowanie poliketydów 276
Ary losu Ifataza A — efekty niedo­
boru ....................................................284
Izoenzymy fosfolipazyC 290
Sygnał sfingom ielinowy 299
S p raw o zd an ia .................................. 310

http://rcin.org.pl
K w a rta ln ik „ P o stęp y B io c h e m ii
"

w y d a w a n y z p o m o cą fin a n s o w ą
K o m ite tu B adań N a u k o w y c h

http://rcin.org.pl
 SPIS TREŚCI
CONTENTS

W YDAW CA
Listy gratulacyjne z okazji 90-lecia C złonków Honoro­
E ditor w ych Tow arzystw a:
P O L SK IE TOW ARZYSTW O
B IO C H E M IC Z N E profesor Stelli Niem ierko i profesora Tadeusza Korzybs-
Polish Biochemical Society kiego
ul. Pasteura 3 Congratulation on the 90th birthday of Professors Stella Niemier­
02-093 W arszawa
Poland ko and Tadeusz K orzybski.................................................................223
Poland

Drukarnia Naukowo-Techniczna Polaryzacja kom órki, białka polarne i cytokineza

Mińska 65 Cell polarity, polar proteins and cytokinesis
03-828 Warszawa
JAN IN A KACZANOWSKA, DOROTA WŁOGA, ANDRZEJ KA­
REDAKCJA CZANOWSKI ........................................................................................ 227
Editorial Board
R ED A K TO R NACZELNY Rola kom pleksów chrom atynow ych w regulacji ekspresji
E ditor in chief genów
Z O FIA ZIELIŃ SK A
Chromatin complexes in regulation of gene expression during
tel. 31-24-03
R ED A KTORZY development
Editors TOMASZ T. CALIKO W SKI.................................................................238
GRAŻYNA PALAM ARCZYK
tel. 658-47-02
A N D RZEJ JER ZM A N O W SK I Kinazy M A P i ich rola w regulacji poziomu, składu podje-
tel. 659-70-72 w. 3234 dnostkow ego oraz stopnia fosforylacji czynnika trans-
ANNA SZAKIEL
krypcyjnego AP-1
tel. 23-20-46
JO LA N TA GRZYBOW SKA Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) — their role in
tel. 13-05-15 regulation of protein level, subunit composition and degree of
BARBARA ZARZYCKA
tel. 659-85-71 w. 332
phosphorylation of the transcription factor AP-1
IRENEUSZ W. B IE D E R M A N N ........................................................244
R EC EN ZEN C I ZESZYTU
Referees of this issue M olekularne podstaw y cytoplazm atycznej męskosteryl-
GRAŻYNA DOBROWOLSKA ności u roślin wyższych
(Warszawa) Molecular basis of cytoplasmic male sterility in higher plants
LILLA HRYNIEWIECKA HANNA JAŃSKA, MAGDALENA W OŁOSZYŃSKA.....................253
(Poznań)
RENATA JASIŃSKA
(Warszawa) Rola genomu jądrow ego w regulacji funkcjonow ania
ANDRZEJ JERZMANOWSKI m itoch ondrió w Saccharom yces cerevisiae
(Warszawa) Nuclear control of mitochondrial functions i Saccharomyces
TADEUSZ KŁOPOTOW SKI cerevisiae
(Warszawa) MAGDALENA B O G U T A ....................................................................259
STEFAN MALEPSZY
(Warszawa)
GRAŻYNA PALAMARCZYK Roślinny łańcuch oddechow y
(Warszawa) Plant respiratory chain
KRZYSZTOF STAROŃ ANNA M. RYCHTER ................. 268
(Warszawa)
PIOTR STĘPIEŃ
(Warszawa) Sterow ana biosynteza an tyb io tykó w poliketydow ych
KRYSTYNA STRZYKAŁA Engineered biosynthesis of polyketide antibiotics
(Poznań) KATARZYNA KUCZEK, MAGDALENA KOTOWSKA, MARIAN
MORDARSKI ..................................................................................... 276
ADR ES REDAK CJI
Address Niedobór aktyw ności arylosuifatazy A jako podłoże leu-
REDAKCJA K W ARTALNIKA
„PO STĘPY B IO C H E M II” kodystrofii m etachrom atycznej
PO L SK IE TOW ARZYSTW O Deficiency of arylsulfatase A activity as a basis of metachromatic
B IO C H E M IC Z N E leukodystrophy
ul. Pasteura 3
02-093 W arszawa AGNIESZKA ŁUGOWSKA, ANNA TYŁKI-SZYMAŃSKA . . . . 284
tel. (2) 659-85-71 w. 332
fax: (22) 22-53-42

http://rcin.org.pl
Izoenzymy fosfolipazy C specyficznie hydrolizującej fos-
fatydyloin ozytole i regulacja ich aktyw ności
Phosphatidylinisitol-specific phospholipase C isozymes and re­
gulation of their activity
TADEUSZ PAW ELCZYK............................................... 290

Sfingom ielina i jej m etabolity jako pośredniki w przeno­

szeniu sygnału w kom órce
Sphingomyelin and its metabolites in cellular signal transduction
JOLANTA M. DZIK, ELŻBIETA W AŁA JTYS -R O D E.....................299

Spraw ozdania i K o m u n ik a ty ........................................................310

Errata
W zeszycie nr 2 b.r. Postępów Biochemii (str. 219) zostały
zniekształcone nazwiska:
Kol. Jacka Kuźnickiego z Warszawy,
Kol. Jerzego Meduskiego z Kaliforni.
Za niedopatrzenie błędów w korekcie Redakcja uprzejmie Kolegów
przeprasza.

222 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 Warszawa dn. 09.05.1996.

W ielm ożna Pani

Profesor Stella Niem ierko

Wielce Szanowna Pani Profesor

Z okazji pięknego jubileuszu dziewięćdziesięciolecia urodzin mam zaszczyt

złożyć Pani Profesor, Członkowi Honorowemu Polskiego Towarzystwa Bio­
chemicznego i Znakomitemu Biochemikowi, najserdeczniejsze życzenia pomyśl­
ności i zdrowia od Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego
i całej społeczności biochemików polskich.
Przywilej reprezentowania Towarzystwa pozwala mi także wyrazić naszą
wdzięczność za wielki wkład Pani Profesor w odbudowę po zniszczeniach
wojennych, tak ważnej placówki badawczej, jaką jest Instytut imienia M. Nenc­
kiego; za stworzenie w nim dynamicznie rozwijającej się szkoły biochemii układu
nerwowego, a przez to zainicjowanie w Polsce badań neurochemicznych.

Łączę wyrazy uznania oraz najgłębszego poważania

Prezes Polskiego Towarzystwa Biochemicznego
Profesor dr Liliana Konarska

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 223

http://rcin.org.pl
 Warszawa, 4 czerwca, 1996

W ielm ożny Pan

Profesor Tadeusz Korzybski

Z okazji pięknego jubileuszu dziewięćdziesięciolecia urodzin mam zaszczyt

złożyć Panu Profesorowi, Znakomitemu Biochemikowi, Członkowi Założycielowi
i Członkowi Honorowemu Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, najserdecz­
niejsze życzenia zdrowia i pomyślności. Życzenia te wraz z gratulacjami składam
w imieniu Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego i całej
społeczności biochemików polskich.
Przywilej reprezentowania Towarzystwa pozwala mi także na wyrażenie nasze­
go uznania za znaczący wkład Pana Profesora w rozwój biochemii w naszym kraju,
a zwłaszcza wiedzy dotyczącej antybiotyków.
Pamiętamy też o udziale Pana Profesora w organizacji i działalności Polskiego
Towarzystwa Biochemicznego, a w szczególności jego Komisji Słownictwa
Biochemicznego. Na naszą wdzięczność zasługuje także fakt, że jako uczeń
Profesora Jakuba Karola Parnasa umiał Pan utrwalić pamięć o tym wielkim
uczonym wśród biochemików kilku pokoleń — poprzez swoje publikacje, odczyty
i chętnie udostępniane wspomnienia oraz zgromadzone pamiątki.

Z wyrazami najgłębszego szacunku i poważania

Prezes Polskiego Towarzystwa Biochemicznego
Profesor dr Liliana Konarska

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 225

 ■

http://rcin.org.pl
 ARTYKUŁY
A rtykuł ten dedykujemy Pani Profesor Dr hab. Zofii Zielińskiej
Polaryzacja komórki, białka polarne i cytokineza
Cell polarity, polar proteins and cytokinesis
J A N I N A K A C Z A N O W S K A 1,
D O R O T A W Ł O G A 2,
A N D R Z E J K A C Z A N O W S K I3
Spis treści:
I. Polarność komórki stanowi instrukcję strukturalną
w rozwoju
II. Zewnętrzne sygnały mogą wywołać reorganizację cyto-
szkieletu
III. Mechanizmy powstania polarności komórki i wyznacza­
nia położenia bruzdy podziałowej w trakcie pączkowania
drożdży Saccharomyces cerevisiae
III-l. Przebieg pączkowania jest związany z reorganiza­
cją cytoszkieletu w trakcie cyklu komórkowego
III-2. Septyny drożdży mogą stanowić instrukcję struk­
turalną dla wyznaczania miejsca pączkowania
III-3. Zewnętrzny bodziec może wywołać reorganiza­
cję cytoszkieletu i wyznaczyć miejsce gromadze­
nia białek biegunowych
IV. Funkcje białek biegunowych w komórkach różnych
typów
V. Biegunowość jaja robaka Caenorhabditis elegans i wy­
znaczanie położenia bruzd podziałowych w embriogenezie
VI. Powstawanie osi w jaju Drosophila melanogaster jako
przejaw wzajemnego oddziaływania na siebie oocy-
tu i komórek folikularnych
VII. Wnioski i pytania
Wykaz stosowanych skrótów: EGF — (ang. epidermal growth
factor) epidermalny czynnik wzrostu; PD G F — (ang. platelet
derived growth factor) płytkowy czynnik wzrostu; LPA
— (ang. lysophosphatidylic acid) kwas lizofosfatydylowy; Ras
— produkt protoonkogenu genu ras pośredniczący w szlaku
przekazu bodźca do jądra; Rho — (ang. Ras homologues)
grupa białek o podobnej strukturze i funkcji do białka Ras;
Rac — (ang. Reorganization o f actin cytoskeleton) białka
zbliżone do Ras bezpośrednio związane z reorganizacją
cytoszkieletu aktynowego; CDC42 — produkt genu cdc42
Saccharomyces cerevisiae o strukturze i funkcji podobnej do
białka Ras; GEF — (ang. guanine nucleotide exchange factor)
czynnik regulujący GTPazową funkcję białka Ras; GAP
— (ang. GTPase activating protein) aktywator funkcji GTPa-
zowej białek Ras; CLbl, Clb 2 — (ang. cyclin binding proteins)
1,3 Prof. dr hab., 2 mgr Zakład Cytofizjologii, Uniwer­
sytet Warszawski, Warszawa 00-927, ul. Krakowskie Przed­
mieście 26/28
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
w dowód naszego szacunku i przyjaźni
Contents:
I. Cell polarity is a developmental instruction
II. External signals serve as the stimuli for the cytoskeletal
reorganisation
III. Mechanisms of appearance of cell polarity and deter­
mination of position of the fission line during budding of
Saccharomyces cerevisiae
III-l. Morphogenesis of the bud is coupled to reorgani­
zation of the cytoskeleton during cell cycle
III-2. Yeast septines may function as structural deter-
minans for selection of the sites of budding
III-3. External signal induces reorganization of the
cytoskeleton and determines the site of nucleation
of the polar proteins
IV. Functions of polar proteins in various cellular systems
V. Polarity of the Caenorhabditis elegans egg and deter­
mination of the pattern of fission lines in embryogenesis
VI. Development of antero-posterior and ventro-dorsal axes
in the Drosophila melanogaster egg as an interplay of
signals between the oocyte and the follicular layer
VII. Conclusions and questions
aktywatory cyklino-zależnej kinazy białkowej Saccharomy­
ces cerevisiae: Myo 2 — produkt genu myo 2 będący
homologiem miozyny w Saccharomyces cerevisiae; septyny
— (ang. septins) kompleks białek szkieletowych z domeną
wiążącą nukleotyd wyznaczających położenie bruzdy po­
działowej; bud — zespół genów kontrolujących powstawanie
miejsca pączkowania u Saccharomyces cerevisiae; cdc24,
cdc43, bem 1, bem 3, rsr 1, spa2, gtpb — geny Saccharomyces
cerevisiae kontrolujące tworzenie kompleksu białek biegu­
nowych; GDI — (ang. guanine nucleotide dissociation in­
hibitor) białko negatywnej kontroli funkcji Ras; ERM
— (ang. ezrin, radixin, moesin family) białka cytoszkieletu
występujące albo w cytoszkielecie miejsc przylegania komó­
rki do podłoża, albo w* bruździe cytokinetycznej; cdcl5,
peanut — geny kodujące białka charakterystyczne dla bruz­
dy podziałowej; MAP kinaza — (ang. Mitogen activated
protein kinase) kinaza serynowo-treoninowa uczestnicząca
w szlaku kaskady kinaz przenoszących mitogenny sygnał
zewnętrzny z cytoplazmy do jądra; c-jun, c-fos — geny
227
kodujące powstanie czynnika transkrypcyjnego (AP-1)
w wyniku działania mitogenów na komórki; par — geny
kodujące białka kontrolujące położenie bruzd podziałowych
w trakcie bruzdkowania robaka Caenorhabditis elegans;
bicoid, staufen, nanos, oskar, gurken — geny matczyne
Drosophila melanogaster kodujące determinanty osi jaja;
MTOC — (ang. microtubules organizing center) kompleks
białek zdolnych do nukleowania polimeryzacji mikrotubuli,
zwykle jest to zespół białek otaczających centriolę tworzącą
razem strukturę zwaną centrosomem; rTGF — (ang. tranfor-
mation growth factor receptor) białko receptora błonowego
przyłączającego czynnik transformujący; torpedo — gen
kodujący białko receptorowe eksprymowane w niektórych
komórkach folikularnych otaczających jajo Drosophila mela­
nogaster; torso — gen matczyny kodujący białko o charak­
terze receptorowej kinazy tyrozynowej eksprymowany w ja ­
ju Drosophila melanogaster.
I. Polarność komórki stanowi w trakcie roz­
woju instrukcję strukturalną
Celem tego arty k u łu jest przedstaw ienie m echaniz­
m ów p ow staw ania osi ciała kom órek som atycznych
i zapłodnionych jaj w odpow iedzi na sygnały zew nętrz­
ne. K o m ó rk a, poprzez transdukcję tych sygnałów,
reorganizuje w określony sposób swój cytoszkielet
oraz uru ch am ia now e transkrypcje. P ow stanie nie­
przypadkow ego rozm ieszczenia stru k tu r w kom órce
w w yniku takiej reorganizacji w zdłuż osi przednio-
tylnej i grzbietow o-brzusznej stanow i jej instrukcję
stru k tu raln ą. T a in strukcja w yznacza położenie b ru z­
dy podziałow ej w trakcie cytokinezy, oraz w przy p ad ­
k u zapłodnionej k o m órki jajow ej — także organizację
przestrzenną zarodka. B lastom ery pow stałe z przed­
niej części k o m ó rk i jajow ej stanow ić będą przód ciała
zarodka. B lastom ery pow stałe z tylnej części kom órki
w ytw orzą tył zaro d ka. O znacza to, że układ stru k tu r
w zapłodnionej kom órce jajow ej determ inuje przyszły
plan przestrzennego rozw oju zarodka. M echanizm
pow staw ania polarności jaja, a także pew nych k o m ó ­
rek spolaryzow anych (np. neuronów ) jest p ra w d o p o ­
dobnie uniw ersalny i wiąże się z uporządkow aniem
przestrzennym rozm ieszczenia kom pleksu tzw. białek
biegunowych.
II. Zewnętrzne sygnały mogą wywoływać re­
organizację cytoszkieletu
K o m ó rk a eu k ariotyczna m oże być k o m ó rk ą apolar-
ną. O znacza to, że organizacja stru k tu r cytoszkieletal-
nych nie w ykazuje żadnego u p o rząd k o w an ia o ch a rak ­
terze osiowym. O ś ta k a m oże pojaw ić się w niektórych
k o m ó rk ach p o d wpływem czynników zew nętrznych
np. ch em o atrak tan tó w . W obecności takiego czynnika
k o m ó rk a reorganizuje swój cytoszkielet i pow staje
p rzó d k o m ó rk i z nibynóżkam i przesuw ającym i k o ­
m órkę w k ieru n k u źródła ch e m o a trak tan ta [1]. P rzy­
kładem m ogą być fibroblasty myszy, k tó re p o d wpły­
wem czynników w zrostow ych, takich ja k epiderm alny
czynnik w zrostu (EG F), płytkow y czynnik w zrostu
(P D G F ), czy też kw asu lizofosfatydylow y (LPA) wy­
228
http://rcin.org.pl
tw arzają p łatow ate nibynóżki (lam m ellipodia) i rusz­
tow anie cytoszkieletu w postaci aktynow ych kabli
(ang. actin cables).
C en traln ą rolę w przew odzeniu bodźca w yzw alają­
cego przem iany w cytoszkielecie grają różne białka
0 charakterze G T P az zbliżonych do białka Ras okreś­
lanych ja k o R ho (ang. Ras Homolgues = Rho), o d ­
m iana G T P az typu R ac zw iązanych bezpośrednio
z reorganizacją cytoszkieletu aktynow ego (ang. R e­
organization o f Actin C ytoskeleton = Rac) (Rye. 1) i być
m oże kluczow e białko C D C 42 (w niektórych p u b lik a­
cjach używ ana jest pisow nia Cdc42p) należące do
grupy G T P a z typu R as [2, 3]. Te sam e bodźce m ogą
rów nież prow adzić do aktyw acji czynników trans-
krypcyjnych, a następnie do syntezy now ych białek.
N iektóre poznane d o tąd drogi transdukcji sygnałów
1 aktyw acji poszczególnych szlaków m etabolicznych
zw iązane są z różnym i białkam i Ras (Rye. 1). Schem at
ten jest jeszcze niekom pletny poniew aż obecnie p o ­
szukuje się białek pośredniczących w przenoszeniu
sygnału od odpow iedniego receptora kom órkow ego
do białek typu Ras, R ac i C D C 42. B iałka p o śred ­
niczące pow inny zaw ierać dom eny SH2 i SH3 o d ­
działyw ujące z pobudzonym receptorem oraz dom eny
aktyw ujące b iałka typu Ras. W procesie aktyw acji
b iałka R as występuje w ym iana G D P n a G T P ; zatem
pew ne białka pośredniczące m uszą spełniać funkcję
w ym ieniacza tych nukleotydów (ang. G EF = Guanine
nucleotide Exchange Factor), a inne regulow ać
aktyw ację hydrolitycznej funkcji G T P azy (ang. G A P
= GTPase Activating Protein). A ktyw acja białek Ras
z kolei aktyw uje pośredniczący system kinaz biał­
kow ych aby uruchom ić system y efektorów (z jednej
strony m echanizm y reorganizacji cytoszkieletu,
a z drugiej aktyw ację czynników transkrypcyjnych).
W w yniku zadziałania bodźca pow staje kom pleks
białek: uczestniczących w transdukcji sygnału (Rac,
R ho, Ras, C D C 42 G E F etc.), ośro d k a inicjującego
reorganizację cytoszkieletu (ang. nucleating center),
oraz białek szkieletow ych reorganizow anych p o d
wpływem bodźca (aktyna, b iałka regulujące polim ery­
zację aktyny, m iozyny, m ikrotubule i tow arzyszące im
białka m otoryczne etc). T aki złożony kom pleks białek
m oże stanow ić zespól białek biegunowych decydujących
0 polarności komórki. W spółczesne b ad a n ia skupiają
się n a poznaniu składu, funkcjonow aniu i trw ałości
kom pleksu białek biegunow ych, a szczególnie n a p o ­
znaniu ich roli ja k o instrukcji strukturalnej w trakcie
różnicow ania i em briogenezy.
P o okresie interfazy zarów no k o m ó rk a p o la rn a ja k
1 ap o larn a m ogą w chodzić w stadium m itozy. W rzecio­
no kariokinetyczne wyznacza położenie bruzdy p o ­
działowej, k tó ra pow staje p ro sto p ad le do osi w rzecio­
n a [4]. Jak pow staje oś wrzeciona? Jaki wpływ m a
p o larność kom órki n a determ inację położenia bruzdy
podziałow ej? Jakie znaczenie w rozw oju m a w yznacze­
nie przestrzennego ułożenia bruzd podziałow ych? P y ­
tan ia te n a razie p o zostają bez jednoznacznych od-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 kaskada
kinaz

? czyn n ik i
transkrypcyjne

'ekspresja
i • ' \ genów
k in a z a # \ 1
aktyw ująca \ f
c -J U N , ^regulacja
h yd roliza zm ian y m itozy
fo sfa ty d y lo in o zito lu w cytoszkielecie
aktyny
i ERM
Ryc. 1 Uproszczony i hipotetyczny schemat zależności stymulacji białek G, Ras, Rho, Rac i CDC42 z aktywacją reorganizacji cytoszkieletu
(grube strzałki) i pobudzaniem aktywności niektórych kinaz białkowych (kompilacja schematów wielu autorów głównie [3,16,44, i 45]).
FAK — kinaza specyficzna dla miejsc przylegania kom órek do podłoża (ang. foci adhesion kinase), ERM — (ang. ezrin, radixin, moesin)
białka cytoszkieletu związane z wytwarzaniem miejsc przylegania do podłoża i występujące w bruździe cytokinetycznej, G s — białko
G stymulowane horm onalnie (wzrost stężenia cAMP) i Gj — białko G stymulowane kwasem lizofosfatydylowym (LPA) (obniżenie
poziom u cAMP) powoduje aktywację fosfolipazy a następnie aktywację kinazy białkowej C (PKC), aktywację kinazy fos-
fatydylonoizytolu (PI3K) i Rac (RAC), oraz aktywację Rho (być może z udziałem niereceptorowych kinaz tyrozynowych (src i JAK); Przy
działaniu LPA i czynników wzrostowych (IG F i EG F) obserwuje się aktywację szlaku Ras. Stymulacja szlaku Ras jest sprzężona
z aktywacją CDC42 być może przez wspólny czynnik aktywujący GAP.

powiedzi. Jednakże postęp b a d a ń n ad m echanizm am i rodzicielską a pączkiem pow staje charakterystyczny

pączkow ania drożdży, p ow staw ania polarności jaja
ro b a k a Caenorhabditis elegans i w yznaczania położe­
nia bru zd w trakcie em briogenezy, oraz b ad a n ia nad
m echanizm em po w staw ania osi ciała w ja ju Drosophila
melanogaster ro k u ją nadzieję n a rozw ikłanie tych
zależności.
III. Mechanizmy powstania polarności komó­
rki i wyznaczania położenia bruzdy po­
działowej w trakcie pączkowania drożdży
Saccharomyces cererisiae
I I I-l. Przebieg pączkowania jest związany z re­
organizacją cytoszkieletu w trakcie cyklu
kom órkowego
P ączkow anie drożdży S. cerevisiae jest asym etrycz­
pierścień złożony z białek biegunowych. T en pierścień
w yznacza położenie przyszłej bruzdy cytokinetycznej
(Ryc. 2b). P rzyrost pączka odbyw a się wyłącznie
w obrębie pierścienia. T u tw orzy się palczasty w yros­
tek z szybko rosnącym czubkiem . W czubku także są
białka biegunow e (wzrost apikalny) (Ryc. 2c). D o
czubka przem ieszcza się rów nież wiele składników
cytoszkieletu np. aktyna, m ikrotubule w raz z kinezyną,
kaldesm on, kalm odulina i inne białka zw iązane z k o n t­
rolą stan u polim eryzacji aktyny. D o czubka są tra n s­
portow ane pęcherzyki stanow iące zapas błony k o m ó r­
kowej; pęcherzyki te drogą egzocytozy n a czubku
pączka pow odują szybki jego w zrost (Ryc. 3d).
W transporcie tym uczestniczy hom olog m iozyny
ludzkiej kodow anej przez gen M y o 2 drożdża.
aktyw acja kinazy aktywacja przez
cdc 2 8 + C lb 1 /2 fosfatazę
degradacja

nym podziałem kom órki. W późnym stadium G1

G 1 - s DN A
I
Clb1/2 cdc 2 8
' cyklin

k o m ó rk a rodzicielska osiąga m aksym alne rozm iary

po czym przestaje ro sn ąć i przygotow uje się do re­
plikacji D N A . W okresie w chodzenia w replikację
(stadium G l/sD N A ) k o m ó rk a rodzicielska zaczyna
tw orzyć pączek (Ryc. 2a). P ow staje pierw otna polar-
ność wzdłuż osi „k o m ó rk a rodzicielska-pączek”
(Ryc. 3d). P ow staw anie pączka jest zależne od a k ­
tywacji kinazy białkow ej zależnej od cykliny
rozpraszanie
(Cln/Cdc28) inicjującej replikację D N A poprzez przy­ przejście w zrostu białek
łączenie dw óch białek (C lb l i C lb2 = Cyclin Binding apikalnego biegunowych
w izom etryczny
proteins) (Ryc. 2a i b). A więc tw orzenie pączka jest
Ryc. 2 Zmiany w rozmieszczeniu białek biegunowych w trakcie
bezpośrednio zw iązane z cyklinam i kontrolującym i pączkowania Saccharomyces cerevisiae. Uproszczony sche­
przebieg cyklu kom órkow ego. Pom iędzy k o m ó rk ą m at wg [5]. Szczegółowy opis w tekście.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 229

 W następnym stadium cyklu kom órkow ego (sta­ m acją stru k tu ra ln ą dla wyznaczenia miejsc pączkow a­
dium przejścia sD N A /G 2) zm ienia się typ w zrostu nia w kolejnych cyklach kom órkow ych. B adania p ro ­
pączka, z biegunow ego w ydłużającego się palca, na w adzone w pracow niach D r P r i n g l e ’ a i H e r s -
izom etryczny, czyli w ydłużający się palec staje się k o w i t z a pozw oliły w yróżnić dw a podstaw ow e typy
rów nom iernie ro sn ącą kulą z rów nom iernie sekreto- w zoru przestrzennego pączkow ania u S. cerevisiae; a)
w anym i pęcherzykam i n a całej pow ierzchni pączka. typ osiowy, (Ryc. 3a) i b) typ biegunow y (Ryc. 3b) [1 ,6 ].
M o m en t tego przejścia z w zrostu apikalnego n a izo­ O dżyw ione drożdże, k tó re często pączkują ch a rak ­
m etryczny jest p o d k o n tro lą genetyczną (ang. api- teryzuje osiowy typ pączkow ania. W trakcie kolejnych
cal/isometric switch) [5]. A ktyw acja czynników Clb 1/2 pączkow ań poprzedni pierścień szyjki stanow i in stru k ­
przez fosfatazę jest w arunkiem niezbędnym do zm iany cję przestrzenną dla w yznaczenia m iejsca tw orzenia
typu w zrostu pączka. T ow arzyszy tem u rozproszenie następnego pączka w tej samej okolicy. W obec tego po
w szystkich składników białek biegunow ych w obrębie kilku pączkow aniach k o m ó rk a m acierzysta w ykazuje
całego pączka, a więc przejściowy zanik osiągniętej uprzyw ilejow aną strefę n a pow ierzchni drożdża w p o ­
uprzednio p olarności (Ryc. 2d). staci jak b y naszyjnika, bądź lokalnego skupienia kolej­
In ak ty w acja ko m pletu białek Clb 1/2 C ln/C dc28 nych pierścieni (Ryc. 3a).
(przez proteolizę cykliny) w trakcie fazy M (Ryc. 2e) Jeżeli jed n ak k o m ó rk a długo nie pączkuje (zostaje
wiąże się z po w tó rn ym zgrupow aniem aktyny i innych zgłodzona), albo w m iędzyczasie przeszła przez zap ło d ­
składników kom pleksu białek apikalnych w regionie nienie, w tedy zm ienia się reguła w yznaczania m iejsca
bruzdy cytokinetycznej. W tym miejscu tw orzą się następnego pączkow ania n a dw ubiegunow y typ pącz­
teraz dw a rów noległe pierścienie szyjki, jeden dla k ow ania (Ryc. 3b). P ączek tw orzy się n a biegunie
pączka, drugi dla kom ó rk i m acierzystej. W trakcie przeciw nym w stosunku do m iejsca poprzedniego
cytokinezy pierścienie te zo stan ą rozdzielone do k o ­ pączkow ania. O kazjonalnie także pow stają k o m ó rk i
m órek po to m n y ch w yznaczając miejsce skupienia
kom pleksu białek biegunow ych (Ryc. 2e i f).
a .ty p o s io w y b .ty p d w u b ieg u n o w y
O znacza to, że w trakcie pączkow ania pierw szym
etapem jest wyznaczenie pew nego specjalnego m iejsca
w któ ry m tw orzy się pączek, i gdzie w przyszłości
odbędzie się cytokineza, a więc wyznaczenie granicy
tylnej pączka. Z kolei w obrębie tego miejsca, zw anego
m iejscem szyjki (ang. neck filam ent site), w postaci
pierścienia podczepionego do błony kom órkow ej g ru ­
pują się zaró w n o białka biegunow e o charakterze
enzym ów ja k i spolim eryzow ane pew ne specyficzne dla
bruzdy podziałow ej białka cytoszkieletow e np. sep-
tyny (ang. septins), radyksyna (ang. radixin), obok
niespecyficznych białek szkieletow ych (np. aktyny).
W śro d k u tego pierścienia w yodrębnia się kom pleks
białek apikalnych (ang. bud site proteins) nie zw iąza­
nych z septynam i, ale z niespecyficznym i białkam i
szkieletowymi, k tó re zgrupują się n a rosnącym czubku
pączka. A więc kolejno tw orzą się dw a bieguny pączka,
z charakterystycznym i kom pletam i białek bieguno­
wych, przejściow o rozpraszanym i w trakcie wczesnej
m itozy i przem ieszczanym i i kondensow anym i p onow ­
nie z septynam i w trakcie cytokinezy [5-7].

III-2. Septyny drożdży mogą wyznaczyć miejsce

tworzenia kolejnego pączka

B iałka filam entu szyjki, w raz z wielocukrem o c h a ra­

kterze chityny łatw o zabarw ić barw nikiem zw anym
kalkofluorem . P o zw ala to n a w ybarw ienie pierścienia
n a pow ierzchni dro żdża interfazalnego, ja k o blizny, po
odbytej uprzednio cytokinezie po oddzieleniu pączka
(Ryc. 21). Jeżeli k o m ó rk a pączkow ała w ielokrotnie, Ryc. 3 D eterm inacja położenia miejsc tworzenia pączków S. cere-
visiae: a. typ osiowy, b. typ dwubiegunowy i metameryczny,
m ożna spraw dzić, czy istnieje określona praw idłow ość
i d. i e. porów nanie morfogenezy pączka i wyrostka koniuga-
przestrzenna w rozm ieszczeniu tych pierścieni. A więc cyjnego shmoo. Wg [1, i 45] uproszczone. O bjaśnienia
m ożna spraw dzić, czy kom plet białek szyjki jest infor­ w tekście.

230 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 o m etam erycznej sym etrii w yznaczania miejsc pącz­
kow an ia (Ryc. 3b, najniższy rząd). W obec tego przy p u ­
szcza się, że b iałk a pierścienia szyjki są źródłem
sygnału w yznaczającego miejsce pączkow ania (zapew ­
ne septyny są zw iązane z białkam i biegunowym i), ale
inform acja ta z czasem zanika (np. w trakcie głodzenia
po zap rzestan iu p ączkow ania b iałka biegunow e zo­
stają rozproszone), a po w tórne ich zgrupow anie o d ­
byw a się w raz z now o polim eryzow anym i septynam i
w najdalszym m iejscu w stosunku do „starego” pierś­
cienia (po procesie seksualnym ).
W yizolow ano szereg m u tan tó w procesu pączkow a­
nia grupy bud, („pączka”), czyli genów zw iązanych
z w yznaczaniem m iejsca pączkow ania u S. cerevisiae.
B iałka B U D nie m ają zasadniczego wpływu n a prze­
bieg sam ego pączkow ania. D otyczą wyłącznie in stru k ­
cji o miejscu tw orzenia pączka [1, 6, 7]. M u tan ty loci
bud 1-5 tw orzą pączki w dow olnym m iejscu ciała i bez
w zględu n a rozm ieszczenie poprzednich pieścieni szyj­
ki n a kom órce. B iałka B U D 1 i B U D 3 (a zapew ne i inne
b iałk a B U D ) g ro m ad zą się w pierścieniu szyjki w tra k ­
cie każdego p ączkow ania przyłączając b iałka recep­
torow e (RS1 i SPA2) [3, 6, 7], oraz białko kotw iczące
w postaci septyny AFR1 (neck filam ent protein) [8].
T en jeszcze słabo p o zn any kom pleks oddziaływ ują­
cych n a siebie białek m oże być źródłem sygnału
w k tó ry m uczestniczy p ro d u k t B U D 1. Sklonow anie
genu budl pozw oliło bow iem wyw nioskow ać, że jest to
gen kodujący G T P azę typu Ras. P ro d u k ty genów bud
2 i 5 są białkam i typu G E F (czynnik w ym iany nukleo-
tydu G D P n a G T P ) i G A P (aktyw ator G TPazy).
(GAP). A więc b iałk a biegunow e drożdży stanow ią
istotnie instrukcję topograficzną w w yznaczaniu m iejs­
ca pączk o w an ia i są regulow ane przez m echanizm
sygnalizacji z pośrednictw em pew nych typów białek
typu Ras [9].
III-3. Zewnętrzny bodziec może wywołać reorga­
nizację cytoszkiełetu i wyznaczyć miejsce
gromadzenia białek biegunowych
Z głodzone k o m ó rk i dw óch typów płciow ych wy­
dzielają do środow iska ferom ony (gam ony) oddziału­
jące n a receptory k o m ó rk i o przeciw nym typie płcio­
wym. W odpow iedzi n a gam ony, dwie kom órki ró ż­
nych typów płciow ych przypadkow o znajdujące się
blisko siebie zaczynają tw orzyć rosnące ku sobie
palczaste w yrostki (ang. shmoo). W ten sposób d o ­
chodzi do połączenia obu kom órek. Szczegółowe
b ad a n ia m orfologiczne i m olekularne w ykazały, że
w rosnących w yrostkach tw orzy się kom pleks białek
biegunow ych, a procesy m orfogenezy pączka i w yrost­
k a są bard zo p o d o b n e (porów naj Ryc. 3d i 3e).
O znacza to, że lokalizacja i tw orzenie kom pleksu
białek biegunow ych w yrostków stanow i rzeczywiście
odpow iedź n a sygnał (w tym przy p ad k u gam onu
sekretow anego przez k o m órkę odm iennej płci).
B adania genetyczne i m olekularne pozw oliły na
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
wykrycie drugiego zespołu m u tan tó w (innych niż
m u tan ty bud) zw iązanych z tw orzeniem kom pleksu
białek biegunow ych [3, 6, 10-13]. M utacje genów
cdc24, cdc42, cdc43, bem 1, bem 3 i kilku innych
charakteryzuje u tra ta zdolności do w ytw arzania pierś­
cienia inicjującego pow staw anie pączka (lub shmoo).
M utacje tych genów pow odują, że k o m ó rk a m acierzy­
sta w trakcie m itozy pow iększa rów nom iernie swoją
powierzchnię, a nie tw orzy zlokalizow anego m iejsca
w zrostu pączka. O becnie w ykryto, że w tych m u ta n ­
tach zachodzi ap o larn a sekrecja pęcherzyków nio są­
cych zapas błon, dezorganizacja cytoszkiełetu, nie
tw orzą się aktynow e kable, a b iałka norm alnie zlokali­
zow ane wyłącznie w rosnącym czubku (w stadium
G l/sD N A ), bądź też w szyjce (w stadiach M i G l) są
rozproszone n a całej pow ierzchni kom órki.
P o raz pierw szy m odel łączący procesy sygnalizacyj­
ne w trakcie pączkow ania drożdża z k o n tro lą m orfo­
genezy przedstaw ili C h a n t i H e r s k o w i t z [6]
(Ryc. 4). W szystkie zebrane dane z ostatnich czterech
lat pozw alają przypuszczać, że białko CDC42 jest
uniwersalną determinantą bieguna przedniego (apikał-
nego) komórki monopolarnej [12-17], C D C 42 jest
m ałym białkiem wiążącym G T P , o charakterze G T P a ­
zy sprzężonej z k o n tro lą przem ian w cytoszkielecie
[11] pod wpływem czynników w zrostu [2, 3, 16, 17].
Białko to m a charakterystyczny koniec karboksylow y
(typu CAAX), które ułatw ia m odyfikację tego za k o ń ­
czenia pod wpływem transferazy geranylgeranylow ej
z form y białka cytosolowej n a form ę zakotw iczoną
w błonie plazm atycznej. G T P a z a C D C 42 w drożdżach
grom adzi się w rosnącym czubku pączka w błonie
plazm atycznej; a zarów no podczepienie do błony
plazm atycznej, ja k i aktyw ność G T P azo w a są w aru n ­
kam i koniecznym i dla w ytw orzenia pączka. Inny p ro ­
d u k t tej grupy genów C D C 43 stanow i jed n o stk ę b eta
transferazy geranyl geranylowej. N ależy przypuszczać,
że działanie tego enzym u aktyw uje C D C 42 um oż­
liwiając m u trw ałe zakotw iczenie w błonie plazm atycz-
nej [10]. Z kolei C D C 24 działa n a C D C 42 aktyw ująco
poprzez wym ianę G D P n a G T P w C D C 42 (ang.
guanine nucleotide exchange factor — G EF). P o ró w ­
nanie sekwencji am inokw asów w ludzkim hom ologu
C D C 24 (zwanym D B L i oddziaływ ującym n a ludzki
hom olog białka CD C 42) z sekwencjam i C D C 24 d ro ż­
dży wykazuje w yraźną hom ologię jednej dom eny [14].
P ośrednio, n a podstaw ie b ad a ń genetycznych sugeruje
się, że w białku drożdżow ym C D C 24 istnieje jeszcze
inna dom ena wrażliwa n a G T P azę typu BU D 1. T o
tłum aczy funkcjonalny związek pom iędzy białkam i
B U D i białkam i polarnym i C D C 42, 43, 24, BEM 1
i BEM 3. G eny bem 1 i bem 3 k o dują b iałka regulujące
aktyw ność C D C 42 [7, 14]. P o n a d to białko BEM 1,
które jest niezbędne dla utrzym ania apikalnego w zros­
tu pączka, zaw iera dwie dom eny SH3 (a więc m a
cechy białka pośredniczącego w transdukcji sygnału).
W skład kom pletu białek biegunow ych czubka w cho­
dzą rów nież białka receptorow e RSR1 i SPA -2 nie-
231
 R S R 1 / B U D 1 = G T P B + S P A 2 •/ B U D 1
R S R 1 / SPA 2 / B U D 1 CDC 42
GTP a za
k a sk a d a
CDC 43 k in a z (?)
ger anyl /g er any 1 CDC 24
tr a n sfe r a za aktyw ator
BEM 1 = GAP w ym ian y
GDP n a GTP
R O Z P A D LU B T R A N S L O K A C JA
SK Ł A D N IK Ó W K OM PLETU
B IE G U N O W E G O
PO W ST A N IE N IE A K T Y W N E G O
K O M PLETU „SZ Y JK I”
NA M IE JSC U C Y T O K IN E Z Y
Ryc. 4 Schemat zmian w komplecie białek biegunowych w trakcie pączkow ania S. cerevisiae. Opis w tekście. Wg [3, 44].
zbędne dla u trzy m ania w zrostu polarnego. Z p rzy to ­
czonych tu taj danych w ynika schem at przem ian
w b iałkach biegunow ych niezbędnych dla realizacji
kolejnych stadiów pączkow ania [3] (Ryc. 4). Schem at
ten jest uproszczony i nie uw zględnia k o n tro li przez
działanie inh ib ito ró w aktyw acji R as lub R ho typu
G D I (ang. guanine nucleotide dissociation inhibitors)
w ygaszających m echanizm sygnalizacji [16]. P raw ­
d o p o d o b n ie w trakcie m orfogenezy drożdży istnieje
pew na hierarchiczna kolejność aktyw acji G T P az
B U D 1, C D C 42 i R ho 1-4 uczestniczących w selekcji
m iejsca pączkow ania, a więc w tw orzeniu pierścienia
szyjki [9, 13, 19, 20].
R ola C D C 42 w raz z kom pleksem białek nie ograni­
cza się do k o n tro li reorganizacji cytoszkieletu i wy­
znaczenia m iejsca pączkow ania we wczesnej fazie
cyklu. Rów nocześnie ze stym ulacją cyklu kom órkow e­
go i pow staw aniem pączka, odbyw a się aktyw acja
kinazy threoninow o-serynow ej należącej do grupy
M A P kinaz (uczestniczących w ścieżce aktyw acji
transkrypcji wczesnych genów w cyklu kom órkow ym )
[21]. W b ad an iach in vitro w ykazano, że C D C 42 jest
źródłem aktyw acji pew nych charakterystycznych dla
koniugacji kinaz białkow ych [15]. W ynik ten oznacza,
że CDC42 jako przekaźnik sygnałów feromonowych
spełnia jednocześnie potrójną rolę; wyznacznika miejsca
inicjacji reorganizacji cytoszkieletu, utrzymania polar-
ności wzrostu pączka i aktywatora ekspresji genów [22].
IV. Funkcje białek biegunowych w komór­
kach różnych typów
W p rzy p ad k u fibroblastów myszy aktyw acja G T P a-
232
http://rcin.org.pl
-► DETERM INACJA MIEJSCA
PĄCZKOWANIA
polim eryzacja
aktyn y i POCZĄTEK TW ORZENIA
lo k a ln y w zrost KOMPLETU
BIEGUNOWEGO
(?)
a k ty w a cja WZROST PĄCZKA
transkrypcji(?) NA DŁUGOŚĆ
► ’’ 9 RI C
S W l iL t i tri
C Y T O K IN E Z A
zy typu R ho prow adzi do w ytw orzenia kabli a k ­
tynow ych cytoszkieletu i do w ytw orzenia miejsc p rzy­
legania do p o dłoża (adhesionfoci), a aktyw acja C D C 42
do w ytw orzenia wiodącej cienkiej nibynóżki zwanej
filopodium . M ikroinjekcja białek R ho, R ac i C D C 42
do k o m ó rek spoczynkow ych stym ulow ała wyjście k o ­
m órek ze stadium G1 i rozpoczęcie sD N A . W trakcie
cytokinezy tych kom órek, białko — R ho jest przem ie­
szczane z cytosolu do bruzdy podziałow ej, a to w arzy­
szą tem u przem ieszczanie się aktyny i białek cyto-
szkieletow ych z grupy E R M (ezryny, radiksyny i m oe-
zyny). B iałka grupy E R M w ystępują, albo w cyto-
szkielecie przylg (regionów przylegania kom ó rek do
podłoża) w okresie interfazy, albo są w bruzdzie
w trakcie cytokinezy [3].
Istnieją rów nież pośrednie przesłanki, aby sądzić, że
niektóre białka kom pleksu białek biegunow ych o c h a­
rakterze septyn są przem ieszczane do bruzdy p o ­
działowej w trakcie cytokinezy i m ogą pełnić funkcję
zarów no przekaźnika w transdukcji sygnału ja k i oś­
ro d k a polim eryzacji innych białek cytoszkieletu.
W b ad an iach n ad podziałem drożdża Schizosac-
charomyces pombe w obrębie sekwencji nukleotydów
genu cdcl5 o charakterze septyny, znaleziono fragm ent
hom ologiczny wobec dom eny kodującej SH3, a także
dom eny charakterystycznej dla białek n a któ ry ch
m oże odbyw ać się polim eryzacja innych białek. B iałko
C D C 15 jest silnie ufosforylow aną fosfoproteiną w tr a ­
kcie całego cyklu, za w yjątkiem m itozy i tylko w tedy
staje się ośrodkiem kondensacji F -ak ty n y i p o śred ­
nikiem w podczepieniu cytoszkieletu do błony k o m ó r­
kowej. B iałko C D C 15 m oże być uniw ersalnym p o śred ­
nikiem w w yznaczaniu m iejsca bruzdy cytokinetycznej
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 poniew aż sekwencje hom ologiczne względem sekw en­
cji cdcl5 znaleziono w genom ie S. cerevisiae, przyw ry
i m yszy [23]. P o d o b n ie w trakcie tw orzenia blastoder-
m y w zaro d k u Drosophila melanogaster w ykryto, że
p ro d u k t praw idłow y genu veanut zw iązany z cyto-
kinezą w ykazuje znaczne podobieństw o do septyn
drożdży [24].
N ależy sobie rów nież zdaw ać spraw ę, że p odane
tutaj w iadom ości dotyczące podobieństw w składzie
i organizacji b ruzdy podziałow ej w k o m ó rk ach ró ż­
nych typów , nie dotyczą k o n tro li sprzężenia położenia
bruzdy podziałow ej z w yznaczaniem osi w rzeciona
m itotycznego. W iadom ości n a ten tem at są skąpe.
W iadom o, że w niektórych przy padkach sprzężenie osi
w rzeciona m itotycznego i p ro stopadłego położenia
bruzdy m oże być regulow ane przez interakcję jednego
z biegunów w rzeciona z białkam i biegunow ym i (Ryc.
3c) [25].
W fibroblastach myszy w ykryto specjalizację funkcji
poszczególnych G T P a z w przekazyw aniu bodźców
urucham iających now e transkrypcje [16]: wyłącznie
R as aktyw uje k askadę kinaz pobudzanych czynnikam i
w zrostu (Ryc. 1). N a to m iast białka R ac i C D C 42 (ale
nie Rho) stym ulow ały aktyw ację specyficznej kinazy
serynow o-treoninow ej fosforylującej czynnik trans-
krypcyjny c-Jun. F osforylacja ta w zm acnia tran sak -
tywację czynnika transkrypcyjnego AP-1 (tzn. k o o p e­
rujących c-Jun i c-Fos) niezbędnej dla wejścia kom órek
w podziały [17]. R ho i C D C 42 aktyw ow ały rów nież
kinazę serynow o-treoninow ą z m ózgu (neuronalną)
A ces ten jest dobrze poznany w p rzypadku oogenezy
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
[26]. P o d o b n ą specjalizację funkcji G T P az, Rac, R ho
i C D C 42 w ykazano w przebiegu odm iennych typów
reorganizacji aktyny [22].
B adania m olekularne dotyczące p ro d u k tó w genów
cdc42, rho, rac oraz odkrycie funkcjonalnych hom o-
logów tych p ro d u k tó w w genom ie ludzkim [27],
a także u ro b a k a Caenorhabditis elegans [28] i innych
m odelow ych k o m órkach ssaków pozw alają przypusz­
czać, że m echanizm uzyskania polarności przez k o m ó ­
rkę jest uniw ersalny i bardzo konserw atyw ny ew olu­
cyjnie. W zależności od bodźca i rodzaju kom órki,
białka biegunow e uczestniczą w urucham ianiu n o ­
wych transkrypcji, oraz różnych typów reorganizacji
cytoszkieletu. R eorganizacja cytoszkieletu m oże p ro ­
wadzić do w yznaczania k ierunku i stym ulacji ruchu
kom órki, w innych przypadkach do w ytw orzenia
miejsc przyczepu do podłoża i p raw dopodobnie do
(słabo jeszcze poznanej) koordynacji pow staw ania osi
w rzeciona i położenia bruzdy. B iałka polarne (septyny)
zw iązane są rów nież z w yznaczaniem miejsca i re­
organizacją cytoszkieletu w trakcie tw orzenia bruzdy
podziałow ej w stadium cytokinezy. K olejne pytanie
dotyczy roli białek biegunow ych w rozwoju.
V. Biegunowość jaja robaka Caenorhabditis
elegans i wyznaczanie położenia bruzd po­
działowych w embriogenezie
W trakcie oogenezy M etazoa, albo po zapłodnieniu,
bądź też po kilku podziałach b ru zdkow ania odbyw a
się determ inacja przestrzenna rozw oju zarodka. P ro ­
ro b a k a C. elegans. 70 m inut po zapłodnieniu oocytu
ro b ak a, filam enty aktynow e grom adzą się na przednim
końcu jaja, nato m iast pęcherzyki P (ang. P-granules)
grom adzą się w biegunie tylnym jaja. W trakcie
następnych 30 m in ją d ro ja ja (pronucleus żeński) zlewa
się z jąd re m plem nika (pronukleusem męskim). Jąd ro
zygoty przesuw a się do tylnego bieguna ja ja i zaczyna
tw orzyć w rzeciono m itotyczne w zdłuż osi przednio-
tylnej zygoty. Przesunięcie do tyłu w rzeciona m itotycz­
nego pow oduje, że b ruzda cytokinetyczna rozdziela
asym etrycznie większy przedni blastom er (nazywany
blastom erem AB) od tylnego m niejszego blastom eru
Ryc. 5 Schemat dwóch podziałów bruzdkow ania jaja robaka Cae­
norhabditis elegans. A i P — oś przednio-tylna jaja w trakcie
pierwszego podziału, a. drugi podział bruzdkow ania w nor­
malnym zarodku; z blastom eru AB tworzą się dwie komórki
ABa i ABp; w blastomerze P I zachodzi rotacja wrzeciona
mitotycznego i potom ne kom órki EMS i P2 uzyskują
prawidłową konfigurację (strzałka), b. rozmieszczenie ak­
tywnego produktu PAR1 przez interakcję z białkiem biegu­
nowym (homolog białka CDC42); c. obrót wrzeciona m ito­
tycznego w mutancie par 3 uniemożliwiający otrzymanie
prawidłowej konfiguracji blastomerów; występuje symet­
ryczny charakter miejsca przyczepu wrzecion (strzałka), d.
fenotypy m utantów par 1,2, 4, 5 o złej konfiguracji czterech
blastomerów związanej z brakiem rotacji wrzeciona m ito­
tycznego w blastomerze P I i brakiem miejsca podczepienia
wrzeciona do bruzdy A B/PI. Inne objaśnienia w tekście.
Rysunek kom binowany wg [28-30].
233
 P I (Ryc. 5). M igracja ją d ra do tyłu i orientacja
położenia bru zd w trakcie bruzdkow ania podlega
ko n tro li genetycznej kilkunastu p ro d u k tó w genów
typu par (ang. partition).
Sklonow anie genu par-1 w ykazało, że p ro d u k t tego
genu stanow i kinazę serynow o-treoninow ą rozm iesz­
czoną rów nom iernie w obrębie ja ja [29]. W trakcie
pierwszego podziału ja ja białko PAR1 przem ieszcza
się do tylnego blastom eru, a n a tylnym biegunie tej
k o m ó rk i pojaw ia się skupienie białka hom ologicznego
do CD C42. W drugim podziale bruzdkow ania, wyłącz­
nie w blastom erze P I w rzeciono m itotyczne podlega
rotacji o 90°, a położenie bruzdy w tym blastom erze
staje się p ro sto p ad łe w stosunku do osi jaja. R otacja
w rzeciona m itotycznego kończy się podczepieniem do
błony kom órkow ej jednego z biegunów w rzeciona
m itotycznego k o m ó rki P I w miejscu znajdującym się
n a bruzdzie podziałow ej (ang. cortical site) rozdzielają­
cej blastom ery AB i P I [30, 31] (Ryc. 5a). W tym
okresie, kin aza PAR1 jest aktyw ow ana przez G T P azę
C D C 42 i pow staje gradient tylno-przedni aktyw acji tej
kinazy (Ryc. 5b).
M u tan ty genu par 1 nie są zdolne do segregow ania
PAR-1 n a ko ń cu ciała, a także zanikają inne cechy
biegunow ości jaja. Inhibicja funkcji każdego z dw óch
enzym ów , zarów no kinazy PAR1 ja k i G T P azy
C D C 42 pow oduje w za ro d k u depolim eryzację zarów ­
no m ik ro tu b u li ja k i rusztow ania aktynow ego. W obec
tego takie zaro d k i nie są zdolne do przeprow adzenia
rotacji i podczepienia w rzeciona m itotycznego do
miejsca bruzdy podziałow ej pom iędzy blastom eram i
A B /P I. P ow staje w tedy zarodek złożony z czterech
ko m ó rek o niepraw idłow ej segregacji granul P i z a ro ­
dek ginie (Ryc. 5d) [29]. D ziałając inhibitoram i poli­
m eryzacji aktyny n a praw idłow e i norm alne genetycz­
nie ja ja uzyskano fenokopie takiego niepraw idłow ego
b ra k u rotacji w rzeciona w blastom erze P I [32].
Inne m u tan ty typu par pow odują rów nież niepraw i­
dłowe w yznaczanie położenia bruzd podziałow ych
w trakcie cytokinezy i wszystkie prow adzą do złego
w zajem nego położenia blastom erów i śmierci za ro d ­
ków (Ryc. 5d). N ieco inny ch a rak ter m a m utacja par 3.
O tó ż fenotypy m u ta n ta par 3 m ają dw a ośrodki
podczepiania w rzecion m itotycznych do bruzdy
A B /P I po obu stro n ach przegrody (Ryc. 5c; strzałka),
podczas gdy w zaro d k ach dzikich taki ośrodek na
przegrodzie jest tylko w blastom erze tylnym (porów naj
schem at Ryc. 5a i 5c). Z atem w fenotypach par 3 rotacji
podlegają o ba w rzeciona m itotyczne zarów no w blas­
tom erze AB ja k i P I. P row adzi to do niepraw idłow ego
ułożenia względem siebie blastom erów i b ra k u k o n ­
ta k tu ko m ó rk i P 2 z ABp (Ryc. 5c) i oczywiście zarodek
ginie.
Prawdopodobnie białko biegunowe CDC42 aktywuje
kinazę PAR1 wyznaczając gradient tylno-przedni ak­
tywacji jaja, a inne białka PAR uczestniczą w wy­
znaczaniu biegunowości zarodka niezbędnej dla prawid­
łowego rozwoju robaka [19, 29, 31, 32]. Jed n ak wyniki
234
http://rcin.org.pl
te, aczkolw iek im ponujące, dotyczą tylko em briogene-
zy jaj o rozw oju determ inacyjnym .
VI. Powstawanie osi w jaju Drosophila mela-
nogaster jako przejaw wzajemnego od­
działywania na siebie oocytu i komórek
folikularnych
W ja ju Drosophila melanogaster białka biegunow e
w ykryto w bruzdach podziałow ych w blastoderm al-
nych kom órkach, a więc w bardzo późnym stadium
b ru zdkow ania [24]. D eterm inacja osi ciała odbyw a się
wcześniej, w trakcie oogenezy, i jest pod k o n tro lą
som atycznych kom órek folikularnych otaczających
jajo. B adania wykazały, że pow stanie osi ciała jest
złożonym procesem kolejnych w zajem nych oddziały­
w ań pom iędzy jajem a otaczającą w arstw ą ko m órek
folikularnych. Te oddziaływ ania m ają ch arak ter pew ­
nej sekwencji w ysyłania sygnałów i odbieran ia ich,
a następnie reakcji n a sygnał w postaci reorganizacji
cytoszkieletu i pow staw ania now ych tran sk ry p tó w
zarów no w jaju, ja k i w poszczególnych ko m ó rk ach
folikularnych (m etaforycznie m ów iąc istnieje rozm ow a
pom iędzy oocytem , a k om órkam i folikularnym i).
A więc instrukcja stru k tu ra ln a w ja ju m uszki ow oco­
wej tw orzy się przez pierw otne zróżnicow ane po d ło ża
cytoplazm atycznego ja ja n a etapie poprzedzającym
pierw szy cykl m itotyczny przez kolejne interakcje ja ja
z poszczególnym i grupam i przylegających ko m órek
folikularnych.
D la w yznaczenia osi przednio-tylnej i grzbietow o-
brzusznej w oocycie D. melanogaster m a zasadnicze
znaczenie określone rozmieszczenie poszczególnych
rodzajów m R N A i białek wielu p ro d u k tó w genów
m atczynych. W czesne stadia tw orzenia polarności
oocytu k ontroluje kilka genów m atczynych, k tó re
podlegają translacji w trakcie oogenezy. m R N A bicoid
stanow i determ inantę przedniego końca osi przednio-
tylnej, a m R N A staufen, nanos, oskar i parę innych
determ inują tylny koniec osi. m R N A gurken i białko
G U R K E N determ inują grzbietow ą część osi grzbieto-
w o-brzusznej jaja, a następnie zarodka. U stalenie tych
osi w postaci gradientów skupienia tych m R N A i b ia­
łek w yznacza porządek przestrzenny losów poszczegó­
lnych części za ro d k a (szczegółowe om ów ienie S t.
J o h n s t o n & N i i s s l e i n - Y o l h a r d [33]*).
(W obrębie tych części za ro d k a odbyw a się pierw o tn a
i w tó rn a segm entacja, ale te późne etapy nie stanow ią
przedm iotu tego artykułu). B adania nad oogenezą
wykazały ja k w ażną rolę w tym procesie odgryw a
pierw otne funkcjonow anie cytoszkieletu, m igracja ją d ra
i różne form y k o n tak tu jaja z kom órkam i ościennymi.
A oto główne stadia tego złożonego procesu [34, 35]:
* W utrzymywaniu tego porządku biorą udział m.in. wy­
specjalizowane regulatory transkrypcyjne działające na po­
ziomie chromatyny, o których mówi artykuł na stronie 238
niniejszego numeru „Postępów Biochemii”.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 selekcja p r o -o o c y tu
komórki
odżyw cze
MTOC
postępujący rozwój 16 kom o—k kanały doprowadzające
w jajniku Drosophila m RNA i białka
do oocytu
Etapy rozwoju jaja O b j a ś n i e n i a : m p NA grzbietowej
* determ inanty GURKEN
»- mRNA bicoid
— mRNA determinanta
bieguna tylnego
jaja
Ryc. 6 Oogeneza Drosophila melanogaster. Według [34] uprosz­
czony, a. schemat selekcji oocytu i kom órek odżywczych, b.
schemat powstaw ania kanałów doprowadzających m RNA
do oocytu, c. schemat powstaw ania w owarioli coraz
bardziej zaawansowanych zespołów kom órek składających
się z kom órek odżywczych i oocytu otoczonego warstwą
komórek folikularnych, d. kolejne stadia rozwoju jaja
w zespole kom órek i stopniowe pojawianie się, strefowego
występowania determ inant w jaju. W późnym stadium
rozwoju po stronie grzbietowej osłonki jajowej pojawiają się
wyrostki (jeden przedstawiony na schemacie). Inne objaś­
nienia w tekście.
Jajn ik Drosophila sk łada się z 16 owarioli; w których
pow stają zespoły k o m órek otaczających jajo. W raz
z rozw ojem poszczególne zespoły kom órek tow arzy­
szące oogenezie są przesuw ane ku tyłowi ovarioli,
a w przedniej części p o w tarza się proces tw orzenia
now ego zespołu (Ryc. 6a). O ogeneza Drosophila ro z p o ­
czyna się asym etrycznym podziałem ko m ó rk i wyj­
ściowej n a proksym alnym k ońcu ow arioli n a p o to m n ą
k o m ó rk ę wyjściową i n a ko m ó rk ę zw aną cytoblastem .
C yto b last przechodzi przez kolejne cztery podziały
k tó ry m tow arzyszą niepełne cytokinezy (Ryc. 6a; M l-
M4). W rezultacie pow staje cysta 16 siostrzanych
ko m ó rek połączonych m iędzy sobą m ostam i cytoplaz-
m atycznym i zw anym i kanałam i. Dwie kom ó rk i w o b ­
rębie 16-tu są połączone z innym i najw iększą liczbą
k anałó w a je d n a z tych dw óch uprzyw ilejow anych
kom ó rek staje się oocytem . M echanizm tej d eter­
m inacji nie jest znany. T ak więc tylko je d n a k o m ó rk a
stanie się oocytem , a pozostałe 15 kom órek stanow ią
poliploidalne k o m ó rk i odżywcze (ang. nurse cells),
k tó re przekazują poprzez k anały m R N A i cytoplazm ę
do oocytu (Ryc. 6b). T a k a cysta jest otoczna w arstw ą
diploidalnych som atycznych kom órek folikularnych
i stanow i k o m o rę jajo w ą (ang. egg chamber) przesuw a­
n ą do części tylnej ow arioli (Ryc. 6c, Ryc. 7a). W ciągu
79 godzin, kolejne 13 stadiów rozw oju prow adzi do
pow stan ia dojrzałej k o m ó rk i jajow ej (Ryc. 6d). W raz
z przesuw aniem się k u tyłowi oocytu wszystkie kanały
p oczątkow o gwiaździście połączone m iędzy sobą stają
się w ydłużonym i k an ałam i z w iązkam i m ikrotubuli
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
skierow anym i ku centrosom ow i (ang. microtubule or­
ganization center, M T O C ) oocytu (Ryc. 7a).
Szczegółowe b ad a n ia w ykazały, że w stadiach 1-6
rozw oju, wiązki m ikrotubuli są dekorow ane dyneiną
i wobec tego cytoplazm a jest tra n sp o rto w an a aktyw nie
z kom órek odżywczych ku centrosom ow i oocytu.
W tym okresie ją d ro w raz z centrosom em znajduje się
w środku oocytu i tam napływ ają przede w szystkim
m R N A oskar, a także m R N A i białka S T A U F E N
i G U R K E N , a nieco później m R N A bicoid. M im o, że
nie m a jeszcze wyraźnej strefowości w jajo, białka
S T A U F E N i G U R K E N są w tylnej okolicy oocytu
[34, 35] (Ryc. 6d).
W yraźnie strefowe rozm ieszczenie poszczególnych
typów m R N A i białek pojaw ia się w 7 i 8 stadium
oogenezy i jest zw iązane ze zm ianą kierunku tra n sp o r­
tu cytoplazm y względem centrosom u. C entrosom
w raz z jąd re m przesuw a się ku tyłowi oocytu i wobec
tego najpóźniej tran sp o rto w an y m R N A bicoid zostaje
energicznie przesunięty do bieguna przedniego jaja,
a pozostałe p ro d u k ty do końca tylnego jaja. Szczegóło­
we b ad a n ia nad m u tan tam i tego procesu, i bad an ia
n ad rolą m ikrotubuli w polaryzow aniu się ja ja [34, 35]
zostały potw ierdzone wykryciem udziału kinezyny
a. Sygnał białka GURKEN b. Zmiana kierunku transportu
determinuje tylne komórki na mikrotubulach (strzałki),
folikularne. ostateczna segregacja
m RNA biegunów
Migracja na m ikrotu b u lac h (s trza łk i)
jaja.
materiału mRNA do jaja (w stępna segregacja).
sygnał białka
GURKEN
determinuje grzbietowe
kom órki folikularne
Wędrówka jądra (gruba strzałka)
ku grzbietowej stronie jaja.
Schemat powiększenia
fragm entu grzbietowego jaja.
B iałko GURKEN sekretow ane(—>)
odziaływuje ra receptory
TORPEDO! >—) powodując
determ inację grzbietowych
kom órek folikularnych.
Ryc. 7 Schemat podwójnego pojawiania się kolejno determinacji
kom órek folikularnych tylnych i grzbietowych przez sek-
retowanie białka G U R K E N w trakcie migracji ją d ra w jaju
Drosophila melanogaster.
a. determinacja tylnych kom órek folikularnych (pogrubione
obrysy komórek) w stadium 6-8 rozwoju, b. determinacja
grzbietowych komórek folikularnych (pogrubione obrysy
komórek) w stadium 8-10 rozwoju, c. schemat oddziaływa­
nia jaja w stadium 8-10 na przyległe kom órki folikularne
(system sygnałów G U R K E N i receptorów TORPEDO ).
W edług danych [40]. Inne objaśnienia w tekście.
235
 w tym tran sp o rcie k u peryferiom ja ja [36].
W tym okresie białko G U R K EN znajdujące się na
tylnym końcu oocytu jest wydzielane na zewnątrz jaja
jako białko sekrecyjne i zaczyna oddziaływać jako
bodziec na ościenne komórki folikularne. Odebranie
tego sygnału przez tylne komórki folikularne powoduje
ich określoną determinację jako tylne komórki folikula­
rne (Ryc. 7a; p o g rubione kom órki folikularne). Jak się
okazało białko G U R K E N jest analogiem czynnika
T G F alfa (ang. transformation growth factor a) i zawiera
pow tórzenia sekwencji charakterystycznych dla E G F .
G U R K E N uw alniane z tyłu oocytu oddziaływ uje
aktyw ująco n a białko receptora błonow ego (o ch a rak ­
terze T G F r) w przyległych k o m órkach folikularnych
[37, 38]. T o białko receptora kom órek folikularnych
jest kodow ane przez gen torpedo i przyłączenie sygnału
G U R K E N pow oduje uruchom ienie syntezy czynni­
ków transkrypcyjnych w ko m ó rk ach folikularnych
i w yznacza ich nieodw racalną determ inację (Ryc. 7c).
N ajbardziej jed n ak niezw ykłym odkryciem było
stwierdzenie, że genotyp i determinacja losu poszczegól­
nych komórek folikularnych oddziaływują zwrotnie na
polarność i losy jaja. O tó ż m u tan ty genu torpedo,
dotyczące przecież białek pojaw iających się wyłącznie
w k o m ó rk ach folikularnych, a nie w jaju, nie tworzyły
praw idłow ej osi przedniotylnej oocytu, a defektywny
zarodek obum ierał. T ran sp lan tacja dzikiego (norm al­
nego) ja ja do k o m o ry jajow ej m u ta n ta torpedo p ro w a­
dziła do śmierci zaro dka, podczas gdy zm utow ane jajo
torpedo im plantow ane do praw idłow ej kom ory jajow ej
z n o rm alnie zdeterm inow anym i k o m órkam i folikular-
nym i rozw ijało się praw idłow o pom im o m utacji. P o ­
dobne b ad a n ia wykazały, że m ała gru p a kom órek
folikularnych przednich kontroluje praw idłow ą lokali­
zację m R N A bicoid w ja ju Drosophila. Dalsze bad an ia
potw ierdziły, że determ inacja osi przedniotylnej ja ja
w ym aga aby zdeterm inow ane kom órki folikularne
przednie i tylne wydzieliły specyficzne białka sekrecyj­
ne oddziaływ ujące zw rotnie n a odpow iednie receptory
w przyległych częściach jaja. Procesy zw rotnego o d ­
działyw ania zdeterm inow anych kom órek folikular­
nych n a poszczególne części oocytu m ają istotnie
ch a rak ter o d b io ru sygnału kontrolującego praw id ­
łow ą po larn o ść jaja, bo np. p ro d u k t genu torso wcześ­
nie pojaw iający się n a pow ierzchni oocytu jest recep­
to ro w ą kinazą tyrozynow ą, a jej wczesna i praw idłow a
aktywacja w arunkuje prawidłowy rozwój zarodka [39].
W następnych stadiach rozw oju (8 do 10), ją d ro
oocytu przem ieszcza się w raz z przyległą cytoplazm ą
zaw ierająca białko G U R K E N z położenia tylnego
ku stronie grzbietowej oocytu (Ryc. 7a; gruba strzał­
ka). M echanizm tego przem ieszczania ją d ra nie jest
znany. W stad iu m 10 przem ieszczone ją d ro aktyw uje
pow tórnie sekrecję b iałka G U R K E N . Przyległa cyto-
p lazm a b o g ata w G U R K E N rozpoczyna sygnalizację
oddziaływ ując tym razem n a przyległe kom órki foliku­
larne grzbietow e (Ryc. 7b; pogrubione kom órki foliku­
larne). K o m ó rk i folikularne odbierają ten sygnał i sta­
236
http://rcin.org.pl
ją się ko m ó rk am i zdeterm inow anym i (grzbietowym i)
(Ryc. 7c). Ł atw o uchw ytnym przejaw em tej grzbieto­
wej determ inacji kom órek folikularnych jest ich zd o l­
ność do w ytw arzania charakterystycznego u k ształ­
tow ania chorionu (czyli osłonki jaja) w postaci w yrost­
ków (Ryc. 6d; ostatnie stadium rozwoju). T ak zd eter­
m inow ane grzbietow e kom órki folikularne oddziały­
w ują zw rotnie n a przyległą część ja ja rozpoczynając
serie kolejnych przem ian w w yniku czego pow staje
determ inacja osi grzbietow o-brzusznej jaja. T ak więc
obie osie jaja Drosophila: przednio-tylna i grzbietowo-
brzuszna powstają w wyniku dwukrotnego powtórzenia
sekrecji sygnału G U R K E N z oocytu, odbieranego przez
komórki folikularne, które po zdeterminowaniu ich
różnicowania oddziaływują zwrotnie na ten oocyt nada­
jąc mu określoną determinację okolic przedniej, tylnej
i grzbietowej [40].
VII. Wnioski i pytania
W szystkie przytoczone tu przykłady w skazują na
rolę procesów odbierania odpow iednich bodźców na
determ inację polarności ciała kom órek. W wielu p rzy ­
pad k ach udało się ju ż pow iązać rolę sygnałów z ze­
w nątrz z nieprzypadkow ą reorganizacją cytoszkieletu,
a naw et zbadać m echanizm transdukcji sygnału za
pośrednictw em białek typu Ras, Rac, R ho i C D C 42.
Istnieją pow ażne przesłanki aby sądzić, że odkryte
m echanizm y są uniw ersalnym i m echanizm am i tw orze­
nia instrukcji przestrzennej w różnicow aniu i em ­
briogenezie. Jest znaczny postęp w bad an iach doty czą­
cych organizacji i funkcjonow ania bruzdy cytokinety-
cznej i septyn [41]. N iezwykle istotne są rów nież
b ad a n ia n ad wpływem sygnałów n a urucham ianie
i przełączanie jednego szlaku m orfogenezy (np. p o ­
działowej), na inny typ m orfogenezy (np. pod wpływem
gam onu) [42, 43].
Jak d o tąd b rak jed n ak w iadom ości o udziale białek
polarnych we wczesnej em briogenezie Drosophila*,
i kręgowców. N a d al nieznany jest m echanizm reg u lu ­
jący instrukcję przestrzenną dotyczącą m igracji aktyny
w cyklu kom órkow ym i w yznaczania osi w rzeciona
m itotycznego. N ieznane są m echanizm y wczesnych
etapów tw orzenia się pierw otnej organizacji cytoszkie­
letu jaj i m igracji stru k tu r w ew nątrz kom ó rk i np.
przesuw ania się ją d ra ja ja Drosophila niezbędnego dla
praw idłow ej determ inacji osi ciała. Słabo poznan y jest
m echanizm regulacji kolejności (tzw. zegara) przem ian
cytoplazm atycznych w em briogenezie i różnicow aniu.
W tej chwili b adane są m echanizm y zw rotnych o d ­
działyw ań kom órek różnych typów n a przebieg ich
różnicow ania i uzyskania polarności. O dkrycie w łaś­
nie tych m echanizm ów jest obecnym wyzwaniem; nic
dziwnego, że właśnie tym i procesam i zajm ują się
* Właśnie ukazała się publikacja na ten temat: M u r p h y
AM , M o n t e l l D J (1996) J Celi Biol 133: 617-630
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 obecnie ubiegłoroczny noblista D r W i e s c h a u s
[44] i niem niej słynny D r N u r s e [45,46] — odkryw ­
ca uniwersalnej roli cyklin w sterow aniu cyklem k o ­
m órkow ym .
Koszty artykułu są finansowane z grantu KBN
Nr 6P04C 07110.
A rtyku ł otrzym ano 16 stycznia 1996 r.
Zaakceptow ano do druku 17 maja 1996 r.
Piśmiennictwo
1. C h e n e v e r t J (1994) M ol Biol Celi 5: 1169-1175
2. H a l l A (1990) Science 249: 635-640
3. T a k a i Y, S a s a k i T, T a n a k a K, N a k a s h i n i H (1995)
Trends Biol Sei 20: 227-231
4. R a p p a p o r t R (1961) J Exp Zool 148:81-89
5. L e w D, R e e d SI (1995) Curr Op Genetics Dev 5: 17-23
6. C h a n t J, H e r s k o w i t z I (1991) Cell 65: 1203-1212
7. C h a n t J, C o r r a d o K, P r i n g l e J R, H e r s k o w i t z
I (1991) Cell 65: 1213-1224
8. K o n o p k a J B, D e M a t t e i C, D a v i s C (1995) M ol Cell
Biol 15: 723-730
9. C h a n t J, S t o w e r s L (1995) Cell 81: 1-4
10. A d a m s AE, J o h n s o n DI , L o n g n e c k e r R W, S l o a t
BF, P r i n g l e J R (1990) J Cell Biol 111: 131-142.
11. J o h n s o n D, P r i n g l e J (1990) J Cell Biol 111: 143-152
12. Z i m a n M, P r e u s s D, M u l h o l l a n d J, O ’ B r i e n J M,
B o t s t e i n D, J o h n s o n D I (1993) M ol Biol Cell 4: 1307-
1316
13. M i l l e r PJ , J o h n s o n D I (1994) M ol Cell Biol 14: 1075-
1083
14. Z h e n g Y, C e r i o n e R, B e n d e r A (1994) J Biol Chem 269:
2369-2372
15. S i m o n M - N , D e V i r g i l i o C, S o u z a B, P r i n g l e J R,
A b o A, R e e d S I (1995) Nature (Lond) 376: 702-705
16. R i e d l e y A J (1994) J Cell Sei, Suppl 18: 127-131
17. O l s o n M F , A s h w o r t h A, H a l l A (1995) Science 269:
1270-1272
18. R o n D , Z a n i n i M , L e w i s M, W i c k n e r R B , H u n t LT,
G r a z i a G, T r o n i c k SR, A a r o n s o n S A, E v a A (1991)
New Biol 3: 372-379
19. G l o t z e r M, H y m a n A (1995) Curr Biol 5: 1102-1105
20. C h e n e v e r t J, V a l t z N, H e r s k o w i t z I (1994) Genetics
136: 1287-1297
21. M a z z o n i C , Z a r c o v P , R a m b o u r g A , M a n n C (1993)
J Cell Biol 123: 1821-1832
22. Z i g m o n d S H (1996) Curr Op Cell Biol 8: 66-78
23. F r a n k h a u s e r C, R e y m o n d A, C e r u t t i L, U t z i g S,
H o f m a n n K, S i m a n i s V (1995) Cell 82: 435-444
24. N e u f e l d T P , R u b i n G M (1994) Cell IT. 371-379
25. M u h u a I, K a r p o v a TS, C o o p e r J A (1994) Cell 78:
669-679
26. M a n s e r E, L e u n g T, S a l i h u d d i n H, Z h a o Z, L i m
L (1994) Nature (Lond) 367: 40-43
27. S h i n j o K, K o l a n d J G, H a r t MJ , N a r a s h i m a h a n
V, J o h n s o n D I, E v a n s T, C e r i o n e R A (1990) Proc N atl
Acad Sei USA 87: 9853-9857
28. K a y n e PS, S t e r n b e r g P W (1995) Curr Op Genetics Dev 5:
38-43
29. G u o S, K e m p h u e s K J (1995) Cell 81: 611-620
30. S t r o m e S (1993) Cell 72: 3-6
31. P r i e s s J R (1994) Curr Op Genetics Dev 4: 563-568
32. A l l e n VW, K r o p f D L (1992) Development 115: 873-883
33. St. J o h n s t o n D, N u s s l e i n - V o l h a r d C (1992) Cell 68:
201-219
34. T h e u r k a u f W E (1994) Dev Biol 165: 352-360
35. S u l l i v a n W, T h e u r k a u f W E (1995) Curr Op Cell Biol 7:
18-22
36. C l a r k I, G i n i g e r E, R u c h o l a - B a k e r H, J a n LY,
J a n N Y (1994) Curr Biol 4: 289-300
37. N e u m a n n - S i l b e r b e r g FS, S c h u p b a c h T (1993)
Cell 75: 165-174
38. C l i f f o r d R C , S c h u p b a c h T (1989) Genetics 123: 771-787
39. D u f f y JB, P e r r i m o n N (1994) Dev Biol 166: 380-395
40. G o n z a l e s - R e y e s A, E l l i o t t H, St. J o h n s t o n
D (1995) Nature (Lond) 375: 654-658
41. C h a n t J , (1996) Cell 84: 187-190
42. H e r s k o w i t z I (1995) Cell 80: 187-197
43. K r ö n S J, G o w N A R (1995) Curr Op Cell Biol 7: 845-855
44. S c h e i t e r E D, W i e s c h a u s E (1993) Annu Rev Cell Biol 9:
67-99
45. S n e l l V, N u r s e P (1994) E M BO J 13: 2066-2074
46. C h a n g F. W o o l l a r d A, N u r s e P (1996) J Cell Sei 109:
131-142

Uprzejm ie zaw iadam iam y PT Koleżanki i PT Kolegów

o przeniesieniu siedziby Zarządu G łów nego
Polskiego T ow arzystw a Biochemicznego
na teren Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M . Nenckiego
pokój 632 i 633
Obecny adres:

Polskie T o w arzystw o Biochemiczne

ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a
Tel. bezpośredni 658 2099
Tel. przez centralę 65985 71 w . 352
Fax 22 5342

Dyżury biura Zarządu odbyw ać się będą jak dotychczas

w e w to rk i w godz 12-18

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 237

http://rcin.org.pl
Rola kompleksów chromatynowych w regulacji ekspresji
genów podczas rozwoju
Chromatin complexes in regulation of gene expression during
development
T O M A S Z T. C A L I K O W S K I *
Spis treści:
I. Wprowadzenie
II. Drosophila melanogaster — organizm modelowy do
badań nad rozwojem
III. Grupa genów Polycomb (Pc-G) — represory ekspresji
genów
III-I. Modele działania Pc-G
IV. Grupa genów trithorax (trx-G) i mechanizmy ich działa­
nia
V. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: ANT-C — kompleks genów
homeotycznych Antennapedia; BX-C — kompleks genów
homeotycznych Bithorax; Ubx — gen homeotyczny Ultra-
bithorax; hb — gen segmentacji hunchback; Pc-G — grupa
genów Polycomb z Drosophila; trx-G — grupa genów trit-
horax z Drosophila.
I. Wstęp
Rozwój organizm u w ielokom órkow ego możliwy
jest dzięki istnieniu system u regulacyjnego, kierujące­
go ekspresją genów w poszczególnych polach m orfo-
genetycznych zaro dka. E kspresja genów u Eukariota
zależy od dostępności m atrycy D N A dla polim erazy
R N A i czynników transkrypcyjnych. D N A w kom órce
eukariotycznej up akow any jest w złożone kom pleksy
n u kleoproteinow e — chrom atynę. P odstaw ow ą je d ­
n o stk ą ch ro m aty n y są nukleosom y zbudow ane z b ia­
łek histonow ych i ow iniętego w okół nich D N A [32].
S tru k tu ra chro m atyny wpływ a w istotny sposób na
dostępność D N A d la czynników regulacyjnych. N ie­
k tó re geny (tak zw ane geny milczące, ang. silent genes),
p o zo stają nieaktyw ne m im o obecności w kom órce
białek p o trzebnych do ich transkrypcji. G eny te po zo ­
stają w stanie zablokow anym rów nież po przejściu
k o m ó rk i przez m itozę. Tego rodzaju efekty przypisuje
się często tw orzeniu specyficznych stru k tu r ch ro m aty ­
nowych. B lokow anie ekspresji genów m oże w ynikać
nie tylko z w ystępow ania kom pleksów nukleosom ów
w określonej pozycji (zwykle po p ro m o to rac h genów
* Mgr, Pracownia Biologii Molekularnej Roślin, Instytut
Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106
Warszawa
238
http://rcin.org.pl
Contents:
I. Introduction
II. Drosophila melanogaster — a model for studying develop­
ment
III. The Polycomb gene group (Pc-G) — the repressors of
gene expression
III-l. The models of Pc-G’s action
IV. The trithorax gene group (trx-G) and its mode of action
V. Conclusions
[33, 34]), ale rów nież z tw orzenia kom pleksów c h ro ­
m atynow ych wyższego rzędu. C hodzi tu w szczególno­
ści o kondensację chrom atyny prow adzącą do utw orze­
nia nieaktywnej transkrypcyjnie heterochrom atyny.
P odczas rozw oju, w sterow aniu aktyw nością za
p o m ocą stru k tu r chrom atynow ych b io rą udział dw a
złożone system y regulatorow e — represyjnie d ziałają­
ca g ru p a genów Polycomb {Pc-G) i ak tyw ato ro w a
g ru p a genów trithorax (trx-G ). G eny Pc-G b io rą udział
w tw orzeniu stru k tu r silnie skondensow anej nieaktyw ­
nej transkrypcyjnie heterochrom atyny w rejonach
D N A zaw ierającego geny, k tó re m ają ulec trw ałem u
wyłączeniu. G eny trx-G przeciw działają tej represji
rozluźniając chrom atynę i czyniąc ją bardziej d o stęp n ą
dla czynników aktyw atorow ych [3-5]. P ro d u k ty obu
grup genów zaangażow ane są rów nież w wiele p o z o r­
nie nie zw iązanych ze sobą zjaw isk takich ja k w ygasza­
nie ekspresji genów (silencing) u drożdży [52], k o n tro la
genów rozwojowych u Drosophila i myszy a także po­
wstawanie niektórych białaczek u człowieka [36, 39, 40].
II. Drosophila melanogaster — organizm mo­
delowy do badań nad rozwojem
W iele czynników zidentyfikow anych u Drosophila
bierze udział w kształtow aniu podstaw ow ego p lan u
ciała ju ż w b ardzo wczesnych etapach rozw oju [2].
G eny zw iązane z rozw ojem u Drosophila podzielić
m ożna n a trzy klasy: geny m ateczne, geny segm entacji
i geny hom eotyczne. R óżnią się one organizacją m ole­
k u larn ą, sposobem działania i funkcją. I tak geny
m ateczne (około 30) działają ja k o pierwsze podczas
oogenezy określając główne osie jaja. G eny te o d ­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 p ow iad ają za w ykształcenie gradientów w zdłuż osi
przód-tył i g ó ra-d ó ł zarodka, a tym sam ym za wy­
tw orzenie w stępnych w zorów rozw oju. D ziałanie ich
rozpoczyna się jeszcze przed zapłodnieniem . P rzed ­
staw icielam i genów m atecznych są bicoid, nanos i Toll
[1, 2, 6]. W kolejnym etapie rozw oju k askadow a
ekspresja genów segm entacji (około 25) dzieli zygotę
n a typow y u m uch szereg pow tarzających się segm en­
tów. G eny segm entacji ulegają ekspresji po zap ło d ­
nieniu jaja, zaś ich m utacje w pływ ają n a liczbę lub
orientację segm entów zarodka. Przedstaw icielam i tej
grupy są geny hunchback, even skipped i hedgehog.
O statn im typem genów rozw ojow ych są geny hom eo-
tyczne działające wzdłuż osi przód-tył. D o starczają
one segm entom , za po m ocą specyficznej kom binacji
p rod u k tó w , inform ację niezbędną do w ytw orzenia
stru k tu r i p rzy d atk ó w charakterystycznych dla seg­
m entów . G eny hom eotyczne k o n tro lu ją tożsam ość
i położenie segm entów , lecz nie w pływ ają n a ich liczbę,
orientację lub wielkość. M utacje w obrębie tych genów
prow ad zą do przekształcenia jednej części ciała w inną.
I tak n a p rzykład p o tró jn a m utacja w genach hom eo-
tycznych abx, bx i pbx prow adzi do przekształcenia
segm entu T3A (zaw ierającego przedzm ianki czyli zre­
dukow ane skrzydła) w tk an k ę typow ą dla segm entu T2
(niosącego skrzydła). W rezultacie pow staje m ucha
z dw iem a param i skrzydeł zam iast ja k zwykle z jed n ą
[1, 2, 7]. G eny hom eotyczne zgrupow ane są w dw a
b ard zo duże kom pleksy genow e liczące 300— 350 kb
(tysięcy p a r zasad) każdy: kom pleks genów Anten-
napedia (ANT-C), ulegający ekspresji w przedniej
(tułowiowej) części za ro d k a oraz kom pleks Bithorax
(BX-C) zw iązany z rozw ojem segm entów odw łoko­
wych. W rozw ój Drosophila zaangażow anych jest
8 genów hom eotycznych, z czego 5 występuje w k o m ­
pleksie A N T -C (między innym i geny Antennapedia
i Deformed), a 3 w kom pleksie BX-C (geny Ultrabit-
horax, Abdom inal-A i Abdom inal-B). P o d o b n ie zo r­
ganizow ane kom pleksy genów hom eotycznych wy­
stępują rów nież u kręgow ców , w tym u myszy i czło­
w ieka [45]. E kspresja genów hom eotycznych jest
konieczna nie tylko do przejścia kom órek w stan
zróżnicow any, ale rów nież — w przeciwieństwie do
wczesnych genów m atecznych i segm entacji — do
po d trzy m an ia zróżnicow anego stan u kom órki. D late­
go też geny hom eotyczne są głów nym i regulatoram i
rozw oju. W szystkie czynniki działające n a wczesnych
etap ach rozw oju (geny m ateczne, segm entacji i h o m eo­
tyczne, a także ich p ro d u kty) m ają ściśle ograniczony
czas działania. N a p rzykład p ro d u k t genu segm entacji
hunchback (hb) działa ja k o represor hom eotycznego
genu Ultrabithorax (U b x) przez około cztery godziny
em briogenezy ograniczając ekspresję U bx w przedniej
części zaro d k a (granicą ekspresji U bx jest parasegm ent
5) [10]. M im o k rótkiego okresu działania hb og ran i­
czona ekspresja genu U bx jest zachow ana podczas
dalszych etap ó w rozw oju. Decyzje rozw ojow e będące
konsekw encją aktyw ności pierw otnych regulatorów
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
m uszą być zatem podtrzym ane przez osobny m echa­
nizm zw any „pam ięcią k o m ó rk o w ą”. T ak a działająca
na dużą odległość i przez długi czas regulacja o p arta
jest u Drosophila na kontroli kondensacji chrom atyny
przez duże kom pleksy białkow e, aktyw ujące lub re-
prym ujące długie regiony chrom osom ow e. W ażną
cechą „pam ięci kom órkow ej” jest zdolność do ro zp o ­
znaw ania aktyw nego lub nieaktyw nego stanu ekspresji
genów i do jego utrzym ania przez wiele podziałów
kom órkow ych. W przeciwieństwie do wczesnych regu­
latorów rozw oju, składniki takiej „pam ięci” w ystępują
powszechnie we wszystkich kom órkach.
III. Grupa genów Polycomb (Pc-G) —
represory ekspresji genów
G eny Pc-G zostały zidentyfikow ane ja k o represory
genów hom eotycznych. M utacje w poszczególnych
genach tej grupy prow adzą do transform acji przypo­
m inających transform acje wyw ołane m utacjam i w sa­
m ych genach hom eotycznych [1] ja k n a przykład
pojaw ienie się nóg pierwszej pary w miejscu nóg
drugiej i trzeciej pary. D o tej pory p oznano kilkanaście
(11-15) genów tej grupy, z których najlepiej zbadane
zostały geny Polycomb (Pc) [1, 11], extra sex combs
(esc) [12], Additional sex combs (Asx), Posterior sex
combs (Psc), Sex comb on midleg (Scm ) [14], P oly comb­
like (Pci), Super sex combs (Sxc) [15], polyhomeotic (ph)
[16], Sex combs extra (See) [17], Enhancer o f zeste
(E(z)) [1 8 ,1 9 ] (Tab. 1). Liczbę genów tej grupy szacuje
się n a około 30-40 [8]. G eny grupy Pc-G są niezbędne
do represji genów kontrolujących tożsam ość segm en­
tów (genów hom eotycznych) A N T -C i BX-C w ciągu
rozwoju. Z aobserw ow ano, że w zaro d k ach niosących
m utację w genach Pc-G wczesny w zór ekspresji genów
hom eotycznych jest identyczny ja k w zaro d k ach „dzi­
kich”, nie m ających m utacji w genach Pc-G. W ten
sposób w ykazano, że Pc-G nie są zaangażow ane
w w ytw orzenie w zorca ekspresji genów hom eotycz­
nych, ale raczej w jego podtrzym anie [20]. Z tego
pow odu geny Pc-G uw aża się za kluczow e elem enty
system u pam ięci kom órkow ej. Z ak ład a się, że p ro d u k ­
ty Pc-G m ogłyby rozpoznaw ać nieaktyw ny stan k o n ­
kretnego genu hom eotycznego, będący rezultatem
działania wczesnych genów rozw ojow ych, a następnie
utrzym yw ałyby ten stan w stabilny i dziedziczny
sposób przez wiele podziałów kom órki podczas ro z­
woju. Elem entem kierującym kom pleks białek Pc-G do
właściwej sekwencji D N A m oże być represor wiążący
się tylko przejściowo do celu (na przykład wczesny
czynnik transkrypcyjny zw iązany z DNA). P raw d o p o ­
dobnym kandydatem do takiej funkcji m oże być
p ro d u k t genu hunchback (hb) [42], Stw ierdzono, że
geny Pc-G k o n tro lu ją nie tylko geny hom eotyczne, ale
rów nież znaczną liczbę innych genów (będących często
regulatoram i procesów rozw ojow ych) prow adząc do
ich inaktyw acji [8, 21]. U stalono n a przykład, że jeden
z genów Pc-G, E(z), jest niezbędny do utrzym ania
239
 stabilnej represji dw óch genów segm entacji, które są
przejściow o blokow ane przez cząsteczki b iałka hb
— knirps i griant. W ykazano, że fragm ent regionu
regulacyjnego knirps (1.8 kb) zaw ierający liczne miejsca
w iązania d la hb w ykazuje praw idłow y w zór ekspresji
genu reporterow ego (podłączonego w opisyw anym
dośw iadczeniu do tego regionu) tylko w obecności
E(z), co świadczy o wspólnej sekwencji docelowej dla
wczesnego rep reso ra hb o raz dla kom pleksu Pc-G [41].
D o tej p o ry scharakteryzow ano n a poziom ie m oleku­
larnym trzy geny grupy Pc-G. Polycomb (PC) jest
m ałym genem (4 kb) kodującym białko jąd ro w e o d łu ­
gości 390 am inokw asów (44 kD a) [22]. Z arów no sam
tran sk ry p t ja k i białko rozm ieszczone są rów nom iernie
we wszystkich tk an k ach , chociaż najwięcej białka Pc
stw ierdza się w takich silnie proliferujących tk an k ach
ja k ośrodkow y u kład nerwowy, dyski im aginalne
i k o m ó rk i h o dow ane in vitro [23, 27]. Białko Pc
zaw iera konserw ow any ew olucyjnie m otyw — chro-
m odom enę, złożony z 48 am inokw asów i położony
blisko N -k o ń c a cząsteczki. M otyw ten w ystępuje m ię­
dzy innym i w b iałk u H P1 (białko zw iązane z hetero-
ch ro m aty n ą Drosophila melanogaster) [25] ja k rów nież
w białkach M31 i M 32 myszy oraz w m ysim białku
C H D -1 zdolnym do w iązania D N A . M im o tych zw iąz­
ków z ch ro m aty n ą nie w ykryto ani w iązania białka Pc
do D N A in vitro, ani też nie w ykazano istnienia w tym
b iałku znanych m otyw ów wiążących się z D N A .
Świadczy to o działaniu Pc poprzez dodatkow e czyn­
niki. B iałka Pc, polyhomeotic (ph) i Posterior sex combs
(Psc) a także białko Polycomb-like (Pel) w iążą się
w około 80-100 różnych, lecz niem al w spólnych dla
tych czterech białek, m iejscach n a chrom osom ach
Tabela 1.
Sklonowane geny z grupy Polycomb i ich produkty [3].
Gen M asa cząsteczkowa
Polycomb (Pc) 44 kD a
polyhomeotic (ph) 169 kD a
Posterior sex 170 kD a
combs (psc)
Polycomb-like (Pcl) 95 kD a
Enhancer o f zeste 87 kD a
E(z)
Suppressor o f zeste 144 kD a
2 (S«[z]2)
extra sex combs 48 kD a
(esc)
C hrom odom ena Pc jest niezbędna do działania białka [27], natom iast domeny typu palców cynkowych w białkach ph
i E(z) i palców R IN G (Psc, Su(z)2) nie są nieodzowne do funkcjonowania tych białek [26, 28].
240
http://rcin.org.pl
politenicznych, przy czym białko Pcl wiąże się do
chrom osom ów sam odzielnie jeszcze w innych m iejs­
cach. W yniki takie uzyskano za pom ocą przeciwciał
skierow anych przeciw ko tym białkom [23, 24]. Białko
polyhomeotic (ph) zostało dobrze poznane pod wzglę­
dem m olekularnym ; ph jest dużym białkiem (168 kD a)
[24], zaw ierającym m otyw pojedynczego palca cyn­
kowego, co sugeruje zdolność w iązania do D N A .
R ów nież białko Posterior sex combs (170 kD a) zaw iera
region bogaty w cysteiny zdolny teoretycznie do
tw orzenia palców cynkow ych i do w iązania D N A [26].
B iałko Psc występuje w 75% miejsc ch ro m o so m o ­
wych, w których w iążą się białka Pc i ph [29]. W spólna
im m unoprecypitacja białek tej grupy w skazuje, że
Pc-G działają w dużych m ultim erycznych k o m p lek ­
sach zaw ierających co najm niej 10 składników [4].
B ezpośredni dow ód n a związek białek represyjnych ze
stru k tu rą chrom atyny pochodzi z b ad a ń n ad Enhancer
ofzeste (E(z)), jedynym przedstaw icielu grupy Pc-G, dla
którego opisano term ow rażliw ą m utację [29]. In ak -
tyw acja białka E(z) poprzez podniesienie tem p eratu ry
hodow li larw Drosophila do w artości nieperm isywnej
(zm iana z 23°C do 29°C) pow odow ała ogólną dekon-
densację (rozluźnienie struktury) chrom osom ów p o li­
tenicznych. B rak p ro d u k tu E(z) pow odow ał dysrupcję
kom pleksu Pc-G i odłączenie białek Psc, ph i Pc od
genów docelow ych. W yniki te św iadczą o wpływie jak i
m ultim eryczne b iałka Pc-G w yw ierają n a wyższy p o ­
ziom organizacji chrom atyny — usunięcie jednego
tylko białka tej grupy prow adzi do w idocznych cy to ­
logicznie zm ian organizacji chrom atyny.
P o d o b n ie interesujące są wyniki b ad a ń n ad ssaczym
hom ologiem genów Psc i Su(z)2 — m ysim genem bmi-1
Znane motywy
Homologi
białkowe
chrom odom ena Su(var) 2-5
(Drosophila)
M33 (mysz)
palec cynkowy rae 28 (mysz)
palec R IN G BM I-1 (mysz/
człowiek)
m ell8 (mysz)
nieznane —
dom ena trx, palec trx, Su(var) 2-9,
cynkowy ssacze
palec R IN G BMI-1 (mysz/
człowiek
powtórzenia W D TUP-1 (drożdże)
(oddziaływania i ssacze
białko-białko)
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
(znany jest rów nież ludzki hom olog tego genu [37]).
G en ten jest zaangażow any w pow staw anie białaczek
k o m ó rek B i T [35, 36], zaś jego b ra k u myszy b m il
prow adzi do przekształcenia przednich części szkieletu
osiowego w stru k tu ry tylnych kręgów [37]. N adeksp-
resja bmi-1 u zw ierząt tram genicznych ujaw nia prze­
ciwny fenotyp: tym razem dochodzi do przesunięcia
ekspresji licznych genów hom eotycznych (w tym genu
H oxc-5 ) ku tyłowi ciała i szeregu deform acji ro z­
wojowych. D eform acje te, to m iędzy innym i przem ie­
szczenie w yrostka ościstego (processus spinosus) z d ru ­
giego kręgu piersiow ego n a trzeci (zm iana tożsam ości
kręgu z T3 n a T2), wydłużenie i pogrubienie żeber L I
i zlanie się łuków neuro n alnych n a kręgach szyjnych
C l i C2 [38]. R epresja genów H o x przez gen bmi-1
przyp o m in a zatem funkcję genów Psc i Su(z)2 w sto ­
sunku do genów hom eotycznych Drosophila. N a to ­
m iast p ro d u k t drożdżow ego hom ologu genu extra sex
combs (esc), Tup-1, choć nie jest zdolny do bezpośred­
niego w iązania się z D N A , jest w stanie tw orzyć duże
m ultim eryczne kom pleksy zdolne do stabilizow ania
nukleosom ów w długich szeregach, co pow oduje re­ n ić c h r o m a t y n y /\ a k ty w a to r
presję tran sk ry p cy jn ą [43]. Jest więc możliwe, że
po d o b n e zjaw isko zachodzi rów nież podczas regulacji
o k o m p l e k s P c -G enhancer
e l e m e n t o d p o w ie d z i
O in h ib icja
genów hom eotycznych.
. n a P c -G ___________
Ryc. 1 Dwa modele działania Pc-G na chrom atynę [21]
I I I-l. M odele działania genów grupy Pc-G

Z ap ro p o n o w an o dw a m ożliwe m echanizm y inak-
tyw acji ekspresji genów przez białka Pc-G. Pierwszy
polega n a organizacji nici chrom atynow ej przez b iałka
Pc-G w stru k tu ry wyższego rzędu (Ryc. la) [21]. D N A
zaw ierałby m iejsca reagujące n a białka Pc-G (elem enty
odpow iedzi — ang. Pc-G response elements, P R E s), od
któreg o rozpoczynałoby się pakow anie chrom atyny
w stru k tu ry wyższego rzędu. W ew nątrz takiego k o m ­
pleksu m ogłyby zostać u k ryte enhancery, niedostępne
w ten sposób dla aktyw ujących czynników transkryp-
cyjnych. D rugi m echanizm to tw orzenie przez k o m ­
pleksy Pc-G przedziałów w ew nątrzjądrow ych (Ryc.
Ib), w k tó ry ch elem enty odpow iedzi (PR E) służą ja k o
p u n k ty zaczepienia ch ro m atyny do białek Pc-G. Im
więcej D N A zaw iera tak i kom pleks, tym m ocniejsza
jest represja D N A [30, 31]. W zw iązku z tym m ogła to
być je d n a z przyczyn skupienia genów hom eotycznych
w dużych b lokach (kom pleksach) podczas ewolucji.
S tabiln a represja tych genów jest najłatw iejsza do
osiągnięcia wtedy, gdy ich organizacja ch ro m o so m o ­
w a pozw ala n a zbudow anie dużych kom pleksów re­
presyjnych [21].
IV. Grupa genów trithorax (trx-G) — krypcyjnego S n f2 /S m 2 , znanego rów nież ja k o G AM 1
aktywatorów ekspresji genów
D ru g ą grupę genów biorących udział w regulacji
genów hom eotycznych jest gru p a trithorax (trx-G )
[44]. P ro d u k ty genow e przedstaw icieli tej grupy są
zdolne do aktyw acji genów rozw ojow ych poprzez
przeciw działanie represji wywołanej przez kom pleksy
Pc-G, nukleosom y i inne czynniki działające w trans na
poziom ie chrom atyny. M utacje w genach trx-G o b ­
niżają ekspresję genów hom eotycznych podczas póź­
niejszych etapów rozw oju. N iek tó re z tych genów są
supresoram i m utacji w genach Pc-G, lecz w przeciw ień­
stwie do tych ostatnich nie tw orzą w spółdziałających
kom pleksów , zaś ich oczyszczone p ro d u k ty m ogą
(przynajm niej w niektórych przypadkach) wiązać się
do D N A in vitro [46]. B iałka tej grupy są heterogenne
pod względem sekwencji, stru k tu ry oraz m iejsca i zape­
wne m echanizm u działania. S pośród poznanych do tej
pory przeszło 18 przedstaw icieli grupy [44,47] d o k ład ­
niej p oznano trzy geny i ich produkty. Są to: trithorax
(trx) [40, 48], brahma [49, 50] i trithorax-like (tri),
którego p ro d u k t zw any jest też czynnikiem G A G A
[51] (Tab. 2).
brahma jest niezbędnym genem Drosophila — m u ­
tan ty hom ozygotyczne brahma giną pod koniec
em briogenezy [53]. M utacje w brahma są supresoram i
transform acji spow odow anych przez m utacje w ge­
nach P oly comb. Białko brahma w ykazuje uderzające
podobieństw o do drożdżow ego ak ty w ato ra trans-
i TYE3 [54]. U drożdży Snf2/Sw i2 jest czynnikiem
koniecznym do transkrypcji wielu regulow anych ge­
nów. Snf2/Sw i2 nie wiąże się bezpośrednio do D N A ,
lecz łączy się z białkam i S w il, Swi3, Snf5, Snfó
i pięciom a innym i, tw orząc ogrom ny kom pleks biał­
kow y o m asie 2 M D a zaangażow any w aktyw ację

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 241

 Tabela 2.
Konserwowane domeny w białkach grupy trithorax i ich homologi [4],
Białko Motyw białkowy
trithorax (trx) domena SET
palce PH D
brahma (brm) brom odom ena,
DNA-załeżna ATPaza,
helikaza
E(var)3-93D motyw tram track
trithorax-like (tri)/czynnik motyw tram track, palec
GAGA cynkowy
tran sk ry p cy jn ą [50]. P odobieństw o białek brahma
i Swi2 jest najw iększe w dw u regionach; pierw szym
z nich jest do m en a A T P azy zależnej od D N A (500
am inokw asów ), zaś drugim m otyw tak zwanej brom o-
dom eny (77 am inokw asów ), w ystępujący często w eu­
kariotycznych białkach regulatorow ych [4,'50]. P rzy ­
puszcza się, że elem enty te m ogą brać udział w ro z­
bijaniu stru k tu r nukleosom ow ych i w spom agać
czynniki i ak ty w atory transkrypcyjne w w iązaniu do
odpow iednich elem entów D N A (na przykład w ią­
zanie ak ty w ato ró w transkrypcyjnych G A L4-V P16
i G A L4-A H ) [55, 56]. Ludzki hom olog genu brahma,
B RG 1, bierze rów nież udział w k o n tro li cyklu k o m ó r­
kow ego poprzez tw orzenie kom pleksów z białkiem
retinoblastoma; odgryw a także rolę w integracji prow i-
rusów [57],
C zynnik GAG A jest aktyw atorem transkrypcji w ią­
żącym się do miejsc w D N A bogatych w pow tórzenia
(GA)n [46]. C zynnik ten kodow any jest przez gen
z grupy trx-G , trithorax-like (tri), i m a 519 am in o ­
kw asów [51]. M utacje w genie tri prow adzą do
transform acji hom eotycznych przypom inających m u ­
tacje w genach hom eotycznych A bd-B i U bx (na
przykład pow iększenie przedzm ianek i przekształcenie
segm entów odw łoka), czyli p row adzą do obniżenia
ekspresji tych genów hom eotycznych. Stw ierdzono, że
in vitro czynnik G AG A wiąże się do D N A w pobliżu
p ro m o to ro w eg o bloku TATA, a następnie w ykorzy­
stując energię w postaci A TP, usuw a nukleosom y
um ożliw iając w ten sposób w iązanie się polim erazy II
R NA i czynnika transkrypcyjnego T F IID [58, 59].
P onadto czynnik GAG A przeciwdziała represji trans-
krypcyjnej będącej rezultatem działania histonu H I [59].
G en trithorax (trx) koduje co najm niej dwie izofor-
my białkow e — tr x l o m asie 368 k D a i t r x l l o masie
404 kD a, z k tó ry ch obie przechodzą złożony proces
o b ró b k i proteolitycznej [44, 48]. B iałka trx zaw ierają
region bogaty w cysteiny, położony w centralnej części
białka i zdolny do tw orzenia palców cynkow ych [21,
44]. M im o to nie u dow o d n io n o bezpośredniego w iąza­
nia trx do D N A . W trx w ystępuje rów nież drugi m otyw
białkow y, położony blisko jego C -końca i w spólny dla
wielu białek Drosophila, w tym dla Enhancer o f zeste,
przedstaw iciela grupy Pc-G. trx wiąże się do ch ro m o ­
242 http://rcin.org.pl
Homologi
Htrx-1, (H R X , M L L , ALL-1)
(człowiek/mysz)
Swi2/Snf2 (drożdże)
brgl (mysz/człowiek)
Hbrm (człowiek)
—
---
som ów politenicznych w 16 rożnych m iejscach. M iejs­
ca te w dużym stopniu pokryw ają się z m iejscam i
w iązania białka Pc-G (na przykład E(z) [48]). W sk azu ­
je to n a podobieństw a w m echanizm ie działania białek
o bu tych grup. U Drosophila zarodki i dorosłe ow ady
z m utacją trx w ykazują transform acje hom eotyczne
p o d o b n e do obserw ow anych w m u tan tach Sex combs
reduced (Ser), U bx, Antennapedia (Antp), Abdom inal-A
i Abdominal-B. Świadczy to, że trx jest konieczny do
norm alnej ekspresji tych genów, należących do k o m ­
pleksów A N T -C i BX-C [60]. Niezwykle ciekawe jest
działanie ludzkiego hom ologu trx, A L L 1 (M L L ,
H R X ). G en M L L -1 (z ang. mixed-lineage leukaemia)
położony jest n a chrom osom ie 11, zaś jego rearanżacje
(głównie typu translokacji) p row adzą do onkogenezy
i pow staw ania białaczek u dzieci [61]. G en H R X
(M L L ) jest niezwykle długi (około 100 kb), zaw iera
przynajm niej 21 eksonów , zaś jego p ro d u k t, białko
0 długości 3910 am inokw asów , m a trzy regiony hom o-
logii z trithorax Drosophila. O cenia się, że 75% ostrych
białaczek niem owlęcych zw iązanych jest z rearan żacją
genu H R X (lokus llq 2 3 ) [61, 62]. H eterozygotyczne
m utacje w genie M L L u myszy prow adzą n ato m iast do
zaham ow ania w zrostu, transform acji hom eotycznych
szkieletu osiowego i deform acji m o stk a [63]. B rak
M L L (-/-) jest em brionalnie letalny. D ysrupcja jednej
kopii genu (M L L + /-) pow odow ała przesunięcie g ra ­
nic ekspresji genów hom eotycznych H oxa-7 i H oxa-9
ku tyłowi ciała, ale aktyw ność tych genów hom eotycz­
nych była zniesiona w zaro d k ach M L L (-/-). T ak więc
hom olog genu trithorax jest konieczny do określenia
tożsam ości segm entów ciała i do k o n tro li ekspresji
genów H ox.
M echanizm y działania przedstaw icieli grupy trx-G
są zróżnicow ane. P ostuluje się [21], że białka trx-G
tw orzą kaskadę regulacyjną — czynniki brahma
1 Tri/GAG A m ogłyby rozluźniać stru k tu rę chro m atyny
z nakładem energii, a trx byłby czynnikiem „ k o t­
w iczącym ” n a poziom ie D N A , koniecznym do p rze­
ciw działania represyjnym białkom Pc-G. W ażnym
m echanizm em działania trx-G m oże być p o n ad to
w ypętlanie D N A , dzięki czem u odległe enhancery
lo k u ją się blisko miejsc prom otorow ych [44] i w zm ac­
niają transkrypcję.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 V. Podsumowanie
O m ów ione prace dow odzą, że regulacja ekspresji
genów rozw ojow ych obejm uje nie tylko oddziaływ anie
białek z D N A , ale odbyw ? się w jądrze rów nież na
innych poziom ach. W m iarę poznaw ania składników
kom pleksów regulacyjnych będzie m ożna wyjaśnić
w ja k i sposób stan transkrypcyjny genów utrzym yw a­
ny jest stabilnie przez wiele podziałów kom órkow ych.
Jest niem al pewne, że w procesach tych stru k tu ra
chro m aty n y odgryw a isto tn ą i tru d n ą do przecenienia
rolę.
Podziękowanie.
Chciałbym podziękować panu profesorowi dr hab. An­
drzejowi Jerzmanowskiemu za wnikliwe i pomocne uwagi
podczas przygotowywania tej pracy.
A rtyku ł otrzym ano 5 marca 1996 r.
Zaakceptow ano do druku 6 maja 1996 r.
Piśmiennictwo
1. L e w i s E B (1978) Nature (Lond) 276: 565-570
2. L a w r e n c e P A (1992) W: The making of the fly Blackwell
Scientific Publications, Oxford
3. P i r o t t a V (1995) Curr Opin Gen Dev 5: 466-472
4. O r l a n d o V, P a r o R (1995) Curr Opin Gen Dev 5: 174-178
5. T a m k u n J W (1995) Curr Opin Gen Dev 5: 473-477
6. A s h e n b u r n e r A (1989) W: Drosophila. A L aboratory
M anual Cold Spring H arbour, New York, Cold Spring H arbour
L aboratory Press
7. S c o t t MP , C a r r o l l S B (1987) Cell 51: 689-698
8. E l g i n S C R (1995) W: C hrom atin Structure and Gene Regula­
tion, IR L Press, Oxford University Press, Oxford
9. U r i e l i - S h o v a l S, G r u e n b a u m Y, S e d a t J, R a z i n
A (1982) FEBS L ett 146: 148
10. W h i t e R A H , L e h m a n R (1986) Cell 47: 311-321
11. D u n c a n I, L e w i s E B (1982) W: Subtelny S, Green FB,
Developmental Order. Its O rgin and Regulation Alan R. Liss,
New York
12. S t r u h 1 G (1981) Nature (Lond) 293: 36-41
13. D u r a J - M , B r o c k H W, S a n t a m a r i a P (1985) M ol Gen
Genet 198: 213-220
14. J u r g e n s G (1985) Nature (Lond) 316: 153-155
15. I n g h a m P W (1984) Cell 37: 815-823
16. D u n c a n I (1982) Genetics 102: 49-70
17. B r e e n T R, D u n c a n I M (1982) Dev Biol 118: 442-456
18. J o n e s RS, G e l b a r d W M (1990) Genetics 126: 185-199
19. W u C - T , J o n e s R S , L a s k o P F (1989) M ol Gen Genet 218:
559-564
20. S i m o n J, C h i a n g A, B e n d e r W (1992) Development 114:
493-505
21. P a r o R (1993) Curr Opin Cell Biol 5: 999-1005
22. P a r o R, H o g n e s s D S (1991) Proc N atl Acad Sci USA 88:
263-267
23. P a r o R, Z i n k B (1992) M ech Dev 40: 37-46
24. D e C a m i l l i s M, C h e n g NS , P i e r r e D, B r o c k
H (1992) Genes Dev 6: 223-232
25. E i s s e n b e r g J C, J a m e s T C, F o s t e r - H a r n e t t D M ,
H a r n e t t T, N g a n V, E l g i n S (1990) Proc N atl Acad Sci
USA 87: 9923-9927
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
26. B r u n k BP, M a r t i n E C, A d l e r P N (1991) Nature (Lond)
353: 351-353
27. M e s s m e r S, F r a n c k e A, P a r o R (1992) Genes Dev 6:
1241-1254
28. F r e e m o n t PS, H a n s o n I M, T r o w s d a l e J (1991) Cell
64: 483-484
29. R a s t e l l i L, C h a n CS, P i r o t t a V (1993) EM BO J 12:
1513-1572
30. S i m o n J, C h e n g A, B e n d e r W, S h i m a m u r a MJ ,
O ’ C o n n o r M (1993) Dev Biol 158: 138-144
31. I r v i n e K D , H e l f l a n d SL, H o g n e s s D (1991) Develop­
ment 111: 407-424
32. K o r n b e r g R D (1974) Science 184: 868-871
33. A i m e r A, R u d o l p h H, H i n n e n A, H o r z W (1986)
EM BO J 5: 2689-2696
34. B r e s n i c k E H , J o h n S, B e r a r d DS , L e F e b r e P,
H a g e r G L (1990) Proc N atl Acad Sci USA 87: 3977-3981
35. v a n L o h u i z e n M, V e r b e e k S, S c h e i j e n B, W i e n t -
j e n s E, v a n d e r G u l d e n H, B e r n s A (1991) Cell 65:
737-752
36. H a u p t Y, A l e x a n d e r WS , B a r r i G, K l i n k e n SP,
A d a m s J M (1991) Cell 65: 753-763
37. v a n d e r L u g t N M , D o m e n J, L i n d e r s K, v a n
R o o n M, R o b a n u s - M a a n d a g E, t e R i e l e H, v a n
d e r V a l k M, D e s c h a m p s J, S o f r o n i e w M, v a n
L o h u i z e n M (1994) Genes Dev 8: 757-769
38. A l k e m a MJ , v a n d e r L u g t N M , B o b e l d i j k RC,
B e r n s A, v a n L o h u i z e n M (1995) Nature (Lond) 374:
724-727
39. F o r d AM, R i d g e SA, C a b e r o ME , M a h m o n d M,
S t e e l C M, C h a n Lc, G r e a v e s M (1993) Nature (Lond)
363: 358-360
40. T k a c h u k D C , K o h l e r S, C l e a r y M L (1992) Cell 71:
691-700
41. P e l e g r i F, L e h m a n n R (1994) Genetics 136: 1341-1353
42. B i e n z M (1992) Curr Opin Cell Biol 4: 955-961
43. C o o p e r J P, R o t h SY, S i m p s o n R T (1994) Genes Dev 8:
1400-1410
44. K e n n i s o n J A (1993) Trends Genet 9: 75-79
45. L e w i n B (1994) W: Genes V str 1166-1181 Oxford University
Press, Oxford
46. B i g g i n MD , T i j a n R (1988) Cell 53: 699-711
47. L i n d s l e y DL , Z i m m G G (1992) W: The Genome of
Drosophila melanogaster, Academic Press
48. K u z i n B, T i l l i b S, S e d k o v Y, M i z r o c h i L, M a z o
A (1994) Genes Dev 8: 2478-2490
49. B r i z e l a Bl, E l f r i n g L, B a l l a r d I, T a m k u n J W,
K e n n i s o n J A (1994) Genetics 137: 803-813
50. P e t e r s o n CL, D i n g w a l l A, S c o t t M P (1994) Proc
Acad Sci USA 91: 1950-1954
51. F a r k a s G, G a u s z J, G a l l o n i M, R e u t e r G, G y u r -
k o v i c s M, K a r c h F (1994) Nature (Lond) 371: 806-808
52. W i n s t o n F, C a r l s o n M (1992) Trends Genet 8: 387
53. K e n n i s o n J A, T a m k u n J W (1988) Proc N atl Acad Sci
USA 85: 8136-8140
54. T a m k u n J W, D e n n i n g R, S c o t t MP , K i s s i n g e r M,
P a t t a t u c c i AM, K a u f m a n T C, K e n n i s o n J A (1992)
Cell 68: 561-572
55. K w o n H, I m b a l z a n o AN, K h a v a n P A, K i n g s t o n
RE, G r e e n M R (1994) Nature (Lond) 370: 477-481
56. I m b a l z a n o AN, K w o n H, G r e e n MR , K i n g s o n
R E (1994) Nature (Lond) 370: 481-485
57. D u n a i e f J L, S t r o b e r BE, G u h a S, K h a v a r i PA,
A l i n K, L u b a n J, B e g e m a n n M, C r a b t r e e GR,
G o f f S P (1994) Cell 79: 119-130
58. T s u k i y a m a T, B e c k e r P B , W u C (1994) Nature (Lond)
367: 525-532
59. C r o s t o n G E , K e r r i g a n LA, L i r a L M, M a r s h a k
D R , K a d o n a g a J (1991) Science 251: 643-649
60. B r e e n TR, H a r t e P J (1993) Development 117: 119-134
61. G u Y, N a k a m u r a T, A l d e r H, P r a s a d R, C a n a a n i
O, C i m i n o G, C r o c e C M, C a n a a n i E (1992) Cell 71:
701-708
62. Z e l e z n i k - L e NJ , H a r d e n A M, R o w l e y J D (1994)
Proc N atl Acad Sci USA 91: 10610-10614
63. Y u B D , H e s s J L, H o r n i n g SE, B r o w n G A J , K o r s -
m e y e r S J (1995) Nature (Lond) 378: 505-508
243
Kinazy MAP i ich rola w regulacji poziomu, składu
podjednostkowego oraz stopnia fosforylacji czynnika
transkrypcyjnego AP-1
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) — their role in
regulation of protein level, subunit composition and degree of
phosphorylation of the transcription factor AP-1
I R E N E U S Z W. B I E D E R M A N N *
Spis treści:
I. Wstęp
II. Ogólny schemat kaskady MAPK
III. Kaskady MAPK występujące u kręgowców
IV. Różnicowy wpływ czynników zewnątrzkomórkowych
na aktywność poszczególnych kaskad MAPK
V. Mechanizmy aktywujące kaskady MAPK
VI. Czynniki transkrypcyjne jako substraty kinaz MAP
VII. Regulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego AP-1
jako efekt współdziałania różnych kaskad MAPK
VIII. Uwagi końcowe
Wykaz stosowanych skrótów: MAPK, kinaza MAP — kina-
za białkowa aktywowana przez czynniki mitogenne, MKP
— fosfataza kinazy MAP; MAPKK — kinaza kinazy MAP
(kinaza aktywująca kinazę MAP); MAP3K — kinaza kinazy
aktywującej kinazę MAP; MAP4K — kinaza kinazy kinazy
aktywującej kinazę MAP; MAPKAPK — kinaza białkowa
aktywowana przez kinazę MAP; ERK — kinaza regulowana
przez sygnały zewnątrzkomórkowe (ang. Extracellular-sig­
nal Regulated Kinase ), dawniej określana jako kinaza MAP;
MEK — kinaza aktywująca ERK; R af— kinaza aktywująca
MEK; PKC — kinaza białkowa C; AP-1 czynnik transkryp-
cyjny AP-1 (ang. Activator Protein- 1), dimer białek Fos i Jun;
JNK — kinaza białka c-Jun (ang. c-Jun N-terminal Kinase );
SAPK —-kinaza białkowa aktywowana przez stres, synonim
dla JNK; JNKK, SEK — kinaza aktywująca JNK; MEKK
— kinaza aktywująca JNKK, dawniej uważana za kinazę
aktywującą MEK; FRK — kinaza białka c-Fos (ang. c-Fos
Regulating Kinase ); p38/RK — kinaza reaktywująca MAP-
KAP kinazę-2, (ang. Reactivating Kinase ); RKK — kinaza
aktywująca p38/RK; GTP — trójfosforan guanozyny; Ras,
Racl, Cdc42, RhoA — niskocząsteczkowe GTP-azy (nisko-
cząsteczkowe białka wiążące GTP, niskocząsteczkowe biał­
ka G); PAK — kinaza aktywowana przez białka Racl i Cdc42
(ang. p21-Cdc42/Rac-activated kinase); SRF — czynnik
transkrypcyjny (ang. Serum Responce Factor ) uczestniczący
w regulacji genu c-fos; TCF — czynnik transkrypcyjny (ang.
Ternary Complex Factor ) uczestniczący w regulacji genu
c-fos; ATF2 — czynnik transkrypcyjny uczestniczący w regu­
lacji genu c-jun.
* Mgr, Pracownia Hodowli Komórek i Tkanek, Instytut
Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, 02-093
Warszawa, Pasteura 3
244
http://rcin.org.pl
Contents:
I. Introduction
II. General scheme of the MAPK cascade
III. MAPK cascades of vertebrate cells
IV. Differential effect of extracellular stimuli on activity of
particular MAPK cascades
V. MAPK cascades — mechanisms of activation
VI. Transcription factors as the substrates of MAPKs
VII. Transcription factor AP-1 regulation as an effect of
cooperation of different MAPKs
VIII. Concluding remarks
I. Wstęp
F unkcjonalnym w yróżnikiem aktyw ności czynnika
transkrypcyjnego AP-1 jest zdolność do specyficznego
w iązania się z sekwencją TG A (C /G )TC A , przy czym
— o ile sekw encja ta występuje w regionie p ro m o to ro -
wym jakiegoś genu — zw iązanie się z nią czynnika
transkrypcyjnego AP-1 m oże prow adzić do w zm ożo­
nej ekspresji p ro d u k tu tego genu. N ależy zauważyć, że
term in „czynnik transkrypcyjny A P -1” jest używ any
ja k o zbiorow e określenie hom o- i heterodim erów
białek rodziny Ju n (c-Jun, Ju n B, Jun D), oraz h etero ­
dim erów białek Jun z białkam i rodziny F os (c-Fos, F os
B, Fra-1 i Fra-2). Isto tn ą cechą genów kodujących
białka rodzin Jun i Fos, pozw alającą zaliczyć te geny
do tzw. grupy genów odpow iedzi wczesnej (ang. Im -
mediate Early Genes, IEG), jest to, że aktyw acja
transkrypcji tych genów nie w ym aga uprzedniej b io ­
syntezy b iałka [1, 2].
A ktyw acja czynnika transkrypcyjnego AP-1, czy to
poprzez de novo syntezę jego składników , czy też
poprzez fosforylację uprzednio istniejących, następuje
w skutek zadziałania n a kom órkę wielu różnych czyn­
ników (horm ony, neuroprzekaźniki, czynniki w zros­
towe, cytokiny, czynniki rakotw órcze, szok osm otycz-
ny, inne) i pośredniczy w różnorodnej, adekw atnej do
działającego czynnika, odpow iedzi kom órki (różnico­
wanie, proliferacja, transform acja now otw orow a, apo-
ptoza, inne). C hociaż w obec dużej liczby m ożliwych
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 w ariantów czynnika AP-1 nie pow inno dziwić, że
czynnik ten uczestniczy w tak ró żn orodnych reakcjach
kom órek, to jed n ak w yjaśnienia w ym aga m echanizm ,
dzięki k tó rem u działające czynniki zew nętrzne d eter­
m inu ją poziom , skład p o djednostkow y i stopień ufos-
forylow ania czynnika AP-1.
D o odpow iedzi n a postaw ione wyżej ważne i cieka­
we pytanie zbliżyło nas niew ątpliw ie odkrycie w o sta t­
nich latach now ych kinaz białkow ych [3-6], należą­
cych do grupy tzw. kinaz aktyw ow anych przez czyn­
niki m itogenne (kinazy M A P, M A PK ). K inazy M A P
są kluczow ym ogniwem łańcucha kolejno aktyw ow a­
nych kinaz białkow ych, tw orzącego kaskadę fosforyla­
cji, zw aną k ask a d ą M A P K . T a o statn ia uw ażana jest
za w spólny d la kręgow ców , drożdży i innych organiz­
m ów eukariotycznych podstaw ow y m echanizm sprzę­
gający zachodzącą n a poziom ie błony kom órkow ej
pierw o tn ą reakcję k o m ó rk i n a działanie czynników
zew nętrznych z właściwą, często w ym agającą zm iany
poziom u ekspresji odpow iednich genów, odpow iedzią
kom ó rk i na d an y bodziec [3, 4],
D la om aw ianych tu taj zagadnień szczególne znacze­
nie m a fakt, że dwie z trzech now oodkrytych kinaz
M A P, a m ianow icie J N K (ang. c-Jun N -term inal
Kinase, [5] i F R K (ang. Fos Regulatin Kinase, [6]
bezpośrednio fosforylują składniki czynnika AP-1.
W a rto rów nież nadm ienić, że dotychczas zn a n a kinaza
M A P , określan a o statn io ja k o E R K (ang. E xtracel­
lular-signal Regulated K inase), najpraw dopodobniej
uczestniczy w aktyw acji czynnika AP-1 [4] oraz, że
udział kolejnej kinazy M A P w tym procesie jest
p ostulow any [7].
Zasygnalizow ane powyżej fakty jasn o sugerują, że
pytanie o m echanizm m o dulow ania aktyw ności czyn­
n ik a transkrypcyjnego AP-1 poprzez działające na
k o m ó rk ę czynniki zew nętrzne m ożna rozbić n a dwie
części, m ianowicie: (i) ja k czynniki zew nętrzne w pływ a­
ją n a aktyw ność poszczególnych kinaz M A P, oraz (ii)
ja k różne kinazy M A P m odulują poziom , skład p o d ­
jedno stk o w y i stopień fosforylacji czynnika tra n sk ry p ­
cyjnego AP-1. Celem niniejszego arty k u łu jest, p o p rze­
dzo n a sk rótow ą ch arak tery sty k ą om aw ianych kinaz
M A P i odpow iadających im kask ad M A P K , p ró b a
odpow iedzi na tak sform ułow ane pytania.
II. Ogólny schemat kaskady MAPK
S kładnikam i w ystępującym i we w szystkich znanych
obecnie w arian tach k ask ady M A P K , zarów no u k rę­
gowców ja k i u drożdży, są: (i) kinaza M A P (M A PK ,
ang. M itogen-A ctivated Protein K inase), (ii) kinaza
aktyw ująca kinazę M A P, określana ja k o M A P K K
(ang. M A P K inase K inase), oraz (iii) kinaza kinazy
aktyw ującej kinazę M A P, określana ja k o M A P K K K
lub M A P 3 K (ang. M A P K inase K inase K inase). T a
o statn ia kinaza, p o d o b n ie ja k dwie poprzednie, m oże
być ak tyw ow ana przez fosforylację, z tym , że funkcję
odpow iedzialnej za ten proces kinazy, określanej cza­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
sami ja k o M A P 4K , m ogą w poszczególnych realizac­
jach kaskady M A P K pełnić różne, aktyw ow ane przez
receptory błonow e, kinazy białkow e, w szczególności
kinaza białkow a C, kinazy tyrozynow e, czy też bliżej
nieokreślone kinazy aktyw ow ane przy w spółudziale
białek wiążących G T P [3, 4, 8]. N ależy tutaj p o d k reś­
lić, że m echanizm y aktyw acji M A P 3K nie są do końca
wyjaśnione. W szczególności wydaje się, że przynaj­
mniej niektóre M A P3K m ogą być aktywow ane w proce­
sie nie wykorzystującym fosforylacji (patrz rozdział V).
O ile zarów no M A P 3K jest zwykle kinazą specyficz­
ną dla odpow iadającej jej M A P K K , ja k i M A P K K jest
kinazą specyficzną dla określonej kinazy M A P, o tyle
ta o statn ia m oże fosforylować różne substraty, również
inne kinazy, określane ja k o „kinazy białkow e ak ­
tyw ow ane przez M A P K ” (M A P K A P K ) i uw ażane za
kolejne ogniw o kaskady M A P K . Isto tn ą gru p ą sub­
stratów kinaz M A P stanow ią czynniki transkrypcyjne
[3-6, 8], fosforylowane in vivo po przem ieszczeniu się
kinazy M A P do ją d ra kom órkow ego [9].
O m ów ione powyżej relacje m iędzy kinazam i i ich
substratam i zilustrow ano na rycinie 1. Jak widać,
Ryc. 1 Aktywacja kaskady M A PK jako podstawowy mechanizm
umożliwiający modulację aktywności czynników transkryp-
cyjnych w odpowiedzi na pobudzenie receptorów błono­
wych.
Poza przedstawioną tutaj aktywacją MAP3K poprzez fos­
forylację obecnie znane są inne, praw dopodobnie niezależne
od fosforylacji, mechanizmy aktywacji tej kinazy. Ufos-
forylowana kinaza M AP może fosforylować substraty cyto-
plazmatyczne, lub — po przemieszczeniu się do jądra
komórkowego — substraty jądrowe, głównie czynniki trans­
krypcyjne. Kinazy poziomu M A P4K i M A PK A PK nie
występują (lub też nie zostały dotychczas zidentyfikowane)
w części obecnie znanych kaskad M APK. Stosowane skróty
uwzględniono w wykazie pod spisem treści.
245
 MAPKK
gen MKP
inhibitory
translacji
Ryc. 2 Regulacja aktywności kinazy M AP (M APK) przez kinazę
aktywującą kinazę M A P (M APKK) i fosfatazę kinazy M AP
(MKP).
Zaktyw ow ana (ufosforylowana przez MAPKK) kinaza
M A P (MAPK) po przemieszczeniu się do jąd ra kom ór­
kowego fosforyluje czynniki transkrypcyjne (Cz. tr.) związa­
ne ze specyficznymi sekwencjami w rejonie prom otorow ym
genu fosfatazy kinazy M AP (MKP). Prowadzi to do syntezy
de novo M K P. Nowopow stała fosfataza poprzez defos-
forylacje inaktywuje M APK. Inhibitory translacji przerywa­
jąc widoczną tutaj pętlę sprzężenia zwrotnego prowadzą do
nagrom adzenia mRNA będącego produktem transkrypcji
genu M K P i innych genów odpowiedzi wczesnej (ang.
Immediate Early Genes, 1EG). O pracow ano wg [4, 11, 57].
Nie m ożna wykluczyć udziału innych fosfataz białkowych
w regulacji M A PK [10].
przedstaw iony tam schem at pokazuje ja k docierający
do błony kom órkow ej sygnał aktyw ując kaskadę
M A P K , u ru ch am ia zależne od niej procesy. N a sche­
m acie tym nie p o k azan o natom iast, poznanego w zn a­
cznie m niejszym stopniu, m echanizm u w yłączającego
kaskadę M A P K . W ydaje się, że pew ną rolę m ogą
odgryw ać tu taj fosfatazy białkow e takie ja k fosfataza
P P-2A i fosfataza tyrozynow a [10]. Istnieją też dane
wskazujące, że istotnym składnikiem tego m echaniz­
m u jest specyficzna dla kinazy M A P fosfataza (M K P ,
ang. M A P Kinase Phosphatase) [11], kodow ana przez
jeden z genów odpowiedzi wczesnej [4]. Tak więc (Ryc. 2)
kinaza M A P , aktyw ując poprzez fosforylację czyn­
ników transkrypcyjnych, transkrypcję genów o d p o ­
wiedzi wczesnej, u ru ch am ia jednocześnie pętlę ujem ­
nego sprzężenia zw rotnego prow adzącą do jej dezak­
tywacji poprzez defosforylację w w yniku aktyw ności
zsyntetyzow anej de novo fosfatazy kinazy M A P.
W chwili obecnej nie są dostatecznie poznane m echani­
zmy prow adzące do wyłączenia kaskady M A P K na
poziom ie M A P K K czy M A P3K .
O pisany tutaj ogólny schem at kaskady M A P K jest,
z niewielkim i m odyfikacjam i, w spólny dla wszystkich
obecnie znanych kinaz M A P. K inazy te w ykazują
także znaczne pod o bieństw a stru k tu raln e i funkcjonal­
ne. W szczególności należy odnotow ać, że (i) wszystkie
kinazy M A P są aktyw ow ane poprzez jednoczesną
fosforylację reszty treoniny i tyrozyny oraz (ii) w szyst­
246
http://rcin.org.pl
kie kinazy M A P fosforylują w su bstratach reszty
seryny lub treoniny w ystępujące w bezpośrednim
sąsiedztw ie reszty proliny (ang. proline-directed kina-
ses) [3].
III. Kaskady MAPK występujące u kręgow­
ców
P rzew ażająca większość b ad a ń n ad kask ad am i
M A P K pro w ad zo n a jest n a dw óch dośw iadczalnych
układach m odelow ych: drożdżach i hodow anych in
vitro ko m ó rk ach zwierzęcych (zwłaszcza ssaczych).
P oniew aż znaczna część w yników, dotyczących regu­
lacji aktyw ności czynnika transkrypcyjnego AP-1,
pochodzi rów nież z b ad a ń w ykorzystujących ten o sta ­
tni m odel, ograniczę się w tym opracow an iu do
bardziej szczegółowego om ów ienia czterech głów nych
klas kinaz M A P w ystępujących u kręgowców. O trzech
z nich w spom niano we w stępie do tego arty k u łu (ERK ,
JN K , FR K ), czw arta określana byw a najczęściej ja k o
p38/R K .
Pierw sza z w ym ienionych kinaz, E R K , występuje
w dw óch izoform ach: E R K I (44 kD a) i E R K 2 (42 kD a)
[12]. W arto odnotow ać, że kinazę tę pierw otnie o trzy ­
m ano ze stym ulow anych insuliną adypocytów i na
podstaw ie oznaczanej in vitro specyficzności su b stra to ­
wej nazw ano kinazą b iałka M A P -2 (ang. M icrotubule-
Associated Protein-2 kinase) [13]. Później nazwę tej
kinazy zm ieniono n a M A P K (ang. M itogen-A ctivated
Protein Kinase), i to określenie, chociaż zalecane jest
obecnie dla całej rodziny kinaz M A P, byw a używ ane
ja k o synonim E R K [8].
P o d różnym i nazw am i w ystępuje rów nież JN K .
M ianow icie, w ystępujące w ko m ó rk ach człow ieka
izoform y tej kinazy określa się ja k o JN K 1 (46 kD a)
i JN K 2 (55 kD a) [5, 14-16], a izozym y w ystępujące
u szczura oznacza się ja k o S A P K a (55 kD a, ang.
Stress-Activated Protein Kinase), SAPK(3 (55 kD a)
oraz S A PK y (45 kD a) [17].
K olejna kinaza, o d k ry ta we wrześniu 1994 r. F R K
(88 kD a) jest jeszcze stosunkow o m ało p o zn a n a
i — ja k o jed y n a z om aw ianych tutaj kinaz M A P
— nie została dotychczas sklonow ana [6].
O statn ia z om aw ianych tutaj kinaz, p38/R K , została
zidentyfikow ana ja k o w ystępujący u ssaków hom olog
drożdżow ej kinazy M A P, określanej ja k o H O G 1
(High-Osmolarity Glycerol response 1) [18, 19]. N ieza­
leżnie opisano ten enzym ja k o kinazę zdolną do
reaktyw acji zdefosforylowanej in vitro M A P K A P ki-
nazy-2 (ang. Reactivating Kinase, R K ) [20].
Wyżej w spom niano, że aktyw acja kinaz M A P za­
chodzi poprzez jednoczesną fosforylację reszty treo n i­
ny i tyrozyny. Reszty te, w raz z rozdzielającym je
pojedynczym am inokw asem , tw orzą tak zw ane m iejs­
ce podw ójnej fosforylacji. O dpow iadającą tem u m iejs­
cu sekwencją jest T hr-G lu-T yr (TEY) w E R K [12],
T h r-P ro -T y r (TPY) w JN K [14-17] oraz T hr-G ly-T yr
(TGY) w p38/R K [18]. Te różne w arianty m iejsca
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 podw ójnej fosforylacji ro zpoznaw ane są przez specyfi­
czne kinazy aktyw ujące kinazy M A P (M A PK K ). Są
nim i, odpow iednio, M E K [21], JN K K [22] (zw ana też
S E K [23, 24]) i R K K [20],
Z n an e są dw a izozym y M E K [21], określane ja k o
M E K 1 (44 kD a) i M E K 2 (45 kD a) lub też ja k o M K K 1
i M K K 2. S charakteryzow ano też dwie dalsze
M A P K K -M K K 3 i M K K 4 [25]. Pierw sza z tych kinaz
aktyw uje specyficznie p38/R K i przypuszczalnie jest
izozym em R K K . D ru g a kinaza (M K K 4) aktyw uje
zarów no JN K ja k i p38/R K , ale pom im o tego uw ażana
jest za izozym JN K K .
Jak się przypuszcza kinazy aktyw ujące kinazy M A P
(M A P K K ) są rów nież aktyw ow ane poprzez podw ójną
fosforylację, zachodzącą w tym przy p ad k u w obrębie
sekwencji złożonej z dw óch reszt seryny i/lub treoniny
rozdzielonych trzem a innym i am inokw asam i [26].
K inazą odpow iedzialną za aktyw ację M E K (poprzez
fosforylację w obrębie sekwencji Ser-M et-A la-A sn-Ser,
SM A N S) jest białko Raf-1 [27, 28], analogiczną funk­
cję w kaskadzie J N K pełni, przypisyw ane początkow o
do k ask ad y E R K , białko M E K K [24, 29]. P rzypusz­
cza się, że k tóryś z czterech znanych izozym ów M E K K
pełni funkcję M A P 3 K w kaskadzie p38/R K [3, 8].
O becnie nie są znane białka poziom u M A P K K
i M A P 3 K kask ad y FR K .
Dwie z om aw ianych kaskad, E R K i p38/R K , są
rozszerzone o kinazę białkow ą aktyw ow aną przez
M A P K , odpow iednio M A P K A P K -1 [30] i M A P -
K A P K -2 [20, 30]. Pierw sza z tych kinaz, opisana
pierw otnie ja k o kin aza fosforylująca rybosom alne
białko S6, o k reślan a jest często ja k o R SK [31].
O p isan a w kilku o statnich ak ap itach organizacja
w ystępujących u kręgow ców wersji k askady M A P K
zo stała p o d su m o w an a w tabeli 1. N ależy zaznaczyć, że
w najbliższym czasie lista znanych kinaz M A P i o d ­
pow iadających im k ask ad M A P K zostanie p ra w d o p o ­
dobnie rozszerzona o now ych przedstawicieli.
Powyższy zarys obejm uje niezbędne m inim um in­
form acji o k ask ad ach M A P K . Więcej szczegółów
zainteresow any C zytelnik znajdzie w pośw ięconych
T abela 1.
Obecnie znane kaskady M A PK występujące u kręgowców
Kaskada ERK Kaskada JN K
M AP3K R af [27, 28] M EKK [24, 29]
Raf-1 (70-75 kDa) 4 izoformy
MAPKK MEK [21] JN K K (SEK) [22-25]
M EK1 (44 kD a, M KK1) JN K K
M EK2 (45 kDa, M KK2) SEK1
MKK4
M APK ERK [8, 12, 13] JN K (SAPK) [5, 14-17]
E R K I (44 kDa) JN K1 (46 kDa)
ERK2 (42 kDa) JN K 2 (55 kDa)
SA PK a (55 kDa)
SAPK(3 (55 kDa)
SAPKy (45 kDa)
M APKAPK MAPKAPK-1 (RSK) [30, 31] ----
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
k askadom M A P K pracach przeglądow ych [3, 4, 8].
P om inięte tutaj zupełnie k askady M A P K drożdży
om ów iono w [32].
IV. Różnicowy wpływ czynników zewnątrz-
komórkowych na aktywność poszczegól­
nych kaskad MAPK
K ilkukrotny, czasam i naw et kilkudziesięciokrotny,
w zrost aktyw ności kinaz M A P m ożna zaobserw ow ać
ju ż w kilkanaście sekund po zadziałaniu na kom ó rk i
wielu różnych czynników . N iektóre z tych czynników ,
przykładow o szok osm otyczny [7, 18], prow adzą
zwykle do aktyw acji w szystkich badanych kinaz M AP;
inne — ja k naskórkow y czynnik w zrostow y (EG F)
— w ykazują efekt zależny od rodzaju stosow anych
w b adaniach kom órek [5]. Z nane są też czynniki
aktyw ujące stosunkow o selektywnie w ybrane kinazy
M A P. Jednakże, poniew aż JN K K (M K K 4) m oże
fosforylować zarówno JN K , jak i p38/RK, nie powinno
dziwić, że czynniki wywołujące wzrost aktywności JN K
pobudzają również w pewnym stopniu p38/R K [25].
Z om aw ianych kinaz jedynie E R K reaguje znacz­
nym w zrostem aktyw ności n a p o trak to w an ie kom órek
znanym aktyw atorem kinazy białkow ej C (PK C ) — es­
tram i forbolu [17,18]. Z kolei p o n ad 30-krotny w zrost
aktyw ności JN K obserw uje się w k o m órkach p o d ­
danych działaniu krótkofalow ego prom ieniow ania ul­
trafioletow ego. W tych sam ych w aru n k ach prak ty cz­
nie nie obserw uje się zm iany aktyw ności E R K , n a to ­
m iast w idoczny jest k ilkukrotny w zrost aktyw ności
p38/R K [5, 7]. D o podobnych w yników prow adzi
potrak to w an ie kom órek kw asem okadajow ym lub
anizom ycyną [5, 33]. Pierw sza z tych substancji jest
znanym inhibitorem fosfataz białkow ych P P 1 i PP2A ,
dru g a rów nie znanym inhibitorem translacji. Jest
ciekawe, że ju ż przy stężeniach anizom ycyny nie
w ystarczających do pełnego zaham ow ania translacji,
obserw uje się w yraźny w zrost aktyw ności J N K [33].
W ażną grupę substancji aktyw ujących kinazy M A P
stanow ią, działające za pośrednictw em swoistych rece­
Kaskada p38/RK Kaskada FRK
? ?
RKK [20, 25] ?
RKK
M KK3
M K K 4 (?)
p38/RK [18-20] FRK [6]
p38 (RK, Mpk2) F R K (88 kDa)
M APKAPK-2 [20, 30] ------
247
p to ró w błonow ych horm ony [13], neuroprzekaźniki
[34], czynniki w zrostow e i cytokiny.
Aktywację JN K i p38/R K obserw ow ano w k o m ó r­
kach trak to w an y ch , zaliczaną do cytokin, interleuki-
ną-1 [14, 17]. Bardziej selektyw ną aktyw ację p38/R K
wywołuje, działająca za pośrednictw em specyficznego
receptora, en d o to k sy n a b akteryjna (lipopolisacharyd,
LPS) [18].
S tosunkow o niewiele w iadom o o czynnikach w pły­
w ających n a aktyw ność F R K . A ktyw ność tego en ­
zym u nie zm ienia się w ko m ó rk ach poddanych działa­
niu p rom ieniow ania ultrafioletow ego, czy też p o tra k ­
tow anych estram i forbolu, nato m iast kilkukrotnie
w zrasta w k o m ó rk ach traktow anych E G F [6]. Ten
o statn i czynnik w większości badanych kom órek wy­
wołuje także w zrost aktyw ności zarów no ER K , ja k też
— chociaż zwykle w m niejszym stopniu — J N K [5,
33]. Z o d w ro tn ą sytuacją, czyli silnym w zrostem
aktyw ności J N K a słabym E R K , m am y do czynienia
w k o m ó rk ach trak tow anych, zaliczanym do cytoklin,
czynnikiem m artw icy now otw orów (T N F, ang. Tumor
N ecrosis Factor) [15, 17].
C hociaż obecnie uw aża się, że kinazy M A P po śred ­
niczą w odpow iedzi kom órki n a większość czynników
zew nątrzkom órkow ych, to jed n ak powyższe om ów ie­
nie właściwie wyczerpuje listę czynników , których
wpływ n a aktyw ność różnych kinaz M A P p o ró w ­
nyw ano. P rzyczyną tego stanu rzeczy jest to, że w ciągu
niespełna dw óch lat, k tó re upłynęły od odkrycia
now ych kinaz M A P, główny wysiłek badaczy został
sk oncentrow any n a p ró b ach ustalenia m echanizm u
w iążącego aktyw ację różnych receptorów błonow ych
z poszczególnym i k ask ad am i M A P. Przejdziem y teraz
do om ów ienia w yników tych badań.
V. Mechanizmy aktywujące kaskady MAPK
D o niedaw na jedynym stosunkow o dobrze p o zn a­
nym był m echanizm prow adzący do aktyw acji kas­
kady E R K . P o d koniec czerwca 1995 r. ukazały się
dwie prace [35, 36] w yznaczające główne zarysy
m echanizm u aktyw ującego kaskadę JN K . N a d al nie­
wiele w iadom o o m echanizm ach aktyw ujących kas­
k ady p3 8 /R K i F R K .
Wyżej w spom niano, że do aktyw acji kaskady E R K
dochodzi w k o m ó rk ach traktow anych estram i forbolu,
co w skazuje n a udział w tym procesie kinazy białkowej
C. F aktycznie w ykazano, że kinaza białkow a C, zarów ­
no in vitro ja k in vivo, jest zdolna do aktyw acji białka
Raf-1 poprzez bezpośrednią fosforylację [37].
Jest rzeczą ciekaw ą, że opisano drugi, niezależny od
kinazy białkow ej C, m echanizm prow adzący do a k ­
tywacji b iałka Raf-1, a tym sam ym do „w łączenia”
kask ad y E R K . M echanizm em ten pośredniczy w a k ­
tywacji k ask ad y E R K przez czynniki w zrostow e dzia­
łające poprzez receptory w ykazujące aktyw ność k in a­
zy tyrozynow ej.
G łów nym ogniw em om aw ianego m echanizm u są
248
http://rcin.org.pl
b iałka rodziny Ras, k tó re w raz z białkam i rodzin Rab,
A rf i R ho tw orzą n adrodzinę białek Ras [38, 39].
W szystkie one zaliczane są do tak zw anych niskocząs-
teczkow ych białek wiążących G T P , określanych też
m ianem niskocząsteczkow ych białek G. Jak w iadom o
białka G w ystępują w form ie nieaktyw nej — związanej
z G D P , i w form ie aktyw nej — związanej z G T P .
A ktyw ację białek G, zachodzącą poprzez w ym ianę
zw iązanego z nim i G D P , n a G T P , k atalizują specyfi­
czne białka określane ja k o „białka wym ieniające nu-
kleotydy” (ang. nucleotide exchange protein). Inak-
tyw acja białek G jest w ynikiem hydrolizy G T P , za­
chodzącej dzięki wykazyw anej przez białka G aktyw ­
ności G T P -azy. Proces ten zachodzi przy w spółudziale
specyficznych białek określanych ja k o G A P (ang.
GTP-ase Activator Protein).
Z godnie z obecnie panującym i poglądam i [40-42],
aktyw acja kaskady E R K przez receptory czynników
w zrostow ych obejm uje następującą sekwencję zd a­
rzeń: (i) zw iązanie liganda z receptorem prow adzi do
aktyw acji kinazy tyrozynow ej receptora, (ii) w skutek
autofosforylacji receptor uzyskuje zdolność do w iąza­
nia „adaptorow ego” białka G rb2, (iii) to o statnie
białko łączy się z cytozolow ym białkiem Sos, k o t­
wicząc je przy cytoplazm atycznej pow ierzchni błony
kom órkow ej, (iv) tutaj Sos (będący białkiem w ym ienia­
jącym nukleotydy guanidynow e) spotyka białko Ras,
stale zakotw iczone przy cytoplazm atycznej pow ierz­
chni błony, (v) białko Ras, zaktyw ow ane przez białko
Sos, wiąże się z białkiem Raf-1 (vi) w skutek bezpośred­
niego oddziaływ ania z białkiem Ras dochodzi w bliżej
nie znany sposób do aktyw acji białka Raf-1 [43,44], co
jest rów now ażne z „w łączeniem ” kaskady ER K .
W ażną rolę w b adaniach prow adzących do rozw i­
kłania wyżej om ów ionego m echanizm u, a także w b a ­
daniach n ad m echanizm am i aktyw acji innych k ask ad
M A P K [6, 35, 36], odegrało w ykorzystanie dw óch
różnych typów m utacji białek G.
Pierw szy typ obejm uje m utacje które pozbaw iając
b iałka G aktyw ności G T P azy prow adzą do ich p e r­
m anentnej aktyw ności. E kspresja takiego zm u to w an e­
go białka G w badanych kom órkach, m ożliw a w w yni­
ku transfekcji tych kom órek odpow iednio sk o n stru o ­
w anym plazm idem , jest w ykorzystyw ana do aktyw acji
procesów zależnych od danego białka G. A ktyw acja
ta k a nie w ym aga oczywiście stym ulacji kom órek czyn­
nikam i zew nątrzkom órkow ym i. W arto nadm ienić, że
takie perm anentnie aktyw ne m u tan ty białek G są
znanym i onkogenam i.
D rugi typ m utacji, określany ja k o „dom inujący
m u ta n t negatyw ny”, pow oduje zw iększone p o w in o ­
w actw o danego białka G do G D P . T ak zm utow ane
białko nie m oże zostać zaktyw ow ane przez w ym ianę
G D P n a G T P , ale wiąże się z białkiem w ym ieniającym
nukleotydy guanidynow e. D latego też ekspresja d o m i­
nującego m u ta n ta negatyw nego białka G prow adzi do
wysycenia kom órkow ej puli odpow iedniego białka
w ym ieniającego nukleotydy guanidynow e i tym sa­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
m ym ham uje aktyw ację procesów zależnych od obec­
nego w kom órce niezm utow anego białka G.
W łaśnie stosując o b a w ym ienione typy m u tan tó w
b iałk a Ras w ykazano udział tego b iałka w aktyw acji
F R K . Stw ierdzono m ianowicie, że w ko m ó rk ach F9
(linia m ysich ko m ó rek now otw orow ych pochodzenia
em brionalnego) k inaza ta jest aktyw ow ana przez eks­
presję p erm anentnie aktyw nego m u ta n ta białka Ras,
n ato m iast w ko m ó rk ach A 4 3 1(linia ludzkich kom órek
now otw orow ych p o chodzenia naskórkow ego) ak ty ­
w acja F R K przez E G F jest całkow icie znoszona przez
ekspresję dom inującego negatyw nego m u ta n ta białka
R as [6].
P o d o b n e dośw iadczenia wykazały, że w stym ulow a­
nych E G F k o m ó rk ach H eL a (linia ludzkich kom órek
now otw orow ych pochodzenia nabłonkow ego) ak ty ­
w acja JN K jest całkow icie znoszona przez ekspresję
dom inującego negatyw nego m u ta n ta b iałka R as [35].
W tych sam ych k o m ó rk ach ekspresja tak zm utow ane­
go b iałk a Ras nie m iała za to większego w pływu na
aktyw ację J N K w odpow iedzi n a czynnik m artw icy
now otw orów (TN F). W skazyw ało to, że białko R as nie
pośredniczy w odpow iedzi kom órek H eL a n a T N F .
Ten sam zespół badaczy [35] w ykazał dalej, że (i)
w yw ołana przez E G F aktyw acja JN K jest częściowo
znoszona przez ekspresję dom inującego negatyw nego
m u tan ta białka R acl należącego do rodziny białek
R ho, (ii) ekspresja perm anentnie aktyw nego m u tan ta
białka R acl, a także innego przedstaw iciela białek
Rho, białka Cdc42, prow adzi do aktyw acji JN K , (iii)
aktyw acja JN K przez ekspresję badanych białek Rho
jest addytyw na z aktyw acją w yw ołaną przez ekspresję
perm anentnie aktyw nego m u ta n ta białka Ras, oraz (iv)
ekspresja perm anentnie aktyw nych białek R acl
i Cdc42 nie aktyw uje E R K . N iezależnie [36] podob n e
wyniki uzyskano w b adaniach w ykorzystujących k o ­
m órki C O S-7 (transform ow ane wirusem SV40 k o ­
m órki nerki małpy), przy czym do d atk o w o stw ier­
dzono, że (v) ekspresja dom inujących negatyw nych
m u tan tó w białek R acl i C dc42 częściowo znosi a k ­
tywację JN K w kom órkach stym ulow anych T N F .
P o n a d to obydw a zespoły stwierdziły, że (vi) białko
R hoA (także należące do rodziny białek Rho) nie jest
zaangażow ane w aktyw ację kaskady J N K [35, 36].
O m ów ione w poprzednim akapicie wyniki w skazują
więc n a udział białek rodziny R ho (R acl i C dc 42, ale
nie RhoA) w aktyw acji kaskady JN K . Jednocześnie
obydw a zespoły sugerują, że w odróżnieniu od a k ­
tywacji kaskady E R K , gdzie dochodzi do bezpośred­
niej interakcji białka Ras z białkiem Raf, aktyw acja

RECEPTORY BŁONOWE

Białko G RhoA

M AP4K PAK(?)

M AP3K M EKK

M APKK MEK JNKK

i
MAPK ERK FRK JNK

Ryc. 3 Rola niskocząsteczkowych białek G w aktywacji znanych kaskad M A PK występujących u kręgowców. Obecnie uważa się, że
niskocząsteczkowe białka G pośredniczą w aktywacji kaskad M A PK w odpowiedzi na stymulację większości receptorów błonowych,
aktywując odpowiednie M A P3K bezpośrednio lub za pośrednictwem MAP4K. Ze względu na stosowaną metodykę badań (patrz
rozdział V) powiązania między różnymi receptoram i a poszczególnymi białkami G nie są dokładnie poznane i zostały tutaj
przedstawione schematycznie jak o przerywane pogrubione linie. Ciągłymi i przerywanymi liniami normalnej grubości przedstawiono
(odp. główne i alternatywne) drogi prowadzące do aktywacji poszczególnych kinaz MAP. Hipotetycznej kinazie M AP aktywowanej
przez szlak zależny od białka RhoA przypisuje się pewną rolę w regulacji ekspresji genu c-fos (Ryc. 4). Stosowane skróty uwzględniono
w wykazie pod spisem treści.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 249

kaskady J N K nie jest w ynikiem bezpośrednim o d ­
działyw ania białek R ho z białkiem M E K K . P rzypusz­
cza się raczej, że pośredniczy tutaj białko P A K [45,
46], będące hom ologiem drożdżow ego białka STE20,
pełniącego funkcję M A P 4K w jednej z drożdżow ych
k ask ad M A P K [32].
O m aw iane tu taj zależności m iędzy białkam i G
a kask ad am i M A P K zilustrow ano n a rycinie 3.
F unkcje przedstaw ionej tam hipotetycznej kaskady
M A P K aktyw ow anej przez białko R ho A [7], będą
dyskutow ane w rozdziale VII.
VI. Czynniki traskrypcyjne jako substraty
kinaz MAP
Istnieją dan e w skazujące, że E R K fosforyluje białka
c-Fos i c-Jun, jednakże, fosforylacja ta prow adzi do
obniżenia aktyw ności czynnika transkrypcyjnego [47,
48]. P o d o b n y efekt m a fosforylacja białka c-Fos przez
ak tyw ow aną przez E R K kinazę, określaną ja k o R SK
[47], Z kolei fosforylow anej przez R SK kinazie syn-
tetazy glikogenu (GSK-3) przypisuje się analogiczną
funkcję w obec b iałk a c-Jun [49]. N ależy jed n ak p o d ­
kreślić, że niewiele w iadom o o znaczeniu fizjologicz­
nym om aw ianych w tym akapicie procesów .
W ykazano też, że E R K in vitro fosforyluje, należące
do rodziny Fos, b iałka Fra-1 i Fra-2, przy czym
fosforylacja ta zachodzi w m iejscach istotnych dla
aktyw acji tych czynników in vivo [50]. C zynnikiem
transkrypcyjnym aktyw ow anym przez E R K jest, nie­
wątpliwie, E lk l/T C F [51, 52]. U w aża się, że czynnik
ten m oże być także aktyw ow any przez JN K [52].
T a o statn ia kin aza została o d k ry ta ja k o enzym
fosforylujący dwie reszty seryny (Ser63 i Ser73) w biał­
ku c-Jun [5, 14-17]. W ykazano, że fosforylacja tych
reszt prow adzi do zw iększenia aktyw ności białka
c-Jun ja k o czynnika transkrypcyjnego. Innym czyn­
nikiem transkrypcyjnym fosforylow anym przez JN K
jest A T F -2 [53]. R ów nież w tym przy p ad k u fosforyla­
cja czynnika transkrypcyjnego prow adzi do podniesie­
nia jego aktyw ności. W a rto w tym miejscu zauważyć,
że w ykazano iż b iałka c-Jun i A T F-2 m ogą tw orzyć
h eterodim er [54]. Jego rolę w regulacji genu c-jun
om aw iam y w następnym rozdziale.
Jedynym obecnie znanym substratem F R K jest
białko c-Fos. F osforylacja tego białka zachodzi n a
reszcie treoniny (Thr232), znajdującej się w pozycji
hom ologicznej do jednej z reszt seryny (Ser73) fos­
forylow anej w b iałk u c-Jun przez J N K [6].
B rak jest obecnie danych o czynnikach transkryp-
cyjnych fosforylow anych przez p38/R K .
VII. Regulacja aktywności czynnika trans­
krypcyjnego AP-1 jako efekt współdzia­
łania różnych kaskad MAPK
Przedstaw ione w poprzednim rozdziale dane jasn o
sugerują, że trzy z om aw ianych kinaz M A P, m ianow i­
250
http://rcin.org.pl
cie E R K , JN K i F R K , m ogą poprzez bezpośrednią lub
pośrednią fosforylację białek c-Fos i c-Jun m odulow ać
aktyw ność czynnika transkrypcyjnego AP-1.
Jednakże w ykazano też, że dwie z tych kinaz (E R K
1 JN K ) w pływ ają z całą pew nością n a poziom ekspresji
białek c-Fos i c-Jun. Wyżej w spom niano, że su b straty
JN K , c-Jun i A TF-2, tw orzą dim er. U w aża się, że dim er
tak i zw iązany jest w regionie prom otorow y m genu
c-jun i odpow iada za w zm ożoną transkrypcję tego
genu w odpow iedzi n a fosforylację białek c-Jun i A T F-
2 [54].
Jednym z w ażniejszych elem entów regulatorow ych
genu c-fos jest tak zw ane miejsce SRE (ang. Serum
Response Element) rozpoznaw ane przez specyficzny
czynnik transkrypcyjny określany ja k o SR F (ang.
Serum Responce Factor) [55]. C zynnik ten m oże
w praw dzie sam aktyw ow ać transkrypcję, jed n ak a k ­
tyw ność jego zostaje znacznie zw iększona po u tw orze­
niu kom pleksu z czynnikiem określanym ja k o T C F
(ang. Ternary Complex Factor) [56]. Jak w spom niano
wyżej czynnik E lk l/T C F jest aktyw ow any przez E R K
i JN K [51, 52].
Oczywiście kom pleks czynników S R F /T C F m oże
być regulow any rów nież przez m odulacje aktyw ności
czynnika SRF. O statn io w ykazano, że aktyw acja czyn­
nik a S R F w ko m ó rk ach stym ulow anych w ystępują­
cym w osoczu czynnikiem m itogennym — kw asem
lizofosfatydylow ym — jest zależna od białek G z ro d zi­
ny R ho (R acl, Cdc42, a także R ho A). U dział w tym
procesie kolejnej, nowej kinazy M A P uw aża się za
wysoce p ra w d o p o d o b n y [7].
O m ów iony tutaj wpływ kinaz M A P na regulację
ekspresji genów c-fos i c-jun został przedstaw iony
schem atycznie n a rycinie 4. Schem at ten uw zględnia
rów nież fosforylację białek c-Fos i c-Jun przez F R K
i JN K . C hociaż pom inięto tam pozostałych p rzed ­
stawicieli rodzin F os i Ju n (których regulacja przez
kinazy M A P nie jest dostatecznie poznana), ze schem a­
tu tego jasn o wynika, że zarów no poziom , ja k i skład
podjednostkow y (w tym przy p ad k u pro p o rcja hom o-
dim eru c-Jun i heterodim eru c-Jun/c-F os) a także
stopień ufosforylow ania czynnika transkrypcyjnego
AP-1 są złożoną funkcją aktyw ności różnych kinaz
M A P.
W a rto zw rócić uwagę n a jeszcze jeden ciekaw y
problem . Jest oczywiste, że fosforylacja now o p o w ­
stałego białka c-Jun jest m ożliw a jedynie w obecności
aktyw nej JN K . Tym czasem z p o ró w n an ia ryciny 4. i 2.
jasn o w ynika, że jednocześnie z białkiem c-Jun syn­
tetyzow ana jest fosfataza (M K P ) inaktyw ująca kinazy
M A P [11, 57]. W zględnie w ysoka aktyw ność JN K
w obecności M K P m oże być u trzym ana jedynie w tedy
gdy wciąż aktyw na jest kinaza aktyw ująca J N K
(JN K K ). Z daje się to wskazywać, że dodatk o w y m
czynnikiem regulującym stopień ufosforylow ania n o ­
w opow stałych czynników transkrypcyjnych m oże być
czas przez jak i utrzym yw ana jest aktyw ność odpow ie­
dnich kask ad M A P K .
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
Ryc. 4 Współdziałanie różnych kinaz M AP w regulacji aktywności czynnika transkrypcyjnego AP-1 (schemat uproszczony).
Przedstawiając wpływ różnych kinaz M AP na regulację genów c-fos i c-jun pominięto większość miejsc regulatorowych występujących
w prom otorach tych genów. Uwzględniono jedynie miejsce regulatorowe SRE genu c-fos (złożone z sekwencji rozpoznawanych przez
czynniki transkrypcyjne SRF i TCF) oraz nietypowe miejsce regulatorowe AP-1 genu c-jun (rozpoznawane przez dimer ATF2/c-Jun).
Pytajnikiem (?) oznaczono hipotetyczną kinazę M AP aktyw ow aną przez szlak zależny od białka RhoA (Ryc. 3) i uczestniczącą
praw dopodobnie w regulacji ekspresji genu c-fos [7]. W prawej części ryciny schematycznie zaznaczono, że — przy braku współdziałania
z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, czy też przy niedostatecznym ufosforylowaniu czynnika AP-1 — samo przyłączenie czynnika
AP-1 do odpowiedniej sekwencji regulatorowej nie musi autom atycznie prowadzić do transkrypcji regulowanego przez nią genu. Poza
pokazanym tutaj heterodim erem c-Jun/c-Fos, znane są inne warianty czynnika transkrypcyjnego AP-1. Stosowane skróty uwzględniono
w wykazie pod spisem treści.

VIII. Uwagi końcowe aktyw ności czynnika transkrypcyjnego AP-1 w ym aga

O gólny schem at kask ady M A P K znany był ju ż od
po czątk u lat dziew ięćdziesiątych, nie było jed n ak jasne
ja k ten pojedynczy szlak m oże pośredniczyć w przek a­
zyw aniu sygnałów m iędzy całą paletą różnorodnych
receptorów obecnych n a pow ierzchni każdej kom órki
a rów nie liczną i zróżnicow aną pulą obecnych w jej
jąd rz e czynników transkrypcyjnych. P rzypuszczano
w praw dzie, że k ask a d a M A P K to raczej jak iś ogólny
schem at, a n iejed en k o n k re tn y szlak,jednakże dopiero
odkrycie, a właściwie sklonow anie, JN K zm ieniło to
przypuszczenie w pewność.
C hociaż po stęp u b ad a ń k tó ry d o k o n ał się w ciągu
ostatn ich dw óch lat, nie sposób nie doceniać, w arto
uzm ysłowić sobie, że jest to dopiero początek drogi do
zadow alającego p o zn an ia w zajem nych relacji m iędzy
różnym i receptoram i błonow ym i i różnym i kaskadam i
M A P K oraz różnym i k askadam i M A P K i różnym i
czynnikam i transkrypcyjnym i.
Z auw ażm y chociażby, że sam o w yjaśnienie regulacji
szczegółowej znajom ości m echanizm ów regulujących
ekspresję trzech genów jun i czterech genów fos.
Ekspresja tych genów prow adzi do pow stania osiem ­
n astu m ożliwych podstaw ow ych w ariantów czynnika
AP-1 i znacznie większej liczby w ariantów różniących
się stopniem fosforylacji.
Podziękowania
Autor niniejszej pracy składa serdeczne podziękowania
Panu doc. dr hab. L e s z k o w i K a c z m a r k o w i za
wszechstronną opiekę oraz Pani E w i e K u b l i k z a pomoc
w wykonaniu rycin.
A rtyku ł otrzymano 24 listopada 1995 r.
Zaakceptow ano do druku 20 marca 1996 r.
Piśmiennictwo
1. A n g e l P, K a r i n M (1991) Biochim Biophys Acta 1072:
129-157
2. K a r i n M (1995) J Biol Chem 270: 16483-16486

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 251

 3. D a v i s R J (1994) Trends Biochem Sei 19: 470-473 R a p p U R (1993) Nature (Lond) 364: 249-252
4. C a n o E, M a h a d e v a n L C (1995) Trends Biochem Sei 20: 38. H a l l A (1993) Curr Opin Cell Biol 5: 265-268
117— 122 39. B o k o c h G M , D e r C J (1993) F ASE B J 7: 750-759
5. H i b i M, L i n A, S m e a l T, M i n d e n A, K a r i n M (1993) 40. E g a n S E , W e i n b e r g R L (1993) Nature (lond) 365:781-783
Genes Dev 7: 2135-2148 41. B u d a y L, D o w n w a r d J (1993) Cell 73: 611-620
6. D e n g T, K a r i n M (1994) Nature (lond) 371: 171-175 42. A r o n h e i m A, E n g l e b e r g D, L i N, A l - A l a w i N,
7. H i l l CS, W y n n e J, T r e i s m a n R (1995) Cell 81: 1159- S c h l e s s i n g e r J, K a r i n M (1994) Cell 78: 949-961
1170 43. L e e v e r s SJ, P a t e r s o n H F , M a r s h a l l C J (1994)
8. S e r g e r R, K r e b s E G (1995) FASE B J 9: 726-735 Nature (lond) 369: 411-414
9. C h e n R H, S a r n e c k i C , B l e n i s J (1992) M ol Cell Biol 12: 44. S t o k o e D, M a c D o n a l d SG, C a d w a l l a d e r K, S y ­
915-927 m o n s M, H a n c o c k J F (1994) Science 264: 1463-1467
10. A l e s s i D R , G o m e z N M , M o o r h e a d G, L e w i s T, 45. M a n s e r E, L e u n g T, S a l i h u d d i n H, Z h a o Z S , L i m
K e y s e S M, C o h e n P (1995) Current Biology 5: 283-295 M (1994) Nature (lond) 367: 40-46
11. L i u Y, G o r o s p e M, Y a n g C, H o l o b r o o k N J (1995) 46. M a r t i n GA, B o l l a g G, M c C o r m i c k F, A b o A (1995)
J Biol Chem 270: 8377-8380 EM BO J 14: 1970-1978
12. B o u l t o n T G, Y a n c o p o u l o s G D , G r e g o r y JS, 47. C h e n R H, A b a t e C, B l e n i s J (1993) Proc N atl Acad Sei
S l a u g h t e r C, M o o m a w C, H s u J, C o b b M H (1990) USA 90: 10952-10956
Science 246: 64-67 48. M i n d e n A, L i n A, S m e a l T, D e r i j a r d B, C o b b M,
13. R a y L B , S t u r g i l l T W (1987) Proc N atl Acad Sei USA 84: D a v i s R, K a r i n M (1994) M ol Cell Biol 14: 6683-6688
1502-1506 49. S u t h e r l a n d C, C o h e n P (1994) FEBS Lett 338: 37-42
14. D e r i j a r d B, H i b i M, W u I H, B a r r e t t T, S u B, D e n g 50. G r u d a MC , K o v a r y K, M e t z R, B r a v o R (1994)
T, K a r i n M, D a v i s R J (1994) Cell 76: 1025-1037 Oncogene 9: 2537-2547
15. S l u s s H K , B a r r e t t T, D e r i j a r d B, D a v i s R J (1994) 51. G i l l e H, K ö r t e n j a n n M, T h o m a e O, M o o m a w C,
M ol Cell Biol 14: 8376-8384 S l a u g h t e r C , C o b b M H , S h a w P E (1995) EM BO J 14:
16. K a l l u n k i T, S u B, T si g e l n y I, S l u s s H K , D e r i j a r d 951-962
B, M o o r e G, D a v i s RJ , K a r i n M (1994) Gen Dev 8: 52. W h i t m a r s h A J, S h o r e P, S h a r r o c k s A D, D a v i s
2996-3007 R J (1995) Science 269: 403-407
17. K y r i a k i s J M, B a n e r j e e P, N i k o l a k a k i E, D a i T, 53. G u p t a S, C a m p b e l l D, D e r i j a r d B, Davis RJ (1995)
R u b i e EA, A h m a d M F , A v r u c h J, W o o d g e t t J R Science 267: 389-393
(1994) Nature (lond) 369: 156-160 54. v a n D a m H, D u y n d a m M, R o t t i e r R, B o s c h A, d e
18. H a n J, L e e J D , B i b b s L, U l e v i t c h R J (1994) Science V r i e s - S m i t s L, H e r r l i c h P, Z a n t e m a A, A n g e l P,
265: 808-811 v a n d e r E b A J (1993) EM BO J 12: 479-487
19. H a n J, R i c h t e r B, L i Z, K r a v c h e n k o Y, U l e w i t c h 55. N o r m a n C, R u n s w i c k M, P o l l o c k R, T r e i s m a n
R J (1995) Biochim Biophys Act 1265: 224-227 R (1988) Cell 55: 989-1003
20. R o u s e J, C o h e n P, T r i n g o n S, M o r a n g e M, A 1o - 56. T r e i s m a n R (1994) Curr Opin Genet Dev 4: 96-101
n s o - L l a m a z a r e s A, Z a m a n i l l o D, H u n t T, N e b - 57. B r o n d e l l o J M, M c K e n z i e F R, S u n H, T o n k s N K ,
r e d a A R (1994) Cell 78: 1024-1037 P o u y s s e e g u r J (1995) Oncogene 10: 1895-1904
21. C r e w s C M, A l e s s a n d r i n i A, E r i k s o n R L (1992)
Science 258: 478-480
22. L i n A, M i n d e n A, M a a r t i n e t t o H, C l a r e t FX,
L a n g e - C a r t e r C, M e r c u r i o F, J o h n s o n GL , K a ­
r i n M (1995) Science 268: 286-290
23. S a n c h e z I, H u g h e s RT, M a y e r BJ, Y e e K, W o o d ­
g e t t J R, A v r u c h J, K y r i a k i s J M, Z o n L I (1994)
Nature (Lond) 372: 794-798
24. Y a u M, D a i T, D e a k J C, K y r i a k i s J M, Z o u LI ,
W o o d g e t t J R, T e m p l e t o n D J (1994) Nature (Lond)
372: 798-800
25. D e r i j a r d B, R a i n g e a u d J, B a r r e t t T, W u I H, H a n
J, U l e v i t c h RJ , D a v i s R J (1995) Science 267: 682-685
26. Z h e n g C F , G u a n K L (1994) EM BO J 13: 1123-1131
27. K y r i a k i s J M, A p p H, Z h a n g XF , B a n e r j e e P,
B r a u t i g a n DL , R a p p U R , A v r u c h J (1992) Nature
(lond) 358: 417-421
28. A l e s s i D R , S a i t o Y, C a m p b e l l D G , S i t h a n a n d a m
G, R a p p U, A s h w o r t h A, M a r s c h a l CJ , C o w l e y
S (1994) EM BO J 13: 1610-1619
29. M i n d e n A, L i n A, M c M a h o n M, L a n g e - C a r t e r C,
D e r i j a r d B, D a v i s RJ , J o h n s o n GL , K a r i n
M (1994) Science 266: 1719-1723
Wydawca prosi
30. S t o k o e D, C a m p b e l l D G , N a k i e l n y S, H i d a k a H,
L e e v e r s SJ, M a r s h a l l C, C o h e n P (1992) EM BO J 11: o kontakt tych,
3985-3994
31. A l c o r t a DA, C r e w s C M, S w e e t LJ , B a n k s t o n L, którzy chcieliby wykorzystać
SW, E r i k s o n R L (1989) M ol Cell Biol 9: 3850-3859
32. H e r s k o w i t z I (1995) Cell 80: 187-197 łamy „Postępów Biochemii”
33. C a n o E, H a z z a l i n CA, M a h a d e v a n L C (1994) M ol
Cell Biol 14: 7352-7362 do reklamowania
34. M i t c h e l l F M , R u s s e l l M, J o h n s o n G L (1995) Bio­
chem J 309: 381-384
35. M i n d e n A , L i n A , C l a r e t F X , A b o A , K a r i n M (1995)
swych produktów i usług
Cell 81: 1147-1157
36. C o s o O A , C h i a r i e l l o M, Y u J C, T e r a m o t o H, związanych z biochemią,
C r e s p o P, X u N, M i k i T, G u t k i n d J S (1995) Cell 81:
1137-1146 biologią molekularną
37. K o l c h W, H e i d e c k e r G, K o c h s G, H u m m e l R,
Y a h i d i H, M i s c h a k H, F i n k e n z e l l e r G, M a r m e D, i biologią komórki.
252 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
 Molekularne podstawy cytoplazmatycznej męskosterylno-
ści u roślin wyższych
Molecular basis of cytoplasmic male sterility in higher plants
H A N N A JA Ń SK A 1
M AGDALENA W OŁOSZYŃSKA2
Spis treści:
I. Wstęp
II. Organizacja genomu mitochondrialnego
III. Charakterystyka zmian towarzyszących CMS
III-l. Zmiany w organizacji genomu mitochondrialnego
III-2. Zmiany w ekspresji
IV. Geny przywracające płodność
V. Funkcja i lokalizacja URF13
VI. Zastosowanie w hodowli
VII. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: CMS — cytoplazmatyczna
męskosterylność; kp — tysiąc par zasad; mtDNA — mito-
chondrialny DNA; urf, orf — otwarta ramka odczytu; cox I,
cox I I — geny kodujące odpowiednio podjednostkę I, II
mitochondrialnego kompleksu oksydazy cytochromowej;
rrn26 — gen kodujący 26S rybosomalny RNA; trnR
(tRNAArg) — gen kodujący RNA transportujący argininę;
kDa — kilodalton; R f — gen przywracający płodność; atpó
— gen kodujący podjednostkę 6 mitochondrialnej syntazy
ATP; URF 13 — białko kodowane przez gen u rf 13 wy­
stępujący w linii CMS-T kukurydzy; HmT — Helmintho-
sporium may dis szczep T; Pm — Phyllosticta may dis.
I. Wstęp
Inform acja genetyczna kom órek roślinnych jest p o ­
dzielona m iędzy ją d ro , m ito ch o n d ria i chloroplasty,
a praw idłow e funkcjonow anie rośliny w ym aga w spół­
działania p ro d u k tó w genów pochodzących z tych
organelli. Z aburzenie interakcji ją d ra i m itochondriów
jest przyczyną cytoplazm atycznej m ęskosterylności
(CM S) u roślin wyższych. N ajogólniej cechę tę m ożna
określić ja k o niezdolność rośliny do w ytw arzania
funkcjonalnego pyłku, a więc do zapylania [1-3].
Rozwój pyłku m oże być zaburzony n a różnych e ta ­
pach. W większości przypadków m orfologia roślin
sterylnych jest norm aln a, a jedynie m ikrosporogeneza
jest niepraw idłow a [1, 4]. Często zw iązane jest to
z niewłaściwym funkcjonow aniem tap etu m [1, 5]
— tk an k i pełniącej odżyw czą funkcję w rozw oju pyłku
[6]. Rzadziej rośliny sterylne nie w ytw arzają pyłku
z pow o d u zm ienionej m orfologii kw iatu. W kw iatach
1 Dr, 2 mgr, Instytut Biochemii, UW, ul. Tamka 2,
50-137 Wrocław
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
Contents:
I. Introduction
II. Organization of mitochondrial genome
III. Characterization of changes associated with CMS
III-l. Changes in mitochondrial genome organization
III-2. Changes in expression
IV. Fertility restorer genes
V. Function and localization URF13
VI. Application in breeding
VII. Concluding remarks
sterylnego tytoniu (N icotiana) pręciki nie pow stają lub
są przekształcane w stru k tu ry pod o b n e do płatków
albo słupka [7]. W rzadkich przypadkach w ytw orzony
pyłek nie jest zdolny do zapylania [3]. C ytoplaz-
m atyczną m ęskosterylność zaobserw ow ano u po n ad
140 roślin kw iatow ych. Sterylne osobniki pojaw iają się
niekiedy spontanicznie w populacji roślin, ale więk­
szość otrzym ano w rezultacie krzyżow ań w ew nątrz-
gatunkow ych, m iędzygatunkow ych oraz m iędzyro-
dzajow ych. K rzyżow anie m iędzygatunkow e p ro w a­
dzące do alloplazm ii, czyli um ieszczenia ją d ra k o m ó r­
kow ego jednego gatu n k u w środow isku cytoplazm y
innego gatunku, jest źródłem 3/4 znanych fenotypów
CM S.
N azw a cytoplazm atyczna m ęskosterylność naw ią­
zuje do pozajądrow ego, m atecznego dziedziczenia
w odróżnieniu od m ęskosterylności w arunkow anej
przez genom jąd ro w y nazywanej jąd ro w ą lub M end-
low ską m ęskosterylnością (M ST) [3], U w aża się, że
m utacje w genom ie m itochondrialnym , a nie c h lo ro ­
plastow ym , są przyczyną cytoplazm atycznej m ęsko­
sterylności [1]. F enotypow e zm iany będące rezultatem
tych m utacji są jed n ak obserw ow ane tylko w obecno­
ści odpow iedniego genom u jądrow ego. Jeśli genom
jądrow y zaw iera specyficzne restorery (geny przyw ra­
cające płodność) to roślina m im o m utacji w genom ie
m itochondrialnym jest płodna. O becność restorerów
nie jest w arunkiem koniecznym do tego, aby rośliny
z niezm utow anym genom em m itochondrialnym stały
się płodne. O kazało się, że różne typy C M S (pow odo­
w ane przez inny rodzaj m utacji w genom ie m ito ch o n ­
drialnym ) w ym agają różnych genów przyw racających
płodność [8]. W niektórych przypadkach niezbędna
253
jest obecność naw et więcej niż jednego genu do
odzyskania płodności [8, 9]. Zazwyczaj wpływ re-
storerów nie jest trw ały — rośliny ponow nie stają się
sterylne, gdy usuniem y te geny poprzez odpow iednie
krzyżow anie. Sugeruje się, że geny przyw racające
p łodność uczestniczą w posttranskrypcyjnej i/lub po-
sttranslacyjnej regulacji ekspresji genów zw iązanych
z cechą CM S.
M ęskosterylne rośliny są cennym m ateriałem gene­
tycznym nie tylko do b ad a n ia oddziaływ ań m iędzy
m ito ch o n d riu m a jąd rem , ale również odgryw ają isto t­
n ą rolę w pro d u k cji nasion m ieszańcowych.
II. Organizacja genomu mitochondrialnego
G enom y m ito ch o n drialne roślin należą do najw ięk­
szych w śród dotychczas poznanych. Ich wielkość w aha
się od 200 kpz [10] do 2500 kpz [11]. D la po ró w n an ia
genom m ito ch o n d rialny ssaków m a w ielkość około 15
kpz, a drożdży 75 kpz [12]. Innym i słowy najm niejszy
genom m ito ch o n d rialny roślin wyższych jest p o n ad 10
razy większy od genom u m itochondrialnego człowie­
ka, a największy jest wielkości połow y chrom osom u
E. coli. Zróżnicow anie wielkości w ykryto naw et u ro ś­
lin blisko spokrew nionych. N a przykład m tD N A
arb u za (330 kpz) jest p o n ad siedm iokrotnie m niejszy
od m tD N A m elona (2500 kpz) [11]. Jak dotychczas nie
znaleziono racjonalnego w ytłum aczenia tak dużych
różnic w ro zm iarach m itochondrialnego D N A .
M im o b ad a ń trw ających ju ż p o n ad pół wieku,
o rganizacja roślinnego genom u m itochondrialnego
jest ciągle kontrow ersyjna. N ad al nie w iadom o, czy
m ito chondrialne D N A występuje w form ie kolistej, czy
liniowej [1 3 ,1 4 ]. K ontrow ersje dotyczą rów nież ilości
niezależnie replikujących się cząsteczek D N A (chro­
m osom ów ) [15-18]. W edług klasycznej teorii, m ito ­
chondrialny genom roślin wyższych składa się z wielu
kolistych cząsteczek o różnej wielkości. N ajw iększa
z nich, zw ana chrom osom em głów nym (ang. master
chromosome), zaw iera całą inform ację genetyczną ge­
n om u i jest jed y n ą cząsteczką m tD N A zdolną do
254
http://rcin.org.pl
replikacji [19,20], P ozostałe cząsteczki są p ro d u k tam i
rekom binacji hom ologicznych zachodzących m iędzy
dużym i sekwencjam i pow tórzonym i chrom osom u głó­
wnego (ang. large repealed sequence) [21, 22]. D uże
jed n o stk i pow tórzone są to sekwencje nukleotydow e
długości 1-14 kpz w ystępujące przew ażnie w dw óch
trzech kopiach. W zależności od wzajemnej orientacji
sekwencji pow tórzonych pow stają form y izom eryczne
(Ryc. 1A) lub cząsteczki koliste o innej wielkości (Ryc.
IB). Z daniem badaczy tego zjaw iska rekom binacja
hom ologiczna dużych sekwencji pow tórzonych jest
procesem odw racalnym , a uczestniczące w niej cząste­
czki m tD N A są w stanie rów now agi dynam icznej.
Liczba, układ i orientacja dużych sekwencji p o w tó rz o ­
nych określa złożoność m itochondrialnego genom u
[22-24],
R oślinne genom y m itochondrialne zaw ierają ró w ­
nież m ałe sekwencje pow tórzone (ang. small repeated
sequence) o długości 10-1000 pz. [25]. R ekom binacje
zachodzą m iędzy nim i rzadko i są źródłem now ych
struktur. T ak pow stałe cząsteczki D N A w ystępują
w niskim stężeniu, ale m ogą być w trakcie ewolucji
am plifikow ane, co do p ro w ad za do zm iany stru k tu ry
genom u [26, 27]. N ieodw racalność rekom binacji m a­
łych sekwencji pow tórzonych jest przypuszczalnie sp o ­
w odow ana ograniczonym praw dopodobieństw em ich
ponow nego połączenia się ze względu n a wielkość tych
sekwencji. U w aża się, że często obserw ow ane u roślin
duplikacje i delecje fragm entów m itochondrialnego
D N A są konsekw encją rekom binacji m iędzy m ałym i
sekw encjam i pow tórzonym i [25-27].
W przeciwieństwie do ogrom nej zm ienności stru k ­
turalnej, genom y m itochondrialne roślin wyższych
w ykazują m ałe zróżnicow anie sekwencji nukleotydo-
wych [28]. N aw et u blisko spokrew nionych gatu n k ó w
roślin obserw uje się różną kolejność genów w m tD N A ,
pom im o że sekwencje nukleotydow e tych genów są
konserw atyw ne. G eny m ogą być prostym i ram kam i
odczytu bądź zaw ierać in tro n y [29]. R ezultatem czę­
stych rekom binacji są geny chim eralne składające się
z fragm entów D N A pierw otnie nie sąsiadujących ze
Ryc. 1 Rekombinacja homologiczna du­
żych sekwencji potworzonych zlo­
kalizowanych w kolistej cząsteczce
DNA mitochondrialnego.
A. Produktem rekombinacji du­
żych sekwencji potworzonych
o przeciwnej orientacji (ang. inver­
ted repeat) jest izomeryczna forma,
w której nastąpiła inwersja frag-
mentu b-c.
c JH H L b B. Produktam i rekombinacji du-
f \ żych sekwencji powtórzonych o tej
i j samej orientacji (ang. direct repeat)
\ J są dwie koliste cząsteczki DNA
zwane subgenomowymi (ang. sub-
genomic circles).
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 (3 ) , 1996
sobą, geny te m ogą rów nież zaw ierać sekwencje o nie­
znanym pochodzeniu [24]. W D N A genom u m ito-
chondrialnego roślin zidentyfikow ano regiony h o m o ­
logiczne z D N A chloroplastow ym i jądrow ym [30,31].
Sądzi się, że obecność tych fragm entów jest wynikiem
przenoszenia inform acji genetycznej pom iędzy o rg a­
nellam i w czasie ewolucji.
M ito ch o n d ria niektórych roślin m ogą zawierać,
specyficzne dla g atunku, liniow e i koliste plazm idy
oraz dw uniciow e cząsteczki R N A [2, 32, 33], W nie­
k tóry ch p rzy p ad k ach p ró b o w an o skorelow ać obec­
ność tych cząsteczek z cechą cytoplazm atycznej męs-
kosterylności. M im o że zaobserw ow ano więcej p laz­
m idów w liniach roślin m ęskosterylnych niż w liniach
roślin płodnych, ich zw iązek z C M S nie jest potw ier­
dzony.
III. Charakterystyka zmian towarzyszących
CMS
M ito ch o n d rialn y genom roślin jest zbyt duży, aby
m ożn a było lokalizow ać w nim zm iany specyficzne dla
linii m ęskosterylnych poprzez sekw encjonow anie.
D latego najczęściej identyfikuje się zm utow ane regio­
ny, p o rów nując profile restrykcyjne (podrozdział III-
1), transkrypcyjne czy polipeptydow e (podrozdział
III-2) roślin sterylnych z płodnym i. W p rzypadku
niektórych g atu n k ó w roślin poró w n an o takie profile
właściwe d la okazów płodnych i sterylnych som atycz­
nych hybrydów [34, 35]. N ie każda zaobserw ow ana
różnica w profilach m usi w skazyw ać na gen, trans-
k ry p t lub białko odpow iedzialne za pojaw ienie się
m ęskosterylności. Jest to spow odow ane zróżnicow a­
niem organizacji m ito chondrialnego genom u roślin
wyższych, naw et w obrębie tego sam ego gatunku.
P oszukuje się zatem roślin ja k najbliżej spokrew ­
nionych, aby zm inim alizow ać ilość różnic nie zw iąza­
nych ze sterylnością. D latego cennym m ateriałem są
rew ertanty pojaw iające się czasam i spontanicznie
w śród roślin sterylnych. W b adaniach n ad CM S
w ykorzystuje się rów nież rośliny będące rezultatem
krzyżów ek linii C M S z linią, której genom jądrow y
różni się tylko obecnością genów przyw racających
płodność. R ośliny te odzyskały płodność, czyli nie
m ogą zaw ierać tran sk ry p tó w bądź białek p o w o d u ją­
cych w ystąpienie cytoplazm atycznej m ęskosterylności
lub zaw ierają ich mniej.
III-l. Zmiany w organizacji genomu mitochon­
drialnego
F rag m en ty genom u m itochondrialnego c h a rak tery ­
styczne dla C M S m ożna identyfikow ać, porów nując
w zory restrykcyjne m tD N A linii sterylnych i płodnych.
Izolacja czystego m tD N A jest często tru d n a i p ra co ­
chłonna, dlatego najczęściej do w ykrycia różnic stru k ­
tury genom u m ito ch o n d rialnego linii sterylnych i p ło ­
dnych stosuje się hybrydyzację sond m itochondrial-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
nych z całkow itym D N A kom órkow ym straw ionym
enzym am i restrykcyjnym i [36-39]. Jak o sondy często
stosow ane są heterologiczne geny m itochondrialne.
M etoda ta jest rów nież używ ana do odróżnian ia
typów C M S w obrębie jednego g atu n k u [40, 41].
N ajpełniejszych jed n ak danych o zm ianach w o r­
ganizacji genom u m itochondrialnego dostarcza p o ­
rów nanie m ap fizycznych m tD N A (kolejności frag­
m entów restrykcyjnych w genom ie) linii płodnych
i sterylnych [16, 34, 42-44].
Zidentyfikow ane regiony genom u m ito ch o n d rial­
nego specyficzne dla linii m ęskosterylnych bardzo
często zaw ierają unikalne geny chim eralne, w których
pow staw aniu b io rą udział w ielokrotne rekom binacje.
G eny chim eralne odkryto w m tD N A kukurydzy typu
T-C M S (u r fl3 ) [1, 9], fasoli zwykłej (pvs ) [4, 45],
słonecznika (o rfH 5 2 2 ) [46], hybrydach petunii (p c f )
[1, 47]. D w a typy C M S rzepaku zaw ierają dw a różne
geny chim eralne — o r fl 38 jest charakterystyczny dla
typu O g u ra [35], a p o l-u rf dla typu polim a [44].
W innych przypadkach okazało się, że regiony
skorelow ane z cechą C M S zaw ierają zm utow ane geny
m itochondrialne. R earanżacje sekwencji nukleotydo-
wych m ogą w ystępow ać w regionie kodującym genu
(np. cox I sorgo [48]) lub w 5' i 3' sekwencjach
flankujących (np. 5' flankujący region genu cox I I
b u ra k a cukrow ego [49], 3' flankująca sekw encja atpó
u ryżu [50]).
Poniżej dokładnie opisano region charakterystycz­
ny dla C M S typu T kukurydzy — najlepiej poznanego
system u cytoplazm atycznej m ęskosterylności na p o ­
ziom ie m olekularnym (Ryc. 2). Region ten zaw iera
dwie ram ki odczytu: u rfl3 i orf221 (poprzednia nazw a
orf25) [1, 9]. G en u rfl3 jest chim eralny i składa się
z fragm entów 3' sekwencji flankującej i kodującej genu
rrn26 oraz fragm entu o nieznanym pochodzeniu. Jest
unikalny — występuje tylko u m ęskosterylności typu
T kukurydzy. W kierunku 3' w stosunku do chim eral-
nego genu znajduje się gen orf221, norm alny m ito ­
chondrialny gen zaw ierający fragm ent sekwencji chlo­
roplastow ego genu trnR (tR N A Arg) [51]. O bie ram ki
odczytu są regulow ane przez tę sam ą sekwencję h o m o ­
logiczną do regionu regulatorow ego atpó. U w aża się,
że przynajm niej 7 zdarzeń rekom binacyjnych brało
udział w tw orzeniu regionu skorelow anego z m ęsko-
sterylnością u kukurydzy. W pobliżu tego regionu
znajduje się rekom binacyjnie aktyw na sekwencja p o ­
w tórzona. Jej bliskie położenie m oże być przypadkow e
bądź odzw ierciedlać jej udział w pow staw aniu locus
C M S. Regiony m tD N A pow iązane z cechą cytoplaz­
m atycznej m ęskosterylności u petunii i fasoli zwykłej
rów nież są zlokalizow ane w pobliżu długich jednostek
rekom binacyjnych [16, 18].
III-2. Zmiany w ekspresji
P rzedstaw ione w poprzednim podrozdziale wyniki
b ad ań dotyczyły różnic w organizacji m itochondrial-
255

o r f 221
TURF 2113
tytoń trnR (tR N A ^r§)
nego D N A roślin sterylnych i płodnych. B adania
porów naw cze prow adzi się rów nież n ad ekspresją
genom u m itochondrialnego. T ranskrypty pojedyncze­
go genu m ito chondrialnego roślin często różnią się
p o d względem wielkości [32, 52]. Jest to konsekw encją
wielu miejsc inicjacji i term inacji w procesie tran sk ry p ­
cji oraz zjaw isk posttranskrypcyjnych. T ranskrypty
genów chim eralnych czy zm utow anych genów m ito-
chondrialnych skorelow anych z cytoplazm atyczną
m ęskosterylnością w ykazują rów nież ta k ą heterogen-
ność. G eny chim eralne są często kotranskrybow ane
z jednym [46, 53-56] lub wielu norm alnym i genam i
m ito chondrialnym i [1, 57]. O pisane różnice w zorów
transkrypcyjnych roślin sterylnych i płodnych dotyczą
pojaw ienia się u roślin sterylnych specyficznych trans-
k ryptów [9, 35, 36, 38, 39, 53, 58, 59]. Dalsze bad an ia
niekiedy ujaw niają, że niektóre zaobserw ow ane specy­
ficzne tran sk ry p ty nie m ają zw iązku z cytoplazm atycz­
n ą m ęskosterylnością [58, 60]. Bliższych inform acji
o tran sk ry p ta ch odpow iedzialnych za sterylność d o ­
starczają p o ró w n an ia m ap transkrypcyjnych roślin
sterylnych z roślinam i o takim sam ym genom ie m ito ­
chondrialnym , ale płodnych dzięki obecności restore-
rów w genom ie jąd row ym (rozdział IV).
O statn io opu b likow ano kilka prac sugerujących, że
zaburzenia procesu redagow ania (ang. editing) [50, 61,
62] lub sk ład an ia R N A (ang. splicing) [53] m ogą być
przyczyną CM S. Jeden z takich przypadków przed­
stawim y w rozdziale IV. Z m iany n a poziom ie tra n s­
krypcji zostały opisane u wielu gatunków roślin, ale
tylko w kilku p rzypadkach zidentyfikow ano białka
unikalne dla roślin sterylnych. Dwie m etody badaw cze
um ożliw iają ta k ą identyfikację. Jed n a z nich opiera się
n a p o ró w n an iu białek pow stających w obecności ra ­
256
http://rcin.org.pl
Ryc. 2 Struktura regionu m tD N A skore­
lowanego z CMS typu T kukury­
dzy (TU RF 2H3). Duże prostokąty
reprezentują otwarte ram ki odczy­
tu. Pierwsze 1145 par zasad tego
regionu jest homologiczne do 5'
sekwencji flankującej atpó. Gen
chimeralny urfl3 złożony jest z fra­
gmentów 3' sekwencji flankującej
i kodującej rrn26. Orf221 jest nor­
malnym genem mitochondrialnym
zawierającym sekwencję hom olo­
giczną z odpowiednią sekwencją
chloroplastowego genu trnR po­
chodzącego z tytoniu. Wg [1] zm o­
dyfikowano.
I ... 1 sekwencja atpó
H H sekwencja rrn26
sekwencja o nieznanym
pochodzeniu
sekwencja orf221
sekwencja chloroplastowe­
104 pz go trnR tytoniu
dioaktyw nych am inokw asów w m itochondriach izo­
low anych ze sterylnych i płodnych roślin. D ru g a
m eto d a w ykorzystuje przeciw ciała skierow ane przeciw
syntetycznem u peptydow i skonstruow anem u n a p o d ­
stawie sekwencji genu skorelow anego z m ęskosteryl­
nością. Stosując te m etody, najwcześniej w ykryto
białko U R F 13 o m asie 13 kD a, w ystępujące tylko
w C M S typu T kukurydzy [1, 63]. P o d o b n e b ad an ia
um ożliwiły rozpoznanie p ro d u k tó w genów chim eral­
nych u petunii (gen p c f białko o m asie 25 kD a) [1, 64],
u rzodkiew ki (orf 138, białko o m asie 20 kD a) [65],
u pszenicy (orf256, białko o m asie 7 kD a) [66]
i u słonecznika (orfC, białko o m asie 15 kD a) [67, 68].
C echą w spólną tych białek jest ich lokalizacja w błonie
m itochondrialnej. Jed n ak sposób ich połączenia z b ło ­
n ą jest najpraw dopodobniej różny [1].
IV. Geny przywracające płodność
Jak już w spom inano, fenotypow e ujaw nienie się
m itochondrialnej m utacji odpow iedzialnej za C M S
jest uzależnione od jądrow ej inform acji genetycznej.
Z b ad a ń wynika, że większość genów jąd ro w y ch
przyw racających płodność działa posttranskrypcyjnie
i/lub posttranslacyjnie [1-3]. P o w o d u ją one zm iany
lokalizacji końców tran sk ry p tó w regionów skorelow a­
nych z cechą C M S [69, 70] i/łub inne stosunki
ilościowe m iędzy tran sk ry p tam i [57]. W konsekw encji
obserw uje się obniżenie ilości [6 4 ,6 5 ,7 1 ] lub brak [66]
białek charakterystycznych dla cytoplazm m ęsko-
sterylnych. Stw ierdzono, że redukcja poziom u tych
białek m oże zachodzić tylko w pew nych częściach
rośliny, n a przykład w tkance rozrodczej fasoli zwykłej
[71], w kw iatach i liściach rzodkiew ki [65]. Ciągle
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
je d n a k bard zo m ało w iadom o o m echanizm ach opisa­
nych zm ian. N iedaw no, p róbując w yjaśnić działanie
genu Rf-1 w procesie przyw racania płodności u ryżu
za p ro p o n o w an o hipotezę [50], zgodnie z k tó rą gen ten
koduje enzym uczestniczący w dojrzew aniu p re k u r­
so ra m tR N A jednej z kopii genu atpó. K o p ia ta jest
obecna wyłącznie w m itochondriach roślin sterylnych.
B adania wykazały, że tylko m tR N A pow stały w w yni­
ku działania tego enzym u m oże być efektywnie redago­
wany, tak aby następnie m ógł stanow ić m atrycę do
syntezy funkcjonalnego białka. P o d nieobecność re-
sto rera nieprzekształcony tran sk ry p t nie jest praw i­
dłow o redagow any, a syntetyzow ane białko jest zm ie­
nione i zab u rza dojrzew anie pyłku przez obniżenie
aktyw ności A TPazow ej.
W śród restorerów w yjątkow ym działaniem ch a rak ­
teryzuje się jeden z jąd ro w ych genów przyw racających
płodność m ęskosterylnej linii fasoli zwykłej [72, 73].
P ow oduje on usunięcie regionu m tD N A odpow ie­
dzialnego za sterylność poprzez elim inację cząsteczki
zaw ierającej ten region [16]. W zw iązku z tym , naw et
po jego usunięciu, kolejne pokolenia roślin są płodne.
Z ostatn ich b ad a ń wynika, że zm iana stru k tu ry geno­
m u m itochondrialnego k ierow ana tym genem zach o ­
dzi w czasie rozw oju kw iatu, jest zależna od ekspresji
regionu C M S oraz w ym aga dw óch alleli dom inujących
do trw ałego przyw rócenia płodności [74].
O becnie trw ają b ad a n ia n ad lokalizacją genów
restorerów [8 ,7 5 ], ale żaden z nich nie został ja k d o tąd
sklonow any i zsekw encjonow any.
V. Lokalizacja i funkcja URF13
Białko U R F 13 jest odpow iedzialne nie tylko za
C M S typu T u kukurydzy, ale rów nież za jej w raż­
liwość n a grzybow e toksyny H m T i P m oraz ich
funkcjonalny an alo g — środek ow adobójczy m etom yl
[76]. D ziałanie toksyn i m etom ylu pow oduje pęcz­
nienie m itochondriów , rozprzęgnięcie fosforylacji
oksydacyjnej, zaham ow anie oddychania, zwiększenie
przepuszczalności błony, co w konsekw encji d o p ro w a­
dza do m asow ego „przecieku” jonów . O bjaw ów tych
nie obserw ow ano w m ito ch o n d riach roślin płodnych.
B rak efektywnego sposobu transform acji k u k u ry ­
dzy spow odow ał zastosow anie innych organizm ów do
b a d a n ia roli U R F13. T ransform acja E. coli potw ier­
dziła jego bło n o w ą lokalizację i odpow iedzialność za
wrażliw ość n a toksyny i m etom yl [77]. D rożdże
rów nież staw ały się wrażliwe n a toksyny i m etom yl, ale
tylko w tedy gdy p ro d u k t translacji zakotw iczał się
w błonie wewnętrznej m itochondriów [78, 79]. D late­
go były one transform ow ane genem chim eralnym
złożonym z genu u rfl3 i m itochondrialnej sekwencji
kierującej. W obecności m etom ylu transform anty
drożdżow e w ykazyw ały b rak aktyw ności oddechow ej.
B adan ia transgenicznego ty to n iu pokazały, że p ro d u k t
genu u rfl 3 nie m usi być zw iązany z b łoną m itochon-
drialną, aby te rośliny w ykazyw ały wrażliw ość na
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
toksyny [3]. G dy białko U R F 13 zlokalizow ane jest
w m itochondriach, staje się toksyczne dla tytoniu.
P row adzone są rów nież intensyw ne b ad a n ia stru k ­
tury kom pleksu U R F 13 z toksynam i (lub m etom ylem )
[80]. Zw iązane z b łoną białko jest receptorem toksyn
i w w yniku oddziaływ ania pom iędzy nim i tw orzą się
hydrofilow e pory w wewnętrznej błonie m ito ch o n ­
drialnej.
M im o ogrom nego postępu w zrozum ieniu zw iązku
białka U R F 13 z w rażliw ością m itochondriów C M S-T
kukurydzy n a toksyny i m etom yl, sposób, w jak i to
białko zaburza rozwój pręcików , jest ciągle nieznany.
W edług hipotezy F l a v e l l a [81] pręciki zaw ierają
organospecyficzne białko oddziałujące z U R F 13 tak
ja k grzybow e toksyny i m etom yl.
VI. Zastosowanie w hodowli
M ęskosterylne rośliny są od daw na w ykorzystyw a­
ne w hodow li odm ian m ieszańcow ych [82, 83], O trzy ­
m ane z nich rośliny przew yższają swoich rodziców
wielkością plonów , o dpornością n a choroby i zm iany
środow iskow e. Użycie linii m ęskosterylnych ja k o żeń­
skiego p artn e ra w krzyżów ce w yklucza niebezpieczeń­
stwo sam ozapylenia, dzięki tem u nie m a potrzeby
ręcznego usuw ania pręcików. B ardzo często rośliny
pokolenia F I są rów nież m ęskosterylne. N ie m a to
znaczenia, jeśli pro d u k tem w ażnym dla hodow cy są
tk an k i w egetatyw ne (liście tytoniu, bulw y ziem niaka).
Jeśli nato m iast rośliny są upraw iane dla nasion, ja k
w przypadku słonecznika czy kukurydzy, płodność
m ieszańca jest niezbędna. W takiej sytuacji ja k o p a r­
tn era m ęskiego stosuje się linię zaw ierającą w swym
genom ie restorery. Linie C M S po skrzyżow aniu z tak ą
linią d ają płodne potom stw o.
N ajstarszym sposobem otrzym yw ania roślin m ę­
skosterylnych w hodow li jest krzyżow anie konw en­
cjonalne. Stosuje się rów nież som atyczną hybrydyza­
cję, której celem jest przeniesienie cechy C M S z je d ­
nego g atu n k u do drugiego [3]. W czasie fuzji p ro to ­
plastów m oże nastąpić rekom binacja rodzicielskich
genom ów m itochondrialnych — pow staje w tedy nowy
typ genom u. D o takiej rekom binacji nie m oże dojść
w czasie krzyżow ania konw encjonalnego, poniew aż
roślinie potom nej przekazyw any jest wyłącznie genom
m itochondrialny linii m atecznej. O statn io pokazano,
że sterylność roślin m ożna wywołać, stosując m etody
inżynierii genetycznej [2, 83]. R ośliny transform uje się
genem zaburzającym rozwój pręcików , którego eks­
presja regulow ana jest przez p ro m o to r aktyw ny jed y ­
nie w tej części rośliny. R ybonukleaza, pow stająca
wyłącznie w tap etu m dzięki specyficznemu dla tej
tkanki prom otorow i, pow odow ała m ęskosterylność
transgenicznego tytoniu i rzepaku [84]. Tego sam ego
p ro m o to ra użyto do ekspresji in h ib ito ra rybonukleazy
w innych roślinach transgenicznych działających
w krzyżow aniu tak, ja k linie przyw racające płodność
[85]. S tw orzono w ten sposób sztuczny system z genem
257
pow odującym sterylność i genem działającym jak
restorer.
VII. Uwagi końcowe
M oże pow stać pytanie, dlaczego defekt m itochon-
driów , obecnych przecież we w szystkich tk an k ach
rośliny, w sposób specyficzny upośledza pyłek. F a k t
ten tłum aczy się w zrostem ilości m itochondriów w cza­
sie rozw oju m ęskich kom órek rozrodczych [86]. Licz­
b a m itochondriów w zrasta w tedy dw udziestokrotnie
w tk ance sporogenicznej, a w tap etu m — aż czterdzies­
to krotnie. M u tacja w genom ie m itochondrialnym m o ­
że więc mieć o wiele bardziej drastyczne konsekw encje
dla rozw oju pyłku niż dla innych procesów nie w ym a­
gających tak dużej aktyw ności m itochondriów [1].
M ożliwe jest również, że zwiększenie liczby m ito ch o n ­
driów d o p ro w ad za do w zrostu ilości białka m itochon-
drialnego, k tó re jest toksyczne dla kom órek roślin­
nych. Sugeruje się również, że białka w ystępujące tylko
w pręcikach od p o w iadają za organospecyficzne ujaw ­
nianie się m utacji m itochondrialnej [81].
M im o niew ątpliw ego postępu w identyfikacji m ito-
chondrialnych regionów , specyficznych transkryptów
i białek zw iązanych z C M S, m olekularny m echanizm
w yw oływ ania sterylności przez te b iałka jest ciągle
hipotetyczny. W yjaśnienie jest tru d n e ze względu na
b rak bezpośredniej m etody transform acji m ito ch o n ­
driów roślinnych. C oraz powszechniej uw aża się, że
m echanizm ten nie jest uniw ersalny, a raczej specyficz­
ny dla każdego ty p u CM S.
A rtyku ł otrzym ano 5 grudnia 1995 r.
Zaakceptow ano do druku 20 marca 1996 r.
Piśmiennictwo
1. H a n s o n M R (1991) Annu Rev Genet 25: 461-486
2. N a i r C K K (1993) J Biosci 18: 407-422
3. V e d e l F, P 1a M, V i t a r t V, G u t i e r r e s S, C h e t r i t P,
D e P a e p e R (1994) Plant Physiol Biochem 32: 601-618
4. J o h n s C, L u M, L y z n i k A, M a c k e n z i e S (1992) Plant
Cell 4: 435-449
5. W a r m k e H E , L e e S L J (1977) J Hered 68: 213-22
6. T a n a k a I (1993) J Plant Res 106: 55-63
7. K o f e r W, G l i m e l i u s K, B o n e t t H T (1991) The Plant
Cell 3: 759-769
8. W i s e R P , S c h n a b l e P S (1994) Theor Appl Genet 88:
785-795
9. D e w e y RE, L e v i n g s s C S I I I , T i m o t h y D H (1986)
Cell 44: 439-449
10. P a l m e r J D , H e r b o n L A (1987) Curr Genet 11: 565-570
11. W a r d BL, A n d e r s o n RS, B e n d i c h A J (1981) Cell 25:
792-803
12. B o n e n L (1991) Curr Opinion in Genet and Develop 1: 515-522
13. B e n d i c h A J, S m i t h S (1990) Curr Genet 17: 421-425
14. B e n d i c h A J (1993) Curr Genet 24: 279-290
15. Y a m a t o Y, O g u r a Y, K a n e g a e T, Y a m a d a Y,
O h y a m a K (1992) Theor Appl Genet 83: 279-288
16. J a n s k a H, M a c k e n z i e S A (1993) Genetics 135: 869-879
17. A n d r e C P , W a l b o t V (1995) M ol Gen Genet 247: 255-263
18. F o l k e r t s O, H a n s o n M r (1991) Genetics 129: 885-895
19. P a l m e r J D, S h i e l d s C R (1984) Nature (Lond) 307:
437-440
258
http://rcin.org.pl
20. L o n s d a l e D M (1984) Plant M ol Biol 3: 201-206
21. S t e r n DB, P a l m e r J D (1984) Nucleic Acids Res 12:
6141-6157
22. L o n s d a l e D M , B r e a r s T, H o d g e T P , M e l v i l l e SE,
R o t t m a n n W H (1988) Phil Trans R Soc Lond B 319:149-163
23. C o n k l i n P, H a n s o n M (1993) Curr Genet 23: 477-482
24. F a u r o n C, C a s p e r M, G a o Y, M o o r e B (1995) Trends
Genet 11: 228-235
25. A n d r e C, L e v y A, W a l b o t V (1992) Trends Genet 8:
128-132
26. S m a l l I D, I s a a c P G , L e a v e r C J (1987) EM BO J 6:
865-869
27. S m a l l I D, S u f f o l k R, L e a v e r C J (1989) Cell 58: 69-76
28. P a l m e r J D, H e r b o n L A (1988) J M ol Evol 28: 87-97
29. W i s s i n g e r B, B r e n n i c k e A, S c h u s t e r W (1992)
Trends Genet 8: 322-328
30. P a l m e r J D (1990) Trends Genet 6: 115-120
31. W a t a n a b e N, N a k a z o n o M, K a n n o A, T s u t s u m i
N, A t s u s h i H (1994) Curr Genet 26: 512-518
32. L e v i n g s I I I CS, B r o w n G G (1989) Cell 56: 171-179
33. F i n n e g a n P M , B r o w n G G (1986) Proc N atl Acad Sci
USA 83: 5175-5179
34. F o l k e r t s O, H a n s o n M (1991) Genetics 129: 885-895
35. B o n h o m m e S, B u d a r F, F e r a u l t M, P e l l e t i e r
G (1991) Curr Genet 19: 121-127
36. D u d a r e v a NA, P o p o v s k y AV, K a s j a n o v a UV,
Y e p r e v SG, M g l i n e t s AV, S a l g a n i k R I (1991) Theor
Appl Genet 83: 217-224
37. H o l f o r d P, C r o f t J H, N e w b u r y H J (1991) Theor Appl
Genet 82: 737-744
38. R o u w e n d a l G J A , C r e e m e r s - M o l e n a a r J, K r e n s
F A (1992) Theor Appl Genet 83: 330-336
39. S a n e A P, N a t h P, S a n e P Y (1994) J Biosci 19: 43-45
40. S a u m i t o n - L a p r a d e P, R o u w e n d a l G J A , C u g u -
e n J, K r e n s F A, M i c h a e l i s G (1993) Theor Appl Genet
85: 529-535
41. R a j e s h w a r i R, S i v a r a m a k r i s h n a n S, S m i t h RL,
S u b r a h m a n y a n i N C (1994) Theor Appl Genet 88:441-448
42. S i c u l e l l a L , P a l m e r J D (1988) Nucleic Acid Research 16:
3787-3799
43. F a u r o n C, H a v l i k M (1989) Curr Genet 15: 149-154
44. L ’ H o m m e Y , B r o w n G G (1993) Nucleic Acid Research 21:
1903-1909
45. C h a s e C D, O r t e g a V M (1992) Curr Genet 22: 147-153
46. K o h l e r R H, H o r n R, L o s s l A, Z e t s c h e K (1991) Plant
Cell 3: 369-376
47. Y o u n g E G, H a n s o n M R (1987) Cell 50: 41-49
48. B a i l e y - S e r r e s , H a n s o n D K , F o x T D , L e a v e r C J
(1986) Cell 47: 567-576
49. S e n d a M, D a g l e s s E, H o d g e R, P a u l W, P e t e r s o n
P A, S a e d l e r H (1991) Curr Genet 19: 175-181
50. I w a b u c h i M, K y o z u k a J, S h i m a m o t o K (1993)
EM BO J 12: 1437-1446
51. P r i o l i L, H u a n g J, L e v i n g s C S I I I (1993) Plant M ol
Biol 23: 287-295
52. G r a y M, H a n i c - J o y c e PJ , C o v e l l o P S (1992) Annu
Rev Plant Physiol M ol Biol 43: 145-175
53. C h a s e C D (1994) Curr Genet 25: 245-251
54. S i n g h M, B r o w n G (1993) Curr Genet 24: 316-322
55. A k a g i H, S a k a m o t o M, S h i n j y o C, S h i m a d a H,
F u j i m u r a T (1994) Curr Genet 25: 52-58
56. S o n g J, H e d g c o t h C (1994) Genome 37: 203-209
57. P r u i t t K D , H a n s o n M R (1991) M ol Gen Genet 227:
348-355
58. M a k a r o f f C , A p e l I J, P a l m e r J D (1991) Curr Genet 19:
183-190
59. S e n d a M, H a r a d a T, M i k a m i T, S u g i u r a M, K i n o -
s h i t a T (1991) 19: 175-181
60. M a k a r o f f C, A p e l I, P a l m e r J D (1990) Plant M ol Biol
15: 735-746
61. H e r n o u l d M, S u h a r s o n o S, L i t v a k S, A r a y a A,
M o u r m a s A (1993) Proc N atl Acad Sci 90: 2370-2374
62. S t a h l R, S u n S, L ’ H o m m e Y, K e t e l a T, B r o w n G G
(1994) Nucl Acids Res 22: 2109-2113
63. W i s e RP , F l i s s AE, P r i n g D R , G e n g e n b a c h B G
(1987) Plant M ol Biol 9: 121-126
64. N i v i s o n H T , H a n s o n M R (1989) Plant Cell 1:1121-1130
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 65. K r i s h n a s a m y S, M a k a r o f f C A (1994) Plant M ol Biol
26: 935-946
66. S o n g J , H e g o t h C (1994) Plant M ol Biol 26: 535-539
67. H o r n R, R a i n e r H K , Z e t s c h e K (1991) Plant M ol Biol
17: 29-36
68. L a v e r H K , R e y n o l d s SJ, M o n e g e r F, L e a v e r C J
(1991) Plant J 1: 185-193
69. K e n n e l l J C , P r i n g D R (1989) M ol Gen Genet 216: 16-24
70. S i n g h M, B r o w n G G (1991) Plant Cell 3: 1349-1362
71. A b a d A , M e h r t e n s B, M a c k e n z i e S (1995) Plant Cell 7:
271-285
72. M a c k e n z i e S, P r i n g D, B a s s e t t M, C h a s e C (1988)
Proc N atl Acad Sei USA 85: 2714-2717
73. M a c k e n z i e S, C h a s e C (1990) Plant Cell 2: 905-912
74. H e S, L y z n i k A, M a c k e n z i e S (1995) Genetics 139:
955-962
75. H e S, Y u Z H , V a l l e j o s CE, M a c k e n z i e (1995) Theor
Appl Genet 90: 7-8
Rola genomu jądrowego w regulacji funkcjonowania
mitochondriów Saccharomyces cerevisiae
Nuclear control of mitochondrial functions in Saccharomyces
cerevisiae
M AGDALENA BOGUTA*
Spis treści:
I. Wstęp
II. Mitochondrialny genom Saccharomyces cerevisiae
III. Mutacje mitochondrialne
IY. Dziedziczenie mitochondriów i mechanizm utrzymywa­
nia mtDNA
V. Replikacja i transkrypcja mtDNA
VI. Stabilność i obróbka transkryptów mitochondrialnych
VII. Translacja mitochondrialna
VIII. Modyfikacja, degradacja i włączanie białek mitochon-
drialnych w kompleksy
IX. Mitochondria regulują funkcję jądra komórkowego
X. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: mt — mitochondrialny; bp
— para zasad.
I. Wstęp
M ito ch o n d ria są organellam i obecnym i w praw ie
w szystkich k o m ó rk ach eukariotycznych (w yjątek sta­
now ią erytrocyty i n iektóre ameby). P odstaw ow ą
funkcją m ito ch o n d rió w jest w ytw arzanie energii w k a ­
skadzie reakcji u tleniania zachodzących w m itochon-
* Dr Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Pawióskiego
5A, 02-106 Warszawa
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
76. L e v i n g s C S I I I , S i e d o w J N (1992) Plant M ol Biol 19:
135-147
77. D e w e y RE, S i e d o w J N, T i m o t h y D H , L e v i n g s C S
(1988) Science 239: 293-295
78. G l a b N, W i s e RP , P r i n g D R , J a c q C, S l o n i m s k i
P (1990) M ol Gen Genet 223: 24-32
79. H u a n g J, L e e SH, L i u C, M e d i c i R, H a c k E, M y e r s
A M (1990) EM BO J 9: 339-347
80. R h o a d s D M , K a s p i Cl , L e v i n g s C S I I I , S i e d o w
J N (1994) Proc N atl Acad Sci USA 91: 8253-8257
81. F l a v e l l R (1975) Physiol Plant Pathol 6: 107-116
82. D u v i c k D N (1959) Econ Bot 13: 167-195
83. R o g e r s HJ , L o n s d a l e D M (1992) Plant Growth Regula­
tion 11: 21-26
84. M a r i a n i C, B e u e k e l e e r M D , T r u e t t n e r J, L e -
e m a n s J, G o l d b e r g R B (1990) Nature (Lond) 347: 737-741
85. M a r i a n i C, B l o c k M D , G o l d b e r g RB, G r e e f W D ,
L e e m a n s J (1992) Nature (Lond) 357: 384-387
86. W a r m k e H E , L e e S L (1978) Science 200: 561-63
Contents:
I. Introduction
II. Mitochondrial genome in yeast
III. Mitochondrial mutations
IV. Mitochondrial inheritance and maitenance of mtDNA
V. Replication and transcription of mtDNA
VI. RNA stability and splicing
VII. Mitochondrial translation
VIII. Modification, assembly and degradation of mitochond­
rial protein
IX. Mitochondrial control of nuclear functions
X. Conclusions
drialnym łańcuchu oddechow ym . W arunkiem k o m ­
petencji oddechow ej kom órki eukariotycznej jest eks­
presja genom u m itochondrialnego. System organizacji
i ekspresji m itochondrialnego D N A jest unikalny
z p u n k tu w idzenia biologii m olekularnej, choć w o b ­
rębie różnych eukariontów m tD N A w ykazuje wysokie
zróżnicow anie wielkości i ilości genów. Ilość infor­
m acji genetycznej zaw artej w m tD N A jest znikom o
m ała w poró w n an iu z inform acją pochodzącą z chro-
m osom alnego D N A i dotyczącą funkcji m itochon-
drialnych. W ysoki stopień złożoności organizacji
m tD N A i sprzężenia ekspresji genom u m ito ch o n d rial­
nego i jądrow ego sugerują, że naw et dro b n e defekty
259
Tabela 1.
Testowanie mutacji zmieniających funkcję mitochondriów S. cere­
visiae.
Typ mutacji W zrost W zrost
na glukozie na glicerolu
typ dziki + +
jądrow a, w genie kodującym
białko mitochondrialne + -
m itochondrialna + -
supresor mutacji
mitochondrialnej + —
genetyczne m ogą pow odow ać u organizm ów wyższych
krytyczne efekty patologiczne. Szybko rośnie d o k u ­
m entacja m o lek u larn a chorób człow ieka zw iązanych
z m tD N A . Z ab u rzenia funkcji m itochondrialnych
u roślin wyższych, k tó re m ogą w ynikać z defektów
w m tD N A lub niepraw idłow ej kom unikacji m itochon-
d riu m -jąd ro kom ó rk ow e m ogą prow adzić do zjaw iska
męskiej sterylności, kluczow ego dla produkcji rolnej.
D latego poznanie m olekularnych m echanizm ów regu­
lacji funkcjonow ania m itochondriów m a też ważne
znaczenie praktyczne.
S. cerevisiae jest m odelow ym organizm em służącym
do b ad a ń genetyki i funkcji m itochondrialnych gdyż,
w odróżnieniu od większości innych organizm ów , jest
fakultatyw nym anaerobem . W praktyce oznacza to, że
jeśli oddychanie nie jest możliwe, organizm jest ży­
wotny, gdyż m oże czerpać energię z procesu ferm en­
tacji. T estow anie funkcji m itochondrialnych m oże się
odbyw ać poprzez p roste m anipulow anie pożyw kam i
zaw ierającym i glukozę ja k o ferm entow alne i glicerol
lub etanol ja k o nieferm entow alne źródło węgla
(Tab. 1).
II. Mitochondrialny genom Saccharomyces
cerevisiae
m itochondrialnej R N A zy P odpow iedzialnej za o b ­
róbkę tR N A . Sekw encjonow anie ujaw niło p o n ad to
dwie ram ki odczytu, z k tórych jedna, E N S 2 , koduje
podjednostkę endonukleazy zaangażow anej w rek o m ­
binację m tD N A . Sekwencje intronow e, często w p o łą ­
czeniu z poprzedzającym i eksonam i, k o dują e n d o n u k ­
leazy odpow iedzialne za propagację in tro n ó w oraz
m atu razy w ym agane do obró b k i m itochondrialnych
transkryptów . m tD N A drożdży nie zaw iera genów k o ­
dujących podjednostki N A D H dehydrogenazy, obec­
nych w większości m tD N A innych organizm ów [3].
C harakterystyczną cechą m tD N A drożdży jest nie­
zwykle niska zaw artość p ar G C (18%), k tó re tw orzą
skupiska. Poszczególne geny są rozdzielone długim i
sekw encjam i AT o nieznanej funkcji. W ysoce h o m o ­
logiczne sekwencje bogate w G C o długości 50-100 bp
odgryw ają praw d o p o d o b n ie rolę w procesach rearan -
żacji m tD N A [4]. M itochondrialny genom drożdży
w ykazuje stosunkow o w ysoką zm ienność ze względu
n a m ożliw ość tw orzenia delecji o dużym zasięgu [5]
oraz duplikacji i transpozycji intronów .
U drożdży, ja k też u grzybów nitkow atych, ob ser­
wuje się rów nież frapujące zjaw isko m igracji m tD N A
do ją d ra kom órkow ego, k tó re p raw dopodobn ie o d ­
gryw a rolę w ewolucji. W genom ie jądrow ym drożdży
zidentyfikow ano sekwencje pochodzące z m tD N A [6].
W ędrów kę D N A z m itochondriów do ją d ra b ad a n o
eksperym entalnie i zidentyfikow ano jąd ro w y gen
Y M E I odpow iedzialny za to zjaw isko [7]. T ransm isja
m ateriału genetycznego z m tD N A do ją d ra k o m ó r­
kow ego wiąże się z procesem starzenia u N eurospora
crassa.
K lasyczne m etody transform acji są zaw odne przy
Tabela 2.
P rodukty genów m itochondrialnych Saccharomyces cerevisiae.
gen/intron kodowany produkt

COXI podjednostką I oksydazy cytochrom u c

D N A m ito ch o n d rialny (m tD N A ) S. cerevisiae jest intron ail m aturaza ail
kolistą cząsteczką o wielkości 74-85 kb, w zależności intron ai2 m aturaza ai2
od szczepu i stanow i 5-15% całkow itego D N A k o m ó r­ intron ai3 endonukleaza IS celll
kow ego [1]. K o ło w a m ap a m tD N A jest przedstaw io­ intron ai4 endonukleaza IScell
intron ai5a endonukleaza IScelV
n a na rycinie 1. N ależy jed n ak pam iętać, że cząsteczki
intron ai5b
koliste stan o w ią tylko część populacji m tD N A S. COX2 podjednostką II oksydazy cytochrom u c
cerevisiae, k tó ra w w arunkach in vivo zaw iera także COX3 podjednostką III oksydazy cytochromu c
długie liniow e k o n k atam e ry [2]. A TP6 podjednostką VI ATPazy
P o zn an o dotychczas sekwencję 92% m tD N A S. ATP8 podjednostką VIII ATPazy
A TP9 podjednostką IX ATPazy
cerevisiae. A nalogicznie ja k w m tD N A innych organi­
COB cytochrom b
zm ów, w skład m tD N A drożdży w chodzą dw a geny intron bi2 m aturaza bi2
kodujące rR N A , pełen zestaw genów tR N A oraz geny intron bi3 m aturaza bi3
kodujące n iek tó re podjednostki enzym ów oddecho­ intron bi4 m aturaza bi4
wych (Tab. 2). D w a geny kodujące białka (COB i COXI, VARI białko rybosomalne
E N S2 endonukleaza
p atrz Ryc. 1) oraz gen L S U kodujący 21S rR N A po sia­ ?
RF1, RF2
d ają introny. D o d atk o w e geny, V A R I i R P M I, które LSU rybosomalny RNA 21S
nie zawsze m ają swoje odpow iedniki w m ito ch o n d rial­ intron co endonukleaza IScel
nych genom ach innych organizm ów , k o d u ją białko SSU rybosomalny RNA 15S
V a rlp zw iązane z m ałą p o d jed n o stk ą rybosom ów RPM I składnik RNA m t RNAzy P
25 genów tRNA komplet m t tRNA
m ito ch o n d rialn y ch oraz R N A w chodzące w skład

260 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 w p row adzaniu D N A do m itochondriów . Sukces osią­
gnięto b o m b ard u jąc k om ó rk i cząstkam i m etali p o ­
krytym i D N A . U d ało się w ten sposób w prow adzić do
m ito ch o n d rió w fragm enty m tD N A , k tó re były stabil­
ne i ulegały replikacji [8, 9].
III. Mutacje mitochondrialne
W spólną cechą m u tan tó w m itochondrialnych S.
cerevisiae jest b ra k zdolności do w zrostu n a pożywce
zaw ierającej nieferm entow alne źródło węgla. W yróż­
n ia się trzy podstaw ow e typy m utacji zw iązanych
z defektam i oddechow ym i: mit ~, rho ~ i rho0. M utacje
m it~ są to m utacje pu n ktow e lub m ałe delecje w ge­
nach kodujących b iałka w chodzące w skład enzym ów
oddechow ych. Z asadniczo efektem m utacji mit~ jest
b ra k syntezy lub aktyw ności pojedynczego białka.
M utacje mit~ w in tro n ac h m itochondrialnych m ogą
m ieć bardziej skom plikow ane fenotypy [10].
M utacje rho ~ zw ane petite, są ogrom nym i delecjam i
obejm ującym i co najm niej 50% całej cząsteczki
m tD N A . Z achow any odcinek ulega kom pensacyjnej
am plifikacji, prow adzącej w efekcie do odtw orzenia
cząsteczki m tD N A o wielkości odpow iadającej
m tD N A szczepu dzikiego. F ragm enty m tD N A za­
chow ane u m u tan ó w rho~ są wiernie replikow ane,
choć nie m uszą zaw ierać miejsc inicjacji replikacji [11].
m tD N A m oże być także całkow icie w ydeletow any
i takie szczepy nazyw am y rho0.
P odstaw ow ym problem em , nie do ko ń ca rozstrzy­
gniętym przez genetyków , jest segregacja w ielokopij-
nych genom ów m itochondrialnych, k tó ra nie stosuje
się do klasycznych praw M endla. Jeśli z dw óch k o m ó ­
rek o genetycznie różnych m tD N A tw orzy się zygota
lub jeśli w pojedynczej cząsteczce m tD N A pow staje
m u tacja to m am y do czynienia z k o m ó rk ą heteroplaz-
m atyczną. Bez w zględu n a to w ja k i sposób tw orzy się
hetero g en n a po p u lacja m tD N A , obserw uje się szybką
segregację m ito ch o n d rialnych genom ów w czasie k o ­
lejnych podziałów i utw orzenie populacji hom ogennej
[12]. N ie d o kładnie w iadom o w jak i sposób określony
w arian t genom u m t osiąga przew agę selektyw ną n ad
całą populacją. Szczególna sytuacja dotyczy hetero-
plazm atycznego d iploida pow stałego w w yniku krzy­
żów ki pom iędzy szczepem rho+ i szczepem rho~ . Jeśli
sekw encja am plifikow ana w m utancie rho~ zaw iera
jeden z głów nych startó w replikacji (Ryc. 1), to m oże
zajść sytuacja, że genom rho~ będzie się replikow ał
szybciej niż rh o +. M am y w tedy do czynienia ze zjaw is­
kiem supresyjności petitów .
Stw ierdzono, że m tD N A tw orzy w kom órce agrega­
ty zw ane chondrillam i, k tó re m ożna uznać za niezależ­
nie segregujące „jednostki” m tD N A . Skłonność
m tD N A do agregacji zw iązana jest z w ydajną rek o m ­
binacją. Ilość chondrilli zależy od p ro d u k tu genu
M G T l, endonukleazy przecinającej złącza rekom bina-
cyjnych stru k tu r D N A . Inaktyw acja genu M G T1 p o ­
w oduje zm niejszenie ilości chondrilli, a co za tym idzie
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
zwiększenie w ydajności rekom binacji i zmniejszenie
ilości podziałów w ym aganych do osiągnięcia h o m o ­
gennej populacji m tD N A [13].
IV. Dziedziczenie mitochondriów i mecha­
nizm utrzymywania mtDNA
T ransm isja m itochondriów do kom órki potom nej
zależy od szeregu genów jądrow ych, których funkcje
nie są do końca znane. W kom órce drożdży obser­
w ow ano ułożenie m itochondriów w zdłuż w łókien a k ­
tyny [14]. Z nane są m u tan ty w genie kodującym
aktynę A C T l, w których m orfologia i dziedzicze­
nie m itochondriów są zaburzone [15]. Przypuszcza
się, że białko analogiczne do m iozyny pośredniczy
w A TP-zależnym w iązaniu m itochondriów do w łókien
aktyny, a konsekw encją tych oddziaływ ań jest stero­
w anie ruchem m itochondriów wzdłuż torów w yzna­
czonych przez cytoszkielet, czyli k o n tro la pozycji
m itochondriów w kom órce oraz ich transm isja do
kom órki potom nej w czasie podziału. N iezależnie od
cytoszkieletu aktynow ego sugeruje się istnienie w k o ­
m órce drożdży stru k tu ry m ikrofilam entów , k tó ra jest
zaangażow ana w proces dystrybucji organelli. O pisa­
no m u ta n ta m dm l, k tó ry w tem peraturze restryktyw ­
nej wykazuje b rak transm isji ją d ra i m itochondriów do
kom órki potom nej [16]. G en M D M 1 koduje białko
niezbędne dla kom órki, które w ykazuje podobieństw o
sekwencji do białek ludzkich, będących składnikam i
cytoplazm atycznej siateczki m ikrofilam entów . Innym
dow odem n a pow iązanie m itochondriów z cytoszkie-
letem jest zm ieniona m orfologia i degradacja m tD N A
w m u tan tach w genie M G M 1, który koduje dynam inę,
białko wiążące m ikrotubule [17]. N iezależnie stw ier­
dzono, że zm iany w cytoszkielecie w yw ołane m utacją
w genie V PR1/M D P 2 kodującym w erprolinę w pływają
pośrednio n a funkcje m itochondrialne zm ieniając
tran sp o rt białek do m itochondriów [18].
D rugim , poza cytoszkieletem , elem entem zasad n i­
czym dla dystrybucji m itochondriów jest właściwa
stru k tu ra błon. C harak tery sty k a m u ta n ta mdm2 w ska­
zuje na niezbędny udział nienasyconych kw asów tłusz­
czowych w dziedziczeniu m itochondriów . W tem p era­
turze restryktyw nej nie następuje w m utancie mdm2
transm isja m itochondriów do pączka kom órki p o to m ­
nej, podczas gdy inne organelle są przenoszone p raw i­
dłowo. Białko M dm 2p jest desatu razą A 9 kw asów
tłuszczowych [19].
Aby zapew nić kom órce kom petencję oddechow ą,
transm isji m itochondriów w czasie podziału m usi
tow arzyszyć przenoszenie m tD N A . D o k ład n y m echa­
nizm segregacji m tD N A i m olekularny m echanizm
kontroli tego procesu nie są do końca poznane.
W iadom o, że stabilność genom u m itochondrialnego
rho+ w ym aga aktyw nej translacji m itochondrialnej,
czego nie w ym aga dziedziczenie genom u rho~ [20].
N ie w iadom o jed n ak czym różni się m echanizm za­
pew niający stabilność genom u rho+, od analogicznego
 m echanizm u dla genom u rho~. Istnieje możliwość, że
uboczny p ro d u k t translacji m itochondrialnej uczest­
niczy w replikacji lub transm isji m tD N A rho +, a jest
zbędny dla u trzy m an ia m tD N A rho~ [3]. P odobnie
nie w iadom o, n a jakiej zasadzie do stabilności m tD N A
w ym agana jest obecność p ro d u k tu genu P IM 1 , prote-
azy odpow iedzialnej za degradację niepraw idłow o
fałdow anych białek im portow anych do m itochond-
riów [21]. W ykryto też ostatnio interesujące pow iąza­
nie m iędzy syntezą am inokw asów a stabilnością
m tD N A . Stw ierdzono, że inaktyw acja genu ILV5
kodującego reduktoizom erazę kw asu hydroksyocto-
wego, k tó ra katalizuje jeden z etapów syntezy am in o ­
kw asów o łańcuchu rozgałęzionym , pow oduje nie­
stabilność m tD N A [22].
Istnieje ścisła zależność m iędzy żyw otnością k o m ó r­
ki, m ito ch o n d riam i i funkcjonalnym m tD N A . Ja k k o l­
wiek m ito ch o n d ria są absolutnie niezbędne dla życia
kom órki, u tra ta funkcjonalnego m tD N A jest to lero ­
w ana przez S. cerevisiae [23]. Istnieją jed n ak m utanty,
k tó re nie toleru ją u traty lub degradacji m tD N A .
T olerancja ta jest w aru n k o w an a poprzez oksydacyjną
fosforylację; szczepy z m utacją opl w genie kodującym
przenośnik A D P /A T P są letalne w połączeniu z geno­
m em m ito ch o n d rialn ym rho~ [224]. W arunkiem u tra ­
ty funkcjonalnego m tD N A jest zatem aktyw na fosfory­
lacja oksydacyjna. L e ta ln o ść m u tan tó w rho~ p o w o d u ­
ją także m utacje w genie YME1 odpow iedzialnym za
m igrację m tD N A do ją d ra kom órkow ego [7].
V. Replikacja i transkrypcja mtDNA
W zależności od szczepu drożdży, m tD N A zaw iera
7-8 startó w replikacji (ori), k tó re zidentyfikow ano na
podstaw ie pod o b ień stw a sekwencji do analogicznych
startó w w D N A innych organizm ów [25]. D elecja
przynajm niej trzech sekwencji startow ych (ori 1, 2 i 7)
pozostaje bez efektu, podczas gdy inne starty (ori 3) są
konieczne do przebiegu replikacji [3]. Z identyfikow a­
n a szereg lat tem u m ito ch o n d rialn a polim eraza D N A
nigdy nie zo stała oczyszczona [26]. P raw d o p o d o b n ie
enzym ten jest k o d o w any przez jąd ro w y gen M IP 1
[27], k tó ry w ykazuje podobieństw o sekwencji poli-
m erazy m tD N A do polim eraz E. coli, bakteriofagów
i eukariontów . O napraw ie uszkodzeń w m tD N A
niewiele w iadom o; p raw d o p o d o b n ie białko kodow ane
przez gen jąd ro w y M S H 1 , hom olog genu M u tS z E.
coli, uczestniczy w napraw ie postreplikacyjnej typu
„m ism atch” [28]. Z identyfikow ano dw a b iałka k o d o ­
wane w jąd rz e zw iązane z rekom binacją m tD N A :
endonukleazę k o d o w an ą przez gen M G Tl (patrz
Rozdz. III) oraz A T P -zależną D N A helikazę k o d o ­
w aną przez gen P IF 1 [29]. W iadom o, że gen PIF1
kontro lu je rów nocześnie długość telom erów w D N A
jądrow ym . P IF1 stanow i ciekawy przykład genu,
k tó ry poprzez w ykorzystanie dw óch alternatyw nych
startó w translacji koduje dw a b iałka różniące się
sekwencją N -k o ń c a — białko dłuższe kierow ane do
262
http://rcin.org.pl
m itochondriów i białko krótsze tran sp o rto w an e do
ją d ra kom órkow ego [30].
T ranskrypcja m tD N A zachodzi z udziałem m ito ­
chondrialnej polim erazy R N A kodow anej przez gen
jąd ro w y R P 0 4 1 . Białko to przypom ina raczej p oli­
m erazy R N A bakteriofagów T3, T7 i SP6 niż R N A
polim erazy eukariotyczne [31]. M ito ch o n d rialn a poli­
m eraza R N A w spółdziała z czynnikiem transkrypcyj-
nym kodow anym przez gen M T F 1 i przypom inającym
bakteryjny czynnik 8 [31]. M iejsca inicjacji tra n sk ry p ­
cji w m tD N A drożdży oznaczono n a rycinie 1. M ito ­
chondrialne tran sk ry p ty są wielogenowe, a poszcze­
gólne geny w m tD N A nie posiadają w łasnych p ro m o ­
torów , co um ożliw ia w ielostopniow y system regulacji.
P ierw otne tran sk ry p ty są cięte, a m otyw em ro z p o ­
znaw anym przez endonukleazę jest charakterystyczna
sekw encja d o dekam eru [33], m R N A nie m ają stru k ­
tury czapeczki n a 5' końcu ani posttranskrypcyjnie
syntetyzow anego poliA n a 3' końcu [3].
T ran sk ry p ty m t tR N A są d o d atk o w o przycinane na
obu końcach. W procesie o b róbki końca 5' m t tR N A
bierze udział m itochondrialny analog R N azy P. E n ­
zym ten składa się z części białkow ej kodow anej przez
jąd ro w y gen R P M 2 [34] oraz R N A kodow anego przez
m itochondrialny gen R P M 1 [35], Poszczególne zasa­
dy w m t tR N A są chemicznie m odyfikow ane z ud zia­
łem enzym ów kodow anych przez jąd ro w e geny CC A l ,
M O D 5, TR M 1 i T R M 2. P oprzez w ykorzystanie a lter­
natyw nych startó w transkrypcji i translacji geny te
k o d u ją izoenzymy, k tó re są sortow ane do różnych
k o m p artm en tó w kom órkow ych i odpow iadają za a n a ­
logiczne m odyfikacje tR N A m itochondrialnych
i tR N A cytozolow ych [36]. R ycina 2 przedstaw ia
schem atycznie ekspresję genu M O D 5 oraz lokalizację
w ew nątrzkom órkow ą pow stających izoenzym ów [37].
VI. Stabilność i obróbka transkryptów mito­
chondrialnych
3' końce tran sk ry p tó w m itochondrialnych pow stają
poprzez cięcie specyficznej dodekam erow ej sekwencji
(patrz wyżej). Sekwencja ta pełni p raw dopod o b n ie
d o d atk o w ą rolę wiążąc kom pleks białek, k tó re o d ­
pow iadają za stabilność tran sk ry p tu [38]. Stw ierdzo­
no, że w skład kom pleksu stabilizującego w chodzą
b iałka kodow ane przez geny jąd ro w e SU V 3 i DSS1
[39-41]. Sekwencje stabilizujące 5' koniec m t tra n s ­
kryptów nie zostały dotychczas scharakteryzow ane.
Z identyfikow ano szereg genów jądrow ych odpow ie­
dzialnych, w sposób bardziej lub mniej specyficzny, za
stabilność tran sk ry p tó w m itochondrialnych. O p isano
szczegółowo gen CBP1, którego ekspresja w arunkuje
specyficznie stabilność m R N A cytochrom u b [42].
D w a inne geny jądrow e, AEP1 i A E P 2, k o dują b iałka
odpow iedzialne za o b ró b k ę i trw ałość m R N A podjed-
nostki 9 A T P azy [43]. Z identyfikow ano także m u ta n ­
ty jądrow e, takie ja k SU V 3 czy N A M I, które oprócz
destabilizacji tran sk ry p tó w m iały wpływ n a w ycinanie
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 Ryc. 1 G enom m itochondrialny S. cerevi-
siae [3]. Geny kodujące rRNA
i znane białka oznaczano na czar­
no. W przypadku genów zawiera­
jących introny, na czarno oznaczo­
no kodujące sekwencje eksonowe.
Introny pozostawiono białe,
a w przypadku intronów, które
występują tylko w niektórych
szczepach drożdży, zaznaczono
miejsca ich insercji. Introny grupy
II oznaczono gwiazdką. N a biało
oznaczono także geny kodujące
hipotetyczne białka RF1, RF2
i ENS2. Geny tRN A oznaczono
według odpowiednich aminokwa­
sów w kodzie jednoliterowym. Cyf­
ry podano dla tRN A izoakceptoro-
wych. Miejsca występowania sek­
wencji startu replikacji oznaczono
białymi trójkącikami, zaś miejsca
startu transkrypcji — czarnymi
trójkącikami.

in tro n ó w m itochondrialnych. G en SU V 3 koduje heli-
kazę RNA, a p ro d u k t genu N A M I nie w ykazuje
istotnego po d o b ień stw a do innych białek [40, 44, 45].
Trzy geny m ito ch o ndrialne S. cerevisiae, C O X I,
COB i L S U zaw ierają intro n y (Ryc. 1). Ilość in tro n ó w
jest zależna od szczepu; gen C O X I zaw iera m aksym al­
nie 7 intronów , gen COB — m aksym alnie 5 intronów ,
zaś gen L S U p o siad a 1 in tro n lub występuje w formie
bezintronow ej. S k o n struow ano szczep laboratoryjny,
k tó ry nie posiad ał w ogóle in tro n ó w m ito ch o n d rial­
nych. B rak in tro n ó w nie wywołuje zauw ażalnych
zm ian fenotypow ych i nie zab u rza funkcji m ito ch o n ­
drialnych [46].
In tro n y m ito ch o n d rialne dzieli się n a dwie grupy (I
i II) w zależności od przew idyw anej stru k tu ry drugo-
rzędowej. W ykazano, że w w aru n k ach in vitro introny
m ito ch o n d rialn e są zdolne do sam ow ycinania, a m e­
chanizm tej reakcji różni się nieznacznie dla intronów
o b u grup [47]. W iększość in tro n ó w m ito ch o n d rial­
nych grupy I zaw iera o tw a rtą ram kę odczytu (O R F)
k od u jącą bąd ź białko uczestniczące w w ycinaniu (ma-
turazę), bądź w ro zprzestrzenianiu (endonukleazę)
kodującego je intronu. N ależą one do rodziny białek
zaw ierających charakterystyczne m otyw y sekwencji
am inokw asow ej L A G L I-D A D G . In tro n y grupy II
k o d u ją m aturazy, k tó re w ykazują znaczące pod o b ień ­
stwo sekwencji do odw rotnych tran sk ry p taz retro-
w irusów [3].
Sekwencje intronow e kodujące m atu razy są zgodne
w fazie i ciągłe z sekwencjam i poprzedzających ek-
sonów, co um ożliw ia kaskadow y proces w ycinania
kolejnych intronów przedstaw iony schem atycznie na
rycinie 3. Wycięcie pierw szego in tro n u genu COB,
niezależne od m aturazy, pow oduje połączenie się
dw óch pierw szych eksonów , B I i B2. T ranslacja obu
tych eksonów w raz z sekwencją k odującą stanow iącą
5' koniec drugiego in tro n u prow adzi do pow stania
m aturazy. K atalityczna ilość m aturazy w ystarcza do
wycięcia drugiego intronu, co prow adzi do połączenia
B I, B2 i B3. Teraz sekwencja k odująca in tro n u trzecie­
go leży bezpośrednio za sekwencją trzech połączonych
eksonów i tak m oże ulegać translacji n astęp n a m atu ra-
za, k tó ra bierze udział w w ycinaniu trzeciego intronu.
Ilość m aturazy w kom órce jest tak niska, że jej

MITOCHONDRIA CYTOPLAZMA JĄDRO KOMÓRKOWE

MOD5-M2 + +

MOD5-M1 u------------------- P U * . + +

Ryc. 2 Lokalizacja subkom órkow a powstających izoenzymów M O D 5 [37]. Dwa kodony inicjacyjne A UG są zgodne w fazie i odległe o 12
aminokwasów. Sekwencje odpowiedzialne za transport do mitochondriów przedstawiono jako czarny blok, sekwencje kierujące do
jąd ra kom órkowego zakreskowano.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 263

http://rcin.org.pl
 p re m R N A
I T ir' «
Ryc. 3 Wstępne etapy dojrzewania mRNA cytochromu
b (COB) S. cerevisiae [25]. Eksony B1-B6 zaczer­
niono, obszary 5' i 3' nie ulegające translacji
zakreskowano, zaś sekwencje kodujące w intro-
nach pozostawiono białe.
indentyfikacja jest m ożliw a jedynie w m u tan tach ,
w któ ry ch w ystępują specyficzne defekty w w ycinaniu
in tro n ó w [48].
Część in tro n ó w m itochondrialnych grupy I koduje
endonukleazy, k tó re um ożliw iają m obilność intronu,
co w ykazano m etodam i klasycznej genetyki [11].
M echanizm procesów zw iązanych z m obilnością in ­
tro n ó w grupy I przedstaw iono schem atycznie n a ryci­
nie 4 [49]. Delecje i addycje intronów m ito ch o n d rial­
nych znajdują potw ierdzenie dośw iadczalne. Z arów no
pow ielanie in tro n ó w ja k ich delecje nie w pływ ają na
funkcję oddechow ą m itochondriów . Stw ierdzono ist­
nienie spontanicznych m itochondrialnych rew ertan-
tów, w któ ry ch następuje delecja jednego lub większej
ilości intronów . D elecja in tro n u następuje dokładnie
n a granicy intron-ekson. Addycję in tro n u grupy
I w hom ologiczne miejsce genu bezintronow ego n az­
w ano “in tro n ho m in g ”. E ndonukleaza pow stała w wy­
niku translacji sekwencji intronow ej rozpoznaje specy­
ficzne miejsce w D N A hom ologicznego genu nie
DELECJA INTRONU
Gen X
Ryc. 4 Uproszczone schematy procesów
związanych z mobilnością intro­
nów m itochondrialnych [49]. Gen Y
264
http://rcin.org.pl
posiadającego in tro n u i nacina obie nici. D w uniciow a
przerw a jest n ap raw ian a n a bazie istniejącej m atrycy,
k tó rą stanow i gen w raz z intronem . T akże i sekwencje
sąsiadujące z intronem ulegają powieleniu. W b u d o w a­
ny in tro n m oże ulegać ekspresji p ro d u k u jąc endonu-
kleazę.
O statn io opisano także m echanizm addycji dla
in tro n ó w grupy II na przykładzie in tro n u ai2 genu
C O X I. Proces ten nazw ano “retro h o m in g ”, gdyż p rze­
niesienie in tro n u do allelu bezintronow ego zachodzi
poprzez o d w ro tn ą transkrypcję m R N A allelu zaw iera­
jącego intron. B iałko kodow ane przez in tro n ai2
spełnia rów nocześnie 3 funkcje: m aturazy, en d o n u ­
kleazy i odw rotnej transkryptazy, przy czym za k ażdą
z funkcji odpow iada określona dom ena białka [50].
O pisano ciekaw ą m utację w sekwencji e n d o n u ­
kleazy in tro n u czw artego genu C O X I, k tó ra k o m p en ­
suje defekt m aturazy genu COB [51]. Z atem pojedyn­
cza substytucja am inokw asu w ystarczy aby e n d o n u ­
kleaza była zdolna do funkcjonow ania ja k o m atu raza.
Gen Y
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 T ranspozycja in tro n u nie zo stała potw ierdzona d o ­
świadczalnie. O p isano jed n ak u drożdży efektywny
m echanizm ro zp rzestrzeniania się sekwencji in tro n o -
wych obejm ujący wstaw ienie sekwencji intronow ych
w niehom ologiczne m iejsca poprzez o d w ro tn ą tra n s­
krypcję i integracją pow stałego cD N A do genom u
m ito chondrialnego [52].
W procesie w ycinania in tro n ó w z m t tran sk ry p tó w
bierze także udział szereg białek kodow anych w jądrze
i tran sp o rto w an y ch do m itochondriów . W iększość
tych białek zidentyfikow ano m etodam i genetycznym i.
N iek tó re z nich uczestniczą także w m itochondrialnej
syntezie białek. W ykazano n a przykład, że m itochon-
d rialn a syntetaza tR N A k o d o w an a przez gen N A M 2
jest bezpośrednio zaan gażow ana w w ycinanie o k re­
ślonych in tro n ó w genów COB i C O X I [53, 54].
P ro d u k ty innych genów jądrow ych regulują syntezę
m atu raz, przez co m ają pośredni wpływ n a wycinanie
in tro n ó w m ito ch o n d rialnych [55].
Bezpośredni zw iązek m iędzy translacją a procesem
w ycinania in tro n ó w jest teoretycznie m ożliwy właśnie
jedynie w m ito ch o n d rialnym system ie ekspresji genów.
M ito ch o n d ria stanow ią bow iem unikalny system,
gdzie o b a procesy m ogą zachodzić „fizycznie” w tym
sam ym miejscu podczas gdy oddzielenie ją d ra k o m ó r­
kow ego k o m ó rk i eukariotycznej poprzez błonę ją d ­
row ą pow oduje ich rozdzielenie.
VII. Translacja mitochondrialna
N aszą obecną wiedzę o m itochondrialnym systemie
translacji drożdży zaw dzięczam y głównie eksperym en­
to m genetycznym . B adania biochem iczne są og ran i­
czone, gdyż do tej pory nie udało się odtw orzyć
m ito chondrialnego system u translacji in vitro. Szacuje
się, że w skład m ito chondrialnego a p a ra tu translacji
w chodzi około 150 różnych białek i cząsteczek R N A
[56]. C o najm niej 77 białek w chodzi w skład rybo-
som u m itochondrialnego, czyli m itorybosom u [57].
Z a syntezę, o bróbkę, m odyfikację i am inoacylację
m t tR N A o d p o w iad a co najm niej 50 genów. O statn ią
g rupę białek stanow ią generalne czynniki transla-
cyjne oraz specyficzne dla poszczególnych m ito c h o n d ­
rialnych tran sk ry p tó w aktyw atory translacji. N ależy
podkreślić, że m ito ch o n drialny system translacji wy­
m aga skoordynow anej ekspresji genom u jądrow ego
i m tD N A . K o m p letn y zestaw tR N A , 15S i 21S rR N A ,
a także V a rlp , jed n o z białek m itorybosom ów oraz
p o d jed n o stk a enzym u odpow iedzialnego za o b róbkę
m t tR N A są k o dow ane w m t D N A . W szystkie, poza
V a rlp , b iałka m ito ry b o som ów oraz pozostałe skład­
niki a p a ra tu translacji są kodow ane w jąd rze k o m ó r­
kowym , syntetyzow ane w cytozolu, a następnie tra n s­
p o rto w an e do m itochondriów .
M itorybosom y, k tó re dysocjują n a podjednostki
54S i 37S, p rzy p o m in ają p o d pew nym i względam i
rybosom y p ro k ario n tó w , a mniej są p o d o b n e do
cytozolow ych rybosom ów eukariotycznych [58]. P o
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
pierwsze szereg zidentyfikow anych białek m ito ry b o so ­
m ów wykazuje podobieństw o sekwencji do białek
rybosom ów bakteryjnych. Zestaw antybiotyków , k tó ­
re h am ują translację m ito ch o n d rialn ą przypom ina te,
k tó re działają n a rybosom y bakteryjne. T akże m ito ­
chondrialne czynniki translacyjne przypom inają b a r­
dziej czynniki translacyjne p ro k a rio n tó w niż euka-
riontów [3]. M itorybosom y zaw ierają jed n ak większą
liczbę białek, które też często są inne, a czasem
podobne, ale większe od analogicznych białek b a k ­
teryjnych [59]. S pośród 23 białek m itorybosom alnych,
k tórych sekwencje są znane, praw ie wszystkie są
niezbędne dla funkcjonow ania translacji, ale tylko 10
wykazuje hom ologię do znanych białek rybosom al-
nych E. coli [60]. U n ik aln ą cechą m itorybosom ów jest
zdolność do oddziaływ ania ze specyficznymi aktyw a­
toram i translacji oraz z błoną m itochondrialną.
T ranslacja co najm niej pięciu spośród ośm iu p o d ­
staw ow ych m t m R N A w ym aga jednego lub większej
ilości specyficznych aktyw atorów [25]. Sugeruje się, że
b iałka te funkcjonują poprzez oddziaływ anie z m ito-
rybosom em , 5' sekwencją w iodącą m R N A i w ew nętrz­
n ą b łoną m ito ch o n d rialn ą [61]. R ola aktyw atorów
polega n a rozpoznaniu m iejsca startu translacji, co
m oże być utrudnione, gdyż m itochondrialne m R N A
nie m ają czapeczki, są długie, a ich drugorzędow a
stru k tu ra jest m ało zróżnicow ana ze względu na
znaczącą przew agę reszt AT. Sugeruje się także, że
aktyw atory translacji praw d o p o d o b n ie ułatw iają
w budow anie pow stającego p ro d u k tu białkow ego
w kom pleksy oddechow e, które funkcjonują w błonie
m itochondrialnej [62, 63]. N a to m iast niespecyficznym
represorem translacji m itochondrialnej, białkiem , k tó ­
re wiąże się do 5' końca w szystkich m itochondrialnych
m R N A , jest dehydrogenaza izocytrynianu. Jest to
jeden z podstaw ow ych enzym ów cyklu K rebsa, który,
ja k się niedaw no okazało posiada zdolność w iązania
się z R N A i pełni alternatyw ną funkcję w regulacji
translacji m itochondrialnej. Ten dualizm funkcji dehy­
drogenazy izocytrynianu pozw ala na sprzężenie tra n s­
lacji m itochondrialnej z generalnym m etabolizm em
kom órkow ym [64]. Z identyfikow ano też białka o nie­
znanej funkcji, które są p raw dopodobnie związane
z rybosom am i m itochondrialnym i [65].
P oza pew nym i aspektam i stru k tu ry m ito ry b o so ­
mów, specyficzność m itochondrialnego system u tra n s­
lacji polega n a stosow aniu k odu genetycznego o d ­
m iennego od k odu uniw ersalnego [66, 67], U S.
cerevisiae kodony A U A i C U N oznaczają odpow ied­
nio m etioninę i treoninę, zaś k o d o n U G A jest tłu m a­
czony n a tryptofan [68]. O graniczona liczba 25 typów
m t tR N A uniem ożliw ia translację w edług reguły
chwiejności sform ułow anej przez C r i c k a, a brak
izoakceptorow ych tR N A w ym usza uproszczoną regu­
łę odczytyw ania [69]. W odróżnieniu od roślin, u d ro ż­
dży nie m a konieczności tra n sp o rtu cytozolow ych
tR N A do m itochondriów . Stw ierdzono jedynie im port
cytoplazm atycznego tR N A lys, który jed n ak nie fun­
265
kcjonuje w aparacie translacyjnym , a jego funkcja
w m ito ch o n d riach jest nieznana [70].
M ito ch o n d rialn e rR N A nie zaw ierają m etylow a-
nych zasad, a m etylacja rybozy jest ściśle ograniczona
do jednej guanozyny w pozycji w 21S rR N A , podczas
gdy 16S rR N A pozostaje niezm odyfikow any. Z a m o ­
dyfikację o d p o w iad a gen PET56, którego ekspresja
w arunkuje pow stanie m itorybosom ów [71].
U n ik aln ą cechą m itorybosom ów S. cerevisiae jest
b rak cząsteczki 5S rR N A .
VIII. Modyfikacja, degradacja i włączanie
białek mitochondrialnych w kompleksy
W szystkie p ro d u k ty m itochondrialnej translacji, za
w yjątkiem V a rlp i białek kodow anych w intronach, są
hydrofobow ym i białkam i błonow ym i w chodzącym i
w skład kom pleksów oddechow ych zlokalizow anych
w wewnętrznej błonie m itochondrialnej. P om im o, że
pow iązanie m itorybosom ów i aktyw atorów translacji
z b ło n ą m ito ch o n d rialn ą pow inno ułatw iać włączanie
pow stających polipeptydów w błonę, zidentyfikow ano
białka, k tó re ułatw iają ten proces. G en ABC 1 jest
niezbędny do utw orzenia kom pleksu b e l [72]. G eny
S C O l i O X A 1 są niezbędne do pow stania oksydazy
cytochrom u c, a b ra k ich aktyw ności prow adzi do
destabilizacji określonych podjednostek tego enzym u
[73, 74].
K o d ow ane jąd ro w o i tran sp o rto w an e do m ito ch o n ­
driów białka są w większości przypadków pozbaw iane
N -końcow ej sekwencji kierującej. O b ró b k a ta zacho­
dzi podczas lub zaraz po transporcie z udziałem
wysoce specyficznych p ro teaz zlokalizow anych w m a t­
rix lub wewnętrznej błonie m itochondrialnej. M etalo-
p ro teaza M P P , złożona z dw óch podjednostek k o d o ­
w anych przez geny M A S1 i M A S 2 , odcina sekwencje
kierujące do m atrix i część sekwencji kierującej do
przestrzeni m iędzy błonow ej [75]. O dpow iednik prote-
azy M P P u Neurospora i u roślin w chodzi w skład
kom pleksu oddechow ego b e l [76], co w skazuje na
w spólną regulację biogenezy m itochondriów i ich
aktyw ności energetycznej. P ro teaz a IM P odpow iada
za odcinanie sekwencji kierującej do przestrzeni mię-
dzybłonow ej. E nzym ten składa się z katalitycznych
po d jednostek IM P 1 i IM P 2 o odm iennej specyficzno­
ści [77].
O prócz specyficznych enzym ów , m ito ch o n d ria p o ­
siadają proteazy, k tó re funkcjonują w A TP-zależnym
procesie degradacji białek o nieodpow iedniej k onfor­
m acji lub takich, k tó ry ch synteza nie była kom pletna
[78]. W m ito ch o n d riach w ystępują hom ologi proteaz
L a i Cip E. coli, ko d o w ane odpow iednio przez geny
drożdżow e P I M l i H SP78. Białko P im l w spółdziała
z m ito ch o n d rialn y m białkiem szoku cieplnego w ro z­
po zn an iu i degradacji niewłaściwie pofałdow anych
białek, a jednocześnie w arunkuje stabilność m tD N A
[79]. B rak b iałk a H sp78 nie zaburza istotnej funkcji
m itochondriów i jego ro la nie jest p o zn an a [80].
266 http://rcin.org.pl
R ośnie liczba białek m itochondrialnych A T P azo-
p o dobnych z rodziny nazw anej A A A, których funkcja
nie jest, w yjaśniona. D o tej klasy należą p ro d u k ty
genów jądrow ych BC S1, AG F3, R C A 1 i YME1. Sek­
wencje wszystkich tych białek p o siadają dwie dom eny
po około 200 am inokw asów , k tó re zaw ierają ch a rak ­
terystyczne dla A T P az m otyw y odpow iedzialne za
w iązanie nukleotydów . P om im o podobieństw a sek­
wencji nie m ożna przypisać w ym ienionym białkom
analogicznych funkcji. B cslp i R c a lp m ają udział
w form ow aniu m itochondrialnych kom pleksów o d ­
dechow ych [81, 82]. W spom niane uprzednio w obec­
nym artykule białko Y m el wpływ a n a m igrację
m tD N A do ją d ra kom órkow ego [7]. Agf3 p ra w d o p o ­
dobnie pełni rów nocześnie funkcje białka chroniącego
(chaperon) i proteazy, przez co jednocześnie p o m ag a­
łoby białkom m itochondrialnym przybrać właściw ą
konfrom ację i degradow ałoby „nienorm alne” polipep-
tydy [3].
IX. Mitochondria regulują funkcję jądra
komórkowego
K o m ó rk a drożdżow a jest w stanie zm ieniać ekspre­
sję różnych genów jądrow ych w zależności od stan u
fizjologicznego m itochondriów , a także stanu m tD N A .
Zjaw isko to jest znane ja k o regulacja typu retro, co
podkreśla m ożliw ość kom unikacji organelli w prze­
ciwnym kieru n k u w stosunku do udokum entow anego
obszernie ruchu inform acji ją d ro kom órkow e-m ito-
chondria. P rzykładem regulacji retro jest wpływ nie­
funkcjonalnych m itochondriów w m u tan tach rho° na
podw yższenie poziom u transkrypcji genu C IT 2, k tó ry
koduje peroksysom alną form ę syntazy cytrynianu.
Efekt ten jest sterow any przez sekwencje UAS w 5'
niekodującej sekwencji genu C IT 2 za pośrednictw em
białek regulatorow ych kodow anych przez geny RTG1
i R T G 2 [83]. P ro d u k ty genów R T G w aru n k u ją w zrost
drożdży n a pożyw ce z kw asem olejowym i są niezbęd­
ne do syntezy białek peroksysom alnych. Sugeruje się,
że białka R tg funkcjonują w system ie kom unikacji
m iędzy m itochondriam i, peroksysom am i i jąd rem k o ­
m órkow ym [84].
X. Podsumowanie
W ciągu ostatniego dziesięciolecia w yizolow ano
kilkaset genów jądrow ych odpow iedzialnych za fu n k ­
cje m itochondrialne Saccharomyces cerevisiae. P o ­
przez identyfikację genów zw iązanych z im portem
białek do m itochondriów , dziedziczenie m ito ch o n ­
driów i ich oddziaływ aniem z cytoszkieletem stw ier­
dzono isto tn ą rolę m itochondriów w procesach w zros­
tu i podziału kom órki. M etody klonow ania pozw oliły
na izolację genów, k tó re w w ypadku nadekspresji są
supresoram i znanych m utacji m itochondrialnych.
S trategia ta um ożliw iła określenie hipotetycznego
w spółdziałania p ro d u k tó w różnych genów odpow ie­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 (3 ) , 1996
 dzialnych za funkcje m itochondrialne. W reszcie p o ­
przez realizację p ro jek tu sekw encjonow ania genom u
Saccharomyces cerevisiae zidentyfikow ano szereg ge­
nów, k tórych inaktyw acja pow odow ała defekty w fun­
kcjonow aniu m itochondriów . A naliza sekwencji p o ­
zw oliła n a stw orzenie rodzin białek hom ologicznych
gdyż białkom danej rodziny przypisuje się analogiczne
funkcje. P rzykładem jest rodzina białek m itochon-
drialnych AAA, k tó re regulują oddziaływ ania białko-
białko w aru n k u jąc pow staw anie kom pleksów i czas
życia białek. Stw ierdzono też, że m ito ch o n d ria m ogą
wpływ ać n a ekspresję genów jądrow ych. N iew ątpliw ie
ch arak tery sty k a oddziaływ ań ją d ro k o m ó rk o w e-m ito-
ch o n d ria pozw ala n a głębsze zrozum ienie zjaw iska
kom unikacji m iędzy organellam i kom órkow ym i.
Podziękowania
Praca została zrealizowana w ramach projektu grantowego
KBN nr 6P04A06208.
A rty k u ł otrzym ano 21 lutego 1996 r.
Zaakceptow ano do druku 15 maja 1996 r.
Piśmiennictwo
1. B o l o t i n - F u k u h a r a M, G r i v e l l L A (1992) Antonie
van Leeuwenhoek; J Gen Microbiol 62: 131-153
2. M a l e s z k a R, S k e l l y PJ , C l a r k - W a l k e r G D (1991)
EM BO J 10: 3923-3929
3. G r i v e l l L A (1995) Crit Rev Bioch M ol Biol 30: 121-164
4. G r o s m a n LI , C r y e r D R , G o l d r i n g ES, M a r m u r
J (1971) J M ol Biol 62 : 565-
5. B e r n a r d i G (1982) Trends Biochem Sei 7: 404-408
6. F a r r e l l y F, B u t ó w R A (1983) Nature (Lond) 301:296-301
7. T h o r s n e s s P E , W h i t e K H , F o x T D (1993) M ol Celi
Biol 13: 5418-5426
8. J o n s t o n SA, A n z i a n o P Q, S h a r k K, S a n f o r d J C,
B u t ó w R A (1988) Science 240: 1538-1541
9. F o x T D , S a n f o r d J C, M c M u l l i n T W (1988) Proc N atl
Acad Sei U SA 85: 7288
10. K r u s z e w s k a A, B o g u t a M (1988) Post Biol Kom 15:
327-346
11. B 1a n c H, D u j o n B (1980) Proc N atl Acad Sei U SA 77: 3942
12. B i r k y C W (1994) J Hered 85: 355-365
13. L o c k s o n D, Z w e i f e l SG, F r e e m a n - C o o k LL, L o -
r i m e r H E , B r e w e r BJ, F a n g m a n W L (1995) Celi 81:
947-955
14. D r u b i n D G , J o n e s H D , W e r t m a n K F (1993) M ol Biol
Celi 4: 1277-1294
15. L a z z a r i n o DA, B o l d o g h I, S m i t h M G , R o s a n d J,
P o n L (1994) M ol Biol Celi 5: 807-818
16. M c C o n n e l l SJ, Y a f f e M P (1993) Science 260: 687-689
17. J o n e s BA, F a n g m a n W L (1992) Genes Dev 6: 380-389
18. Z o l a d e k T, V a d u v a G, H u n t e r LA, B o g u t a M, G o
BD, M a r t i n N C , H o p p e r A K (1995) M ol Celi Biol 15:
6884-6894
19. S t e w a r t LC, Y a f f e M P (1991) J Celi Biol 115: 1249-1257
20. M y e r s A M, P a p e L K , T z a g o l o f f A (?985) EM BO J 4 :
2087-2092
21. W a g n e r L H, A r l t H, v a n D y c k L, L a n g e r T,
N e u p e r t W (1994) EM BO J 13: 5135-5145
22. Z e l e n a y a - T r o i t s k a y a O, P e r l m a n PS, B u t ó w
R A (1995) EM BO J 14: 3268-3276
23. S ł o n i m s k i P P , P e r r o d i n G , C r o f t J H (1968)Biochem
Biophys Res Com 30: 232-239
24. K o l a r o v J , K o l a r o v a N , N e l s o n N (1990) J Biol Chem
265: 12711-12716
25. P o n L, S c h a t z G (1991) The M olecullar Biology of Sac­
charomyces cerevisiae 1 1, Cold Spring H arbor L aboratory Press,
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
str 333-406
26. W i n t e r s b e r g e r U, B l u t s c h H (1976) Eur J Biochem 13:
11-19
27. G e n g a A, B i a n c h L, F o u r y F (1986) J Biol Chem 261:
9328
28. R e e n a n RA, K o l o d n e r R D (1992) Genetics 132: 975-985
29. F o u r y F, V a n D y c k E (1985) EM BO J 4: 3225-3530
30. S c h u l z VP , Z a k i a n V A (1994) Cell 76: 145-155
31. S c h i n k e l AH, T a b a k F H (1989) Trends Genet 5: 149-154
32. J a n g SH, J a e h n i n g J A (1991) J Biol Chem 266: 22671-
22677
33. H o f m a n n TJ , M i n JJ, Z a s s e n h a u s H P (1993) Yeast 9:
1319-1330
34. D a n g YL, M a r t i n N C (1993) J Biol Chem 268: 19791-
19796
35. M i l l e r DL , M a r t i n N C (1983) Cell 34: 911-917
36. M a r t i n N C , H o p p e r A K (1994) Biochimie 76: 1161-1167
37. B o g u t a M, H u n t e r LA, S h e n WC , G i l m a n EC,
M a r t i n N C , H o p p e r A K (1994) M ol Cell Biol 14:
2298-2306
38. M i n J J , Z a s s e n h a u s H P (1993) M ol Cell Biol 13:
4167-4173
39. D m o c h o w s k a A, G o l i k P, S t ę p i e ń P P (1995) Curr
Genet 28: 108-112
40. S t ę p i e ń P P , K o k o t L, L e s k i T, B a r t n i k E (1995)
Curr Genet 27: 234-238
41. S t ę p i e ń P P , M a r g o s s i a n SP, L a n d s m a n D, B u ­
t ó w R A (1992) Proc N atl Acad Sei USA 89: 6813-6817
42. M i t t e l m e i e r T M, D i e c k m a n C L (1993) M ol Cell Biol
13: 4203-4213
43. Z i a j a K, M i c h a e l i s G, L i s o w s k y T (1993) J M ol Biol
229 : 909-916
44. G r o u d i n s k y O, B o s q u e t I, W a l l i s MG , S l o n i m s -
k y P P , D u j a r d i n G (1993) M ol Gen Genet 240: 419-427
45. G o l i k P, S z c z e p a n e k T, B a r t n i k E, S t ę p i e ń P,
Ł a z o w s k a J (1995) Curr Genet 28: 217-224
46. S e r a p h i n B, B o u l e t A, S i m o n M, F a y e G (1987) Proc
N atl Acad Sei USA 84: 6810-6814
47. L a m b o w i t z A M, B e l f o r t M (1993) Annu Rev Biochem
62: 587-622
48. Ł a z o w s k a J, J a c q C, S ł o n i m s k i P P (1980) Cell 22 :
333-342
49. D u j o n B (1989) Gene 82: 91-114
50. C u r c i o MJ , B e l f o r t M (1996) Cell 84:9-12
51. D u j a r d i n G, J a c q C, S ł o n i m s k i P P (1982) Nature
(Lond) 298: 628-632
52. M u e l l e r M, A l l m a i e r M, E s k e s R, S c h w e y e n R J
(1993) Nature (Lond) 366: 174-176
53. L a b o u e s s e M (1990) M ol Gen Genet 224 : 209-221
54. Z a g ó r s k i W, C a s t a i n g B, H e r b e r t CJ , L a b o u e s s e
M, M a r t i n R, S ł o n i m s k i P P (1991) J Biol Chem 266:
2357-2541
55. P e l H, R e p M, G r i v e l l L A (1992) Nucleic Acid Res 20:
6339-6346
56. P e l H, G r i v e l l L A (1994) M ol Biol Rep 19: 183-194
57. B o g u t a M, M i e s z c z a k M, Z a g ó r s k i W (7988) Curr
Genet 13: 129-135
58. K i t a k a w a M, I s o n o K (1991) Biochimie 73: 813-825
59. B o g u t a M, D m o c h o w s k a A, B o r s u k P, W r ó b e l K,
G a r g o u r i A, Ł a z o w s k a J, S ł o n i m s k i P P , S z c z e ś -
n i a k - K r u s z e w s k a A (1992) M oll Cell Biol 12: 402-412
60. F e a r o n K, M ason TL (1992) J Biol Chem 257: 5162-5170
61. C o n s t a n z o MC , F o x T D (1990) Annu Rev Genet 24 :
91-113
62. B r o w n N G , C o n s t a n z o MC , F o x T D (1994) M ol Cell
Biol 14: 1045-1053
63. M u l e r o J J , F o x T D (1993) M ol Biol Cell 4 : 1327-1355
64. E l z i n g a SD, B e d n a r z A L, v a n O o s t e r u m K, D e k -
k e r PJ , G r i v e l l L A (1993) Nucleic Acids Res 21: 5328-5331
65. K o n o p i ń s k a A, S z c z ę ś n i a k B, B o g u t a M (1995)
Yeast 11: 1513-1518
66. F o x T D (1987) Annu Rev Genet 21: 67-91
67. B o g u t a M, P u t r a m e n t A (1987) Kosmos 34: 67-87
68. M a r t i n N C , P h a m H D , U n d e r b r i n k - L y o n K,
M i l l e r DL , D o n e l s o n J E (1990) Nature (Lond) 285:
579-581
69. M a r t i n R P, S i b l e t AP , G e h r k e C W, K u o K, E d -
267
 m o n s C G , M c C l o s k e y J A, D i r h e i m e r G (1990) 77. N u n n a r i J, F o x T D , W a l t e r P (1993) Science 262:
Biochemistry 29: 956-959 1997-2004
70. M a r t i n RP , S c h n e l l e r J M, S t a h l J C, D i r h e i m e r 78. G o l d b e r g A L (1992) Eur J Biochem 203: 9-23
G (1979) Biochemistry 18: 4600-4605 79. S u z u k i C K, S u d a K, W a n g N, S c h a t z G (1994)
71. S i r u m - C o n n e l l y K, M a s o n T L (1993) Science 262: Science 264: 273-276
1886-1889 80. L e o n a r d t SA, F e a r o n K, D a e s e P N , M a s o n T L
72. B o s q u e t I , D u j a r d i n G , S ł o n i m s k i P P (1991)EMBO (1993) M ol Cell Biol 13: 6304-6313
J 10: 2023-2031 81. N o r b e r g a F G , N o r b e r g a M P , T z a g o l o f f A (1992)
73. B o n n e f f o y N , C h a l v e t F, H a m e l P, S ł o n i m s k i PP, EM BO 11: 3821-3829
D uj a r d i n G (1994) J M ol Biol 239: 201-212 82. T z a g o l o f f A, D i e c k a m n C L (1990) Microbiol Rev 54:
74. K r u m m e c k G, R o d e l G (1990) Curr Genet 18: 13-15 211-225
75. Y a f f e M P , S c h a t z G (1984) Proc N atl Acad Sei USA 81: 83. L i a o X, B u t ó w R A (1993) Cell 72: 61-71
4819-4823 84. C h e ł s t o w s k a A, B u t ó w R A (1995) J Biol Chem 270:
76. E r i c k s o n AC, G l a s e r E (1992) Biochem Biophys Acta 18141-18146
1140: 208-214

Roślinny łańcuch oddechowy

Plant respiratory chain

A N N A M. RYCHTER*

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction
II. Dehydrogenazy NAD(P)H roślinnego łańcucha oddecho­ II. Plant respiratory chain NAD(P)H dehydrogenases
wego II-l. External NAD(P)H dehydrogenases
II-I. Zewnętrzne dehydrogenazy NAD(P)H II-l.l. Characteristics of external NAD(P)H dehydroge­
II-l.l. Charakterystyka zewnętrznych dehydrogenaz nases
NAD(P)H II-1.2. Physiological role of external NAD(P)H dehy­
11.1.2. Rola fizjologiczna zewnętrznych dehydrogenaz drogenases
NAD(P)H II-2. Internal NADH dehydrogenases
II-2. Wewnętrzne dehydrogenazy NADH II-2.1. Internal NADH dehydrogenase (inhibited by rote­
II-2.1. Kompleks I, dehydrogenaza NADH (hamowana non), Complex I
przez rotenon) II-2.2. Internal NADH dehydrogenase, rotenon insen­
11.2.2. Dehydrogenaza NADH niewrażliwa na rotenon sitive
III. Oksydaza alternatywna III. Alternative oxidase
III-l. Charakterystyka oksydazy alternatywnej III-l. Characteristics of alternative oxidase
III-2. Regulacja przepływu elektronów przez drogę cyto- III-2. Regulation of electron flux between cytochrome
chromową i alternatywną and alternative pathways
III-3. Oznaczanie aktywności drogi alternatywnej III-3. Determination of the activity of alternative path­
III-4. Rola fizjologiczna drogi alternatywnej way
IV. Uwagi końcowe III-4. Physiological role of alternative pathway
IV. Concluding remarks

I. Wstęp stratów oddechow ych dla m itochondriów m oże być

W ydajność energetyczna oddychania wpływ a na
wiele procesów zw iązanych ze w zrostem i rozw ojem
roślin. K ońcow y etap oddychania zachodzi w m ito-
chondriach, gdzie zlokalizow any jest łańcuch odde­
chow y i cykl K rebsa. R ośliny oddychają nie tylko
w ciemności, ale rów nież n a świetle, podczas fotosyn­
tezy. W k o m ó rk ach fotosyntetyzujących źródłem sub-
* Prof. dr hab., Zakład Bioenergetyki Roślin, Instytut
Biologii Eksperymentalnej Roślin, Uniwersytet Warszawski,
02-106 Warszawa, ul. Pawińskiego 5A.
nie tylko glikoliza (pirogronian, jabłezan), ale rów nież
p ośrednio fotosynteza (jabłezan) lub fotooddychanie
(glicyna). D opływ tych substratów m oże podlegać
zm ianom , nie tylko w w arunkach światło-ciem ność,
ale rów nież n a świetle w zależności od intensyw ności
fotosyntezy lub fotooddychania. W ko m ó rk ach niefo-
tosyntetyzujących ilość substratów rów nież m oże się
zm ieniać w zależności od m etabolizm u i od wpływu
w arunków środow iskow ych, np. przy zm ianach tem ­
peratury.
M ito ch o n d ria uw aża się za centrum przetw arzania
energii w kom órce. G łów ną ich funkcją jest utlenianie

268 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 substrató w zw iązane z tran sp o rtem elektronów sprzę­
żonych z syntezą A TP. Ł ańcuch oddechow y składa się
z w ielobiałkow ych kom pleksów biorących udział
w przenoszeniu elektronów z różnych su b strató w na
tlen cząsteczkowy. C ztery główne kom pleksy to: k o m ­
pleks I — o k sy d o red u k taza N A D H : ubichinon, k o m ­
pleks II — o k sy d o red u k taza bursztynian: ubichinon,
kom pleks III — o k sy d o red u k taza u b ic h in o l: cyto-
chrom c i kom pleks IV — oksydaza cytochrom ow a
(Ryc. 1). W błonie m itochondrialnej znajduje się ro z­
puszczony w niej m obilny ubichinon, k tó ry łączy ze
sobą kom pleksy enzym atyczne dehydrogenaz łań cu ­
cha oddechow ego z oksydazam i regulując przepływ
i dystrybucję elektronów n a łańcuch cytochrom ow y
(kom pleks III, cytochrom y b -c2 oraz kom pleks IV,
oksydaza cytochrom ow a) lub oksydazę alternatyw ną.
Z lokalizow any po zewnętrznej stronie błony wewnę­
trznej, cytochrom c działa ja k o m obilny przenośnik
elektronów łączący kom pleks III z kom pleksem IV.
P o do b n ie ja k w m ito chondriach zwierzęcych k o m ­
pleksy I, III i IV są ułożone w poprzek błony i uczest­
niczą w w ytw arzaniu gradientu protonów . G ra d ien t
ten w ykorzystyw any jest przez syntazę A T P (F0 Fj
— A TPazę) do syntezy A TP.
W m ito ch o n d riach roślinnych, dzięki obecności
dodatk o w y ch kom pleksów enzym atycznych, możliwy
jest tra n sp o rt elektronów n a tlen z pom inięciem tych
fragm entów łań cu ch a oddechow ego, k tó re są zw iązane
z tran slo k acją p ro to n ó w (Ryc. 1). Ze względu na
m ożliwość przenoszenia elektronów bez syntezy A TP,
m ito ch o n d ria roślinne m ogą charakteryzow ać się niż­
szym stopniem sprzężenia (stosunek P/O ). R oślinny
łańcuch oddechow y jest więc bardziej złożony niż
zwierzęcy łańcuch oddechow y, a centralnym jego
członem jest ubichinon. M ito ch o n d ria roślinne różnią
się od m itochondriów zwierzęcych:
— rozbudow anym system em utleniania N A D (P)H ;
d o d atk o w ą (oprócz kom pleksu I), w ew nątrz m ito-
ch ondrialną dehydrogenazą N A D H , niew rażliw ą na
ro ten o n oraz m ożliw ością utleniania cytosolow ego,
zew nątrz m itochondrialnego N A D (P )H przez zw iąza­
n ą z łańcuchem oddechow ym zew nętrzną dehydroge­
nazę N A D (P)H ;
— obecnością tzw. oksydazy alternatyw nej, niew ra­
żliwej n a cyjanek, dzięki której m ożliwy jest tran sp o rt
elektronów n a tlen z pom inięciem łańcucha cytochro-
mowego.
— obecnością w m itochondriach enzym u jabłczano-
wego (dehydrogenazy jabłczanow ej dekarboksylują-
cej, specyficznej dla NAD).
— zdolnością do utleniania glicyny przez m itocho n ­
d ria izolow ane z liści roślin, u k tórych w ystępuje
fotoodychanie.
W szystkie te cechy odzw ierciedlają bardziej „plas­
tyczną” funkcję m itochondriów w kom órce roślinnej.
W ynika ona z konieczności szybkiego przystosow yw a­
nia się do zm iennych w arunków m etabolicznych oraz
w spółdziałania z innym i organellam i przetw arzający­
mi energię (chloroplasty) lub z peroksyzom am i bio­
rącym i udział w fotooddychaniu. Z tego też względu
funkcja m itochondriów w kom órce roślinnej nie m oże
być rozw ażana w oderw aniu od innych organelli oraz
od tk an k i (np. liści łub korzeni) i w arunków zew nętrz­
nych (np. światło, ciemność) w jak ich znajduje się cała
roślina. W iele cech w spólnych z m itochondriam i roślin
wyższych w ykazują m ito ch o n d ria am eb [1]. W o sta t­
nich latach ukazały się artykuły przeglądow e opisujące
zarów no budow ę roślinnego łańcucha oddechow ego
ja k i funkcję m itochondriów [2-6]. B adania z za­
stosow aniem technik biologii m olekularnej okazały się

H+ N AD (P)H
f Przestrzeń międzybłonowa
KCN

Matriks
Ryc. 1 Schemat roślinnego łańcucha oddechowego, zmodyfikowano wg [6 i 10], B.w. — wewnętrzna błona m itochondrialna, w której
umieszczony jest łańcuch oddechowy; I, II, III i IV — oznaczono kolejno kompleksy łańcucha oddechowego, strzałkami oznaczono
miejsca i kierunek translokacji protonów; podwójnymi strzałkami oznaczono fragmenty łańcucha, z których przeniesienie elektronów
nie jest związane z translokacją protonów; grubą kreską oznaczono miejsce ham ow ania przez rotenon, K C N i SHAM; Q — ubichinon;
deh.z. i deh.w. — odpowiednio zewnętrzne i wewnętrzne dehydrogenazy NAD(P)H, niewrażliwe na rotenon; Alt. — oksydaza
alternatywna; b, c1# c, a 3, a — cytochromy tworzące tzw. łańcuch cytochromowy.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 269

http://rcin.org.pl
niezm iernie p rzy d atn e do określenia stru k tu ry i m iejs­
ca pow iązania n iektórych k om ponentów łańcucha
oddechow ego (oksydaza alternatyw na) oraz m echani­
zm ów regulacji przepływ u elektronów . A rtykuł ten jest
podsum ow aniem o statnich b ad a ń dotyczących stru k ­
tu ry i funkcji dodatkow ych, charakterystycznych dla
roślin, fragm entów łańcucha oddechow ego.
II. Dehydrogenazy NAD(P)H roślinnego
łańcucha oddechowego
R oślinny łańcuch oddechow y m a dw a system y dehy­
drogenaz zw iązane z utlenianiem N A D (P)H : zew nętrz­
ne dehydrogenazy N A D (P )H , utleniające N A D (P)H
cytosolow e i dehydrogenazy w ewnętrzne, utleniające
N A D H w ytw orzone w m atriks. M itochondrialnym
dehydrogenazom N A D (P )H w ostatnich latach p o ­
święcono szereg arty kułów przeglądow ych [7-10].
I I -l. Zewnętrzne dehydrogenazy N A D (P )H
I I - l .l. Charakterystyka zewnętrznych dehydroge­
naz N A D (P )H
Izolow ane m ito ch o n d ria roślinne, w odróżnieniu od
m ito ch o n d rió w zwierzęcych, aktyw nie utleniają d o d a ­
ne, egzogene N A D (P)H . W ynika to z obecności w ro ś­
linnym łańcuchu oddechow ym dehydrogenazy utle­
niającej N A D (P )H cytosolow e i przekazującej elektro­
ny n a ubichinon [1 1 ,1 2 ]. W zw iązku z tym utlenianiu
zew nątrz m ito ch o n d rialnego N A D H tow arzyszą dwie
fosforylacje [9]. K ontrow ersyjne jest zagadnienie czy
jest to je d n a dehydrogenaza specyficzna zarów no dla
N A D H ja k i N A D P H czy też są to dwie dehyd­
rogenazy. N a obecność jednej dehydrogenazy w skazy­
wały prace M o l i e r a i w s p . [10]. O statnie b ad an ia
przy zastosow aniu przeciw ciał w ykazały jed n ak obec­
ność co najm niej dw óch dehydrogenaz, różniących się
o ptim um p H i specyficznością su b strato w ą w stosunku
do N A D H i N A D P H [13].
U tlenianie N A D (P )H przez dehydrogenazę zew nę­
trzn ą jest zależne od pH . O ptim um utleniania N A D H
zachodzi przy p H m iędzy Ó.8-7.2, n ato m iast utlenianie
N A D P H zachodzi przy p H nieco niższym [14-17],
a więc jest to pH b ard zo zbliżone do pH cytosolow ego
(7.1-7.6) [18]. U tlenianie egzogennego N A D (P )H przez
m ito ch o n d ria roślinne jest stym ulow ane przez k a tio ­
ny, szczególnie zaś przez jo n y w apnia [14]. F unkcja
ja k ą pełnią jo n y C a 2+ w regulacji aktyw ności zewnę­
trznej dehydrogenazy N A D H nie jest w yjaśniona.
O becnie sądzi się, że jo n y C a 2+ nie stym ulują aktyw ­
ności dehydrogenazy n ato m iast ułatw iają przekazy­
w anie elektronów na ubichinon znajdujący się w lipi­
dowej frakcji błony, co wskazuje, że miejscem działania
C a2 + jest raczej u b ichinon [19]. Stym ulacja utleniania
N A D H przez jo n y C a 2+ obserw ow ana jest przy pH
obojętnym , sp ad a n ato m iast przy p H poniżej 7 [20].
U sunięcie jo n ó w C a 2+ (np. przez dodanie czynników
270
http://rcin.org.pl
chelatujących) pow oduje zaham ow anie utleniania
N A D H przez izolow ane m ito ch o n d ria [20]. G dy
dehydrogenaza N A D H uw olniona jest z błony m ito ­
chondrialnej przez sonifikację lub traktow anie d eter­
gentem , zależność aktyw ności od jo n ó w C a 2+ spada,
aczkolw iek enzym ten w dalszym ciągu redukuje
analogi ubichinonu [21, 22]. G odnym o d n o to w an ia
jest fakt, że m aksim um stym ulacji przy p ad a na stęże­
nia C a 2+ bliskie stężeniom w ystępującym w cytosolu
u większości roślin, k tó re to stężenie podlega regulacji
i zm ienia się podczas w zrostu i rozw oju oraz p o d
wpływem zm iennych w arunków środow iskow ych.
Stym ulację przez jo n y C a 2+ obniżają też regulatory
w zrostu, poliam iny [23].
II-1.2. R ola fizjologiczna zewnętrznych dehydro­
genaz N A D (P )H
Zew nętrzne dehydrogenazy N A D (P )H m ogą regu­
low ać stężenie N A D (P )H w cytosolu. R egulacja n a d ­
m iaru siły redukcyjnej, przy pow iązaniu dehydro g en a­
zy zew nętrznej N A D (P )H z dro g ą alternatyw ną, m o ­
głaby zachodzić bez produkcji A TP. Jednakże podczas
utleniania cytosolow ego N A D H lub N A D P H elek tro ­
ny przekazyw ane n a ubichinon przepływ ają n a drogę
cytochrom ow ą z jednoczesną syntezą dw óch czą­
steczek A T P [24-27]. N ie w yjaśniony jest b rak dostępu
zewnętrznej dehydrogenazy N A D H do drogi alter­
natyw nej u roślin nieterm ogennych [12,23, 27]. Tylko
u Araceae, u których poziom oddychania cyjanood-
pornego podczas kw itnienia jest b ardzo wysoki, utle­
nianie zew nątrz m itochondrialnego N A D H m oże za­
chodzić praw ie wyłącznie przy udziale drogi alter­
natyw nej [12, 26].
N A D H utleniane jest b ardzo intensyw nie przez
m ito ch o n d ria większości roślin, K m dla N A D H w aha
się pom iędzy 10-100 pM [8], n ato m iast stężenie
N A D H w cytosolu w liściach szpinaku n a świetle
wynosi zaledwie 0.6 pM [28]. P o n a d to szereg su b ­
stratów (glicyna, jabłczan) utlenianych jest preferencyj­
nie n a świetle przez m ito ch o n d ria roślinne w p o ró w ­
n an iu z N A D H [29, 30]. T ak więc w ydaje się, że in vivo
utlenianie N A D H cytosolow ego jest n a dość niskim
poziom ie i zachodzi głównie przy udziale drogi cyto-
chrom ow ej. Aczkolwiek nie jest w ykluczone, że przy
dużym wzroście stężenia N A D (P )H w cytosolu udział
w jego utlenianiu zewnętrznej dehydrogenazy
N A D (P )H m oże się zwiększać.
II-2. W ewnętrzne dehydrogenazy N A D H
Ź ródłem N A D H w ew nątrz m itochondriów jest głó­
wnie cykl K rebsa, dehydrogenaza jabłczanow a dekar-
boksylująca, oksydaza glicyny oraz system przen o szą­
cy N A D H /N A D z cytosolu. N A D H w ytw arzane we­
w nątrz m itochondriów m oże być utleniane przez jed n ą
z dw óch dehydrogenaz N A D H łańcucha oddechow e­
go (Ryc. 1) lub tran sp o rto w an e n a zew nątrz m itochon-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
driów przez przenośnik jabłczan/szczaw iooctan obec­
ny w błonie m itochondrialnej [31, 32].
Jeśli różne enzym y w ytw arzające N A D H w m atriks
m iałyby tak i sam d ostęp do dehydrogenaz łańcucha
oddechow ego, tru d n o byłoby zrozum ieć w pew nych
w aru n k ach tzw. preferencyjne utlenianie poszczegól­
nych sub strató w np. glicyny, jab łczan u [33, 34]. P rzy ­
puszcza się, że poszczególne enzym y redukujące N A D
m ogą znajdow ać się w sąsiedztw ie odpow iednich de­
hydrogenaz łańcucha oddechow ego i tw orzyć k o m ­
pleksy zw ane m etab o lo nam i [35].
S tosunek N A D H /N A D w cytosolu w czasie fo to ­
syntezy, jest około 70-krotnie niższy niż w ew nątrz
m ito ch o n d rió w podczas utleniania substratow ego
w stanie 3 [36], W skazuje to n a ścisłą regulację
tra n sp o rtu N A D H z m atriks m itochondriów do cyto­
solu zabezpieczającą w m atriks właściwe stężenie
N A D H niezbędne do w ytw arzania A T P w łańcuchu
oddechow ym .
N A D H w m atriks m oże być utleniane przez dwie
dehydrogenazy — dehydrogenazę N A D H kom pleksu
I, h am o w an ą przez ro ten o n i zw iązaną z syntezą A TP,
lub dehydrogenazę nie h am o w an ą przez ro ten o n i nie
uczestniczącą w przem ieszczaniu p ro to n ó w w poprzek
błony (brak syntezy ATP). O bie w ew nętrzne dehyd­
rogenazy N A D H b ad a n o w tzw. pęcherzykach błon
m itochondrialnych, w k tórych b ło n a w ew nętrzna była
o d w ró co n a n a zew nątrz. O trzym uje się je poprzez
sonifikację m ito ch o n d riów przy w ysokim stężeniu soli,
a następnie poprzez w irow anie różnicow e [15, 37-39].
II-2.1. Dehydrogenaza N A D H (hamowana przez
rotenon), kom pleks I
D eh y d ro g en aza N A D H zw iązana z kom pleksem
I jest b ard zo p o d o b n a do dehydrogenazy kom pleksu
I w m ito ch o n d riach zwierzęcych [10]. K om pleks I nie­
daw no w yizolow ano i oczyszczono z m itochondriów
b u ra k a czerw onego [40]. Jest to duży kom pleks biał­
kow y o ciężarze 680 k D a [10] lub 400 k D a [40],
składający się z co najm niej 6 polipeptydów i zaw iera­
jący flawinę [41-43]. K m dla N A D H w ynosi 8 pM [5],
w skazuje to n a znacznie wyższe pow inow actw o do
N A D H niż dehydrogenazy niewrażliwej n a rotenon.
II-2.2. D ehydrogenaza N A D H niewrażliwa na
rotenon
O becność wewnętrznej dehydrogenazy N A D H nie­
wrażliwej n a ro ten o n i ro la ja k ą pełni w przenoszeniu
elektronów była d y sk u to w an a przez wiele lat. Z asa d ­
niczą tru d n o ścią w b ad an iach jest b ra k specyficznego
in h ib ito ra tej dehydrogenazy albow iem zew nętrzna
deh y drogenaza N A D H rów nież nie jest h am o w an a
przez ro ten o n [5, 10]. W ew nętrzna dehydrogenaza
N A D H niew rażliw a n a ro ten o n zo stała w yizolow ana
z b u ra k a czerw onego, jest o n a praw d o p o d o b n ie dime-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
rem składającym się z dw óch identycznych jedno stek
o m asie 43 k D a [10].
W odróżnieniu od dehydrogenazy kom pleksu I,
dehydrogenaza niew rażliw a n a ro ten o n wykazuje nis­
kie pow inow actw o do N A D H [8, 9], a więc m oże
działać tylko, gdy stężenie N A D H w m atriks jest
w ysokie (K m = 80 pM), podczas gdy K m dehydrog en a­
zy N A D H kom pleksu I jest 10-krotnie niższe, a więc
m oże działać przy b ardzo niskim stężeniu N A D H
w m atriks [44]. W ysokie stężenie N A D H m oże wy­
stępow ać w m atriks, gdy zw iększa się aktyw ność
enzym ów cyklu K rebsa lub utlenianie jab łczan u przez
obecną w m itochondriach roślinnych dehydrogenazę
jabłczanow ą dekarboksylującą oraz przy dużej aktyw ­
ności przenośnika jabłczan/szczaw iooctan. L a n c e
[45] sugerow ał pow iązanie działania dehydrogenazy
jabłczanow ej dekarboksylującej (wytwarzającej we­
w nątrz m itochondriów p iro g ro n ian i N A D H ) z dehy­
drogenazą niew rażliw ą n a ro ten o n i oksydazą alter­
natyw ną. W ten sposób, w m atriks, przy w ysokim
poziom ie N A D H jego utlenianie m ogłoby się odbyw ać
bez syntezy A TP. O becnie wydaje się jednak , że
przyczyną obserw ow anej niewrażliwości oddychania
na cyjanek przy w ysokim stężeniu N A D H w m atriks
jest stym ulacja oksydazy alternatyw nej przez p iro ­
gronian w ytw arzany przez dehydrogenazę jab łcz an o ­
wą dekarboksylującą.
R ola fizjologiczna dehydrogenazy N A D H niew raż­
liwej n a ro ten o n nie jest do tej pory w yjaśniona, być
m oże działa o n a tylko in situ [10, 39].
III. Oksydaza alternatywna
Jedną z najdaw niej poznanych, charakterystycznych
cech roślinnego łańcucha oddechow ego, jest obecność
końcow ej oksydazy alternatyw nej, k tó ra katalizuje
przeniesienie elektronów z ubichinonu n a tlen, z po m i­
nięciem łańcucha cytochrom ow ego (Ryc. 1). O ksydaza
ta jest nazyw ana rów nież oksydazą niew rażliw ą na
cyjanek, drogą niew rażliw ą n a cyjanek i odpow iedzial­
na jest za tzw. oddychanie cyjanoodporne. Tego typu
oddychanie obserw ow ane było u roślin ju ż od począ­
tk u stulecia. Najlepiej scharakteryzow ana jest rola
fizjologiczna oddychania cyjanoodpornego u roślin
z rodziny Araceae, u których oddychaniu podczas
procesu kw itnienia tow arzyszy wydzielanie dużych
ilości ciepła [46-48]. Artykuł poświęcony charakterystyce
biochemicznej i roli fizjologicznej oksydazy alternaty­
wnej opublikow any był w „Postępach Biochemii” [49].
III-l. Charakterystyka oksydazy alternatywnej
P om im o wielu prób, do tej pory m etodam i b io ­
chemicznym i, nie udało się wyizolow ać oksydazy
alternatyw nej. Częściowo oczyszczony enzym uzys­
kan o z kolb Arum maculatum, Sauromatum guttatum
oraz Symplocarpus foetidus [50-56]. P rzyczyną brak u
sukcesów jest po pierwsze tru d n o ść uw olnienia k o m ­
271
 pleksu oksydazy alternatyw nej z błony m ito ch o n d rial­
nej, a p o n a d to b ra k odpow iedniego d o n o ra elektro­
nów dla oksydazy alternatyw nej in vitro (zastępującego
kom pleks I lub II in vivo). Z niew iadom ych przyczyn
durochinol, k tó ry jest dobrym donorem elektronów
dla oksydazy alternatyw nej wyizolowanej z Araceae,
m a bard zo słabą aktyw ność dla oksydazy alternatyw ­
nej izolow anej z roślin nieterm ogennych [5, 56].
Oczywiste ograniczenie b ad a ń pow oduje więc koniecz­
ność w ykorzystania roślin z rodziny Araceae, które
kw itną tylko raz w roku. P o n a d to uw olniona z błon
oksydaza altern aty w na jest b ardzo niestabilna, w ciągu
12-24 godz. w ykazuje w tem p. 0°C znaczny spadek
aktyw ności [4, 53]. Jed n ą z przyczyn tej niestabilności
jest p raw d o p o d o b n ie w ysoka aktyw ność proteazy
sulfhydrylowej w tk ance Araceae [56]. W szystkie te
tru d n o ści sprawiły, że do tej pory nie udało się uzyskać,
m etodam i biochem icznym i, hom ogennego p re p ara tu
oksydazy alternatyw nej.
O ksy d aza altern atyw na w yizolow ana z Arum macu-
latum lub Sauromatum guttatum czy też z Symplocarpus
foetidus jest kom pleksem m ałych białek [53-56]. W y­
izolow anie z Sauromatum guttatum i nieznaczne oczy­
szczenie oksydazy alternatyw nej pozw oliło E 11 h o -
n o w i i M c l n t o s h o w i otrzym ać przeciw ciała
m o n o i p oliklonalne dla oksydazy alternatyw nej, które
okazały się specyficzne dla trzech polipeptydów 37, 36
i 35 k D a [54, 55, 57]. Z apoczątkow ało to b ad an ia
oksydazy alternatyw nej z zastosow aniem technik b io ­
logii m olekularnej [6, 58]. Przeciw ciała te w ykazywały
krzyżow ą aktyw ność ze w szystkim i roślinam i p o siad a­
jącym i aktyw ność oksydazy alternatyw nej, m ogły więc
służyć ja k o sondy m olekularne do jej w ykryw ania
[59-63]. Przeciw ciała te użyto do w yizolow ania i zsek-
w encjonow ania pojedynczego klonu cD N A dla o k ­
sydazy alternatyw nej z Sauromatum guttatum , Arabido-
psis thaliana oraz ty to n iu [64-66]. W ykazano, że
aktyw ność oksydazy alternatyw nej i zw iązane z nią
oddychanie niew rażliw e n a cyjanek jest wynikiem
działania jednego genu jądrow ego [64], Z a p ro p o n o ­
w ano stru k tu rę b iałka oksydazy alternatyw nej ja k o
dim eru, w któ reg o skład, w zależności od rośliny, m ogą
w chodzić b iałk a o ciężarze od 32-39 k D a [5, 6, 58].
C ząsteczka oksydazy alternatyw nej um ieszczona jest
w poprzek wewnętrznej błony m itochondrialnej, końce
C łańcucha polipeptydow ego znajdują się po stronie
m atriks, a S heliks po stronie przestrzeni m iędzy-
błonow ej [6, 67]. D im er połączony jest m ostkiem
disiarczkow ym , w form ie utlenionej jest on mniej
aktyw ny niż w form ie zredukow anej. Stan red u k ­
cji/utlenienia m o stk a disiarczkow ego reguluje więc
Vmaks. oksydazy alternatyw nej [6, 68].
Już od daw n a obserw ow ano, że w w yizolow anych
m ito ch o n d riach aktyw ność oksydazy alternatyw nej
jest ró żn a w zależności od substratu, najwyższe aktyw ­
ności obserw ow ano z jabłczanem i bursztynianem ,
a najniższe z N A D H [24]. R óżnice te m ogą zanikać po
d o d an iu a-k eto kw asów organicznych [69]. W m ito-
272 http://rcin.org.pl
chondriach soi niew ielka aktyw ność oksydazy alter­
natyw nej obserw ow ana z bursztynianem m oże być
znacznie stym ulow ana przez piro g ro n ian [70]. K w as
pirogronow y jest efektorem obniżającym K moksydazy
alternatyw nej w stosunku do ubichinolu [6, 71].
A ktyw ność oksydazy alternatyw nej w zm aga rów nież
w ytw arzanie p iro g ro n ian u w ew nątrz m itochondriów
podczas utleniania bursztynianu lub jab łczan u [70].
W ydaje się więc, że w izolow anych m itochon d riach
różnice aktyw ności oksydazy alternatyw nej przy ró ż­
nych su b stratach m ożna tłum aczyć odm ienną ich
zdolnością do w ytw arzania endogennego p iro g ro n ia­
nu. D opływ p iro g ro n ian u z glikolizy aktyw uje drogę
alternatyw ną, podobnie ja k w ytw arzanie piro g ro n ian u
w ew nątrz m itochondriów np. przez enzym jabłczan o -
wy [69]. Tłum aczy to, ja k się zdaje, zaobserw ow ane
wcześniej pow iązanie aktyw ności enzym u jabłczan o -
wego w m ito ch o n d riach z działaniem oksydazy alter­
natyw nej [72].
W transgenicznym tytoniu z zw iększoną ekspresją
białka oksydazy alternatyw nej, m ito ch o n d ria w yizolo­
w ane z liści, wykazyw ały stosunkow o niską aktyw ność
drogi alternatyw nej, aktyw ność ta zw iększała się d o ­
piero po d o d an iu czynnika redukującego i p iro g ro n ia­
nu [73]. W m itochondriach tych duża część białka
oksydazy alternatyw nej była w postaci zw iązanego
kow alencyjnie utlenionego (mniej aktyw nego) dim eru,
dodanie zaś czynnika redukującego (DTT), ja k ró w ­
nież izocytrynianu i jab łczan u pow odow ało redukcję
białka oksydazy alternatyw nej do zw iązanego nieko-
walencyjnie (bardziej aktyw nego) dim eru. Przypuszcza
się, że czynnikiem regulującym stan utlen ien ia/red u k ­
cji dim eru oksydazy alternatyw nej m ogłaby być nie
tioredoksyna [6, 68], ale przede w szystkim N A D P H
pow stający w ew nątrz m itochondriów [73]. W procesie
izolow ania m itochondriów dim er m oże ulegać utlenie­
niu, dlatego wydaje się, że oksydaza alternaty w n a
m oże być dużo bardziej aktyw na in vivo niż w w yizolo­
w anych m itochondriach. W tkance p o n ad to stan utle­
nienia/redukcji białka oksydazy alternatyw nej m oże
podlegać regulacji poprzez zm ienną ilość siły redukcyj­
nej w ytw arzanej w ew nątrz m itochondriów [68, 73].
K ońcow ym p ro d u k tem redukcji tlenu przez o k ­
sydazę alternatyw ną jest w oda [6, 49, 74]. O ksydaza
alternatyw na m a m niejsze pow inow actw o do tlenu niż
oksydaza cytochrom ow a (Km dla 0 2 oksydazy alter­
natyw nej w ynosi 10-20 pM , podczas gdy oksydazy
cytochrom ow ej 0.1-0.6 pM [75]. Jednakże w zakresie
stężeń tlenu (100-200 pM ) używ anych do po m iaru
oddychania, aktyw ność oksydazy alternatyw nej jest
praktycznie niezależna od stężenia tlenu [5].
O d daw na sugeruje się obecność w centrum aktyw ­
nym oksydazy alternatyw nej żelaza zw iązanego niehe-
m ow o [6, 49, 76]. Jed n ak żadna z dotychczasow ych
analiz w yizolow anego białka oksydazy alternatyw nej
nie potw ierdziła w sposób jednoznaczny obecności
żelaza [5]. O statn io zap ro p o n o w an o hipotetyczną
stru k tu rę centrum aktyw nego oksydazy alternatyw nej,
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 analogiczną do m etalo -białka m ono oksygenazy m e­
ta n u [6, 77].
III-2. Regulacja przepływu elektronów przez dro­
gę cytochrom ową i alternatywną
D o oznaczania udziału w oddychaniu drogi a lter­
natyw nej i cytochrom ow ej używ ano m etody B a h r a
i B o n n e r a polegającej n a m iareczkow aniu aktyw ­
ności o b u d ró g odpow iednio in hibitoram i drogi alter­
natyw nej (kwas salicylohydroksam ow y) lub cy to ch ro ­
mowej (cyjanek potasu) [49, 78-80]. M eto d a ta znalaz­
ła zastosow anie nie tylko w odniesieniu do izolow a­
nych m itochondriów , ale rów nież do tk an ek i całych
roślin [80, 81].
Przy użyciu inh ib ito rów drogi alternatyw nej i cyto­
chrom ow ej w ykazano, że dro g a altern aty w n a działa
przy wysyconej drodze cytochrom ow ej [78, 79]. O bie
drogi rozgałęziają się n a poziom ie ubichinonu, m ają
jed n ak w sto su n k u do niego odm ienne własności
kinetyczne. A ktyw ność drogi cytochrom ow ej zależna
jest od sto p n ia redukcji ubichinonu w sposób liniowy,
n ato m iast aktyw ność drogi alternatyw nej nie w ykazu­
je tej zależności i ujaw nia się dopiero, gdy pula
ubich in o n u jest zred u k o w an a powyżej 35-40% [82,
83]. Tylko u roślin term ogennych zależność ak ty w n o ­
ści drogi alternatyw nej od sto p n ia redukcji ubichinonu
jest zależnością liniow ą [83].
W yniki p o m iaró w w oltam etrycznych poziom u re­
dukcji u b ichinonu w ykazały, że jego redukcja m oże
być dw u sto p n io w a [84]. Z ap ro p o n o w an o m odel regu­
lacji przepływ u elektronów przez pulę ubichinonu na
drogę alternatyw ną, tlen reagow ałby z oksydazą alter­
natyw ną, gdy osiągnie o n a stan cztero elektronow ej
redukcji [84]. P o tw ierdzałoby to b rak translokacji
p ro to n ó w przez oksydazę alternatyw ną [11], w przeci­
wieństwie do oksydazy cytochrom ow ej działającej
ja k o p o m p a p ro to n o w a [85],
N a stan redukcji ubichinonu wpływ a aktyw ność
dehydrogenaz łań cu ch a oddechow ego. W większości
dośw iadczeń w izolow anych m ito ch o n d riach wysyce-
nie o b u dróg oznaczano dod ając ja k o su b strat bur-
sztynian [86, 87]. W tych w aru n k ach dro g a cyto­
chrom ow a p raw d o p o d o b n ie nigdy nie osiąga stanu
wysycenia, bo np. d odanie N A D H jednocześnie z bur-
sztynianem spraw ia, że oddychanie poprzez drogę
cytochrom ow ą, w tych sam ych m itochondriach, jest
znacznie wyższe [88]. P o n a d to oznaczenia aktyw ności
obu d ró g przy użyciu in h ibitorów (tzw. m iareczkow a­
nia inhibitoram i) w ykazały, że zaham ow anie drogi
alternatyw nej m oże prow adzić do w zrostu oddychania
d ro g ą cytochrom ow ą [87, 88]. W skazuje to n a b rak
wysycenia drogi cytochrom ow ej przy działającej d ro ­
dze alternatyw nej oraz n a m ożliwość jednoczesnego
przepływ u elektronów przez obie drogi i w spółzaw od­
nictw o o elektrony [86, 89]. B iorąc pod uwagę czyn­
niki wpływ ające n a aktyw ność oksydazy alternatyw ­
nej, w ydaje się, że regulacja przepływ u elektronów na
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
drogę alternatyw ną jest o wiele bardziej skom plikow a­
na niż to początkow o przypuszczano. P ytanie o m e­
chanizm regulacji stale czeka na odpow iedź.
III-3 O znaczanie aktywności drogi alternatywnej
O pisane powyżej b ad an ia wykazały, że oznaczana
przy użyciu inhibitorów aktyw ność drogi alternatyw ­
nej, zarów no w całych roślinach ja k izolow anych
m itochondriach, m oże być niższa niż w ystępująca in
vivo [87-89]. W izolow anych m itochondriach zarów no
poziom piro g ro n ian u ja k i czynnika redukującego
m ostki disiarczkow e dim eru oksydazy alternatyw nej
m oże być różny od poziom u tych czynników w m ito ­
chondriach w tkance. P o n ad to , pobieranie tlenu h a ­
m ow ane przez inh ib ito r drogi alternatyw nej nie m oże
być m iarą jej aktyw ności in vivo, albow iem zaham ow a­
nie drogi alternatyw nej m oże pow odow ać przepływ
elektronów na niew ysyconą drogę cytochrom ow ą.
Przy użyciu inhibitorów m ożna więc jedynie określać
typ oddychania; np. cyjanoodporne lub wrażliwe na
kwasy hydroksam ow e (SHAM ), podkreślając jed n o ­
cześnie, że w artość tego oddychania w ażna jest wyłącz­
nie dla danych w arunków eksperym entalnych (od­
dychanie w obecności inhibitora), m oże n ato m iast być
różna w w arunkach in vivo, (przy b ra k u inhibitora)
[87], W yrazem krytyki oznaczania aktyw ności o k ­
sydazy alternatyw nej przy użyciu inhibitorów jest
artykuł w dziale „view points” jednego z ostatnich
num erów Plant Physiology p o d znam iennym tytułem
„O ksydaza niew rażliw a n a cyjanek: ham ow ać czy nie
ham ow ać, oto jest pytanie”. K onkluzja i odpow iedź na
postaw ione w tytule pytanie brzm i — nie ham ow ać, nie
oznaczać aktyw ności oksydazy alternatyw nej przy
pom ocy inhibitorów [90]. W obec tego ja k oznaczać
aktyw ność drogi alternatyw nej in vivo?
O statn io rozw inęła się technika oznaczania aktyw ­
ności drogi alternatyw nej poprzez oznaczenie stopn ia
dyskrym inacji (tzn. nierów nom iernie niższego) pobie­
ran ia z pow ietrza izotopu 180 2 w stosunku do 160 2
[91-93]. D yskrym inacja p obierania 180 2 przez drogę
alternatyw ną jest większa niż przez drogę cytochrom o ­
wą. Stopień dyskrym inacji p obierania przez drogę
cytochrom ow ą wynosi 17,1-20%, n ato m iast przez d ro ­
gę alternatyw ną 23,5-25,5% , w artości te w przypad k u
różnych roślin są nieco odm ienne [91-93]. P rzy za­
stosow aniu tej techniki w ykazano, że w izolow anych
m itochondriach soi w w arunkach stan u 3 (w obecności
ADP), po d o d an iu pirogronianu, przy niskim pozio­
mie redukcji ubichinonu, obie drogi w spółzaw odniczą
o zredukow aną pulę ubichinonu [93]. Z astosow anie
do tych sam ych w arunków tradycyjnej m etody p om ia­
ru oddychania elektrodą C lark a i użycie inhibitorów
nie w ykazało udziału drogi alternatyw nej [93].
W ydaje się, że technika dyskrym inacji pobierania
izotopu tlenu jest obecnie jedyną w iarygodną i niein­
w azyjną (bez użycia inhibitorów ) m etodą oznaczania
in vivo udziału drogi alternatyw nej w oddychaniu. Nie
273
ulega jed n ak wątpliw ości, że jest nieco bardziej czaso­
ch ło n n a i w ym agająca specyficznej a p a ra tu ry (chro­
m ato g raf gazowy, sp ek tro m etr masowy).
III-4. R ola fizjologiczna drogi alternatywnej
R ola fizjologiczna drogi alternatyw nej ja k o procesu
generującego ciepło wydaje się być bezsporna jedynie
u Araceae [47], U innych roślin poziom w ytw arzania
ciepła przez drogę alternatyw ną jest zbyt mały, aby
m iał jakiekolw iek znaczenie fizjologiczne. H ipoteza
„przelew u” (overflow) w ysunięta przez L a m b e r s a
opisyw ała stany fizjologiczne w jak ich m oże funkc­
jo n o w ać d ro g a alternatyw na, przy wy syconej drodze
cytochrom ow ej [94-96]. W pew nych w arunkach (np.
w zrost zaw artości cukrów w kom órce i w ynikający
z tego intensyw niejszy ich przepływ przez szlak glikoli-
tyczny) m oże w ystąpić b rak rów now agi pom iędzy
oksydacyjnym m etabolizm em węgla a m ożliw ością
przepływ u elektronów przez łańcuch cytochrom ow y.
D ro g a cy tochrom ow a m oże być w ysycona przy sp ad ­
k u A D P , ograniczeniu aktyw ności jednego ze skład­
ników łań cu ch a oddechow ego [66, 73, 79], lub przy
deficycie P i [97, 98]. W tedy, przy zw iększonym m eta­
bolizm ie oksydacyjnym , następuje uruchom ienie drogi
alternatyw nej. W ydaje się jednak, że hipoteza ta m usi
ulec pewnej m odyfikacji i uwzględnić udział drogi
alternatyw nej przy nie całkow icie wysyconej drodze
cytochrom ow ej, a także uwzględnić regulację aktyw ­
ności drogi alternatyw nej tn vivo przez p irogronian
i potencjał redukcyjny w ew nątrz m itochondriów . Jak
w ykazały o statnie badania, w izolow anych m ito ch o n ­
driach tytoniu, w arunkiem uruchom ienia drogi alter­
natyw nej jest spadek poziom u A D P , w zrost siły red u k ­
cyjnej w ew nątrz m itochondriów , (niezbędnej do re­
dukcji w iązania disiarczkow ego) oraz obecność piro-
gro n ian u (p o trzeb n a do stym ulacji zredukow anej for­
m y oksydazy alternatyw nej) [73].
In n ą interesującą hipotezą opisującą rolę fizjologicz­
n ą oksydazy alternatyw nej jest jej udział w regulacji
poziom u p o n ad tlen k ó w i nadtlenków w odoru w tk a n ­
ce [87, 101]. N ad tlen k i w odoru m ogą odgryw ać rolę
w indukcji ekspresji genu oksydazy alternatyw nej [87].
W w aru n k ach stresu spow odow anego chłodem [99-
101], inw azją pasożytów , zranieniem [96], czy też
o gran iczo n ą d o stępnością fosforanu [97,98] następuje
uruchom ienie odd y chania niewrażliwego n a cyjanek.
W tedy, przy ograniczonej aktyw ności drogi cy to ch ro ­
mowej i zwiększonej redukcji ubichinonu, n a terenie
m ito ch o n d rió w m oże dochodzić do w ytw arzania po-
n ad tlen k u lub n ad tlen k u w odoru [101]. Sugeruje się,
że udział w o d d ychaniu drogi alternatyw nej m oże
ograniczać ich w ytw arzanie [87, 101]. Z ap ro p o n o w a­
n a ostatn io hip o teza regulacji aktyw ności i indukcji
oksydazy alternatyw nej uw zględnia zarów no stym ula­
cję aktyw ności oksydazy alternatyw nej przez kw asy
organiczne zapobiegającą zwiększonej redukcji ubichi­
n o n u ja k i udział nadtlenków w indukcji ekspresji genu
274
http://rcin.org.pl
odpow iedzialnego za syntezę białka oksydazy alter­
natyw nej [87]. T a niezm iernie interesująca hipoteza
jest obecnie testow ana.
IV. Uwagi końcowe
W ciągu ostatnich pięciu lat techniki biologii m ole­
kularnej niew ątpliw ie b ardzo posunęły n ap rzó d b a d a ­
nia n ad stru k tu rą i ro lą fizjologiczną oksydazy a lter­
natyw nej. D ostępność przeciw ciał oksydazy altern aty ­
wnej oraz klonów cD N A pozw ala śledzić ekspresję
o ddychania niew rażliw ego n a cyjanek n a poziom ie
R N A i białka z jednoczesnym i pom iaram i gazom et-
rycznym i (pobieranie tlenu). O trzym anie roślin tran s-
genicznych ze zw iększoną lub zm niejszoną ekspresją
oksydazy alternatyw nej um ożliwi określenie jej roli
w procesach w zrostu i rozw oju roślin.
O znaczenie udziału w oddychaniu niefosforylującej
drogi alternatyw nej oraz m echanizm ów zw iązanych
z regulacją tego udziału m a ogrom ne znaczenie dla
określenia w ydajności energetycznej odd ychania
[102]. U pew nych roślin (Lolium perenne) obserw uje
się negatyw ną korelację m iędzy w ysokością p lo n o w a­
nia a intensyw nością oddychania. M oże to być m.in.
w ynikiem różnej intensyw ności oksydacyjnej fosfory­
lacji [95]. W ydaje się więc, że określenie udziału
w oddychaniu drogi alternatyw nej jest o wiele bardziej
istotne niż to się do tej pory w ydaw ało, a d o ty ch ­
czasowe wyliczenia w ydajności energetycznej o d d y ­
chania roślin in vivo m ogą być n a znacznie zaniżonym
poziom ie. D o tych zad ań niezbędny jest rozwój n o ­
wych m etod pozw alających n a precyzyjne określenie
udziału obu dróg, drogi alternatyw nej i cy to ch ro m o ­
wej w oddychaniu roślin.
Napisanie tego artykułu było możliwe dzięki sfinansowaniu
przez Grant KBN 6P2043705 uczestnictwa autorki w Kon­
ferencji „Plant Mitochondria from Gene to Function”.
A rtyku ł otrzym ano 6 lutego 1996 r.
Zaakceptow ano do druku 20 marca 1996 r.
Piśmiennictwo
1. H r y n i e w i e c k a L (1993) Post Biol Komórki 20: 181-199
2. Do u c e R, B r o u q u i s s e R, J o u r n e t E- P (1987) W:
Davies D.D (red) The Biochemistry of Plants: A Comprehensive
Treatise, t 11 Academic Press, San Diego, Ca, str. 177-221
3. D o u c e R (1985) W: Mitochondria in Higher Plants: Structure,
Function, and Biogenesis. Academic Press, Orlando, Florida
4. Do u c e R, N e u b u r g e r M (1989) Annu Rev Plant Physiol
Plant M ol Biol 40: 371-414
5. Mo o r e A L , S i e d o w J N (1991)Biochim BiophysActa 1059:
121-140
6. S i e d o w JN, U m b a c h AL (1995) Plant Cell 7: 821-831
7. P a l m e r JM, Mö l l e r I M (1982) TYends Biochem Sci 7:
258-261
8. P a l m e r JM, Wa r d JA (1985) Encycl Plant Physiol 18:
173-201
9. Mö l l e r IM, Li n W (1986) Annu Rev Plant Physiol 37:
309-334
10. Mö l l e r IM, R a s m u s s o n AG, F r e d l u n d KM (1993)
J Bioenerg Biomembranes 25: 377-384
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 11. Mo o r e AL, B o n n e r WD, Ri c h PR (1978) J Exp Bot 29:
1-12
12. C o t t i n g h a m IR, M o o r e AL (1983) Biochim Biophys
Acta 724: 191-200
13. E l t h o n TE (1995) Referat na Konferencji „Plant Mitochond­
ria” From Gene to Function” Duke University, Durham, N.C.
USA
14. Mö l l e r IM, P a l m e r J M (1981) Biochim Biophys Acta 638:
22-233
15. Mö l l e r IM, P a l m e r J M (1981) Physiol Plant 53: 413-420
16. Mö l l e r I M, P a l me r J M, J o h n s t o n SP (1983)Biochim
Biophys Acta 725: 289-297
17. E d m a n K , E r i c s o n I , Mö l l e r I M (1985) Biochem J 232:
471-477
18. K u r k d j i a n A, G u e r n J (1989) Annu Rev Plant Physiol
Plant M ol Biol 40: 271-303
19. S o o l e KL , D r y l B , W i s k i c h J T (1990) Physiol Plant 78:
205-210
20. Mö l l e r IM, J o h n s t o n SP, P a l m e r J M (1981) Biochem
J 194: 487-495
21. C o o k N D , C a m m a c k R (1984)E u r J Biochem 141:573-577
22. C o t t i n g h a m IR, Mo o r e AL (1984) Biochem J 224:
171-179
23. Ru g o l o M, Z a n n o n i D (1992) Plant Physiol 99:1037-1043
24. La n c e C, C h a u v e a u M, D i z e n g r e m e l P (1985)
Encycl Plant Physiol 18: 202-247
25. G a r d e s t r ö m P, E d w a r d s GE (1983) Plant Physiol 11\
24-29
26. H u q S, P a l m e r J M (1978) Plant Sei Lett 11: 351-358
27. H e m r i k a - W a g n e r AM, G u d e H, Ma r i s s e n N,
Va n der Pi a s LHW, Ve r l e u r J.D. (1986) Plant Cell
Physiol 27: 499-503
28. He i n eke D, Ri e ns B, G r o s s e H, H o f e r i c h t e r P,
P e t e r U (1991) Plant Physiol 95: 1131-1137
29. D ry IB, D ay DA, Wi s k i c h J T (1983) F EBS L ett 158:
154-158
30. B e r g ma n A, Er i c s on I (1983) Physiol Plant 59: 421-427
31. E b b i g h a u s e n H, Ch e n J, He i d t HW (1985) Biochim
Biophys Acta 810: 184-189
32. Ol i v e r DJ, Wa l k e r GH (1984) Plant Physiol 16: 409-413
33. D ay DA, N e u b u r g e r M, D o u c e R (1985) Austr J Plant
Physiol 12: 119-130
34. D ry IB, Wi s k i c h J T (1985) Austr J Plant Physiol 12:
329-339
35. Wi s k i c h JT, Br yc e JH, Da y DA, Dr y IB (1990) Plant
Physiol 93: 611-616
36. K r ö m e r S, He i d t HW (1991) Biochim Biophys Acta 1057:
42-50
37. Mö l l e r IM, Li d e n AC, E r i c s o n I, G a r d e s t r ö m
P (1987) Methods in Enzymol 148: 442-453
38. P e t i t PX, G a r d e s t r ö m P, R a s m u s s o n AG, M ö l ­
l er I M (1991) Plant Sei 78: 177-183
39. R a s m u s s o n AG, Mö l l e r I M (1991) Physiol Plant 83:
357-365
40. Sool e K L, D r y IB, Wi s k i c h J T (1992) Plant Physiol 98:
588-594
41. C o t t i n g h a m IR, C l e e t e r MW J, R a g a n Cl, Mo o r e
A L (1986) Biochem J 236: 201-207
42. C o t t i n g h a m IR, M o o r e AL (1988) Biochem J 254:
303-305
43. Ch e n S, G u i l l o r y PJ (1981) J Biol Chem 256: 8318-8323
44. Mö l l e r IM, P a l m e r JM, J o h n a s t o n SP (1983) Bio­
chim Biophys Acta 725: 289-297
45. La n c e C, R u s t i n P (1984) Physiol Veg 22: 625-641
46. Me e u s e BJ D (1975) Annu Rev Plant Physiol 26: 117-126
47. O r d e n t l i c h A, L i n z e r RA, R a s k i n I (1991) Plant
Physiol 97: 1545-1550
48. R h o a d s D M , M c I n t o s h L (1992) Plant Cell 4: 1131-1139
49. R y c h t e r AM (1982) Post Biochem 28: 89-111
50. H u q S, P a l m e r J M (1978) FEBS L ett 95: 217-220
51. Ri ch PR (1978) FEBS L ett 96: 252-256
52. B o n n e r WD, Ri ch PR (1983) 72: S-19
53. B o n n e r WD, C l a r k e S D, Ri ch PR (1986) Plant Physiol
80: 838-842
54. E l t h o n TE, M c I n t o s h L (1986) Plant Physiol 82: 1-6
55. E l t h o n TE, M c I n t o s h L (1987) Proc N atl Acad Sei USA
84: 8399-8403
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
56. B e r t h o l d DA, Si e d o w J N (1993) Plant Physiol 101:
113-119
57. E l t h o n TE, Ni c k e l s RL, M c I n t o s h L (1989) Plant
Physiol 89: 1311-1317
58. M c I n t o s h L (1994) Plant Physiol 105: 781-786
59. Hi s e r C, M c I n t o s h L (1990) Plant Physiol 93: 312-318
60. L a m b o w i t z AM, S a b o u r i n JR, B e r t r a n d H, N i c ­
kel s R, M c I n t o s h L (1988) M ol Cell Biol 9: 1362-1364
61. O b e n l a n d D, Di e t h e l m R, Dh i b l e s R, S t e wa r t
C (1990) Plant Cell Physiol 31: 897-901
62. K e a r n s A, Wh e l a n J, Yo u n g S, E l t h o n TE, Da y
DA (1992) Plant Physiol 99: 712-717
63. S a k a j o S, M i n a g a w a N, K o m i y a m a T, Yo s h i mo -
t o A (1991) Biochim Biophys Acta 1090: 102-108
64. R h o a d s DM, M c I n t o s h L (1991) Proc N atl Acad Sci
U SA 8 8 : 2122-2126
65. K u m a r AM, Soi l D (1992) Proc N atl Acas Sci USA 89:
10842-10846
66. V a n l e r b e r g h e GC, M c I n t o s h L (1994) Plant Physiol
105: 867-874
67. Si e d o w J N, Wh e l a n J , Ke a r n s A, Wi s ki c h J T, Da y
D A (1992) W: Lambers H, van der Plas LHW (red) Molecular,
Biochemical and Physiological Aspects of Plant Respiration.
Academic Press, The Hague, The Netherlands, str 19-27
68. U m b a c h AL, Si e d o w J N (1993) Plant Physiol 103:
845-854
69. Wa g n e r AM, K r a a k MS, v a n E m m e r i k WAM,
van de r Pl a s L HW (1989) Physiol Plant 27: 837-845
70. Mi l l a r AH, Wi s k i c h JT, Wh e l a n J , Da y DA (1993)
FEBS L ett 329: 259-262
71. D ay DA, Mi l l a r AH, Wi s k i c h J T , Wh e l a n J (1994)
Plant Physiol 106: 1421-142
72. R u s t i n P, M o r e a u F, La n c e C (1980) Plant Physiol 66 :
457-462
73. V a n l e r b e r g h e GC, Da y DA, Wi s k i c h J T , V a n l e r ­
b e r g h e AE, M c I n t o s h L (1995) Plant Physiol 109:
353-361
74. K ay CJ, P a l m e r J M (1985) Biochem J 228: 309-318
75. R i b a s - C a r b o M, Be r r y JA, A z c o n - B i e t o J, S i e ­
dow J N (1994) Biochim Biophys Acta 1188: 205-212
76. S c h o n b a u m GR, B o n n e r WD, S t o r e y BT, Ba h r
J T (1971) Plant Physiol 47: 124-128
77. Si e d o w JN, U m b a c h A L, Mo o r e AL (1995) FEBS Lett
362: 10-14
78. Ba h r JT, B o n n e r WD (1973) J Biol Chem 248: 3441-3445
79. B a h r J T, B o n n e r W D (1973) J Biol Chem 248: 3446-3450
80. Mo H er IM, Ber c zi A, van der P l a s LHW, L a m ­
ber s H (1988) Physiol Plant 72: 642-649
81. T h e o l o g i e s A, L a t i e s GG (1978) Plant Physiol 62:
232-237
82. D ry I B, Mo o r e AL, Day DA, Wi s k i c h J T (1989) Arc/j
Biochem Biophys 273: 148-157
83. D ay DA, D ry IB, Sool e KL, Wi s h i c h JT, Mo o r e
A L (1991) Plant Physiol 95: 948-953
84. S i e d o w JN, Mo o r e AL (1993) Biochim Biophys Acta 1142:
165-174
85. Ba b c o c k GT, Wi k s t r o m M (1992) Nature (Lond) 356:
301-309
86. Wa g n e r AM, Wa g n e r MJ (1995) Plant Physiol 108:
277-283
87. Wa g n e r AM, K r a b K (1995) Physiol Plant 95:318-325
88. Ho e f n a g e l MHN, Mi l l a r AH, Wi s k i c h JT, Da y
DA (1995) Arch Biochem Biophys 318: 394-400
89. At k i n OK, Vi l l a r R, L a m b e r s H (1995) Plant Physiol
108: 1179-1183
90. D ay DA, K r a b K, L a m b e r s H, Mo o r e A L, Si e d ow
JN, Wa g n e r AM, Wi s k i c h J T (1996) Plant Physiol 110:
1-2
91. We g e r HG, Gu y RD, T u r p i n DH (1990) Plant Physiol
93: 356-360
92. R o b i n s o n SA, Ya k i r D, R i b a s - C a r b o M, Gi l e s L,
O s m o n d CB, S i e d o w JN, Be r r y JA (1992) Plant
Physiol 100: 1087-1091
93. R i b a s - C a r b o M, Be r r y JA, Ya k i r D, Gi l e s L,
R o b i n s o n SA, L e n n o n AM, S i e d o w J N (1995) Plant
Physiol 109: 829-837
94. L a m b e r s H (1982) Physiol Plant 55: 478-485
275
95. L a m b e r s H (1980) Plant Cell and Environment 3: 293-302
96. L a m b e r s H (1985) W: Douce R, Day DA (red.) Encyklopedia
of Plant Physiology New Series, t. 18 Springer-Yerlag Berlin
Eleidelberg, str 418-473
97. R y c h t e r A M, M i k u l s k a M (1990) Physiol Plant 79:
663-667
98. R y c h t e r A M , C h a u v e a u M, B o m s e l J - L , L a n c e
C (1992) Physiol Plant 84: 80-86
Sterowana biosynteza antybiotyków poliketydowych
Engineered biosynthesis of polyketide antibiotics
K A T A R Z Y N A K U C Z E K 1,
M A G D A L E N A K O T O W S K A 2,
M A R IA N M O R D A R S K I3
Spis treści:
I. Wstęp
II. Syntazy poliketydowe
III. Geny syntaz poliketydowych
IY. Próby sterowania biosyntezą
IV-1. Badanie mutantów zablokowanych na poszcze­
gólnych etapach biosyntezy
IV-2. Heterologiczna ekspresja genów
IV-3. Badanie funkcji natywnego kompleksu syntazy
podlegającego ekspresji w komórkach Escheri­
chia coli
IY-4. Badanie funkcji wyselekcjonowanego zespołu en­
zymów PKS w układzie pozakomórkowym
IV-5. Analiza sekwencji genów
V. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: PKS — syntaza poliketydowa;
minPKS — minimalny zestaw genów' syntazy; DEBS — syn­
taza 6- dezoksyerytronolidu B; SU — jednostka syntazy; AT
— acylotransferaza; ACP — białkowy czynnik przenoszący
grupy acylowe; KS — syntaza P-ketoacylowa; KR — ketore-
duktaza; DH — dehydrogenaza; ER — enoiloreduktaza; TE
— tioesteraza; CLF — czynnik determinujący długość
łańcucha; ARO — aromataza; CYC — cyklaza; MT
— 0-metylotransferaza.
I. Wstęp
N azw a „połiketydy” oznacza klasę zw iązków wy­
tw arzanych w w yniku szeregu reakcji kondensacji
reszt acylow ych k ró tk ich kw asów karboksylow ych
oraz reakcji ich redukcji w sposób p o d o b n y do syntezy
kw asów tłuszczowych. Jest to heterogenna grupa
3Dr, 2mgr inż.,3prof., Instytut Immunologii i Terapii
Doświadczalnej PAN ul. Czerska 12, 53-114 Wrocław.
276 http://rcin.org.pl
99. R y c h t e r A M, C i e ś l a E, K a c p e r s k a A (1988) Physiol
Plant 73: 299-304
100. Y a n l e r b e r g h e G C , M c I n t o s h L (1992) Plant Physiol
100: 115-119
101. P u r v i s AC, S h e w f e l t R L (1993) Physiol Plant 8 8 :
712-718
102. M o o r e AL, L e a c h G, W h i t e h o u s e D G , v a n d e r
B e r g e n C, W a g n e r A, K r a b H (1994) Biochim Biophys
Acta 1187: 145-151
Contents:
I. Introduction
II. Polyketide synthases
III. Genes of polyketide synthases
IV. Attempts of programming of biosynthesis
IV-1. Investigation of mutants blocked on different
stages of biosynthesis
IV-2. Heterologous gene expression
IV-3. Investigation of synthase complex expressed in
Escherichia coli
IV-4. Investigation of enzyme complex in cell free
systems
IV-5. Gene sequence analysis
V. Concluding remarks
zw iązków, do której zalicza się roślinne flaw onoidy,
toksyny grzybow e oraz liczne związki pochodzenia
bakteryjnego [1-3] (Ryc. 1). Wiele z nich wykazuje
właściwości przeciw bakterjne, przeciwgrzybicze, prze-
ciw now otw orow e, a naw et toksyczne w obec p asoży­
tów przew odu pokarm ow ego kręgow ców [3-7]. N ie­
k tó re połiketydy pochodzenia grzybow ego i b ak tery j­
nego odgryw ają rolę regulatorów w zrostu i różnicow a­
nia kom ó rk i [8]. F u n k cja biologiczna większości
z nich nie jest jed n ak znana. B ogatym źródłem poli-
ketydów są prom ieniow ce — G ram -d o d atn ie bakterie
glebowe. C h arak tery zu ją się złożonym cyklem ro z­
wojowym , podczas którego w ytw arzają wiele m etab o ­
litów w tórnych, m.in. zw iązków poliketydow ych. N a j­
bardziej znanym i z tej grupy są antybiotyki m ak ro -
lidow e oraz tetracykliny. N ależą do nich po n ad to :
antracykliny, polieny, polietery oraz pochodne chino-
nowe [9]. B adania dotyczące m echanizm u biosyntezy
poliketydów zm ierzają do utw orzenia kontrolo w an e-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 o o
Ryc. 1 Struktury związków poliketydo-
wych: stilben — poliketydowy pre­
kursor fitoaleksyn (związków po­
chodzenia roślinnego); aflatoksyna
BI — toksyna Aspergillus flavus
oryzae; tetracenomycyna C — zwią­
zek o aktywności przeciwnowo-
tworowej wytwarzany przez Strep-
HOOC.
tomyces glaucescens; aktynorody-
na, erytromycyna A, monenzyna
A, oksytetracyklina i tylozyna
— antybiotyki wytwarzane przez
różne szczepy Streptomyces.
go u k ład u dostarczającego zw iązków o za p ro g ra m o ­
wanej strukturze.
II. Syntazy poliketydowe
W szystkie syntazy poliketydow e (PK S) są pod
względem budow y i m echanizm u działania pod o b n e
do syntazy kw asów tłuszczowych. Są to wielofunkcyj­
ne zespoły enzym atyczne. K atalizują pow tarzające się
dekarboksylacyjne kondensacje (Claisena) m iędzy
acylotioestram i koenzym u A: acetylowym , propionyl-
owym, m alonylow ym lub m etylom aionylow ym . R za­
dziej m iędzy estram i innych kró tk ich kw asów k a rb o k ­
sylowych a acylotioestram i połączonym i z cysteiną
centrum aktyw nego enzym u kondensującego [9]
(Ryc 2). P ro d u k ty kondensacji uzyskują zróżnicow anie
stru k tu raln e w w yniku przejścia przez cały, lub tylko
część cyklu redukcyjnego, k tó ry obejm uje reakcje:
ketoredukcji, d eh ydratacji i redukcji enoilu przy grupie
P-ketonow ej rosnącego łańcucha poliketydow ego.
Ł ańcuch węglowy o długości charakterystycznej dla
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
OH O
CO,H
AKTYNORODYNA
STILBEN
<, OH OH N(CH3)2
,OH
CONH,
Oh II
OH O OH O
COOCH,
^CH2OH
MONENZYNA A
specyficznego p ro d u k tu zostaje uw olniony z syntazy
w skutek hydrolizy reszty acylowej (tiolizy). D ługość
łańcucha węglowego i w ybór reszt acylow ych b u d u ją­
cych łańcuch do d atk o w o w pływ ają n a olbrzym ie zróż­
nicow anie stru k tu raln e n aturalnie w ystępujących poli-
ketydów . Szkielet poliketydow y najczęściej nie jest
ostatecznym p ro d u k tem i ulega dalszym przem ianom ,
tzw. m odyfikacjom post-poliketydow ym , co rów nież
zw iększa ró żn orodność pow stających związków. D o
tych reakcji należą: cyklizacja, tw orzenie pierścieni
arom atycznych, laktonow ych, glikozylacja, m etylacja,
utlenienie.
Zw iązki poliketydow e m ożna zaliczyć do dw óch
typów stru k tu raln y ch — poliketydy arom atyczne oraz
o strukturze złożonej. Odzw ierciedleniem tego p o ­
działu są dw a różne typy organizacji kom pleksów
enzym atycznych syntazy.
Typ I stanow i jeden lub kilka dużych polipeptydów .
K ażdy z nich to m ultifunkcjonalny enzym analogiczny
do eukariotycznej syntazy kw asów tłuszczowych i syn­
tazy kw asu 6-m etylosalicylowego Pénicillium patulum
277
Ryc. 2 Schemat syntezy poliketydów (wg
[9], reprodukcja za zgodą Annu
Rev Inc). Asymetryczne atom y wę­
gla oznaczono kółkiem. Zmiana
koloru z białego na czarny oznacza
inwersję konfiguracji. ACP — biał­
kowy czynnik przenoszący grupy
acylowe, KS — syntaza P-ketoacy-
lowa.
[10]. W ielofunkcyjny polipeptyd składa się z p o w tó ­
rzonych regionów , zw anych jed n o stk am i syntazy (syn-
thase units - SU), katalizujących kolejne cykle re d u k ­
cyjne. K a żd a je d n o stk a skupia centra katalityczne
poszczególnych reakcji doprow adzających do k o n d en ­
sacji i całkow itej lub częściowej redukcji pow stającego
łańcucha. W szystkie SU zaw ierają syntazę P-ketoacy-
low ą (KS), acylotransferazę (AT) i białkow y czynnik
przenoszący grupy acylowe (ACP), różnią się liczbą
dom en k eto red u k tazy (KR), dehydrogenazy (DH)
i en oiloreduktazy (ER). D om eną kończącą syntezę
szkieletu poliketydow ego jest tioesteraza (TE). K ażde
centrum aktyw ne jest w ykorzystyw ane tylko raz p o d ­
czas syntezy jednej cząsteczki pro d u k tu .
D o typu I zaliczana jest m.in. syntaza aglikonow ej
części m ak ro lid u — erytrom ycyny Saccharopolyspora
erythraea oraz inne m akrolidow e syntazy prom ieniow ­
ców i aw erm ektyny Streptom yces avermitilis, tylozyny
Streptom yces fradiae, spiram ycyny Streptom yces am-
bofaciens oraz karbom ycyny Streptom yces thermotole-
rans [11-13].
Syntaza ty p u II stanow i kom pleks kilku zasoc-
jow anych enzym ów , z których każdy jest w ielokrotnie
aktyw ny w ciągu syntezy jednego zw iązku [9]. Te
enzym y to KS, AT, A C P, czynnik determ inujący
długość łań cucha (chain length determining fa ctor
- CLF), K R , cyklaza (CYC) i aro m a taza (ARO). D o
typu II należy syntaza kw asów tłuszczow ych Escheri-
chia coli oraz wszystkie znane syntazy arom atycznych
p oliketydów u prom ieniow ców rodzaju Streptomyces.
Ze względów funkcjonalnych został w yróżniony
trzeci typ syntazy, w ystępujący wyłącznie u roślin
wyższych. C h arak teryzuje się on brakiem A C P. Jego
funkcje przejm uje koenzym A zestryfikow any kw asam i
karboksylow ym i [14, 15].
G enetyczne pod staw y p ro g ram o w an ia stru k tu ry
poliketydu były do niedaw na całkow icie nieznane.
P ro w ad zo n e obecnie w kilku o środkach b ad a n ia zmie-
278
http://rcin.org.pl
rzają do ich w yjaśnienia i w ykorzystania w p ro g ram o ­
w aniu syntez now ych zw iązków in vivo.
III. Geny syntaz poliketydowych
W yodrębniono i sklonow ano geny kilkunastu syn­
taz poliketydow ych prom ieniow ców . G eny każdego
z dotychczas scharakteryzow anych zespołów syntaz są
zgrupow ane w jednym regionie genom u. Tow arzyszą
im geny oporności (jeśli poliketyd jest antybiotykiem )
oraz geny enzym ów w prow adzających postpolikety-
dow e m odyfikacje w szkielecie związku.
W przy p ad k u wszystkich zbadanych syntaz typu
I geny są długim i jed n o stk am i transkrypcyjnym i (ok.
10 tysięcy p ar zasad). K ażd a z nich koduje wszystkie
enzym y uczestniczące kolejno w cyklach w ydłużania
i redukcji łańcucha węglowego. P ełną sekwencję nuk-
leotydow ą pozn an o jedynie w przy p ad k u genów syn­
tazy dezoksyerytronolidu B (6-deoxyerythronolide
B synthase - D E B S) czyli aglikonow ej części eryt-
rom ycym y A. Sekwencja ta obejm uje około 56 tys. p ar
zasad tw orzących trzy jed n o stk i transkrypcyjne (ot­
w arte ram ki odczytu): ery A l, e ry A II i e r y A III (Ryc. 3).
K ażd a ra m k a odczytu zaw iera po dw a m oduły, z k tó ­
rych każdy koduje ciąg dom en enzym atycznych skła­
dających się n a jed n o stk ę syntazy. Liczba m odułów
w zespole genów syntazy odpow iada liczbie cykli
kondensacji i redukcji. T ak więc w zespole genów
D EB S w ystępują trzy jed n o stk i transkrypcyjne sk u ­
piające po dw a m oduły. O dpow iada to łącznie sześciu
reakcjom kondensacji i tow arzyszących im redukcji
podczas syntezy erytrom ycyny. P o n ad to , ciąg dom en
enzym atycznych kodow anych przez dany m oduł o d ­
pow iada dokładnie kolejności reakcji, k tó re zachodzą
w określonym cyklu. T ak więc stru k tu ra i długość
łańcucha poliketydu jest zap ro g ram o w an a przez linio­
wą sekwencję genów [16].
A naliza D N A izolow anego z różnych szczepów
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 MODUŁ 2 MODUŁ 4 MODUŁ 6
MODUŁ 1 MODUŁ 3 MODUŁ 5

(1)

(2)

(3)

(4)

Ryc. 3 O rganizacja genetyczna syntazy 6 -dezoksyerytronolidu B (DEBS) i jej modyfikacje (wg [28], zmodyfikowano, reprodukcja za zgodą Am
Assoc Adv Sei).
(1) -— naturalny produkt DEBS, 6 -dezoksyerytronolid B;
(2), (3), (4) produkty DEBS zmodyfikowanej przez, odpowiednio, delecję domeny KR z m odułu 5, inaktywację domeny ER z modułu 4,
przeniesienie domeny TE z m odułu 6 na koniec modułu 2.
AT — acylotransferaza, A CP — białkowy czynnik przenoszący grupy acylowe, KS — syntaza ß-ketoacylowa, K R — ketoreduktaza, DH
— dehydrogenaza, ER — enoiloreduktaza, TE — tioesteraza.

Streptom yces, kodującego enzym y biosyntezy innych
m akrolidów takich jak: tylozyna, spiram ycyna, aw er-
m ektyna, k arb o m y cy n a czy kandycydyna sugeruje
p o d o b n ą organizację m olekularną. Zespoły genów
biosyntezy tych m ak ro lidów obejm ują znacznie więk­
szy region genom u w p o ró w n an iu z zespołem ery t­
rom ycyny: aw erm ektyny — 95 tys. p a r zasad, tylozyny
— 80 tys. pz i kandycydyny — 105 tys. pz.
W kom pleksie syntazy typu II poszczególne enzym y
są kodow ane przez osobne geny. U łożenie tych genów
jest bardzo p o d obne we w szystkich syntazach (Ryc. 4).
G eny różnych syntaz kodujące KS, AT, C L F i A C P
m ają niem al identyczną wielkość i w zajem ne położenie
[17-24]. W przypadku tego typu organizacji ułożenie
genów nie pozw ala w nioskow ać o kolejności reakcji,
a co za tym idzie — o strukturze p ro d u k tu .
IV. Próby sterowania biosyntezą
D ośw iadczenia prow adzące do otrzym ania polike-

Ryc. 4 Geny syntaz poliketydowych typu II od­ lOOOpz

powiedzialnych za syntezę aktynorodyny
(act) przez Streptomyces coelicolor, grana- a ct < KR KS AT> CLF |aCP^> ARO CYC
tycyny (gra) — S. violaceoruber, tetraceno-
mycyny (tem) — S. glaucescens, frenolicy- g ra <C KR KS AT> CLF > ACP)> CYC >
ny (fren) — S. roseofulvus, gryzeuzyny
(gris) — S. griseus oraz barw nika zarod­
tem KS AT> CLF |aCP^> ARO/
CYC MT
ników (whiE) — S. coelicolor (wg [48],
zmodyfikowano, reprodukcja za zgodą
Macmillan M agaz Ltd.). fren KS AT> CLF ACP^> KR^> ARO~> CYC >
KR — ketoreduktaza, KS — syntaza
P-ketoacylowa, AT — acylotransferaza, gris KS AT^> CLF |aCP^> KR> ARO >
C LF — czynnik determinujący długość
łańcucha, A CP — białkowy czynnik prze­ KS AT> CLF |aCP^>
w hiE
noszący grupy acylowe, ARO — arom ata-
za, CYC — cyklaza, M T — o-m etylotran-
sferaza.
SYNTAZA "MINIMALNA"

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 279

http://rcin.org.pl
tydów nie w ystępujących w naturze są bardzo ściśle
pow iązane z b ad an iam i n ad m echanizm em biosyntezy.
W tych b ad an iach w ykorzystano wiele m etod eks­
perym entalnych, k tó re um ożliwiły poznanie stru k tu ry
zw iązków przejściowych, przypisanie funkcji p ro d u k ­
to m poszczególnych genów i określenie specyficzności
enzymów. M eto d y te opisano poniżej.
IV-1. Badanie mutantów zablokowanych na
poszczególnych etapach biosyntezy
„K o lin earn o ść” genów syntaz typu I i ich p ro d u k ­
tów n arzu ca sposób potencjalnej zm iany stru k tu ry
w ytw arzanego zw iązku przez m odyfikacje genetyczne
pow odujące unieczynnienie fragm entów określonego
m odułu. Stosując takie podejście eksperym entalne
D o n a d i o i w s p . [25] dokonali zm ian w obrębie
zespołu syntazy dezoksyerytronolidu B, m ających
wpływ n a redukcję łańcucha węglowego (Ryc. 3).
P o w odując delecję genom ow ego D N A w obrębie całej
dom eny k eto red u k tazy w podjednostce piątej otrzy­
m ano, w efekcie końcow ym , spodziew aną p o ch o d n ą
nie zred u k o w an ą przy węglu piątym , co jednocześnie
potw ierdziło, że ta k eto red u k taza jest aktyw na przy
piątej kolejno reakcji kondensacji. W pod o b n y sposób
poprzez inaktyw ację dom eny enoiloreduktazy z m o ­
dułu czw artego uzyskano p o ch o d n ą zaw ierającą w ią­
zanie podw ójne w pozycji C-6 — C-7 zam iast n o rm al­
nie występującej grupy m etylenowej [26]. O bydw a
zm odyfikow ane zw iązki to p rekursory antybiotyków
0 szerokim sp ek tru m działania.
Z espół enzym ów D EB S wydaje się tolerow ać, przy­
najm niej do pew nego stopnia, zm iany w program ie
syntezy i prow adzi „o b ró b k ę” zm ienionego poliketydu
przez dw a lub trzy dalsze cykle. Szkielet poliketydow y
jed n ak rzad k o reprezentuje p ro d u k t końcow y, a zm ie­
niony w w yniku m anipulacji genetycznych poliketyd
m oże nie stanow ić su b stratu dla enzym ów m odyfikują­
cych. S tw arza to potencjalne ograniczenia takich m a ­
nipulacji. B ad an ia dotyczące przem ian postpolikety-
dow ych dow iodły jed n ak , że enzym y m odyfikujące
w ykazują dość d u żą „elastyczność” w stosunku do
zm ienionych substratów . N a przykład, podczas syn­
tezy erytrom ycyny z dezoksyerytronolidu B najpierw
następuje hydroksylacja w pozycji C-6 p row adzona
przez p ro d u k t genu eryF, a następnie glikozylacja
szkieletu w pozycji C-3 i C-5, hydroksylacja przy C-12
1 O-metylacja jednej z reszt cukrow ych. Szczep ze
zinaktyw ow anym genem eryF prow adzi wszystkie
pozostałe m odyfikacje su b stratu nie m ającego grupy
hydroksylow ej przy węglu szóstym i pro d u k u je 6-
dezoksyerytrom ycynę A — antybiotyk znacznie b a r­
dziej stabilny w w aru n k ach kw aśnych niż erytrom ycy­
na A [27].
O statn io C o r t e s i w s p . [28] opisali inną m odyfi­
kację D EB S polegającą n a przeniesieniu aktywnej
dom eny katalitycznej w inne miejsce w obrębie k o m ­
pleksu syntazy (Ryc. 3). G en kodujący tioesterazę
280
http://rcin.org.pl
działającą ja k o cyklaza odpow iedzialna za za k o ń ­
czenie syntezy i laktonizację szkieletu został um iesz­
czony n a końcu drugiego m odułu DEBS. S pow odow a­
ło to wcześniejsze zakończenie syntezy — po dw óch
cyklach kondensacji i redukcji — i utw orzenie oczeki­
w anego zw iązku triketydow ego (złożonego z trzech
jed n o stek dwuwęglowych).
N ow e pochodne aw erm ektyny otrzym ano w w yniku
m utacji szczepu Streptom yces avermitilis [29-31]. W ie­
le z nich m a zw iększone właściwości ow adobójcze
i toksyczne względem nicieni. M ogą też służyć ja k o
su b straty do m odyfikacji chemicznych.
B adanie m u tan tó w zablokow anych na poszczegól­
nych etapach biosyntezy było w m niejszym sto p n iu
w ykorzystyw ane do b ad a n ia syntaz poliketydów a ro ­
m atycznych, poniew aż m utacje w obrębie genów o d ­
pow iedzialnych za syntezę szkieletu poliketydow ego
najczęściej przeryw ają syntezę na b ardzo wczesnym
etapie [32]. M eto d a ta okazała się p rzy d atn a do
określenia funkcji enzym ów m odyfikujących P K S ty ­
pu II [33].
IV-2- Heterologiczna ekspresja genów
H eterologiczna ekspresja genów obejm uje kilka
różnych typów doświadczeń:
a) kom plem entacja m utacji g ospodarza za po m o cą
plazm idu zaw ierającego odpow iedni fragm ent genów
syntazy z innego organizm u [34],
b) w ym iana genów n a chrom osom ie gospodarza w wy­
niku podw ójnego crossing-over [35],
c) w prow adzenie do kom órek gospodarza — p ro m ie­
niow ca nie m ającego endogennych genów P K S p laz­
m idu zaw ierającego całą „kasetę ekspresyjną” złożoną
genów jednej lub kilku syntaz [36-43],
d) w prow adzenie heterologicznych genów syntaz do
kom órek gospodarza m ającego własny zestaw genów
P K S [44-47].
D ośw iadczenia n ad program ow aniem poliketydów
typu I w ykazały, że specyficzność su b strato w a p o ­
szczególnych m odułów D EB S jest zw iązana nie tylko
z ich liniow ym ułożeniem determ inującym kolejność
reakcji [42] (Ryc. 3). Syntazy rozpoznają bow iem
podstaw ow e cechy stru k tu raln e p ro d u k tó w p o śred ­
nich. N a przykład podaw ane z zew nątrz znakow ane
związki pośrednie — diketydy w postaci tioestrów były
przyjm ow ane ja k o su b straty przez drugi m od u ł syn­
tazy w prow adzonej do Streptom yces coelicolor dając
praw idłow y p ro d u k t końcow y. W łączanie diketydów
do ery tro n o lid u potw ierdza funkcjonow anie bez za­
rz u tu syntaz poddanych „obróbce” w heterologicznym
gospodarzu. B adania te stw arzają system bezpośred­
niego testow ania stru k tu raln y ch i stereochem icznych
podstaw specyficzności przy zastosow aniu analogów
substratów .
W prow adzenie genu carE ze Streptom yces ther-
motolerans (odpow iedzialnego za przyłączenie reszty
kw asu izow alerianow ego do karbom ycyny) do Strep-
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 tomyces ambofaciens spow odow ało acylację spiram y-
cyny — n atu raln eg o p ro d u k tu S. ambofaciens [44].
W w yniku w prow adzenia do kom órek Streptom yces
galilaeus (w ytw arzającego aklacynom ycynę) genu ze
Streptom yces peucetius (producenta doksorubicyny),
kodującego hydroksylazę aklaw inonu (p ro d u k tu p o ­
średniego w syntezie obydw u zw iązków) otrzym ano
hydroksylow any an alog aklacynom ycyny. Zw iązek
ten wykazyw ał w ysoką, specyficzną cytotoksyczność in
vitro względem linii k o m ó rek białaczkow ych i czer­
niak a [45].
Ł ącząc kilka pełnych szlaków biosyntezy w k o m ó r­
kach jednego szczepu uzyskano oprócz naturalnych,
zupełnie now e p ro d u k ty . K lasycznym ju ż dzisiaj przy­
kładem jest dih y d ro g ra n aty ro d y n a — hybrydow y p ro ­
d u k t syntaz: ak ty n o ro d y n y i granatycyny [46]. O s ta t­
nio d o k o n an o p ró b y połączenia trzech zespołów ge­
nów syntaz: tetracenom ycyny, elloram ycyny i urdam y-
cyny [47].
A naliza stru k tu ry poliketydów p ro dukow anych
przez szczepy zaw ierające różne kom binacje genów
pochodzących z jednej lub wielu syntaz um ożliw iła
określenie funkcji i specyficzności poszczególnych
podjed n o stek budujących syntazy poliketydow e. N a
tej podstaw ie w yodrębniono w zespole genów P K S
typu II tzw. „syntazę m in im aln ą” (m inPK S) obej­
m ującą KS, AT, C L F i A C P (Ryc. 4). Jest to zestaw
trzech genów niezbędnych do utw orzenia n a jp ro st­
szego, niezredukow anego szkieletu poliketydow ego
(Ryc. 5), np. 16-węglowego (SEK4) w przy p ad k u
m inP K S ak ty n o ro d y n y (act) lub 20-węglowego
(SEK15) w p rzy p ad k u m inP K S tetracenom ycyny
(tem). U zyskanie an alo g u SEK 4 zredukow anego w p o ­
zycji C-9 (SEK34) w ym agało w prow adzenia d o d a t­
kow o genów K R i A R O . A nalogiczne podjednostki
różnych syntaz ró żn ią się specyficznością. N a przykład
act K R prow adzi redukcję łańcucha zarów no 16- ja k
i 20-węglowego (SEK 4 i SEK15), n ato m iast act A R O
nie jest w stanie utw orzyć pierścienia arom atycznego
SEK 4 (act m inPK S)
Ryc. 5 Struktury związków poliketydowych
otrzymanych w wyniku kombinacji pod­
jednostek syntaz poliketydowych typu II.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
w SEK15. Stw ierdzono także zjaw isko spontanicznej
cyklizacji łańcuchów niezredukow anych.
W yzw aniem dla badaczy stało się znalezienie takich
kom binacji syntaz m inim alnych i pozostałych p o djed ­
nostek, które pozw olą n a uzyskanie p ro d u k tó w o ocze­
kiwanej strukturze. O m ów ione wyżej b ad an ia d o ­
prow adziły do sform ułow ania w niosków , które m ożna
trak to w ać ja k o zasady projektow ania now ych poli­
ketydów arom atycznych przez ingerencję we wczesne
etapy ich biosyntezy [48]. P rzedstaw ione wskazów ki
dotyczą długości łańcucha, ketoredukcji, cyklizacji
i arom atyzacji poszczególnych pierścieni.
IV-3. Badanie funkcji natywnego kompleksu
syntazy podlegającego ekspresji w komór­
kach Escherichia coli
Jak o przykład m oże posłużyć eksperym ent, w k tó ­
rym jeden z genów syntazy 6-dezoksyerytronolidu
B (eryA III) został w prow adzony, w odpow iednim
systemie w ektorów ekspresyjnych, do kom órek E s­
cherichia coli. U zyskano w stosunkow o dużych iloś­
ciach oraz oczyszczono do stan u bliskiego hom ogen-
nem u natyw ne białko DEBS3. W ystępuje ono w p o ­
staci dim eru, którego podjednostki m ają m asę 330
kD A i są wielofunkcyjnym i białkam i o dziewięciu
centrach katalitycznych. Białko to nie podlega po-
translacyjnej m odyfikacji przez enzym y gospodarza.
U zyskanie oczyszczonego białka D EB S stw arza m oż­
liwość pozn an ia specyficzności substratow ej jego d o ­
m en [48].
IV-4. Badanie funkcji wyselekcjonowanego zespo­
łu enzymów PKS w układzie pozakomór-
kowym
E ksperym enty te przeprow adzono m.in. w odniesie­
niu do zespołu syntazy tetracenom ycyny u Strep­
tomyces glaucescens [5, 50, 51]. W ko m ó rk ach tego
SE K 15 (tem m inPK S)
OH
SEK 34 (act m inPKS, act KR, act A R O )
281
szczepu spow odow ano zablokow anie ekspresji w łas­
nych genów syntazy tetracenom ycyny. Ekspresji p o d ­
legał n ato m iast w prow adzony z zew nątrz niepełny
zestaw genów tej samej syntazy, stanow iący odpow ied­
nio d o b ra n ą kom binację. Z kom órek tych uzyskano
ek strak ty białkow e — funkcjonalne zestawy enzymów.
Poszczególne enzym y m ożna w ybiórczo usuw ać (me­
to d ą im m unoprecypitacji), do u k ładu m ożna też d o d a ­
w ać różne su b straty szlaku biosyntezy poliketydu.
Stosując opisan ą m etodę potw ierdzono aktyw ność
„m inim alnego” zestaw u białek P K S oraz to, że m ożna
sko n stru o w ać zestaw optym alny pod względem a k ­
tyw ności przez włączenie białka cyklazy.
M eto d a system u p ozakom órkow ego m oże być sto ­
sow ana do b ad a n ia innych enzym ów P K S typu II.
U m ożliw ia uzyskanie do dalszych b ad a ń oczyszczo­
nych białek oraz rek o nstrukcję aktyw nej syntazy z wy­
branych składow ych kom pleksu.
IY-5. Analiza sekwencji genów
Sekwencje odpow iednich genów różnych syntaz są
bard zo zbliżone (ok. 70% identycznych zasad). R ów ­
nież sekwencje białek w yprow adzone n a podstaw ie
sekwencji nukleotydow ych są zachowawcze, szczegól­
nie w rejonie przypuszczalnego centrum aktyw nego
[1 8 ,2 1 ,5 2 , 53]. U m ożliw ia to przypisanie określonych
funkcji biologicznych otw artym ram k o m odczytu n o ­
wo oznaczanych sekwencji nukleotydow ych [20, 43,
54-58]. O znaczanie funkcji genów n a zasadzie p o ró w ­
nan ia sekwencji spraw dziło się w przy p ad k u k ilk u n as­
tu now o p oznanych syntaz. Zespoły kodujących je
genów zostały od k ryte n a podstaw ie podobieństw a
kodow anych przez nie białek z podstaw ow ym i en­
zym am i szlaku biosyntezy poliketydów [6, 11, 17-20,
23, 24, 33],
P o ró w n an ie genów różnych syntaz pozw ala w ycią­
gnąć w nioski dotyczące w spólnego schem atu ich o r­
ganizacji. D aje to teoretyczną podstaw ę wszelkich
ingerencji w syntezę poliketydów , tj. zarów no tw orze­
nia zw iązków będących p ro d u k tem m ozaiki genów,
ja k i m anipulacji w obrębie poszczególnych genów.
V. Podsumowanie
M edycyna nieustannie poszukuje now ych leków
o silniejszym działaniu terapeutycznym , m niejszych
sk u tk ach ubocznych, większej trw ałości. Zw iązki p o ­
chodzenia n atu raln eg o nie zawsze m ają pożądane
własności farm akologiczne, a p o n ad to ich pozyskiw a­
nie i oczyszczanie jest b ardzo kosztow ne. T rudności te
rozw iązuje częściowo synteza chem iczna lub m odyfi­
kacja p ro d u k tó w n aturalnych.
W raz z rozw ojem m etod inżynierii genetycznej w zra­
sta znaczenie m odyfikow anych genetycznie m ik ro o r­
ganizm ów ja k o p ro d u centów now ych leków. D ro b n o ­
ustroje o odpow iednio d o b ran y m zestawie genów
m ogą w yp ro d u k o w ać substancje, których otrzym anie
282
http://rcin.org.pl
w inny sposób jest b ardzo tru d n e lub niem ożliwe [59].
Pierw sze eksperym enty prow adzące do otrzym ania
„hybrydow ych” zw iązków poliketydow ych zostały
przeprow adzone przez K o p w o o d a i wsp.
w 1985 r. [46]. C oraz dokładniejsze w yjaśnianie m e­
chanizm ów biosyntezy zw iązków poliketydow ych p o ­
zw ala n a przejście od eksperym entalnego łączenia
genów różnych syntaz do racjonalnego p ro g ram o w a­
nia żądanych p ro d u k tó w poprzez ingerencję w stru k ­
tu rę i ułożenie genów odpow iedzialnych za kon k retn e
etapy syntezy [48, 60, 61].
A rtyku ł otrzym ano 24 listopada 1995 r.
Zaakceptow ano do druku 25 kwietnia 1996 r.
Piśmiennictwo
1. T r o p f S, L a n z SA, R e n s i n g J, (1994) J M ol Evol 38:
610-618
2. B r o w n D W , S a l v o J J (1994) Appl Environ Microbiol 60:
979-983
3. H o p w o o d DA, S h e r m a n D (1990) Annu Rev Genet 24:
37-66
4. M c N e i l DJ , O c c i J L, G e w a i n K M , M c N e i l T (1994)
Ann N Y Acad Sei 721: 123-132
5. S h e n B, H u t c h i n s o n C R (1993) Science 262: 1535-1540
6 . Y e J, D i c k n s ML , P l a t e r R, L i Y, L a w r e n c e J,
S t r o h 1 W R (1994) J Bacteriol 176: 6270-6280
7. I k e d a H, O m u r a S (1995) J Antibiot 48: 549-562
8 . S o l i v e r i J, V i j g e n b o o m E, G r a n o z z i C, P l a s k i t t
KA, C h a t e r K F (1993) J Gen Microbiol 139: 2569-2578
9. K a t z L, D o n a d i o S (1993) Annu Rev Microbiol 47: 875-912
10. B e c k J, R i p k a S, S i e g n e r A, S c h w e i z e r E (1990) Eur
J Biochem 192: 487-489
11. M e r s o n - D a v i e s LA, C u n d l i f f e E (1994) M ol M ic­
robiol 13: 349-355
12. R i c h a r d s o n MA, K u h s t o s s S, H u b e r M L B , F o r d
L, G o d f r e y O, T u r n e r J R, R a o R N (1990) J Bacteriol
172: 3790-3798
13. A r i s a w a A, T s u n e k a w a H, O k a m u r a K, O k a m o -
t o R (1995) Biosci Biotech Biochem 59: 582-588
14. L a n z T, T r o p f S, M a r n e r FJ , S c h r ö d e r J,
S c h r ö d e r G (1991) J Biol Chem 266: 9971-9976
15. S c h r ö d e r J, S c h r ö d e r G, (1990) Z Naturforsch 45: 1-8
16. D o n a d i o S, S t a v e r MJ , M c A l p i n e JB, S w a n s o n
SJ, K a t z L (1992) Gene 115: 97-103
17. S h e r m a n D H , M a l p a r t i d a F, B i b b MJ , K i e s e r
H M , B i b b M J H o p w o o d D A (1989) E M BO J 8 :
2717-2725
18. B i b b MJ , B i r o S, M o t a m e d i H, C o l l i n s J F , H u t ­
c h i n s o n C R (1989) E M BO Journal 8 : 2727-2736
19. F e r n a n d e z - M o r e n o MA , M a r t i n e z E, B o t o L,
H o p w o o d DA, M a l p a r t i d a F (1992) J Biol Chem 267:
19278-19290
20. B i b b MJ , S h e r m a n D H , O m u r a S, H o p w o o d D A
(1994) Gene 142: 31-39
21. K im E S , B i b b MJ , B u t l e r MJ , H o p w o o d DA,
S h e r m a n D H (1994) Gene 141: 141-142
22. T i n - W e i n Y, B i b b MJ , R e v i l l WP , H o p w o o d D A
(1994) J Bacteriol 176: 2627-2634
23. P i e c q M, D e h o t t a y P, B i o t A, D u s a r t J (1994) DNA
Sequence - J D N A Sequencing and mapping 4: 219-229
24. H a n L, Y a n g K, R a m a l i n g a m E, M o s h e r R H,
V i n i n g L C (1994) Microbiology 140: 3379-3389
25. D o n a d i o S, S t a v e r MJ , M c A l p i n e JB, S w a n s o n
SJ, K a t z L (1991) Science 252: 675-679
26. D o n a d i o S, M c A l p i n e JB, S h e l d o n PJ , J a c k s o n
M, K a t z L (1993) Proc N atl Acad Sei USA 90: 7119-7123
27. W e b e r J M, L e u n g J O, S w a n s o n SJ, I d l e r KB,
M c A l p i n e J B (1991) Science 252: 114-117
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 28. C o r t e s J, W i e s m a n K E H , R o b e r t s GA, B r o w n
M J B , S t a u n t o n J, L e a d l a y P F (1995) Science 268:
1487-1489
29. P a n g C H, M a t s u z a k i K, I k e d a H, T a n a k a H,
O m u r a S (1995) J Antibiot 48: 59-66
30. P a n g C H, M a t s u z a k i K, I k e d a H, T a n a k a H,
O m u r a S (1995) J Antibiot 48: 92-94
31. I k e d a H, T a k a d a Y, P a n g C H , M a t s u z a k i K,
T a n a k a H, O m u r a S (1995) J Antibiot 48: 95-97
32. M e u r e r G, H u t c h i n s o n C R (1995) J Bacteriol 177:
477-481
33. S u m m e r s R G, W e n d t - P i e n k o w s k i E, M o t a m e d i
H, H u t c h i n s o n C R (1992) J Bacteriol 174: 1810-1820
34. S h e r m a n D H , K i m ES, B i b b MJ , H o p w o o d D A
(1992) J Bacteriol 174: 6184-6190
35. K h o s l a C, E b e r t - K h o s l a S, H o p w o o d D A (1992)
M ol Microbiol 6 : 3237-3249
36. M c D a n i e l R, E b e r t - K h o s l a S, H o p w o o d DA,
K h o s l a C (1993) J Am Chem Soc 115:11671-11675
37. M c D a n i e l R, E b e r t - K h o s l a S, H o p w o o d DA,
K h o s l a C (1993) Scienced 262: 1546-1550
38. F u H, E b e r t - K h o s l a S, H o p w o o d DA, K h o s l a
C (1994) J A Chem Soc 116: 4166-4170
39. F u H, M c D a n i e l R, H o p w o o d DA, K h o s l a C (1994)
Biochemistry 33: 9321-9326
40. K im E S , C r a m e r K D , S h r e v e AL, S h e r m a n D H
(1995) J Bacteriol 177: 1202-1207
41. K a o C M , K a t z L , K h o s l a C (1994) Science 236: 509-512
42. C a ñ e D E , G a u n g l i n L, K h o s l a C, K a o C M, K a t z
L (1995) J Antibiot 48: 647-651
43. G r i m m A, M a d d u r i K, A l i A, H u t c h i n s o n C R
(1994) 151: 1-10
44. E p p J K , H u b e r M L B , T u r n e r J R, G o o d s o n T,
S c h o n e r B E (1989) Gene 85: 293-301
Do członków
Polskiego Towarzystwa Biochemicznego
Zarząd P.T.Bioch. uprzejmie prosi wszystkich członków o wpłatę
zaległych i bieżących składek członkowskich. Zachęcamy także do
zaprenumerowania „Postępów Biochemii”.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
45. H w a n g C K, K i m HS, H o n g YS, K i m YH, H o n g SK,
K i m SJ, L e e J J (1995) Antimicro Agents Chemother 39:
1616-1620
46. H o p w o o d DA, M a l p a r t i d a F, K i e s e r H M , I k e d a
H, D u n c a n J (1985) Nature (Lond) 314: 642-644
47. D e c k e r H, H a a g S, U d v a r n o k i G, R o h r J (1985)
Angew Chem In t Ed Engl 34: 1107-1110
48. M c D a n i e l R, E b e r t - K h o s l a S, H o p w o o d DA,
K h o s l a C (1995) Nature (lond) 375: 549-554
49. R o b e r t s GA, S t a u n t o n J, L e a d l a y P F (1993) Eur
J Biochem 214: 305-311
50. D e c k e r H, M o t a m e d i H, H u t c h i n s o n C R (1993)
J Bacteriol 175: 3876-3886
51. D e c k e r H, H u t c h i n s o n C R (1993) J Bacteriol 175:
3887-3892
52. D o n a d i o S, K a t z L (1992) Gene 111:51-60
53. B e v i t t DJ , C o r t e s J, H a y d o c k SF, L e a d l a y P F
(1992) Eur J Biochem 204: 39-49
54. A r r o w s m i t h TJ , M a l p a r t i d a F, S h e r m a n D H ,
B i r c h A, H o p w o o d DA, R o b i n s o n J A (1992) M ol Gen
Genet 234: 254-264
55. A r i s a w a A, K a w a m u r a N, T s u n e k a w a H, O k a -
m u r a K, T o n e H, O k a m o t o R (1993) Biosci Biotech
Biochem 57: 2020-2025
56. D i c k e n s ML , Y e J, S t r o h l W R (1995) J Bacteriol 177:
536-543
57. F e r n a n d e z - M o r e n o MA, M a r t i n e z E, C a b a l l e ­
r o J L, I c h i n o s e K, H o p w o o d DA, M a l p a r t i d a
F (1994) J Biol Chem 40: 24854-24863
58. K u c z e k K, M o r d a r s k i M, G o o d f e l l o w M (1994)
F E M S Microbiol L ett 118: 317-326
59. H u t c h i n s o n C R (1994) Bio/Technology 12: 375-380
60. M a n n J (1995) Nature (Lond) 375: 533-534
61. H o p w o o d D A (1995) F E M S Microbiol Rev 16: 233-234
283
Niedobór akty wności arylosulfatazy A jako podłoże leuko-
dystrofii metachromatycznej

Deficiency of arylsulfatase A activity as a basis of metachromatic

leucodystrophy

A G N I E S Z K A Ł U G O W S K A 1,
A N N A T Y L K I-S Z Y M A Ń S K A 2

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction
II. Árylosulfataza A i substrat jej działania II. Arylsulfatase A and substrate of its action
III. Defekt biochemiczny przyczyną leukodystrofii meta­ III. Biochemical defect in metachromatic leukodystrophy
chromatycznej IV. SAP-B activator
IV. Aktywator SAP-B V. Arylsulfatase A pseudodeficiency
V. Pseudodeficyt arylosulfatazy A VI. Defect of posttranslational modification of sulfatases
VI. Defekt posttranslacyjnej modyfikacji sulfataz VII. Molecular bases of arylsulfatase A defects
VII. Molekularne podstawy defektów arylosulfatazy A

Wykaz stosowanych skrótów: LDM — leukodystrofia meta-
chromatyczna; ASA — arylosulfataza A; Tf-a ASA — prze­
ciwciała przeciw ASA, połączone z transferyną; SAP-B
— ang. sphingolipid activator protein-B; GABA — kwas
y-aminomasłowy; ASA-PD — pseudodeficyt arylosulfatazy
A; MSD — ang. multiple sulfatase deficiency, brak wielu
sulfataz; pz — pary zasad; nt — nukleotyd.
I. Wstęp
L eukodystrofia m etachrom atyczna (L D M ) jest ge­
netycznie uw aru n k o w anym schorzeniem m etabolicz­
nym , spow odow anym deficytem aktyw ności arylosul­
fatazy A (ASA) (EC 3.1.6.1.) prow adzącym do spich-
rzan ia galaktozylosulfatydu (siarczanu cerebrozydu)
w lizosom ach kom órki. M im o, że spichrzanie galak ­
tozylosulfatydu dotyczy wszystkich kom órek organiz­
m u, to jed n ak zm iany patologiczne przebiegają głów ­
nie w m ielinie ośrodkow ego u k ład u nerw ow ego oraz
mielinie nerw ów obw odow ych. G alaktozylosulfatyd
oraz laktozylosulfatyd (w m niejszym stopniu) spich-
rzają się rów nież w nerkach, pęcherzyku żółciowym
oraz innych n arząd ach w ew nętrznych. Sulfatydy są
w ydalane w dużych ilościach z m oczem i żółcią.
W p re p ara ta ch histologicznych sulfatydy tw orzą
stru k tu ry kuliste, barw iące się m etachrom atycznie pod
wpływem fioletu krezylu (m etachrom azja) [1].
1 Mgr, Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka, Za­
kład diagnostyki Laboratoryjnej, Al. Dzieci Polskich 20,
04-736 Warszawa,
2 doc. dr hab n. med., Instytut Pomnik Centrum Zdrowia
Dziecka, Zespół Chorób Metabolicznych, Al. Dzieci Pol­
skich 20; 04-736 Warszawa
U pacjentów z leukodystrofią m etachrom aty czn ą
obserw uje się postępującą demielinizację, k tó ra jest
przyczyną objaw ów neurologicznych, takich jak: z a b u ­
rzenia chodu, ataksja, niedow ład kończyn, zanik n er­
wów w zrokow ych, n ap ad y drgaw ek, dem encja.
W yróżnia się trzy typy leukodystrofii m etac h ro m a­
tycznej n a podstaw ie w ieku w ystąpienia pierw szych
objaw ów oraz przebiegu choroby [1]: późnoniem o-
wlęcy (pierwsze objaw y w wieku 1-2 lat), m łodzieńczy
(3-16 lat), dorosłych (powyżej 16 lat). P o stęp choroby
u dorosłych jest pow olny i charakteryzuje się obecnoś­
cią objaw ów psychotycznych.
II. Arylosulfataza A i substrat jej działania
A rylosulfataza A (ASA) jest sp o ty k an a we w szyst­
kich tk an k ac h i płynach ustrojow ych. Białko enzym u
zostało w yizolow ane z różnych źródeł, m.in. ludzkiej
w ątroby, łożyska i m oczu, tkanek jeżow ca, szczura,
świni [2-4].
ASA jest kw aśną glikoproteiną o niskim pi, co wiąże
się z dużą zaw artością kw asu glutam inow ego i a sp a ra ­
ginowego. Zaw iera rów nież duże ilości proliny. P o w y ­
żej p H 6.5 enzym istnieje ja k o m onom er o m asie
cząsteczkowej ok. 100 kD a. ASA m oże polim eryzow ać
w zależności od p H środow iska tw orząc dim er przy p H
4.5. Enzym pochodzący z ludzkiego m oczu składa się
z dw óch podjednostek o m asach 54 i 63 kD a, n a to ­
m iast pochodzący z ludzkiej w ątroby, łożyska i fibro-
blastów składa się z dw óch podjednostek o m asach 55
i 64 k D a [5, 6].
W kom órce ASA jest um iejscow iona w lizosom ach,
gdzie praw d o p o d o b n ie tw orzy dimery.

284 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 P o d obnie, ja k w przy p ad k u innych enzym ów lizoso-
m alnych, ASA jest syntetyzow ana n a szorstkim retiku-
lum endoplazm atycznym ja k o N -glikozylow any p re­
kursor. N astęp n ie przenika o n a przez retikulum endo-
plazm atyczne i a p a ra t G olgiego, gdzie do N -zw iąza-
nych łańcuchów oligosacharydow ych dołączane są
reszty fosforanow e i siarczanow e [7]. P rzed tra n s p o r­
tem p re k u rso ra do k o m p artm en tu prelizosom alnego
(kwaśnego endosom u) w aparacie G olgiego zachodzi
synteza m ark era m annozo-6-fosforanow ego. Jest on
rozpoznaw any przez receptor enzym u w błonie kw aś­
nego endosom u, lizosom u, ja k rów nież w błonie k o ­
m órkow ej. S tru k tu rą ro zpoznaw aną jest reszta kw asu
fosforowego zw iązanego z szóstym atom em węgla
reszty m annozow ej, k tó ra jest połączona z łańcuchem
oligosacharydow ym w iązaniem a l-> 2 . Synteza m a r­
kera zachodzi w dw óch etapach. W pierw szym — N -
acetyloglukozoam inotransferaza przenosi N -acetylog-
lu k o zo am in o -l-fo sfo ran z U D P -N -acetyloglukozoa-
m iny n a C 6 m annozy. W drugim etapie następuje
odszczepienie N -acetyloglukozoam iny i zw iązanie re­
szty fosforanowej z C 6 m annozy [8]. Stw ierdzono, że
w hodow anych fibroblastach skóry pow staje prekur-
sorow y p o lipeptyd o m asie 62 k D a, k tó ry za pośrednic­
tw em recep to ra wiążącego m annozo-6-fosforan prze­
mieszcza się do kw aśnego, prelizosom alnego en doso­
m u [9]. P rzed osiągnięciem lizosom u, od C -końca
p rek u rso ra odcinanych jest ok. 50 am inokw asów .
D i e s n e r i w s p. stosując przeciw ciała skierow ane
przeciw ASA, połączone z transferyną (Tf-aASA) u d o ­
wodnili, że now osyntetyzow ana ASA przechodzi przez
kom p artm en ty k om órkow e zaw ierające receptor
transferyny do dojrzałego lizosom u [10]. W k o m p art-
m entach zaw ierających receptor transferyny, tzn.
w kw aśnych en d osom ach i błonie kom órkow ej, now o­
syntetyzow ana ASA wiąże się z k o niugatam i Tf-aASA,
pow raca n a pow ierzchnię kom órki, część enzym u jest
uw alniana do środow iska zew nątrzkom órkow ego.
C en tru m aktyw ne ASA zaw iera histydynę oraz dwie
(lub więcej) argininy. Aniony: S 0 42~, P 0 43 - , S 0 32 - ,
F _ oraz kationy: Ag + , C u 2+ i H g 2+ w stężeniach
m ilim olarnych są in h ib ito ram i aktyw ności enzymu.
R eakcja k atalizo w an a przez ASA podlega rów nież
inhibicji p o d wpływem h y d rokortyzonu, 2-hydroksy-
Ryc. 1 Schematyczna budow a galaktozylosulfatydu
i miejsce działania arylosulfatazy A.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
dopam iny oraz zw iązków karbonylow ych w obecnoś­
ci C u 2 + .
A rylosulfataza A (EC 3.1.6.1) jest enzym em um iej­
scow ionym we w nętrzu lizosom ów. W raz z białkiem
SAP-B (ang. sphingolipid activator protein-B) w chodzi
w skład 3-sulfohydrolazy cerebrozydo-3-siarczanow ej
(EC 3.1.6.8.) [1]. ASA katalizuje I etap degradacji
sulfolipidów — odszczepia grupę chem iczną zaw iera­
jącą resztę siarczanow ą. T erm in „sulfolipidy” odnosi
się do w szystkich lipidów zaw ierających w swej cząs­
teczce atom siarki. S pośród tej grupy zw iązków o r­
ganicznych substratam i ASA są:
— galaktozylosulfatyd, czyli siarczan cerebrozydu;
— laktozylosulfatyd;
— sem inolipid, czyli sulfogalaktoglicerolipid;
— siarczan psychozyny.
Sulfatydy są estram i siarczanow ym i galaktocerebrozy-
du z gru p ą siarczanow ą przyłączoną w położeniu
C 3-hydroksyl cząsteczki galaktozy. Schem atyczną b u ­
dow ę galaktozylosulfatydu przedstaw ia rycina 1.
G alaktozylosulfatyd jest w ażnym składnikiem mie-
liny. Zw iązek ten znajduje się n a pow ierzchni m ieliny
i p raw dopodobnie jest zw iązany z białkam i p o d staw o ­
wymi i białkam i proteolipidów poprzez działanie sił
jonow ych. P o n ad to galaktozylosulfatyd uczestniczy
w aktyw nym transporcie N a + ja k o k o fak to r dla N a -K
zależnej A TP-azy. G alaktozylosulfatyd aktyw uje kal-
m odulinozależną fosfodiesterazę cyklicznych nukleo-
tydów , znajduje się w m iejscach w iążących opiaty oraz
jest jednym ze składników m iejsca rozpoznaw ania
GABA.
III. Defekt biochemiczny przyczyną leuko-
dystrofii metachromatycznej
B rak aktyw ności ASA, k tó ry uznano za pierw otną
przyczynę leukodystrofii m etachrom atycznej, obser­
w ow ano u chorych w: m oczu, leukocytach krwi o b ­
wodowej, hodow anych fibroblastach skóry, surowicy,
łzach, ślinie, hodow anych lim focytach, hodow anych
ko m órkach szpiku kostnego, hodow anych kom órkach
płynu ow odniow ego.
Przeciw ciała przeciw ludzkiej ASA reagują krzyżo­
wo z polipeptydam i syntetyzow anym i przez hodow ane
H H
CHaOH
c - c - c H r o ,a
T
4 -H są ,
OH
A SA
285
 fibroblasty skóry pacjentów trzech typów L D M [11].
W m ateriale od pacjentów z leukodystrofią m eta-
chro m aty czn ą typu późnoniem ow lęcego stw ierdzono
obecność g likoprotein reagujących krzyżow o z prze­
ciwciałam i anty-A SA zarów no w sposób pozytyw ny
(co oznacza, że p olipeptyd enzym u podlega syntezie),
ja k i nie reagujących pozytyw nie (co świadczy o tym, że
synteza po lip ep ty d u enzym u nie zachodzi). K om órki
fibroblastów od pacjentów z L D M typów: m łodzień­
czego i dorosłych syntetyzują i wydzielają polipeptydy
ASA w tem pie w ynoszącym 20-70% tem pa kom órek
kontrolnych. Jed n ak now osyntetyzow ane, zm utow ane
cząsteczki enzym u są gw ałtow nie degradow ane po
p rzed o stan iu się do w nętrza lizosom u [12]. P o za­
stosow aniu inh ib ito rów proteinaz cysternowych o b ­
serwuje się m ateriał reagujący krzyżow o z przeciw ­
ciałam i anty-A SA oraz częściową aktyw ność ASA
w fibroblastach niektórych pacjentów z L D M typu
m łodzieńczego lub dorosłych.
P odczas b ad a n ia aktyw ności procesów katabolizm u
siarczanu cerebrozydu (tzn. galaktozylosulfatydu) in
situ w k u ltu rach tkankow ych spostrzeżono, że w k o ­
m ó rk ach pochodzących od pacjentów z L D M typów
późnych w ykryw a się pew ną resztkow ą aktyw ność
ASA i zależność czasow ą m iędzy zdolnością h o d o w a­
nych ko m ó rek do d egradow ania dostarczanego do
pożyw ki sulfatydu, a wiekiem w ystąpienia pierw szych
objaw ów klinicznych u pacjenta [1]. T ak a obserw acja
tłum aczy zjaw isko pseudodeficytu, w którym niska
aktyw ność enzym u, w ynosząca 10-30% średnich w ar­
tości norm alnych, byłaby w ystarczająca do zachow a­
nia norm alnego m etabolizm u kom órki [12-14].
C o n z e l m a n n i S a n d h o f f [15-17] wysunęli hi­
potezę zakładającą, że powyżej pew nego krytycznego
pro g u aktyw ności enzym u k o m ó rk a m oże pozbyw ać
się n ad m iaru substratów , takich np. ja k sulfatyd. Stę­
żenie danego su b stratu w lizosom ie określa rów now a­
ga dynam iczna zachow ana m iędzy tem pem napływ u
k atab o litu do lizosom u a kinetycznym i p aram etram i
enzym u degradującego ów su b strat (K m, Vmax). W edług
h i p o t e z y C o n z e l m a n n a i S a n d h o f f a przejście
od stan u fizjologicznej norm y do patologicznego spi-
chrzania su b stratu (np. sulfatydu) m ogłoby n astęp o ­
wać w sytuacji, gdy aktyw ność resztkow a enzym u
byłaby niższa od założonego krytycznego progu ak ty ­
wności. H ip o teza ta stanow i pró b ę w yjaśnienia bioche­
m icznych po d staw w ystępow ania pierwszych o b ja­
wów klinicznych w różnym w ieku u pacjentów z leuko­
dystrofią m etach ro m atyczną różnych typów.
IV. Aktywator SAP-B
H ydroliza niek tó ry ch sfingolipidów w ym aga działa­
nia m ałych glikoprotein zw anych SAP (ang. sphin-
golipid activator proteins) lub sapozynam i. B iałka te
działają ja k detergenty rozpuszczając hydrofobow e
su b straty lipidow e lub bezpośrednio aktyw ują nie­
k tó re enzym y lizosom alne. ASA m oże hydrolizow ać
286
http://rcin.org.pl
swoje substraty tylko przy w spółdziałaniu z SAP-B
[18]. Białkow y ak ty w ato r SAP-B wpływ a n a rozpusz­
czalność siarczanu cerebrozydu i czyni go dostępnym
dla enzym u [19]. R zadko sp o ty k an a form a leukodyst-
rofii m etachrom atycznej jest spow odow ana brakiem
ak ty w a to ra SAP-B. D o 1992 r. opisano zaledwie
sześciu pacjentów [20]. O b raz kliniczny przypom ina
typ m łodzieńczy lub późnoniem ow lęcy leukodystrofii
m etachrom atycznej [21, 22], U pacjentów z brakiem
białka SAP-B stw ierdza się w ydalanie sulfatydów
w m oczu i rów nocześnie aktyw ność ASA m ierzoną
w leukocytach lub fibroblastach w norm ie lub tylko
nieznacznie obniżoną.
C ztery białka aktyw atorow e zw ane sapozynam i A,
B, C i D pow stają ze w spólnego p rek u rso ra — prosa-
pozyny. P ro sap o zy n a jest glikoproteiną złożoną z 524
am inokw asów . Z b u d o w an a jest o n a z czterech h o m o ­
logicznych dom en białkow ych i obszarów rozdzielają­
cych [23, 24]. P ro sap o zy n a jest syntetyzow ana ja k o
glikoproteinow y p rek u rso r o m asie 65 kD a. W tej
postaci przedostaje się ona do a p a ra tu Golgiego, gdzie
podlega glikozylacji dając złożony polipeptyd o m asie
73 kD a. N iew ielka część puli polipeptydu 73 kD A jest
w ydzielana do cytozolu. Jed n ak znaczna część puli
polipeptydu 73 k D a przechodzi etap enzym atycznej
obró b k i w lizosom ach [25]. W w yniku proteolizy
z prosapozyny pow stają cztery aktyw ne białka sapozy-
nowe; SAP-B pow staje z drugiej dom eny [26].
V i e l h a b e r i S a n d h o f f stw ierdzili,ż e endocy-
to za cząsteczek prosapozyny do w nętrza lizosom ów
odbyw a się w sposób całkow icie niezależny od recep­
torów m annozo-6-fosforanu [27].
G en kodujący prosapozynę znajduje się w ch ro m o ­
som ie 10 [28]. K odujący D N A (cDNA) prosapozyny
sklonow ano niezależnie w zespołach O ’ B r i e n a
i F ü r s t a w 1988 r. [23, 24]. R egion kodujący m a
długość ok. 1,6 tys. pz. R egion nie podlegający tra n s ­
lacji od końca 3’ m a długość ok. 1,2 tys. pz Sapozyny A,
B, C, D w ykazują porów nyw alną hom ologię, k tó rą
szczególnie odzw ierciedla zachow anie reszt cysterno­
wych i potencjalnych miejsc N -glikozylacji. G en k o d u ­
jący prosapozynę został sklonow any, chociaż info rm a­
cje o budow ie eksonu 1 są nad al niekom pletne [29,30].
G en kodujący prosapozynę m a długość ok. 20 tys. pz
i praw d o p o d o b n ie składa się z 13-tu eksonów. D o m e­
na SAP-B jest k o d o w an a przez eksony 5-7. D o ty ch ­
czas opisano trzy m utacje w genie prosapozyny usz­
kadzające białko SAP-B: T217I [31, 32], C241S [33,
19], oraz 777 + 1 8 9 5 C > A [34, 35].
V. Pseudodeficyt arylosulfatazy A
N iską aktyw ność ASA obserw uje się rów nież w o k o ­
ło 5-15% ogólnej populacji. W grupie tej znajdują się
osoby klinicznie zdrow e [36], ja k rów nież „nietypow i”
pacjenci z innym i niż L D M schorzeniam i neurologicz­
nym i lub psychiatrycznym i [37]. Zjaw isko obniżenia
aktyw ności ASA do 10-30% średnich w artości n o r­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
m alnych u znano za polim orfizm w obrębie genu ASA
i nazw ano pseudodeficytem . U żyw ając zwykle stoso­
w anych su b strató w nie m ożna rozróżnić pseudodeficy-
tu ASA (ASA-PD) od L D M tylko n a podstaw ie
aktyw ności enzym u. U osób z pseudodeficytem nie
obserw uje się w ydalania sulfatydów w m oczu. Częste
w ystępow anie A SA -PD w ym aga szczególnej p ro ced u ­
ry w pre- i p o stn ataln y m diagnozow aniu leukodyst-
rofii m etachrom atycznej.
VI. Defekt posttranslacyjnej modyfikacji
sulfataz
Stw ierdzono rów nież inny defekt zw iązany z b ra ­
kiem aktyw ności nie tylko ASA, lecz rów nież arylosul-
fataz B i C oraz innych sulfataz biorących udział
w degradacji m ukopolisacharydów . Schorzenie to
określono ja k o b rak wielu sulfataz (ang. múltiple
sulfatase deficiency, M S D ). B rak wielu sulfataz opisano
dotychczas u ok. 50 pacjentów z cecham i klinicznym i
L D M typu późnoniem ow lęcego oraz m ukopolisacha-
rydoz.
W edług najnow szych doniesień sulfatazy w ym agają
dla swojej aktyw ności pewnej posttranslacyjnej m o d y ­
fikacji, k tó ra w p rz y p ad k u M S D przebiega niepraw i­
dłowo. W p rzy p ad k ach arylosulfataz A i B opisano
nieznany d o tą d rodzaj posttranslacyjnej o b ró b k i b ia­
łek tych enzym ów , k tó ra polega n a zam ianie cysteiny
na kw as 2-am ino-3-oksopropionow y. P o ró w n an o sek­
wencję am inokw asow ą w szystkich znanych sulfataz
u Eukaryota. Stw ierdzono, że cysteina znajduje się
w tym fragm encie sulfataz, k tó ry jest zachow any we
w szystkich przebadanych enzym ach (fragm ent ko n ser­
watywny). N a to m iast w nieaktyw nych polipeptydach
ASA i ASB, pochodzących z fibroblastów od pacjenta
z M SD , nie zauw ażono obecności reszty cysternowej.
F a k t ten potw ierdza przypuszczenie, że b rak cysteiny
we fragm encie konserw atyw nym jest przyczyną deficy­
tu aktyw ności sulfataz u chorych z przejaw am i M SD
[38, 39].
VII. Molekularne podstawy defektów arylo-
sulfatazy A
G en kodujący ASA przypisano m eto d ą hybrydyza­
cji ko m ó rek som atycznych do chrom osom u 22 [40].
O becnie w iadom o, że gen ASA znajduje się n a długim
ram ieniu ch rom osom u 22 w regionie p rą żk a q l3 . G en
kodujący białko ak ty w a to ra SAP-B i jego p re k u rso ra
— pro sapozyny przypisano do chrom osom u 10.
W 1989 r. S t e i n i w s p. sklonow ali cD N A k o d u ją­
cy lu d zk ą ASA. Jed n ak pełną i obecnie przyjętą
stru k tu rę genu ASA o p u blikow ał K r e y s i n g i w s p .
[41,42]. G en kodujący ASA jest dość m ały — długości
3,2 tys. pz i składa się z 8 eksonów . R egion 5' nie
podlegający translacji zaw iera miejsce cap m R N A przy
ok. -370nt, a p o n a d to cztery sekwencje G C -box w p o ­
łożeniu -10, -40, -50, -60, k tó re są typow ym i pozycjam i
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
w iązania się z transkrypcyjnym czynnikiem prom o to -
row ym S p l. Tylko G C -box w położeniu -10 jest
zorientow any w dobrym kierunku. R egion 5' nie
podlegający translacji nie zaw iera sekwencji typu
TATA lub CAA T-box, co jest dość rzadkim zjawis­
kiem w śród genów Eukaryota. R egion kodujący p o d ­
legający translacji rozpoczyna się kodonem inicjują­
cym A TG, za którym następuje sekw encja 18-amino-
kw asow ego peptydu sygnałow ego i 489-ciu am in o ­
kw asów białka enzymu. R am ka odczytu kończy się
kodonem term inacyjnym TGA. W odległości ok. lOOnt
od k o d o n u T G A znajduje się sygnał poliadenylacji
A AT A AC (1621nt) i ok. 20nt za nim ogon poliA.
R egion 3' nie podlegający translacji m a długość 140 pz
W norm alnych ludzkich fibroblastach pow stają 3 ró ż­
ne rodzaje m R N A dla ASA: 2.1,3.7,4.8 tys. pz [41]. 2.1
tys. pz m R N A stanow i ok. 30-40% , m R N A długości
3.7 oraz 4.8 tys. pz stanow ią ok. 60-70% całości m R N A
dla ASA.
W yliczona m asa cząsteczkow a białka kodow anego
przez A SA -cD N A wynosi 62 kD a, co pozostaje w zgo­
dzie z w ynikam i otrzym anym i na drodze biosyntezy
[6]. O prócz polipeptydu o m asie cząsteczkowej 62
kD A w ykryw a się rów nież form y ASA o m asie czą­
steczkowej 54-59 kD A [6, 43]. P rzypuszcza się, że
polipeptyd o m asie cząsteczkowej 62 kD A jest p re k u r­
sorem ASA, k tóry podlega obróbce proteolitycznej
dając form y o mniejszej m asie cząsteczkowej [44].
W genie kodującym ASA w ystępują sekwencje dla
3 miejsc możliwej N -glikozylacji cząsteczki białka
enzym u, z których faktycznie dw a są w ykorzystyw ane.
S trukturę genu ASA przedstaw ia rycina 2.
W 1989 r. G i e s e l m a n n i w s p . [45] sklonow ali
i zsekw encjonow ali gen kodujący ASA w m ateriale
pochodzącym od osoby będącej hom ozygotą pseudo-
deficytu ASA. W ykazano obecność dw óch tranzycji
A -»G . Jed n a z nich zam ienia asparaginę w położeniu
1049nt cD N A n a serynę, co pow oduje u tratę m iejsca
N -glikozylacji cząsteczki białka ASA oraz zm niej­
szenie m asy cząsteczkowej enzym u o 2.5 kD a, co
jed n ak nie jest zasadniczą przyczyną pseudodeficytu
ASA.
D ru g a tranzycja A -> G zm ienia sekwencję pierw ­
szego sygnału poliadenylacji za kodonem „stop” z AA-
TA A C n a A GTA AC. M utacja ta pow oduje brak
obecności m ałego 2.1 tys. pz m R N A , k tóry odpow iad a
za ok. 90% poli(A +) m R N A arylosulfatazy A i o b ­
niżenie aktyw ności enzym u do 10-30% norm y. N iska
aktyw ność ASA u osób z pseudodeficytem w ynika
zatem z częściowo zaham ow anej syntezy białka en­
zym u, a nie z zaburzenia jego stabilności [46].
D otychczas w genie kodującym ASA w ykryto blisko
60 m utacji zw iązanych z leukodystrofią m etachrom a-
tyczną; w śród nich jest: 6 delecji, 5 m utacji typu „splice
site” i 47 tranzycji nukleotydow ych [46]. W yróżnia się
dw a typy m utacji w genie ASA [47-50]. M utacja typu
0 (lub I) pow oduje całkow ite zaham ow anie syntezy
p ro d u k tu genu ASA. M utacje typu 0 w stanie hom o-
287
 E2P400 E7S2195
E2P436 E8P238I
E2S609 E8D2506
E3P799

ATG E4P1070 TGA

E3P898 AATAAC
E3P934
E2D447 E5P1574
E2P445 E5P1533 E7P2I33

O 3.1kb

Ryc. 2 Schemat genu kodującego arylosulfatazę A. Przykładowo pokazano 15 mutacji.

Pola czarne wskazują eksony; linie — introny, pola zakreskowane — 5' i 3' regiony nie podlegające translacji. ATG oznacza kodon
inicjujący, TGA — kodon terminacyjny translacji. AATAAC wskazuje sygnał poliadenylacji.

zygotycznym p ro w ad zą do późnoniem ow lęcej form y
L D M . M utacje ty p u R (lub A) cechują się niską
aktyw nością resztkow ą enzymu. W stanie hom ozygo-
tycznym m utacje typu R prow adzą do postaci d o ro ­
słych L D M . H eterozygotyczność m utacji typu
0 i R w ystępuje najczęściej u pacjentów z typem
m łodzieńczym L D M .
D w a spośród zm utow anych alleli — 459 + I G > A
oraz P426L — stanow ią razem ok. 50% w ykryw anych
m utacji u pacjentów z L D M [48, 49, 51]. M utacja
459 + IG > A (typ 0) polega n a zam ianie G -> A w pozy­
cji n t 609 genu, czego skutkiem jest u tra ta donorow ego
m iejsca cięcia dla posttranskrypcyjnej o b róbki m R N A
— sk ład an ia (splicing). U pacjentów będących hom o-
zygotam i tego allelu praw ie nie w ykryw a się ASA
m R N A . M u tacja P 426L (typ R) polega n a tranzycji
C -> T w pozycji n t 2381 genu, co pow oduje zam ianę
Pro426 w Leu. P ro d u k t zm utow anego genu wykazuje
pew ną aktyw ność enzym atyczną, ale jest bardzo nie­
stabilny.
H o n k e zauw ażył, że m utacje L D M g rupują się
w regionie 5' genu, szczególnie w eksonach 2 i 3 [52].
O koło połow y w szystkich m utacji um iejscow iono w ła­
śnie w tych dw óch eksonach [46]. G dy p o rów nano
sekwencje am inokw asow e sulfataz izolow anych od
różnych ssaków stw ierdzono, że stopień hom ologii
maleje od regionu N -końcow ego w kierunku regionu
C -końcow ego. N ajw iększy stopień hom ologii w ykaza­
no po ró w n u jąc sekwencje kodow ane przez ekson 2.
Jeśli stopień hom ologii sekwencji am inokw asów o d ­
zw ierciedla funkcjonalne znaczenie danego regionu
cząsteczki enzym u, to grupow anie się m utacji w pew ­
nych określonych rejonach genu nie jest niczym nie­
zwykłym.
L eukodystrofia m etachrom atyczna jest ch o ro b ą
dziedziczoną autosom alnie, recesywnie. O gólną czę­
stość w ystępow ania L D M m ożna oszacow ać tylko
w przybliżeniu, gdyż jest ona różna w zależności od
badanej populacji i w ykryw alności klinicznej choroby
(rozpoznaw alności). W północnej Szwecji częstość w y­
stępow ania późnoniem ow lęcego typu L D M ustalo n o
n a 1:40000 [53], we F rancji — 1:130000 [54], w śród
Ż ydów habanickich w Izraelu — 1:75 [55], w USA
— 1:100000 urodzeń [1], w stanie W ashington
— 1:40000 [46]. C zęstość w ystępow ania allelu pseu-
dodeficytu arylosulfatazy A (ASA-PD) w ogólnej p o ­
pulacji ustalono n a 7.3-15% [1, 57-59], n ato m iast
hom ozygot P D /P D n a 0.5-2% [1].
A rtyku ł otrzym ano 6 listopada 1995 r.
Z aakceptow ano do druku 30 kwietnia 1996 r.
Piśmiennictwo
1. K o l o d n y E H , F l u h a r t y A L (1995) W: Scriver CR,
Beaudet AL, Sly WS, Valle D (red) The M etabolie and M olecu­
lar Bases of Inherited Disease, wyd. 7, Me Graw-Hill, New York,
str 2693-2739
2. S a s a k i H, Y a m a d a K, A k a s a k a K, K a w a s a k i H,
S u z u k i K, S a i t o A, S a t o M, S h i m a d a H (1988) Eur
J Biochem 177: 9
3. V a n d e r P a l R H , K l e i n W, V a n G o l d e L M, L o -
p e s - C a r d o z o M (1990) Biochim Biophys Acta 1043: 91
4. S e l m i S, M a i r e J, R o u s e t t B (1989) Arch Biochem
Biophys 273: 170
5. D r a p e r R K , F i s k u m G M , E d m o n d J (1976) Arch
Biochem Biophys 177: 525

288 http://rcin.org.pl POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

 6 . W a h e e d A, H a s i l i k A, v o n F i g u r a K (1982) Hoppe-
Seyler’s Z Physiol Chem 363: 425-430
7. W a h e e d A, v a n E t t e n R L (1985) Biochim Biophys Acta
847: 53
8 . V e r b e r t A, C a c a n B, C e c c h e l i n i R (1987) Biochemie
69: 91-99
9. K e l l y B M, Y u CZ, C h a n g P L (1989) Eur J Cell Biol 48:
71
10. D i e s n e r F, S o m m e r l a d e HJ , B r a u l k e T (1993)
Biochem Biophys Res Commun 197: 1-7
11. K a p p l e r J, L e i n e k u g e l P, C o n z e l m a n n E, K l e i -
j e r WJ , K o h l s c h ü t t e r A, T ö n n e s e n T, R o c h e l M,
F r e y c o n F, P r o p p i n g P (1991) Hum Genet 8 6 : 463-470
12. B a c h G, D a g a n A, H e r z B, G a t t S (1987) Clin Genet 31:
211-217
13. B a c h G, N e u f e l d E F (1983) Biochem Biophys Res Commun
112: 198-205
14. F l u h a r t y AL, M e e K W, K i h a r a H (1983) Biochem
Biophys Res Commun 112: 191-197
15. C o n z e l m a n n E, S a n d h o f f K (1983/84) Dev Neurosci 6 :
58-71
16. C o n z e l m a n n E, S a n d h o f f K (1991) Dev Neurosci 13:
197-204
17. L e i n e k u g e l P, M i c h e l S, C o n z e l m a n n E, S a n d -
h o f f K (1992) Hum Genet 88:513-523
18. F i s c h e r G, J a t z k e w i t z H (1977) Biochim Biophys Acta
481: 561-572
19. S c h l o t e W, H a r z e r K, C h r i s t o m a n o u H, P a t o n
BC, K u s t e r m a n n - K u h n B, S c h m i d t B, S e e g e r J,
B e n d t U, S c h u s t e r J, L a n g e n b e c k U (1991) Eur J Ped
150: 584-591
20. W e n g e r DA, W i l l i a m s C, C o n s i d i n e E, R a f i M A
(1992) Int Pediatr 7: 34-39
21. S h a p i r o LJ , A l e c k KA, K a b a c k M M , I t a b a s h i H,
D e s n i c k RJ , B r a n d N, S t e v e n s e n RL, F l u h a r t y
A L, K i h a r a H (1979) Pediatr Res 13: 1179
22. W e n g e r D A, D e G a l a G, W i l l i a m s C, T a y l o r HA,
S t e v e n s o n RE, P r u i t t J R, M i l l e r J, G a r e n P D ,
B a i e n t i n e J D (1989) Am J M ed Genet 33: 255-265
23. O ’ B r i e n J S, K r e t z KA, D e w j i N N , W e n g e r DA,
E s c h F, F l u h a r t y A L (1988) Science 234: 1098-1101
24. F ü r s t W, M a c h l e i d t W , S a n d h o f f K (1988) Biol Chem
Hoppe-Seyler 369: 317-328
25. F ü r s t W, S a n d h o f f K (1992) Biochim Biophys Acta 1126:
1-16
26. F u j i b a y a s h i S , W e n g e r D A (1986)BiochimBophysActa
875: 554-562
27. V i e l h a b e r G , S a n d h o f f K (1993) 9th ESGLD Workshop,
Delphi
28. D e w j i N N , W e n g e r DA, O ’ B r i e n J S (1987) P N A S
USA 84: 8652-8656
29. H o l t s c h m i d t H, S a n d h o f f K , F ü r s t W, K w o n HY,
S c h n a b e l D, S u z u k i K (1991) FEBS L ett 280: 267-270
30. R o r m a n E G, S c h e i n k e r Y, G r a b o w s k i G A (1992)
Genomics 13: 312-318
31. K r e t z K, G i n n s E, C a r s o n G, M o r i m o t o S, K i ­
s h i m o t o Y, F l u h a r t y A L, O ’ B r i e n J S (1989) Am Soc
Hum Genet, abstrakt
32. R a f i MA, Z h a n g XL, D e G a l e G, W e n g e r D A (1990)
Biochem Biophys Res Commun 166: 1017-1023
33. H o l t s c h m i d t H, S a n d h o f f K , K w o n HY, N a k a n o
T, S u z u k i K (1990) J Biol Chem 266: 7556-7560
34. Z h a n g X L , R a f i M A , D e G a l a G , W e n g e r D A (1990)
P N A S USA 87: 1426-1430
35. Z h a n g XL, R a f i MA, D e G a l a G, W e n g e r D A (1991)
Hum Genet 87: 211-215
36. D u b o i s G, H a r z e r K, B a u m a n N (1977) Am J Hum
Genet 29: 191-194
37. H e r s k a M, M o s c o v i c h D G , K a l i a n M, G o t t l i e b
D, B a c h G (1987) Am J M ed Genet 26: 629-635
38. R o m m e r s k i r c h (1992) P N A S USA 89: 2561-2565
39. S c h m i d t B, S e l m e r T, I n g e n d o c h A, v o n F i g u r a
K (1995) Cell, in press
40. D e L u c a C, B r o w n J A, S h o w s T B (1979) P N A S USA
76: 1957
41. S t e i n C, G i e s e l m a n n V, K r e y s i n g J, S c h m i d t B,
P o h l m a n n R, W a h e e d A, M e y e r E H , O ’ B r i e n JS,
v o n F i g u r a K (1989) J Biol Chem 264: 1252-1259
42. K r e y s i n g J, v o n F i g u r a K, G i e s e l m a n n V (1990)
Eur J Biochem 191: 627-631
43. H o h e n s c h u t z C, F r i e d l W, S c h l ö r K H , W a h e e d
A, C o n z e l m a n n E, S a n d h o f f K , P r o p p i n g P (1988)
Am J M ed Genet 31: 169-175
44. G i e s e l m a n n V, v o n F i g u r a K (1990) J Inher M etab Dis
13: 560-571
45. G i e s e l m a n n V, P o l t e n A, K r e y s i n g J, v o n F i g u r a
K (1989) P N A S USA 8 6 : 9436-9440
46. G i e s e l m a n n V, Z l o t o g o r a J, H a r r i s A, W e n g e r
DA, M o r r i s C P (1994) Hum M utation 4: 233-242
47. G i e s e l m a n n V, P o l t e n A, K r e y s i n g J, K a p p l e r J,
F l u h a r t y A, B o h n e W, v o n F i g u r a K (1991) Brain
Dysfunction 4: 235-243
48. G i e s e l m a n n V, P o l t e n A, K r e y s i n g J, K a p p l e r J,
F l u h a r t y A, v o n F i g u r a K (1991) Dev Neurosci 13:
222-227
49. P o l t e n A, F l u h a r t y A L, F l u h a r t y CB, K a p p l e r J,
v o n F i g u r a K, G i e s e l m a n n V (1991) N Engl J M ed 324:
18-22
50. K a p p l e r J , v o n F i g u r a K , G i e s e l m a n n V (1992)Ann
Neurol 31: 256-261
51. B a r t h ML , F e n s o m A, H a r r i s A (1993) Hum Genet 91:
73-77
52. H o n k e K, K o b a y a s h i T, F u j i T, G a s a S, X u M,
T a k a m a r u Y, K o n d o R, T s u j i S, M a k i t a A (1993)
Hum Genet 92: 451-456
53. G u s t a v s o n K, H a g b e r g B (1971) Acta Pediatr Scand 60:
585-590
54. G u i b a u d P , G a r c i a I, G u y o n n e t C L (1973) Lyon M ed
229: 1215
55. Z l o t o g o r a J, B a c h G, B ö s e n b e r g C, B a r a k Y, v o n
F i g u r a K, G i e s e l m a n n V (1995) Hum M utat 5: 137-43
56. F a r r e l l D F (1981) Hum Genet 59: 129-134
57. H o h e n s c h u t z C, E i c h P, F r i e d l W, W a h e e d A,
C o n z e l m a n n E, P r o p p i n g P (1989) Hum Genet 82:
45-48
58. N e l s o n PY, C a r e y WF , M o r r i s C P (1991) Hum Genet
87: 87-88
59. C h a b a s A, C a s t e l l v i S, B a y e s M, B a l c e l l s S,
G r i n b e r g D, Y i l a g e l i n L, M a r f a n y G, L i s s e n s W,
G o n z a l e s - D u a r t e R (1993) Clin Genet 44: 320-323
Please contact the Editors if you wish
to advertise in „Postępy Biochemii"
the products and services related to
biochemistry, molecular biology and
cell biology.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 289

http://rcin.org.pl
Izoenzymy fosfolipazy C specyficznie hydrolizującej
fosfatydyloinozytole i regulacja ich aktywności
Phosphatidylinositol-specific phospholipase C isozymes and
regulation of their activity
TA D EU SZ PAW ELCZYK*
Spis treści:
I. Wstęp
II. Izoenzymy fosfolipazy C
III. Właściwości katalityczne fosfolipazy C
IV. Regulacja aktywności izoenzymów fosfolipazy C
IV-1. Regulacja aktywności izoenzymów fosfolipazy
C typu p
IV-2. Regulacja aktywności izoenzymów fosfolipazy
C typu y
IV-3. Regulacja aktywności izoenzymów fosfolipazy
C typu 8
IV-4. Regulacja aktywności fosfolipazy C przez kinazę
białkową C i kinazę białkową A
V. Wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie izoenzymów fos­
folipazy C
VI. Rola fosfolipazy C w patofizjologii
Wykaz stosowanych skrótów: PLC—fosfolipaza C;
DAG—diacylogliceroł; Ins—inozytol; IP 3—inozytolotrisfo-
sforan; PI—fosfatydyloinozytol; PIP—fosfatydyloinozytolo
4-fosforan; P IP 2—fosfatydyloinozytolo 4,5-bisfosforan;
PD G F—płytkowopochodny czynnik wzrostu; EGF—czyn­
nik wzrostu naskórka; CSF—czynnik stymulujący komórki
macierzyste (colony-stimulating factor ); NGF—czynnik
wzrostu nerwu; PMA-octan mirystoilo forbolu; PKC—kina-
za białkowa C; SM—sfingomielina.
I. Wstęp
B iałka receptorow e zlokalizow ane w błonie k o m ó r­
kowej um ożliw iają kom órce odbieranie sygnałów
z otaczającego ją środow iska. Zw iązanie cząstki syg­
nałowej z receptorem prow adzi do pow stania i uw ol­
nienia do w nętrza k om órki odpow iedniej substancji
przekaźnikow ej, k tó ra poprzez stym ulację lub za h a ­
m ow anie określonych przem ian w ew nątrz kom órki
zm ienia jej m etabolizm lub funkcje. K lasycznym przy­
kładem takiego przek aźnika jest cykliczny A M P p o ­
w stający w reakcji katalizow anej przez cyklazę adeny-
lanow ą. Zw iązanie h o rm o n u z receptorem prow adzi
do aktyw acji b iałka G i zw iązania G T P z podjednost-
k ą a b iałk a G s lub G ;. P ow stały kom pleks G a-G T P
wpływ a n a aktyw ność cyklazy adenylanow ej.
O dm iennym m echanizm em przekazyw ania infor­
m acji w kom órce jest k ask a d a przem ian zapocząt-
* Dr hab., Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej, Akade­
mia Medyczna, ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk
290
http://rcin.org.pl
Contents:
I. Introduction
II. Isoenzymes of phospholipase C
III. Catalytic properties of phospholipase C
IV. Regulation of phospholipase C isoforms
IV-1. Regulation of phospholipase C p isoforms
IV-2. Regulation of phospholipase C y isoforms
IV-3. Regulationof phospholipase C 8 isoforms
IV-4. Regulationof phospholipase C activity by protein
kinase C and protein kinase A
V. Subcellular distribution of phospholipase C isoenzymes
VI. Role of phospholipase C in pathophysiology
kow ana hydrolizą fosfatydyloinozytoli w wewnętrznej
w arstw ie błony kom órkow ej (Ryc. 1). Zw iązanie su b ­
stancji sygnałowej z receptorem pow oduje aktyw ację
fosfolipazy C specyficznie hydrolizującej fosfolipidy
inozytolow e [1 ,2 ]. W rezultacie dochodzi do hydrolizy
fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu (P IP 2) i p o w sta­
nia diacyloglicerolu (D A G ) oraz inozytolotrisfosfora-
nu (IP 3). I P 3 ja k o zw iązek rozpuszczalny w środow is­
ku w odnym dyfunduje z błony kom órkow ej do cyto-
plazm y, a następnie po zw iązaniu ze swoistym i recep­
toram i w błonach retikulum endoplazm atycznego in ­
dukuje uw olnienie w apnia z w ew nątrzkom órkow ych
zapasów [2-4]. W zrost stężenia C a 2+ stym uluje szereg
przem ian kom órkow ych zależnych od tego jonu . M ię­
dzy innym i dochodzi do aktyw acji kinaz białkow ych
zależnych od C a 2+ i kalm oduliny. F osfolipaza C oraz
kinaza białkow a C rów nież aktyw ow ana jest przez
C a 2 + . D iacylogliceroł ja k o związek nierozpuszczalny
w środow isku w odnym pozostaje w błonie k o m ó r­
kowej i przem ieszczając się w niej m oże oddziaływ ać
z kinazą białkow ą C, której jest fizjologicznym a k ­
tyw atorem [5]. D otychczas p oznano 11 izoenzym ów
kinazy białkow ej C [6]. S ubstratam i kinazy białkowej
C in vivo są białka zw iązane z przekazyw aniem infor­
m acji w kom órce, białka szlaków m etabolicznych oraz
regulatorow e białka zw iązane z ekspresją genów [7 ,8 ].
P ow stały w w yniku działania fosfolipazy C I P 3 ulega
przem ianom w w yniku których następuje odtw orzenie
P I P 2 [9, 10].
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 B ło n a
k o m ó rk o w a

C DP

B iałk o

Ryc. 1 Schemat głównych przem ian fosfatydyloinozytoli zachodzących w komórce z udziałem fosfolipazy C (PLC). D la przejrzystości rysunku
zaznaczono tylko główne przemiany istotne dla sygnałowania komórkowego opartego o przemiany P IP 2 pomijając szereg istotnych
czynników biorących udział w przemianach fosfatydyloinozytoli. Stosowane oznaczenia: R, receptor; H, horm on; DAG, diacyłoglicerol
P IP 2, fosfatydyloinozytolo 4,5-bisfosforan; PIP, fosfatydyloinozytolo 4-fosforan; PI, fosfatydyloinozytol; Ins, inozytol; PK C, kinaza
białkowa C; PS, fosfatydyloseryna; RE, retikułum endoplazmatyczne.

O p ublikow ane dotychczas dane w skazują, że h y d ro ­
liza P I P 2 przez fosfolipazę C inicjuje kaskadę przem ian
m ających isto tn e znaczenie dla szeregu podstaw ow ych
funkcji kom órki. W ym ienić tutaj m ożna aktyw ność
m etaboliczną, wydzielniczą, nerw ow ą i skurczow ą
oraz podział kom órkow y.
II. Izoenzymy fosfolipazy C
W iele fosfolipaz C w yizolow ano i oczyszczono z ro z­
m aitych tk an ek zwierzęcych [11-14]. N a podstaw ie
cD N A u stalo n o sekwencje am inokw asow e 14 enzy­
m ów z tk an ek ssaczych i 2 sekwencje enzym ów z m u ­
szki owocowej Drosophila [15, 16]. P o śró d fosfolipaz
C m o żn a w yróżnić trzy głów ne typy, nazw ane: P L C
(3 (155 kD a), P L C y (145 kD a) i P L C 5 (85 kDa).
C ząsteczka każdej fosfolipazy C zb udow ana jest z p o ­
jedynczego łań cucha białkow ego. W obrębie każdego
typu fosfolipazy C m o żn a w yróżnić kilka izoenzymów.
I tak zidentyfikow ano w śród fosfolipaz C typu (3 izoen­
zymy: (31, (32, (33, (34 i n orpA (enzym z Drosophila).
W p rzy p ad k u fosfolipazy C typu y znaleziono izoen­
zymy y l i y2. N a to m iast fosfolipaza C typ 6 w ystępuje
w postaci izoenzym ów 61, 82, 83, 84 [13]. Fosfolipazy
C poszczególnych typów są w m ałym stopniu h o m o ­
logiczne. W obrębie stru k tu ry każdego z izoenzym ów
W izoenzym ach typu y, pom iędzy dom enam i X i Y wy­
stępuje region około 400 am inokw asów , w którym
zaw arta jest stru k tu ra hom ologiczna do stru k tu ry src.
M ożna w niej w yodrębnić dom eny SH2 i SH3, wy­
stępujące rów nież w kinazach tyrozynow ych rodziny
src [18]. W izoenzym ach P L C (3 znajduje się około 450
am inokw asów m iędzy dom eną Y a C końcem . Region
ten jest znacznie krótszy w izoenzym ach fosfolipazy
C y oraz fosfolipazy C 8 [19]. W szystkie ssacze
izoenzym y fosfolipazy C zaw ierają rów nież jed n ą lub
dwie dom eny P H (dom ena po raz pierwszy opisana
w białku plekstrynie) składające się z około 100
am inokw asów . D om eny te obecne są u wielu białek
sygnałow ych [20, 21]. W izoenzym ach P L C dom ena
P H położona jest n a N końcu łańcucha białkowego.
Izoenzym y y p osiadają d o d atk o w ą dom enę P H p o ło ­
żoną m iędzy dom enam i X i Y, k tó ra jest rozdzielona
dom enam i SH (Rys. 2) [22]. W iększość białek po siad a­
jących dom enę P H jest białkam i k tó re do aktyw acji
P L C ty p |3
N -ffiS — IZZ]— MMM c
PH X Y
P L C typ Y
"-iiffl— 1 [BMWWWHlM ilł c
PH X PH SH2 SH2 SH3 PH Y
PL C ty p 8

fosfolipazy C, znaleziono tylko dw a hom ologiczne N -E ffl \Hw w ą w fl- c

konserw atyw ne regiony, k tó re oznaczono X i Y (Ryc. PH X Y
2). D o m en a X sk łada się z około 170 am inokw asów ,
Ryc. 2 Organizacja łańcuchów peptydowych trzech podstawowych
a dom en a Y z 260 am inokw asów [11, 16]. W szystkie typów fosfolipazy C. Jedyną cechą strukturalnie wspólną
izoenzym y fosfolipazy C zaw ierają około 300 am in o ­ w obrębie wszystkich dotąd poznanych izoenzymów jest
kwasów , k tó re p o p rzedzają dom enę X od N końca. obecność domen X i Y oraz domeny PH. Identyczność
pomiędzy poszczególnymi izoenzymami w obrębie domeny
Izoenzym y typu (3 i 8 zaw ierają k ró tk ą sekwencję 50-70 X i Y wynosi odpowiednio około 60% i 40%. D om ena PH
am inokw asów rozdzielającą dom eny X i Y [15-17]. uczestniczy w wiązaniu z P IP 2.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 291

http://rcin.org.pl
w ym agają asocjacji z b łoną kom órkow ą. W ykazano,
że w obrębie dom eny P H znajdują się m iejsca o dużym
pow inow actw ie do P I P 2 [24,25]. W skazyw ać to m oże
n a P I P 2 ja k o miejsce w iązania pewnej klasy białek
sygnałowych.
W piśm iennictw ie m ożna rów nież znaleźć inform a­
cje n a tem at fosfolipazy C o ciężarze cząsteczkow ym
57-70 k D a [23, 26-29]. Enzym ten oznaczono sym ­
bolem P L C a. N a podstaw ie stru k tu ry cD N A o p u ­
blikow ano sekwencję am inokw asow ą tego enzym u
[27], b rak u je jed n ak d o tąd inform acji o ekspresji
aktyw nego enzym u. S tru k tu ra sklonow anej fosfolipa­
zy C a nie jest p o d o b n a do stru k tu r innych znanych
fosfolipaz C [27], jest n ato m iast niem al identyczna ze
stru k tu rą uprzednio w yizolow anego z m ikrokosm ków
w ątro b y bliżej nie scharakteryzow anego białka o m a­
sie 58 k D a, k tó re nie w ykazuje aktyw ności fosfolipazy
C [30]. M o żn a przypuszczać, że izolow ane m ałe białka
o aktyw ności fosfolipazy C są w rzeczywistości frag­
m entam i proteolizy znanych fosfolipaz C. W ykazano,
że we frakcji błonow ej przeciw ciała przeciw fosfolipa-
zie C 5 reagują z białkam i o m asach 45 i 43 k D a [31].
Stw ierdzono również, że fosfolipaza C 8 ulega łatw o
proteolizie w m iejscu m iędzy dom enam i X i Y. P o ­
w stałe fragm enty o m asach 30 i 40 k D a posiadają
zdolność oddziaływ ania ze sobą z w ytw orzeniem stru ­
k tu ry o m asie 70 k D a posiadającej aktyw ność fos­
folipazy C [32].
III. Właściwości katalityczne fosfolipazy C
A ktyw ność fosfolipazy C zależy od C a 2 + zarów no
w w aru n k ach in vitro ja k i in vivo [33-37]. W zależności
od su b stratu i typu fosfolipazy C, wpływ C a 2+ na
aktyw ność enzym u obserw uje się zarów no w zakresie
stężeń m ikrom ołow ych ja k i m ilim olowych. D o ty ch ­
czas nie m a danych n a tem at bezpośredniego w iązania
C a 2 + przez fosfolipazę C. M utacje lub delecje w pro w a­
dzone w obrębie dom eny P L C 5 (144-236) zawierającej
m otyw E F (stru k tu ra uczestnicząca w w iązaniu w ap­
nia) p ro w ad zą do znacznego obniżenia aktyw ności
enzym u, lecz nie znoszą zależności aktyw ności od
C a 2+, co zdaje się w skazyw ać n a istnienie większej
liczby miejsc wiążących w apń [38]. Inni autorzy
p ostulują, że miejscem w iązania w apnia w fosfolipazie
C jest d om ena Y, k tó ra w części jest hom ologiczna
z dom enam i wiążącym i C a 2 + w fosfolipazie A 2 i kina-
zie białkowej C [39].
S ubstratem fosfolipaz C w szystkich typów są trzy
fosfolipidy zaw ierające inozytol, tj.: fosfatydyloinozy-
tol (PI), fosfatydyloinozytolo 4-fosforan (P IP ) i fos-
fatydyloinozytolo 4,5-bisfosforan (P IP 2), przy czym
P I P 2 i P IP są su b stratam i preferow anym i. P ow inow a­
ctwo poszczególnych fosfolipaz C do P I P 2 przedstaw ia
się następująco: P L C p > P L C 5 > P L C y [41]. Inne
fosfatydyloinozytolofosforany w ystępujące w kom órce
w niewielkich ilościach, ja k fosfatydyloinozytolo 3-fos-
foran, fosfatydyloinozytolo 3,4-bisfosforan i fosfatydy-
292
http://rcin.org.pl
loinozytolo 3,4,5-trisfosforan, nie są hydrolizow ane
przez żaden z izoenzym ów fosfolipazy C [40, 41]. Jak
w spom niano powyżej, p ro d u k tam i reakcji katalizo w a­
nej przez fosfolipazę C jest diacyloglicerol oraz I P 3.
W ykazano, że I P 3 pow staje w postaci cyklicznej oraz
ja k o p ro d u k t niecykliczny [43]. Najwięcej cyklicznego
inozytolotrisfosforanu pow staje w reakcji katalizo w a­
nej przez P L C P, a najm niej w reakcji katalizow anej
przez P L C y [43]. A naliza stereochem iczna pow staw a­
nia I P 3 w ykazała, że w reakcji katalizow anej przez
fosfolipazę C najpierw pow staje cykliczny p ro d u k t,
k tó ry jest uw alniany bądź przem ieniany do zw iązku
niecyklicznego [44]. W ykazano, że kom órki z m niejszą
zaw artością cyklicznego I P 3 ro sn ą w hodow li k o m ó r­
kowej do gęstości niższej niż kom órki z wyższą zaw ar­
tością tego zw iązku, co sugeruje, że stężenie cyklicz­
nego I P 3 m oże regulow ać proliferację kom órek [1].
IV. Regulacja aktywności izoenzymów fosfo­
lipazy C
IV-1. Regulacja aktywności izoenzymów fosfoli­
pazy C typu p
T oksyna krztuśca podobnie jak toksyna cholery
m oże katalizow ać A D P-rybozylację białek G co p o ­
woduje zm ianę ich właściwości. W pływ toksyny krztu ś­
ca n a przebieg niektórych przem ian kom órkow ych
w skazuje pośrednio n a udział białek G w tych przem ia­
nach. D latego, obserw ow ane w niektórych ko m ó rk ach
zaham ow anie przez toksynę krztuśca horm onalnej
stym ulacji fosfolipazy C, w skazuje n a udział białek
G w przekazyw aniu inform acji od receptora do fos­
folipazy C [45, 46]. W ykazano również, że w k o m ó r­
kach niew rażliw ych n a tę toksynę, nie podlegające
m etabolizm ow i analogi G T P , oraz fluorek glinowy
zw iększają efektywność hydrolizy endogennego P I P 2
[46-50]. F a k t ten w skazuje n a udział innego ro d zaju
białek G w regulacji aktyw ności fosfolipazy C. N a tu rę
białek G niew rażliw ych n a toksynę krztuśca zb ad an o
niedaw no, i zakw alifikow ano je ja k o podrodzin ę G q.
O trzym ano i określono sekwencję szeregu cD N A
odpow iadających nieznanym uprzednio podjednost-
kom a podrodziny G q [51-53]. O becnie znanych jest 15
różnych podjednostek Goc, które n a podstaw ie sekw en­
cji am inokw asow ej zostały pogrupow ane w cztery
podrodziny; G s, G i/G 0, G q i G 12. W białkach p o d ­
rodziny G q w ystępują podjednostki Gocq, Goc11? Goc14,
G a j 5 i G a 16 [15]. W ykazano, że G a q i G a j j aktyw ują
fosfolipazę C (31, n ato m iast nie m ają wpływu na
aktyw ność fosfolipazy C y l i fosfolipazy C 51 [54, 55].
Białko G a 31 połączone z receptorem purynergicznym
P 2y aktyw uje fosfolipazę C p i w erytrocytach indyka
[56, 57]. E xpresja G a q, G a n , G a 14 i G a 16 w k o m ó r­
kach linii Cos-7 i następnie użycie błon tych kom órek
w b ad aniach n ad aktyw acją fosfolipazy C p i i p2
w ykazało, że wszystkie cztery białka G stym ulują
aktyw ność obu izoenzym ów. N ajbardziej efektywnym i
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

Ryc. 3 Przypuszczalny mechanizm aktywacji fosfolipazy C (3 przez
białko ocq. Z nak zapytania wskazuje, że nie jest znany
mechanizm przemieszczenia fosfolipazy C |3 z cytoplazmy do
miejsca związania z białkiem a q. N a rysunku przedstawiona
jest PLC pi jako izoenzym najbardziej podatny na stymula­
cję przez a q. Jak to zaznaczono w tekście, inne izoenzymy
PL C p również ulegają aktywacji przez a q lecz w znacznie
mniejszym stopniu.
w aktyw acji fosfolipazy C (31 okazały się białk a G a q,
G a 11? n ato m iast fosfolipaza C (32 jest najbardziej
stym ulow ana przez G a 16 [58]. W yniki te w skazują na
specyficzność oddziaływ ania białek G z poszczegól­
nymi izoenzym am i fosfolipazy C (3. D ośw iadczenia
z trzem a subtypam i recep to ra a adrenergicznego tj.
a 1A, a 1B i a lc wykazały, że każdy z tych receptorów
oddziaływ a ze swoistym izoenzym em fosfolipazy
C (3 poprzez odpow iednie białko G [59]. S pośród re­
ceptorów , k tó re po aktyw acji stym ulują fosfolipazę C
poprzez b iałk a G a q i G a 1Ł wym ienić m ożna receptory
tro m b o k san u A 2, bradykininy, angiotensyny, histam i­
ny, w azopresyny i acetylocholiny (Ryc. 3) [61-64].
H o rm o n a ln a aktyw acja fosfolipazy C w k o m ó rk ach
jajn ik a chom ika, m ięśniów ki gładkiej naczyń, k o m ó r­
kach hodow lanych H L-60 granulocytów i k o m ó rk ach
m ezangialnych nerki h am o w an a jest przez toksynę
krztuśca [45, 65-67]. D ośw iadczenia przeprow adzone
z użyciem ludzkich granulocytów linii H L-60 w ykaza­
ły, że za aktyw ację fosfolipazy C typu p w k o m ó rk ach
tych odpow iedzialna jest dim eryczna p o d jed n o stk a (3y
białka G (Ryc. 4) [68]. D alsze b ad a n ia wykazały, że
p o d jed n o stk a py aktyw uje fosfolipazę C p2 [69, 70].
R eceptoram i któ ry ch aktyw acja prow adzi do stym ula­
cji P L C P za p o m o cą dim erycznego b iałka Py są
receptory m uskarynow e p o d ty p m2 i m 4 oraz receptor
dla interleukiny 8 [71]. W oddziaływ aniu P L C P z biał­
kam i G b io rą udział różne dom eny białkow e tego
enzymu. P o d je d n o stk a a b iałka G q oddziaływ uje
z regionem C końcow ym P L C P leżącym za d o m eną Y,
n ato m iast dim er Py p o siad a pow inow actw o do N k o ń ­
cowego fragm entu P L C p zaw ierającego dom enę P H
[72,73]. O becność osobnych miejsc w obrębie których
dochodzi do oddziaływ ania P L C p z białkam i G w ska­
zuje, że izoenzym y P L C p m ogą być aktyw ow ane
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
addytyw nie przez podjednostki białek G. P o d atn o ść
poszczególnych izoenzym ów P L C P n a aktyw ację
przez białka G jest różna. W rażliw ość izoenzym ów
P L C P n a stym ulujące działanie G qa m aleje w kolejno­
ści p l > p3 > P4 > p2 [74, 75]. Z kolei dim eryczne
białko Py najbardziej aktyw uje P L C P3, słabiej P L C P2
i najsłabiej P L C p i [76, 77]. Izoenzym P L C p4 nie jest
aktyw ow any przez białko py [75]. P rzytoczone pow y­
żej dane w skazują n a ró żn orodność m echanizm ów
biorących udział w ko n tro li aktyw ności P L C typu P,
co przy zróżnicow anym poziom ie ekspresji poszczegó­
lnych izoenzym ów w różnych typach kom órek zabez­
piecza precyzyjną regulację aktyw ności tego enzymu.
IV-2. Regulacja aktywności izoenzymów fosfoli­
pazy C typu y
P olipeptydow e czynniki w zrostu, takie ja k płyt-
k ow opochodny czynnik w zrostu (P D G F ), czynnik
w zrostu n ask ó rk a (EG F), czynnik stym ulujący k o m ó r­
ki m acierzyste (CSF-1), czynnik w zrostu nerwów
(N G F) oraz insulina wyw ierają swój wpływ n a k o m ó r­
kę docelow ą poprzez przyłączenie do receptorów obec­
nych w błonie kom órkow ej. W szystkie te receptory
oprócz podobnej budow y p o siadają w swojej cytoplaz­
m atycznej dom enie aktyw ność kinazy tyrozynow ej.
A ktyw acja receptora np. P D G F lub E G F pow oduje
autofosforylację jego dom eny cytoplazm atycznej, cze­
m u tow arzyszy przem ieszczenie fosfolipazy C z cyto­
plazm y do przestrzeni błonow ej [78, 79]. Dalsze
bad a n ia wykazały, że dochodzi do zw iązania fos­
folipazy C typu y z ufosforylow aną dom eną receptora.
W śród pięciu autofosforylow anych miejsc receptora
E G F m iejscem wiążącym fosfolipazę C y l jest Tyr-992
[80, 81]. P o aktyw acji receptora N G F , P D G F lub
E G F obserw uje się rów nież fosforylację fosfolipazy
PLC (31
Ryc. 4 Mechanizmu aktywacji fosfolipazy C (3 przez dimeryczną
podjednostkę py białka G. Znak zapytania wskazuje, że nie
jest znany mechanizm przemieszczenia PLC p z cytoplazmy
do miejsca związania z podjednostką py białka G. N a
rysunku przedstawiona jest PLC P3 jak o izoenzym najbar­
dziej podatny na stymulację przez (3y. Izoenzymy pi i P2
znacznie słabiej są aktywowane przez Py. Izoenzym P4 nie
jest aktywowany przez Py.
293
 C y [82-84]. W k o m ó rk ach posiadających wszystkie folipazy C y w odpow iedzi n a stym ulację receptora
trzy typy fosfolipazy C stym ulacja receptora N G F E G F jest w arunkiem koniecznym , ale nie w ystarcza­
pow oduje fosforylację tylko typu y a nie P lub 5 [85, jącym do aktyw acji enzymu. N a rycinie 5 p rz ed sta­
86]. Stym ulacja receptora insulinow ego lub CSF-1 nie w iono przypuszczalny m echanizm aktyw acji fosfolipa­
wpływ a n a aktyw ność fosfolipazy C i nie obserw uje się zy C y z udziałem receptorow ej kinazy tyrozynow ej.
fosforylacji żadnego izoenzym u fosfolipazy C [87, 88], Fosforylację reszt tyrozynow ych prow adzącą do
pom im o dużego p odobieństw a strukturalnego tych aktyw acji izoenzym ów fosfolipazy C typu y obserw uje
dw óch receptorów do receptorów dla takich czyn­ się rów nież w w yniku działania kinaz tyrozynow ych
ników w zrostu jak: E G F , N G F , P D G F lub E G F . nie zw iązanych z receptorem , k tó re są aktyw ow ane
W obrębie cząsteczki fosfolipazy C y zidentyfikow a­ w w yniku pobudzenia receptorów w lim focytach,
no cztery m iejsca fosforylacji. W w yniku stym ulacji w zasadochłonnych k o m ó rk ach białaczkow ych, m o-
recep to ra E G F w fosfolipazie C y l ulegają fosforylacji nocytach i k o m ó rk ach N K (Ryc. 6) [95-99]. F os-
reszty tyrozynow e w pozycji 771, 783, 1254 oraz 472 folipaza C y 1 jest fosforylow ana w lim focytach T w od-
[82, 89]. N a to m iast w cząsteczce fosfolipazy C y2
znaleziono tylko dw a m iejsca fosforylacji Tyr-753 ANTYGEN
i Tyr-759 [19]. Fosforylacja fosfolipazy C y nie wpływa
n a aktyw ność enzym u w oznaczeniach in vitro z eg­
zogennym P I P 2 ja k o substratem . P rzy użyciu techniki
m utacji punktow ej w ykazano, że fosforylacja Tyr-783
i Tyr-1254 niezbędna jest do aktyw acji fosfolipazy C y l
in vivo [55, 70]. W ykazano, że tylko enzym ufos-
forylow any p o siad a zdolność do hydrolizow ania sub­
stratu zw iązanego z białkiem typu profaliny [90, 91].
Przypuszcza się, że w w aru n k ach in vivo znaczna część
su b stratu dla fosfolipazy C czyli P I P 2 w ystępuje
w form ie związanej z profaliną i innym i białkam i
cytoszkieletu [109].
P rzedstaw ione powyżej dane w skazują, że fosforyla­
cja izoenzym ów fosfolipazy C typu y jest koniecznym
w arunkiem ich aktyw acji. W k o m ó rk ach niektórych
typów w przenoszeniu sygnału od receptora E G F
bierze udział b iałko G. W hepatocytach indukow ane
PH
przez E G F w ytw arzanie I P 3 oraz diacyloglicerolu
ham ow ane jest przez toksynę krztuśca, nie jest za h a­ Ryc. 6 Aktywacja fosfolipazy C y przez receptor antygenowy
z udziałem cytozolowej kinazy tyrozynowej. Znak zapytania
m o w an a n ato m iast fosforylacja fosfolipazy C y [92- wskazuje, że nie jest znany mechanizm oddziaływania
94]. P o n a d to obserw uje się indukow ane przez E G F receptora z cytoplazmatyczną kinazą tyrozynową oraz
w iązanie b iałka G ia z fosfolipazą C y. M ikrow strzyk- późniejsze przemieszczenie ufosforylowanej PLC y do błony
komórkowej. Y, tyrozyna; Y-P, fosfotyrozyna.
nięcie do pojedynczej kom órki hep ato cy ta przeciwciał
przeciw ko G ia ham uje indukow any przez E G F w zrost
C a 2+ [94]. D an e te w skazują, że fosforylacja fos- pow iedzi n a aktyw ację kom pleksu receptorów (TCR)
[100,101]. Z a fosforylację reszt tyrozynow ych w P L C
y odp o w iad ają kinazy należące do rodziny src, p56lck
i p59fyn w lim focytach T oraz p56lck i p53lyn w lim ­
Biona
focytach B [102]. W lim focytach B głów nym su b ­
stratem kinaz tyrozynow ych jest P L C y2 [103]. Z w ią­
zanie antygenu z receptorem IgE w białaczkow ych
unaza
k o m ó rk ach zasadochłonnych R BL indukuje fosforyla­
cję reszt tyrozynow ych w P L C y l [91]. N a tu ra i m e­
chanizm oddziaływ ania niereceptorow ych kinaz ty ro ­
zynow ych, fosfolipazy C i receptorów leukocytów , ja k
n a razie, nie są znane.

IV-3. Regulacja aktywności izoenzymów fosfoli­

pazy C typu 8
PH

Ryc. 5 Mechanizm stymulacji fosfolipazy C y przez receptor zawie­ A ktyw ność fosfolipazy C typu 5 stym ulow ana jest
rający w swojej strukturze kinazę tyrozynową. W niektórych
typach kom órek w procesie tym uczestniczy również białko przez C a 2+, poliam iny oraz białka zasadow e [34,105].
Gia. Y, tyrozyna; Y-P, fosfotyrozyna. P rzypuszcza się, że rolę fizjologicznego regu lato ra

294 http://rcin.org.pl POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

 fosfolipazy C 8 m oże odgryw ać sperm ina, której
poziom w kom órce zm ienia się w raz z rozw ojem
kom órki [106, 107]. Jak d o tąd , nie znany jest żaden
receptorow y m echanizm aktyw acji tej fosfolipazy C.
Żaden izoenzym fosfolipazy C 8 nie jest substratem
kinaz tyrozynow ych. B iałka G regulujące fosfołipazę
C (3 nie m ają wpływu n a aktyw ność fosfolipazy C 8. Być
może regulacja aktyw ności P L C 8 jest zw iązana
z innym i białkam i należącym i do rodziny białek Ras.
O statn io w ykazano, że P L C 81 jest aktyw ow ana przez
białko p l2 2 -R h o G A P będące aktyw atorem G T P azo -
wym dla b iałka R ho A [108]. W skazyw ać to m oże na
udział P L C 81 w regulacji organizacji białek cyto­
szkieletu. W ykazano, że w erytrocytach około 70%
P I P 2 uczestniczy w w iązaniu białek cytoszkieletu tzw.
frakcji 4.1 z b ło n ą k o m ó rk o w ą [108]. A ktyw acja P L C
81 i hydroliza P I P 2 m oże zatem pociągać zm ianę
arch itek tu ry i oddziaływ ania białek cytoszkieletu. W y­
kazano, że izoenzym 81 wiąże się z błonam i fos-
folipidowym i zaw ierającym i P I P 2 lub sfingom ielinę
(SM) [110, 111]. N a podstaw ie stężeń fosfolipidów
potrzebnych do zw iązania fosfolipazy C 81 w 50% oraz
zaw artości P I P 2 i SM w kom órce m ożna w nioskow ać,
że znacząca część tego enzym u m oże w ystępow ać in
vivo w formie związanej z b ło n ą k o m ó rk o w ą [111].
P otw ierdzeniem tej hipotezy m oże być doniesienie
o w ybiórczym w iązaniu się fosfolipazy C 81 z m iejs­
cami syntezy P I P 2 w obrębie błon m iocytów psa [112].
B adania z użyciem fosfolipazy C 81 oczyszczonej
z w ątro b y szczura oraz fosfolipazy C 81 z ludzkich
fibroblastów indukow anej w E. coli pokazały, że
aktyw ność tego izoenzym u silnie zależy od sfingomieli-
ny oraz jej m etabolitów [113, 114]. W ykazano, że
sfingomielina jest silnym inhibitorem P L C 81, podczas
gdy sfingozyna (m etabolit sfingomieliny oraz silny in­
hibitor kinazy białkowej C) stym uluje ten enzym [113].
D ane powyższe w skazyw ać m ogą n a pow iązanie
regulacji aktyw ności P L C 81 z m etabolizm em sfin­
gomieliny. D o zm ian zaw artości sfingom ieliny w k o ­
m órce dochodzi zarów no w w arunkach fizjologicz­
nych ja k i w n iektórych stanach patologicznych [115-
120]. Z ainteresow anie sfingolipidam i utrzym uje się od
m om entu odkrycia, że p ro d u k ty ro zp ad u tej klasy
lipidów są aktyw ne biologicznie. Sfingolipidy i lizosfin-
golipidy w pływ ają n a w ażne funkcje k o m ó rk i oraz
przejaw iają właściwości przeciw now otw orow e w wielu
k o m ó rk ach zwierzęcych [21]. D ane n a tem at m etab o ­
lizm u sfingom ieliny w kom órce, zdają się w skazyw ać
na udział tych przem ian w przekazyw aniu inform acji
w ew nątrz k o m ó rk i [122, 123]. Z ależność regulacji
fosfolipazy C 81 od m etabolizm u sfingom ieliny m oże
być ogniw em w iążącym szlak przenoszenia inform acji,
w któ ry m kluczow ą rolę odgryw a fosfolipaza C typu
8 ze szlakiem przekazyw ania inform acji op arty m
o przem iany sfingomieliny.
IV-4. Regulacja aktywności fosfolipazy C przez
kinazę białkową C i kinazę białkową A
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
W ko m ó rk ach niektórych typów aktyw acja kinazy
białkowej C oraz kinazy A osłabia stym ulow aną
receptorow o aktyw ność fosfolipazy C. W skazyw ać to
m oże n a kon tro lę aktyw ności fosfolipazy C na zasadzie
sprzężenia zw rotnego. W ykazano, że w k o m órkach
glejaka C6Bul, ko m ó rk ach 3T3 oraz ludzkich białacz-
kow ych lim focytach T fosfolipaza C typu y m oże być
fosforylow ana n a reszcie serynowej (Ser-1248) w spo­
sób zależny od cA M P przez kinazę białkow ą A [124,
127]. F osfolipaza C typu P i 8 nie ulega takiej
fosforylacji. F osfolipaza C y m oże być rów nież nega­
tywnie regulow ana przez kinazę białkow ą C. W k o m ó ­
rkach m ięśni gładkich linii J u rk a t potrak to w an y ch
estrem forbolu (octan m irystoilo forbolu — PM A )
obserw uje się fosforylację reszty serynowej 1248 fos­
folipazy C y l [124]. Fosforylacja ta k a zm ienia o d ­
działyw anie fosfolipazy C y z niereceptorow ym i k in a­
zam i tyrozynow ym i lub fosfatazą tyrozynow ą [128].
In n ą drogą, n a której kinaza białkow a białkow a
C reguluje aktyw ność fosfolipazy C y jest fosforylacja
receptora, odpow iedzialnego za stym ulację P L C y.
F osforylacja T hr-654 receptora E G F przez P K C
obniża zdolność receptorow ej kinazy tyrozynow ej do
fosforylacji fosfolipazy C y l, co zapobiega jej ak ty ­
wacji [129].
Również fosfolipaza C typu p fosforylow ana jest
przez kinazę białkow ą C. P o trak to w an ie kom órek
P C 12, C6Bul lub N IH 3T3 estrem forbolu pow oduje
fosforylację Ser-887 fosfolipazy C p i, n ato m iast nie
dochodzi do fosforylacji fosfolipazy C typu y i 8 [130].
R ów nież w w arunkach in vitro oczyszczona fosfolipaza
C p l fosforylow ana jest przez P K C w pozycji Ser-887
[130]. D otychczas nie jest znana ro la i znaczenie tej
fosforylacji.
V. Wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie
izoenzymów fosfolipazy C
F unkcjonow anie cyklu przem ian fosfoinozytoli
w błonie kom órkow ej od szeregu lat jest tem atem
intensyw nych b ad a ń [131-133]. O becność aktyw ności
fosfolipazy C stw ierdzono rów nież w ją d ra c h kom órek
fibroblastów linii N IH 3T3, linii Swiss 3T3 oraz
kom órek w ątroby [134-136]. B adania im m unocyto-
chem iczne wykazały, że poszczególne izoenzym y fos­
folipazy C w ystępują w różnych przestrzeniach k o ­
m órki oraz, że stym ulacja odpow iednich receptorów
pow oduje przem ieszczenie poszczególnych typów fos­
folipazy C w obrębie kom órki. W k o m ó rk ach fibro­
blastów linii Swiss 3T3 fosfolipaza C typu y obecna jest
w cytoplazm ie, a fosfolipaza C typu P w jądrze
kom órkow ym [136]. Stym ulacja kom órek 3T3 in-
sulinopodobnym czynnikiem w zrostu (IG F) indukuje
w ytw arzanie I P 3 praw ie wyłącznie w jąd rze k o m ó r­
kowym. W ko m ó rk ach tych nie stw ierdzono obecności
fosfolipazy C 8 w cytoplazm ie i frakcji jądrow ej [136].
Im m unocytochem iczna analiza kom órek no w o tw o ro ­
wych rdzenia nadnerczy linii P C 12 w ykazała, że fos-
295
folipaza C y w ystępuje w cytoplazm ie oraz jąd rze
kom órkow ym , n ato m iast fosfolipaza C 8 obecna jest
tylko w cytoplazm ie. Z kolei fosfolipaza C P znajduje
się wyłącznie w jąd rz e tych kom órek [138]. B adania
z użyciem izolow anych ją d e r kom órek w ątroby w ska­
zują, że jedynym typem fosfolipazy C w ystępującym
w jąd rze tych k o m ó rek jest fosfolipaza C typu p i,
jakkolw iek frakcja ją d ro w a stanow i tylko 5% k o m ó r­
kowej zaw artości tego izoenzym u [31]. W szczurzych
fibroblastach płodow ych fosfolipaza C y obecna jest
w form ie wolnej w cytoplazm ie oraz w form ie zw iąza­
nej z filam entam i aktyny. Stym ulacja tych kom órek
przez P D G F pow oduje zw iększone nagrom adzenie
P L C y w m iejscach k o n ta k tu błony kom órkow ej
z filam entam i aktyny [139].
D ane te w skazują, że rozm ieszczenie poszczegól­
nych izoenzym ów fosfolipazy C zależy od typu k o ­
m órki. P o n a d to m o żna przypuszczać, że w różnych
organellach k o m ó rk i cykl inozytolow y jest k o n tro lo ­
w any przez różne izoenzym y fosfolipazy C.
VI. Rola fosfolipazy C w patofizjologii
Z uwagi n a to, że fosfolipaza C odgryw a znaczącą
rolę w aktyw acji szeregu funkcji w kom órce m ożna
przypuszczać, że w wielu stanach patologicznych d o ­
chodzi do zaburzeń w funkcjonow aniu tego enzymu.
Stw ierdzono, że w nadciśnieniu sam oistnym aktyw ­
ność fosfolipazy C w k o m ó rk ach kan alik a proksym al-
nego nerki szczura jest podw yższona [140]. D ośw iad­
czenia z użyciem skraw ków kory nerki szczura w yka­
zały, że odpow iedź nerki n a dopam inę, m ierzona
w zrostem aktyw ności fosfolipazy C jest niższa u szczu­
rów z nadciśnieniem sam oistnym [140] . U szczurów
z nadciśnieniem w yw ołanym przez podaw anie octanu
d eo k sy k o rtik o stero n u jednocześnie z hypertonicznym
roztw orem soli aktyw ność fosfolipazy C jest podw yż­
szona w k o m ó rk ach rdzenia nerki, n ato m iast o b ­
niżona w korze nerki oraz w k o m ó rk ach ścian tęt­
niczych [141]. P o m iary ilości P I 3 i diacyloglicerolu
w k o m ó rk ach ao rty u szczurów z nadciśnieniem
sam oistnym w ykazały, że ilość I P 3 i D A G u tych
zw ierząt jest znam iennie wyższa niż u szczurów n o r­
m alnych. A ktyw ność fosfolipazy C 81 w k o m órkach
ao rty zw ierząt z nadciśnieniem sam oistnym jest wyż­
sza, a poziom P I P 2 obniżony [142]. P o n a d to enzym
ten jest bardziej w rażliwy n a stym ulujące działanie
niskich stężeń C a 2+ [142]. Z a podw yższoną w raż­
liwość fosfolipazy C 81 n a stym ulujące działanie
w apnia odpow iedzialna jest ja k wydaje się, m utacja
p u n k to w a w cząsteczce enzym u [142,143]. A ktyw ność
fosfolipazy C y stym ulow ana jest przez szereg czyn­
ników w zrostu co w skazyw ać m oże n a jej udział
w przekazyw aniu kom órce sygnału do podziału. M i-
krow strzyknięcie fosfolipazy C y lub |3 do fibroblastów
indukuje syntezę D N A [144], k tó ra jest zaham ow ana
p o m ikrow strzyknięciu przeciw ciał przeciw tym en­
zym om [145]. W ykazano, że szereg kom órek now o­
296 http://rcin.org.pl
tw orow ych p osiada podw yższoną aktyw ność fosfoli­
pazy C. K o m ó rk i n ow otw oru piersi [146] oraz lu d z­
kiego czerniaka [147] zaw ierają podw yższony poziom
fosfolipazy C y. D ane te sugerują, że podział ko m órek
rakow ych m oże być stym ulow any przez podw yższony
poziom fosfolipazy C. Szereg chorób neurodegenera-
cyjnych u ludzi zw iązanych jest z akum ulacją P L C
8 w regionach m ózgu zm ienionych chorobow o [148].
U pacjentów cierpiących n a chorobę A lzheim era
stw ierdzono, że enzym ten jest nadm iernie n a g ro m a ­
dzony w zw ojach neurofibryli i neu ro n ach o taczają­
cych plam ki starcze. A naliza techniką „W estern b io t”
w ykazała, że fosfolipaza C 8 skoncentrow ana jest we
frakcji sparow anych filam entów hełikalnych m ózgu
[149. 150]. Stw ierdzono, że aktyw ność specyficzna
tego enzym u jest znacznie obniżona w m ózgu pacjen­
tów z c h o ro b ą A lzheim era [151].
A rtyku ł otrzym ano 28 marca 1996 r.
Z aakceptow ano do druku 16 maja 1996 r.
Notatka uzupełniająca
Już po wysłaniu tego artykułu do druku, w Naturę* ukazał
się artykuł poświęcony strukturze fosfolipazy C 81. Dane
otrzymane w wyniku badań krystalograficznych wykazały,
że enzym ten posiada w swojej N końcowej części cztery
domeny EF, które są umieszczone parami w dwóch pętlach.
Domena EF1 i EF2 uczestniczy w wiązaniu wapnia, podczas
gdy domena EF3 i EF4 tworząca pętlę drugą nie posiadała
związanego wapnia. Autorzy pracy na podstawie analizy
struktury kryształu PLC 81 proponują mechanizm od­
działywania enzymu z błoną plazmatyczną, w którym to
procesie brałyby udział domeny PH oraz domena C2.
W zaproponowanym modelu domena PH zlokalizowana na
N końcu cząsteczki miałaby odpowiadać za wiązanie en­
zymu do błony lipidowej, natomiast domena C2 (626-756 aa)
odpowiadałaby za właściwą orientację enzymu w stosunku
do substratu. W podsumowaniu autorzy stwierdzają, że
architektura domen białkowych PLC 81 wskazuje na typ
cząsteczki zdolnej do odwracalnej asocjacji z błoną plaz­
matyczną, co jest cechą charakterystyczną szeregu białek
sygnałowych takich jak kinaza białkowa C, cytoplazmatycz-
na fosfolipaza A2 czy fosfatydyloinizytolo 3-kinaza.
Piśmiennictwo
1. M a j e r u s P W (1992) Annu Rev Biochem 61: 225-250
2. R a n a RS, H o k i n L E (1990) Physiol Rev 70: 115-164
3. I r v i n e R F (1990) FEBS L ett 263: 5-9
4. I r v i n e R F (1991) Bioassays 13: 419-427
5. N i s h i z u k a Y (1988) Nature (London) 334: 661-665
6. N i s h i z u k a Y (1995) F A SE B J 9: 489-496
7. K i k k a k a w a U, N i s h i z u k a Y (1986) Ann Rev Cell Biol 2:
149-178
8 . M e e k D W, S t r e e t A J (1992) Biochem J 287: 1-15
9. D o w n e s C P , M a c p h e e C H (1990) Eur J Biochem 193:
1-18
10. M a t o J M (1990) W: Phospholipid metabolism in cellular
signaling. C. R. S. Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston, str
9-17
*E s s e n L-O, P e r i s i c O, C h e u n g R, K a t a n M,
W i l l i a m s R L (1996) Nature ( London) 380, 595-602
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 11 . R h e e SG, K i m H, S u h P - G , C h o i W C (1991) Biochem
Soc Trans 19: 337-341
12 . R h e e S G , S u h P G , R y S, L e e S Y (1989) Science 244:
546-550
13. C o c k c r o f t S , T h o m a s G M H (1992) Biochem J 288:1-14
14. D e n n i s EA, R h e e S, B i l l a M M , H a n n u n Y A (1991)
FASE B J 5: 2068-2077
15. K r i z R , L i n L - L , S u l t z m a n L , E l l i s C , H e l d i n C - H ,
D a w s o n T, K n o p f J (1990) W: Proto-Oncogenes in Cell
Development (Ciba F oundation Symposium 150) str 112-127,
Wiley, Chichester, England
16. R h e e S G , C h o K D (1992) Adv Second Messenger Phosphop-
rotein Res 26: 35-60
17. R h e e S G (1991) Trends Biochem Sci 16: 297-301
18. K o c h AC, A n d e r s o n DA, M o r a n M F , E l l i s C,
P a w s o n T (1991) Science 252: 668-674
19. R h e e SG, C h o i K D (1992) J Biol Chem 227: 12393-12396
20. M u s a c c h i o A, G i b s o n T, R i c e P, T h o m p s o n J,
S a r a s t e M (1993) Trends Biochem Sci 18: 343-348
21. P a r k e r PJ , H e m m i n g s BA, G i e r s c h i k P (1994)
Trends Biochem Sci 19: 54-55
22. L e e SB, R h e e S G (1995) Current Opinion in Cell Biol 7:
183-189
23. T a k e n a w a T, N a g a i Y (1981) J Biol Chem 256:6769-6775
24. H a r l a n J E, H a j d u k P J , Y o o n HS , F e s i k S W (1994)
Nature (Lond) 371: 168-170
25. C i f u e n t e s MC , H o n k a n e n L, R e b e c c h i M J (1993)
J Biol Chem 268: 11586-11593
26. N a k a n i s h i O, H o m m a Y, K a w a s a k i H, E m o r i Y,
S u z u k i K, T a k e n a w a T (1988) Biochem J 256: 453-459
27. B e n n e t t C F , C r o o k e S T (1987) J Biol Chem 262:
13789-13797
28. T o m k i n s TA, M o s c a r e l l o M A (1991) J Biol Chem 266:
4228-4236
29. G r i e n d l i n g K K , T a u b m a n MB , A k e r s M, M e n d -
l o w i t z M, A l e x a n d e r R W (1991) J Biol Chem 266:
15498-15504
30. M a r t i n J L, P u m f o r d N R , L a R o s a AC, M a r t i n
B M, G o n z a g a H M S , B e a v e n MA, P o h l L R (1991)
Biochem Biophys Res Commun 178: 679-685
31. D i v e c h a N , R h e e S G , L e t c h e r A J, I r v i n e R F (1993)
Biochem J 289: 617-620
32. E l l i s MV, C a r n e A, K a t a n M (1993) Eur J Biochem 213:
339-347
33. B i d e n TJ , P e t e r - R i e s c h B, S c h l e g e l W, W o l l h e -
i m C B (1987) J Biol Chem 262: 3567-3571
34. F u k u i T , L u t z RJ , L o w e n s t e i n J M (1988) J Biol Chem
263: 17730-17737
35. S a s a k a w a N, N a k a k i R, Y a m a m o t o S, K a t o
R (1987) FEBS L ett 223: 413-416
36. W a t s o n SP, K a i J, S a s a g u r i T (1990) Br J Pharmacol
99 : 212-216
37. W h i t a k e r M, A i t c h i s o n M (1985) FEBS L ett 182:
119-124
38. N a k u s h i m a S, B a n n o Y, W a t a n a b e T , N a k a m u r a
Y, M i z u t a n i T, S a k a i H, S u g i m o t o Y, N o z a w a
Y (1995) Biochem Biophys Res Comm 211: 365-369
39. C l a r k J D, L i n L - L , K r i z R W, R a m e s h a CS,
S u l t z m a n LA, L i n AY, M i l o n a N, K n o p f J W (1991)
Cell 65: 1043-1051
40. L i p s D L , M a j e r u s P W , G o r g a F R, Y o u n g AT,
B e n j a m i n D L (1989) J Biol Chem 264: 8759-8763
41. S e r u n i a n LA, H a b e r MT , F u k u i T, K i m J W, R h e e
SG, L o w e n s t e i n J M , C a n t l e y L C (1989) J Biol Chem
264: 17809-17815
42. R y u S H, S u h P G , C h o K S , L e e K Y , R h e e S G (1987)
Proc N atl Acad Sci U SA 84: 6649-6653
43. K i m JW , R y u S H , R h e e S G (1989) Biochem Biophys Res
Commun 163: 177-182
44. B r u z i k KS , M o r o c h o A M, J h o n D - Y , R h e e SG,
T s a i M - D (1992) Biochemistry 31: 5183-5193
45. A s h k e n a z i A, P e r a l t a E G , W i n s l o w J W, R a m a -
c h a n d r a n J, C a p o n D J (1989) Cell 56: 478-493
46. C h i b a T , R a f f o u l K , Y a m a d a T (1987) J Biol Chem 252:
8467-8469
47. B a l d a s s a r e J J , K n i p p MA , H e n d e r s o n PA, F i s ­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
h e r G J (1988) Biochem Biophys Res Commun 154: 351-357
48. C o c k c r o f t S, G o m p e r t e s B D (1985) Nature (London)
314: 534-536
49. D e c k m y n H, T u S - M, M a j e r u s P W (1986) J Biol Chem
261: 16553-16558
50. L i t o s c h I, W a l l i s C, F a i n J N (1985) J Biol Chem 260:
5464-5471
51. S i m o n M I , S t r a t h m a n M P , G a u t a m N (1991)Science
252: 802-808
52. S m r e k a AV, H e l p e r J R, B r o w n K O , S t e r n w e i s
P C (1991) Science 250: 804-807
53. T a y l o r SJ, S m i t h J A, E x t o n J H (1990) J Biol Chem 265:
17150-17156
54. P a r k D, I h o n D - Y , K r i z R, K n o p f J, R h e e S G (1992)
J Biol Chem 267: 16048-16055
55. T a y l o r SJ, C h a e H Z , R h e e SG, E x t o n J H (1991)Va-
ture (London) 350: 516-518
56. M o r r i s A J, W a l d o G L , D o w n e s C P , H a r d e n T K
(1990) J Biol Chem 265: 13508-13514
57. W a l d o G L , B o y e r J L, M o r r i s AJ , H a r d e n T K
(1991) J Biol Chem 266 : 14217-14225
58. L e e C H , P a r k D , W u D , R h e e S G , S i m o n M I (1992)
J Biol Chem 267: 16044-16047
59. W u D, K a t z A, L e e C - H , S i m o n M I (1992) J Biol Chem
267: 25798-25802
60. W o n g SK, P a r k e r E M, R o s s E M (1990) J Biol Chem
265: 6219-6224
61. B e r n s t e i n G, B l a n k J L, S m r e k a A V, H i g a s h i j i -
m a T, S t e r n w e i s P C, E x t o n J H, R o s s E M (1992)
J Biol Chem 267: 8081-8088
62. G u t o w s k i S, S m r e k a A V, N o w a k L, W u D, S i m o n
M, S t e r n w e i s P C (1991) J Biol Chem 266: 20519-20524
63. S h e n k e r A, G o l d s m i t h P, U n s o n C G , S p i e g e l
A M (1991) J Biol Chem 266: 9303-9313
64. W a n g e RL, S m r e k a A V, S t e r n w e i s P C , E x t o n J H
(1991) J Biol Chem 266 : 11409-11412
65. A s h k e n a z i A, W i n s l o w J W, P e r a l t a E G, P e t e r s ­
o n G L , S c h i m e r l i k MI , C a p o n DJ , R a m a c h a n d -
r a n J (1987) Science 238: 672-675
66 . B i r n b a u m e r L, A b r a m o w i t z J, B r o w n A M (1990)
Biochim Biophys Acta 1031: 163-224
67. L a B e l l e E F , M u r r a y B M (1990) FEBS L ett 268: 91-94
6 8 . C a m p s M, H o u C, S i d i r o p o u l o s D, S t o c k JB,
J a k o b s K H , G i e r s c h i k P (1992) Eur J Biochem 206:
821-831
69. C a m p s M, C a r o z z i A, S c h n a b e l P, S c h e e r A,
P a r k e r PJ , G i e r s c h i k P (1992) Nature (London) 360:
684-686
70. K im H K , K im JW , Z i l b e r s t e i n A, M a r g o l i s BL,
K i m C K, S c h l e s s i n g e r J, R h e e S G (1991) Cell 65:
435-441
71. R h e e S G (1994) Signal-activated phospholipases(LiscovithM ,
Austin RG wyd) Landes Com pany
72. L e e SB, S h i n SH, H e l p e r J R, G i l m a n AG, R h e e
S G (1993) J Biol Chem 268: 25952-25957
73. T o u h a r a K, I n g e l s e J, P i t c h e r J A, S h a w G, L e f -
k o w i t z R J (1994) J Biol Chem 269 : 10217-10220
74. J h o n D - Y , L e e H - H , P a r k D, L e e C - W , L e e K - H ,
Y o o O J, R h e e S G (1993) J Biol Chem 268: 6654-6661
75. L e e C - W , L e e K - H , L e e S B , P a r k D , R h e e S G (1994)
J Biol Chem 269 : 25335-25338
76. P a r k D , J h o n D - Y , L e e C - W , L e e K - H , R h e e S G
(1993) J Biol Chem 268: 4573-4576
77. S m r e k a AV, S t e r n w e i s P C (1993) J Biol Chem 268:
9667-9674
78. K im U - H , K i m H - S , R h e e S G (1990) FEBS L ett 270:
33-36
79. T o d d e r u d G, W a h l M, R h e e SG, C a r p e n t e r
G (1990) Science 249: 296-298
80. R o t i n D, M a r g o l i s BL, M o h a m m a d i M, D a l y G,
D a u m G, L i N, B u r g e s s W, F i s c h e r E H, U l l r i c h A,
S c h l e s s i n g e r J (1992) EM BO J 11: 559-567
81. V e g a Q C , C o c h e t C, F i l h o l O, C h a n g CP , R h e e
SG, G i l l G N (1992) M ol Cell Biol 12: 128-135
82. K im JW , S im S S , K i m U - H , N i s h i b e S , W a h l MI ,
C a r p e n t e r G, R h e e S G (1990) J Biol Chem 265: 3940-
3943
297
 83. M e i s e n h e l d e r J, S u h P - G , R h e e SG, H u n t e r
T (1989) Cell 57: 1103-1122
84. N i s h i b e S, W a h l MI , R h e e SG, C a r p e n t e r
G (1989) J Biol Chem 264 : 10335-10338
85. H o m m a Y, S a k a m o t o H, T s u n o d a M, A o k i M,
T a k e n a w a T, O o y a m a T (1993) J Biochem 290: 649-653
8 6 . K im U - H , F i n k D J r , K i m HS, P a r k DJ , C o n t ­
r e r a s ML , G u r o f f G, R h e e S G (1991) J Biol Chem 266:
1356-1362
87. D o w n i n g J R, M a r g o l i s BL, Z i l b e r s t e i n A, A s h -
m u n RA, S h e e r UA, S c h l e s s i n g e r J (1989) EM BO
J 8 : 3345-3350
88 . N i s h i b e S , W a h l MI , W e d e r g a e t n e r P B , K i m JJ,
R h e e SG, C a r p e n t e r G (1990) Proc N atl Acad Sci USA
87: 424-428
89. W a h l M I , N i s h i b e S , K i m J W , R h e e S G , C a r p e n ­
t e r G (1990) J Biol Chem 265: 3944-3948
90. G o l d s c h m i d t - C l e r m o n t PJ , K i m J W, M a c h e s -
k y L M, R h e e S G, P o l l a r d T D (1991) Science 251:
1231-1233
91. G o l d s c h m i d t - C l e r m o n t PJ , M a c h e s k y L M,
B a l d a s s a r e J J , P o l l a r d T D (1990) Science 247: 1575-
1578
92. Y a n g - L , B a f f y G, R h e e SG, M a n n i g D R , H a n s e n
CA, W i l l i a m s o n J R (1991) J Biol Chem 266: 22451-22458
93. L i a n g M N , G a r r i s o n J C (1991) J Biol Chem 266:
13342-13349
94. Y a n g - L , C a m o r a t t o AB, B a f f y G, R a j S, M a n ­
n i n g D R , W i l l i a m s o n J R (1993) J Biol Chem 268:
3739-3746
95. A z z o n i L, K a m o u n M, S a l c e d o T W, K a n a k a r a j
P, P e r u s s i a B (1992) J Exp M ed 176: 1745-1750
96. B i a n c h i n i L, T o d d e r u d G, G r i n s t e i n S (1993)
J Biol Chem 268: 3357-3363
97. K u m a d a T, F u j i m i y a H, M i y a t a H, B a n n o Y,
N o z a w a Y (1992) Arerugi 41: 1710-1716
98. L i a o F, S h i n HS, R h e e S G (1992) Proc N atl Acad Sci
USA 89: 3659-3663
99. T i n g A T , K a r n i t z L M , S c h o o n R A , A b r a h a m RT,
L e i b s o n P J (1992) J Exp M ed 176: 1751-1755
100. S e c r i s t J P , K a r n i t z L, A b r a h a m T T (1991) J Biol
Chem 266 : 12135-12139
101. W e e S, S c h i e v e n G L , K i r i h a r a J M, T s u TT,
L e d b e t t e r J A, A r u f f o A (1993) J Exp M ed 177: 219-223
102. C o o k e M P , A b r a h a m K M , F o r b u s h KA, P e r l ­
m u t t e r R M (1991) Cell 65: 281-291
103. H e m p e l W M , S c h a t z m a n R C, D e F r a n c o A L
(1992) J Immunol 148: 3021-3027
104. P a r k DJ , M i n H K , R h e e S G (1991) J Biol Chem 266 :
24237-24240
105. H a b e r T M , F u k u i T, L e b o w i t z MS , L o w e n s t e i n
J M (1991) Arch Biochem Biophys 288: 243-249
106. M o r g a n D M L (1990) Biochem Soc Trans 18: 1080-1084
107. P e g g A E (1988) Cancer Res 48: 759-774
108. H o m m a Y, E m o r i Y (1995) EM BO J 14: 286-291
109. G a s c a r d P, P a w e l c z y k T, L o w e n s t e i n J M, C o ­
h e n C M (1993) Eur J Biochem 211: 671-681
110. R e b e c c h i M, P e t e r s o n A, M c L a u g h l i n S (1992)
Biochemistry 31: 12742-12747
111. P a w e l c z y k T, L o w e n s t e i n J M (1993) Biochem J 291:
693-696
112. W o l f R A (1992) Am J Physiol 263 : C1021-C1028
113. P a w e l c z y k T, L o w e n s t e i n J M (1992) Arch Biochem
Biophys 297: 328-333
114. P a w e l c z y k T, L o w e n s t e i n J M (1993) Biochem Phar­
macol 45: 493-497
115. B a r e n h o l z Y, T h o m p s o n T E (1980) Biochim Biophys
Acta 604: 129-158
116. B a r e n h o l z Y, G a t t S (1982) Phospholipids (H awthorne
JN, Ansell GB wyd.) Elsevier Biomedical Press, Amsterdam
117. L e v i n E, J o h n s o n R M , A l b e r t S (1958) Arch Biochem
Biophys 73: 247-254
118. H o s t e t l e r KY, Z e n n e r BD, M o r r i s H P (1979)
Cancer Res 39: 2978-2983
119. E n g e l m a n B, S t r e i c h S, S c h o n t h i e r U M , R i c h ­
t e r WO , D u h m J (1992) Biochim Biophys Acta 1165: 32-37
120. F u Y F , D o n g YZ, L i H, W a n g W (1992) Chin M ed
298
http://rcin.org.pl
J Engl 105: 803-808
121. H a n n u n YA, B e l l R M (1989) Science 243: 500-507
122. D r e s s i e r KA, M a t h i a s S, K o l e s n i c k R N (1992)
Science 255: 1715-1718
123. M a t i a s S, Y o u n e s A, K a n C - C , O r l o w I, J o s e p h
C, K o l e s n i c k R N (1993) Science 259: 519-522
124. B r u n s C, M a r m e D (1987) F EBS L ett 212: 40-44
125. B u r n a t o w s k a - H l e d i n MA, S p i e l m a n W S (1989)
J Clin Invest 83: 84-89
126. K a n a i d e H, M a t s u m o t o T, N a k a m u r a M (1986):
Biochem Biophys Res Commun 140: 195-203
127. S h a y m n J A, M o r r i s e y JJ, M o r r i s o n A R (1987)
J Biol Chem 262 : 17083-17087
128. P a r k D J, M i n H K , R h e e S G (1992) J Biol Chem 261 :
1496-1501
129. D e c k e r SJ, E l l i s C, P a w s o n T, Y e l u T (1990) J Biol
Chem 265: 7009-7015
130. G o M, Y o k o y a m a M, A k i t a H, F u k u z a k i H (1988)
Biochem Biophys Res Commun 153: 51-58
131. K w i a t k o w s k a J (1989) Post Biochem 35: 253-263
132. B a r a ń s k a J, C z a r n y M (1991) Post Biochem 37:129-132
133. P o d d a n a H, B a r a ń s k a J (1991) Post Biochem 37:
129-132
134. D i v e c h a N, B a n f i c H, I r v i n e R F (1991) EM BO J 10:
3202-3214
135. S m i t h C D , W e l l s W W (1983) J Biol Chem 258:9368-9373
136. M a r t e l l i A M, G i l m o u r RS, B e r t a g n o l o V, N e r i
L M , M a n z o l i L, C o c o L (1992) Nature (London) 358:
242-245
137. P a y r a s t r e B, N i e v e r s M, B r e t o n M, V e r k l e i j A,
V a n b e r g e n e n H e n e g o u w e n P M P (1992) J Biol
Chem 261 : 5078-5084
138. M a z z o m i M, B e r t a g n o l o Y, N e r i L M, C a r i n i C,
M a r c h i s i o M, M i l a n i D, M a n z o l i FA, C a p i t a n i
S (1992) Biochem Biophys Res Comm 187: 114-120
139. M c B r i d e K, R h e e SG, J a k e n S (1991) Prot N atl Acad
Sci USA 8 8 : 7111-7115
140. C h e n CJ , V y a s SJ, E i c h b e r g J, L o k h a n d w a l a
M F (1992) Hypertension 19: 102-108
141. U e h a r a Y, N u m a b e A, T a k a d a S, H i r a k a w a N,
M a t s u o k a H, I k e d a Y, Y a g i S, S a g i m o t o T (1991)
Jpn Circ J 55: 509-515
142. K a t o H, F u k a m i K, S h i b a s a k i F, H o m m a Y,
T a k e n a w a T (1992) J Biol Chem 261 : 6483-6487
143. K a t s u y a T, H i g a k i J, M i k i T, K o h a r a K, Y a g i s a -
w a H, T a n e s e H, M i k a n i H, S e r i k a w a T, N o j i m a
H, O g i h a r a T (1992) Biochem Biophys Res Commun 187:
1359-1366
144. S m i t h MR , R y u S - H, S u h P - G , R h e e S G, K u n g
H - F (1989) Proc N atl Acad Sci USA 8 6 : 3659-3663
145. S m i t h MR , L i u Y- I , K i m H, R h e e SG, K u n g H - F
(1990) Science 247: 1074-1077
146. A r t e a g a CL, J o h n s o n M D , T o d d e r u d G, C o f -
f r e y RJ , C a r p e n t e r G, P a g e D L (1991) Proc N atl Acad
Sci USA 8 8 : 10435-10439
147. P e r e l l a F W, J a n k i e w i c z R, D a n d r o w E A (1991)
Biochim Biophys Acta 1076: 209-214
148. S h i m o h a m a S, P e r r y G, R i c h e y P, T a k e n a w a T,
W h i t e h o u s e PJ , M i y o s h i K, S u e n a g a T, M a t ­
s u m o t o S, N i s h i m u r a M, K i m u r a J (1993) Neurosci
L ett 162: 183-186
149. S h i m o h a m a S, H o m m a Y, S u e n a g a T, F u j i m o t o
S, T a n i g u c h i T, A r a k i W, Y a m a o k a Y, T a k e n a ­
w a T, K i m u r a J (1991) Am J Pathol 139: 737-742
150. S h i m o h a m a S, P e r r y G, R i c h e y P, P a p r o t n i k D,
T a k e n a w a T, F u k a m i K, W h i t e h o u s e PJ , K i m u ­
r a J (1995) Brain Res 669 : 217-224
151. S h i m o h a m a S , F u j i m o t o S , M a t s u s h i m a H , T a ­
k e n a w a T, T a n i g u c h i T, P e r r y G, W h i t e h o u s e
PJ , K i m u r a J (1995) J Neurochem 64: 2629-2634
Prenum erata „P o stęp ó w Biochem ii"
w 1996 r.
Prenum erata dla instytucji — 60 zł
Indyw idualna — 28 zł
50% zniżki dla członków PTBioch.
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

Sfingomielina i jej metabolity jako pośredniki
w przenoszeniu sygnału w komórce
Sphingomyelin and its metabolites in cellular signal transduction
JOLANTA M. DZIK1,
ELŻBIETA WAŁAJTYS-RODE2
Spis treści:
I. Wstęp
II. Wpływ metabolitów sfingomieliny na różnicowanie i pro­
liferację komórek
II-l. Wpływ pochodnych sfingozyny na poziom kwasu
fosfatydowego
III. Rola metabolitów sfingomieliny w apoptozie
IV. Wpływ sfingozyno-l-P na ruchliwość komórek nowo­
tworowych
V. Regulacja homeostazy wapniowej w komórce przez
metabolity sfingomieliny
VI. Rola metabolitów sfingomieliny w przenoszeniu syg­
nałów cytokin i czynników wzrostu w komórkach
VI-1. Receptory dla TNF
VI-2. Receptor Fas/APO-1
VI-3. Różne drogi przenoszenia sygnału pochodzącego
od nSM-azy i aSM-azy
VI-4. Receptor PDGF
VII. Uwagi końcowe
Wykaz stosowanych skrótów: DAG — diacyloglicerol; PC
— fosfatydylocholina; PC-PLC — fosfolipaza C swoista dla
fosfatydylocholiny; PLA2 — fosfolipaza A2; PLD — fos­
folipaza D; SM — sfingomielina; SP — sfingozyna; SPP
— sfmgozyno-1-fosforan; SPC — sfmgozylofosfocholina;
aSM-aza i nSM-aza — sfingomielinazy o optimach działania
w pH odpowiednio kwaśnym i obojętnym; PA — kwas
fosfatydowy; IP 3 — inozytolotrisfosforan; PMA = TPA,
12-o-tetradekanoilo-forbolo-13-octan — ester forbolu, EGF
— nabłonkowy czynnik wzrostu; FG F — fibroblastowy
czynnik wzrostu; PD G F — płytkowy czynnik wzrostu;
PDGF-R — receptor dla PDGF; TNF — czynnik martwicy
nowotworów; TNF-R — receptor dla TNF; N F k B, AP-1
— czynniki transkrypcyjne; I- kB — inhibitor N F kB; PKC
— kinaza białkowa C; MAPK — kinazy białkowe ak­
tywowane mitogenami; MEK — kinazy MAPK; SAPK,
JM K — kinazy białkowe aktywowane stresem; Raf— kinaza
białkowa Raf; CAPK — kinaza białkowa aktywowana
ceramidem; PDK — „ukierunkowane proliną” seryno-
wo/treoninowe kinazy białkowe; CAPP — fosfataza biał­
kowa aktywowana ceramidem; PP-2A — fosfataza białkowa
2A; TRADD — białko homologiczne do domeny śmierci
receptora TNF-R55; Fas/APO-1 — receptor z rodziny
receptorów TNF.
1 Dr, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego
PAN, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa,
2 prof. dr hab., Zakład Bioinżynierii Instytutu Biotech­
nologii i Antybiotyków, ul. Starościńska 5,02-516 Warszawa
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
Szanownej Pani Profesor Zofii Zielińskiej
pracę tę dedykują Autorki
C ontents:
I. Introduction
II. Regulation of proliferation and differentiation by sphin­
gomyelin metabolites
II-l. Influence of sphingosine derivatives on the level of
phosphatidic acid
III. Sphingomyelin metabolites in apoptosis
IV. Sphingosine-l-P involvement in cancer cell motility
V. Regulation of cellular calcium homeostasis by sphin­
gomyelin metabolites
VI. Sphingomyelin metabolites and cytokine and growth
factor signal transduction
VI-1. TNF receptors
VI-2. Fas/APO-1
VI-3. Diversity of nSM-ase and aSM-ase induced signal
pathways
VI-4. PDGF receptor
VII. Concluding remarks
I. Wstęp
W latach osiem dziesiątych ubiegłego stulecia T h u -
d i c h u m wyizolow ał i scharakteryzow ał składnik
wyciągu eterow ego m ózgu, który nazw ał sfmgomieli-
ną. P oczątkow o łączono obecność tego zw iązku z fun­
kcjonow aniem m ózgu, ale po stw ierdzeniu pow szech­
nego w ystępow ania we frakcji lipidów błonow ych
i w m ielinie zaczęto uważać, iż pełni on funkcje
strukturalne. W następstw ie odkrycia przez O k a z a -
k i e g o i w s p. [1], że w itam ina D 3 stym uluje aktyw ­
ność sfingom ielinazy działającej w zakresie obojętnego
pH (nSM -aza), pow odując nagrom adzanie ceram idu
w ko m ó rk ach H L-60, rozpoczęto intensyw ne b ad an ia
nad m etabolizm em sfingom ieliny ja k o potencjalną
d ro g ą przenoszenia sygnału w kom órce. W krótce
potem stw ierdzono, że do czynników aktyw ujących
nSM -azę należą rów nież działające plejotropow o w o r­
ganizm ie cytokiny T N F -a , IN F -y i IL-1 [2]. W ażnym
następnym etapem b ad a ń było w ykazanie przez
H a n n u n a i jego grupę [3], że krótkołańcuchow e,
przechodzące przez błony kom órkow e ceram idy, wy­
w ołują wiele biologicznych efektów identycznych do
pow odow anych aktyw acją nSM -azy, co spraw iło, że
299
ceram idy zostały uznane za w tórne przekaźniki syg­
nału. N ajlepiej dotychczas scharakteryzow anym u k ła­
dem jest aktyw acja nSM -azy przez T N F -a , d o k o n an a
przez zespół K o l e s n i c k a [p raca przeglądow a: 4],
O statnie b ad a n ia wiążące działanie T N F -a z aktyw a­
cją błonow ych kinaz białkow ych i fosfatazy białkowej
należącej do typu fosfataz P-2A niew ątpliw ie staw iają
sfingom ielinę i jej m etabolity w centrum zainteresow a­
n ia badaczy now ych dróg przekazyw nia sygnałów
w kom órce [p raca przeglądow a 5].
W „Postępach Biochemii” ukazały się dotychczas
dw a artykuły przeglądow e dotyczące roli sfingomieli-
ny [6, 7] do k tó ry ch kierujem y czytelników , trak tu jąc
naszą pracę ja k o uzupełnienie w iadom ości o tej gw ał­
tow nie rozwijającej się dziedzinie badań.
II. Wpływ metabolitów sfingomieliny na róż­
nicowanie i proliferację komórek
Analogicznie do różnych fosfolipaz, k tó re w ytw a­
rzają w ew nątrzkom órkow e w tórne przekaźniki b ęd ą­
ce m etabolitam i glicerofosfolipidów zaproponow ano,
że sfingom ielinaza działająca w obojętnym zakresie pH
(nSM -aza) [fosfodiesteraza sfingom ielinow a (EC
3.1.4.12)] m oże stanow ić pierw szy etap w szlaku syg­
nałow ym (Ryc. 1) [9, 10], Enzym ten jest zlokalizow a­
ny w raz ze swym substratem n a zew nętrznym listku
błony plazm atycznej [11].
Stw ierdzono, że hydroliza sfingom ieliny m a znacze­
nie w różnicow aniu ludzkich prom ielocytów białacz-
kow ych H L-60 indukow anym przez w itam inę D 3 [1,
12], czynnik m artw icy now otw orów (T N F -a) i inter-
feron-y [2]. P o n a d to S p i e g e l i w s p . [13] w yka­
zali, że egzogenna sfingom ielinaza stym ulow ała p ro li­
ferację m ysich fibroblastów 3T3, zaś d o d an a razem
z takim i czynnikam i w zrostow ym i ja k insulina, n a ­
błonkow y czynnik w zrostu (EG F) lub bom bezyna,
potęgow ała ich działanie. T raktow anie kom órek sfin-
gom ielinazą pow odow ało znaczący spadek poziom u
sfingomieliny, czem u tow arzyszył w zrost poziom u
ceram idu. Egzogenne, krótkołańcuchow e ceram idy
stym ulow ały włączanie radioaktyw nej tym idyny
i działały synergistycznie z wyżej w spom nianym i czyn­
nikam i w zrostu. Z atem ceram idy m ogą być z a a n ­
gażow ane także w regulację proliferacji kom órek, a nie
tylko ja k o pośrednik w ich różnicow aniu. Z b ad a ń n ad
wpływem ceram idów i sfingozyny n a proliferacje
i w zrost ludzkich keratynocytów D JM -1 wynika, że
syntetyczne krótkołańcuchow e ceram idy prom ow ały
różnicow anie tych kom órek, podczas gdy sfingozyna

DE NOVO

PALMITOILO-Co A + SERYNA

Ryc. 1 Drogi metabolizm u sfingolipidów. N a podstawie prac przeglądowych [ 6 - 8 ], z uwzględnieniem następujących modyfikacji, odzwiercie­
dlających obecne poglądy: (i) wprowadzenie podwójnego wiązania 4-trans odbywa się już po reakcji acylacji, zatem wolna sfingozyna nie
jest pośrednikiem w syntezie sfingolipidów de novo; (ii) biosynteza sfingomieliny polega na przeniesieniu fosfocholiny z fosf-
atydylocholiny na ceramid i uwolnieniu diacyloglicerolu; (iii) sfingozyna, k tóra powstaje w wyniku hydrolizy ceramidu, może być
przem ieniana z pow rotem do ceramidu lub degradowana, co obejmuje fosforylację do sfingozyno-l-P oraz lityczny rozpad do fosforanu
etanoloam iny i trans-2-heksadekanalu. Zaznaczono wpływ czynników regulatorowych. D la uproszczenia pominięto niektóre substraty,
produkty, a także nazwy enzymów.

300 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 stym ulow ała w zrost [14].
Sfingozyna, w raz z innym i długołańcuchow ym i za­
sadami: stearyloam iną, 3-ketosfinganiną i sfinganiną
ham uje specyficznie kinazę białkow ą C (PK C ) [15],
kluczowy enzym zaangażow any we w zrost i tran sfo r­
mację n o w otw orow ą kom órek. D ziałanie jej jest więc
przeciw staw ne działaniu diacyloglicerolu, k tó ry jest
aktyw atorem P K C [10, 16,17]. Z h a n g i w s p . [18]
pokazali, że niskie stężenia sfingozyny < 20 pM sty­
m ulują proliferację m ysich fibroblastów spoczynko­
wych 3T3, a także, że sfingozyna potęguje odpow iedź
kom órek n a czynniki w zrostow e działające niezależnie
od PK C . D ziałanie sfingozyny m oże polegać n a m o d u ­
lacji aktyw ności enzym ów potencjalnie zaangażow a­
nych w przenoszenie sygnałów: fosfolipazy D (PLD )
[19, 20], fosfohydrolazy kw asu fosfatydow ego [21],
80 k D izoenzym u kinazy diacyloglicerolow ej [22]
i kilku cytosolow ych kinaz białkow ych [23, 24].
Spośród m etabolitów sfingom ieliny o b o k sfingozy­
ny także N ,N -dim etylosfingozyna, S P P i sfingozylo-
fosfocholina m ają wpływ n a proliferację kom órek
drog ą niezależną od P K C . N ,N -dim etylosfingozyna
jest silniejszym niż sfingozyna inhibitorem kinazy
białkowej C, a p o n ad to aktyw uje kinazy tyrozyno we:
kinazę src i kinazę receptora E G F [25, 26]. Sfin-
g o zy n o -l-P jest silnym m itogenem dla m ysich fibro­
blastów 3T3 [27]. W odpow iedzi n a m itogenne stęże­
nia sfingozyny poziom S P P w zrastał praw ie dziesięcio­
krotnie. M im o że SP i S P P działały synergistycznie
z insuliną i E G F , nie obserw ow ano synergizm u ani
addytyw ności, gdy zastosow ano optym alne daw ki SP
(20 pM ) i S P P (5 pM ), co wskazuje, że o b a związki
m odulują proliferację ko m órek tą sam ą drogą. P o n a d ­
to, kom petycyjny in h ib ito r kinazy sfingozynowej, D L -
treo-dihydrosfingozyna [28], ham ow ał zarów no p o ­
w staw anie S P P ja k i syntezę D N A [29].
Sfingozylofosfocholina jest silnym stym ulatorem
w zrostu wielu typów ko m órek [30]. Jej działanie jest
silniejsze niż insuliny czy E G F , lecz rów nie efektywne
ja k surow icy płodow ej [31]. Z b ad a ń w ynika, że SPC
nie w spółzaw odniczy z estram i forbolu o miejsce
w iązania do P K C w fibroblastach 3T3, a działa
synergistycznie z T P A stym ulując m itogenezę, co
sugeruje, że S PC nie działa poprzez ham ow anie kinazy
białkowej C. N ie m o żn a wykluczyć jed n ak pewnej roli
tego enzym u w m itogenezie indukow anej przez SPC,
gdyż obserw ow ano w yraźny spadek syntezy D N A po
zaham ow aniu PK C . Z atem SPC może działać zarów no
drogą zależną ja k i niezależną od kinazy białkowej C.
II-1. Wpływ pochodnych sfingozyny na poziom
kwasu fosfatydowego
P oszu k u jąc dróg, jak im i sfingozyna m oże in d u k o ­
wać proliferację ko m ó rek zw rócono uwagę n a fakt, że
jej wpływowi tow arzyszyło dw ukrotne podniesienie
poziom u kw asu fosfatydow ego (PA) — silnego m ito-
genu dla mysich fibroblastów 3T3 [20]. W zrost wew­
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
http://rcin.org.pl
nątrzkom órkow ego poziom u PA m oże być spow odo­
w any stym ulacją fosfolipazy D, ham ow aniem fosfohy­
drolazy kw asu fosfatydowego, zwiększeniem acylacji
glicerolo-3-P i podw yższeniem fosforylacji diacylog­
licerolu katalizow anej przez kinazę diacyloglicerolo-
wą. W ykazano, że sfingozyna stym uluje aktyw ność
fosfolipazy D w wielu typach kom órek: N G 108-15,
fibroblastach 3T3, fibroblastach N T H 3T3 i w k o m ó r­
kach śró d b ło n k a naczyń krw ionośnych płuc [19]. In
vitro stw ierdzono ham ow anie fosfohydrolazy kw asu
fosfatydowego przez sfingozynę [32]. W ludzkich
ko m ó rk ach białaczkow ych Ju rk a t T bogatych w 80
kD izoenzym kinazy diacyloglicerolow ej sfingozyna
pow odow ała akum ulację PA [33].
W wielu typach kom órek kwas fosfatydow y wywo­
łuje efekty podobne działaniu czynników w zrosto­
wych: podnosi w artość p H cytoplazm y, indukuje eks­
presję proto o n k o g en ó w c-fos i c-myc i pow oduje
hydrolizę fosforanów fosfatydyloinozytolu [34], P o ­
n ad to działa synergistycznie z czynnikam i w zrostow y­
mi: E G F , F G F lub cielęcą surow icą płodow ą oraz
estram i forbolu [20]. U w aża się, że PA jest pow iązany
z działaniem b iałka R as [35], k tó re pośredniczy we
wczesnych etapach przenoszenia sygnałów stym ulują­
cych w zrost kom órek [36]. W ykazano również, że
P D G F i T P A stym ulują w ytw arzanie PA w w yniku
aktyw acji fosfolipazy D [37]. Jest wysoce p ra w d o p o ­
dobne, że kwas fosfatydow y funkcjonuje ja k o we­
w nątrzkom órkow y w tórny przekaźnik w kaskadzie
sygnałów m itogennych [38].
D ziałanie PA m a ważne im plikacje dla biologicznej
funkcji sfingozyny. W iadom o, że w fibroblastach 3T3
i innych typach kom órek PA ham uje nagrom adzanie
się c-A M P i m oże zapoczątkow yw ać hydrolizę lipidów
fosfatydyloinozytolow ych, co pow oduje zwiększenie
stężenia trisfosfoinozytolu (IP 3) [39]. P o d o b n e skutki
w yw ołują m itogenne (10 pM ) stężenia sfinogozyny
[20]. Sfinogozyna także indukuje uw alnianie w apnia
z m agazynów w ew nątrzkom órkow ych w nienaruszo­
nych fibroblastach naw et p o d nieobecność w apnia
zew nątrzkom órkow ego [40], co zostanie om ów ione
w dalszej części artykułu. Z arów no indukow anie uw al­
niania w apnia ja k i proliferacja kom órek są specyficzne
dla izom eru D -erytro-sfingozyny.
Sfingozylofosfocholina rów nież stym uluje n ag ro m a­
dzanie się kw asu fosfatydowego praw dopodobn ie
przez aktyw acje fosfolipazy D [31]. Jednakże nie jest
ono tak znaczące ja k w przy p ad k u SP i S P P i nie
wydaje się żeby PA był zaangażow any w m echanizm
działania SPC. W ko m ó rk ach trak to w an y ch SPC nie
obserw uje się zm iany ilości c-A M P, k tó ry pod wpły­
wem SP lub S P P obniża się drastycznie [20], co
wskazuje, że ten klasyczny przekaźnik sygnałów nie
m a wpływu n a m itogenezę i m obilizacje w apnia w ywo­
ływ aną działaniem SPC. Z aobserw ow ano natom iast,
że m itogenne stężenia SPC pow odują uw alnianie
kw asu arachidonow ego z fosfolipidów błon m ysich
fibroblastów 3T3. K w as arachidonow y w obecności
301
w apnia aktyw uje w ystępujący w tych ko m ó rk ach
izoenzym PKC-oc [41, 42]. D odanie sfinogozyny h a ­
m ow ało zarów no stym ulow ane przez SPC uw alnianie
kw asu arachidonow ego ja k i m itogenne działanie SPC,
co potw ierdza rolę kw ąsu arachidonow ego w tym
procesie.
III. Rola metabolitów sfingomieliny w apop-
tozie
Rozwój organizm ów w ielokom órkow ych jest regu­
low any przez procesy proliferacji i różnicow ania oraz
program ow anej śmierci kom órek, zwanej ap o p to zą
[p raca przeglądow a: 43]. K o m ó rk i ulegają apoptozie
w odpow iedzi n a ró żn o ro d n e bodźce fizjologiczne
i farm akologiczne. N asza wiedza o sygnałach in d u k u ­
jących proces ap o p to zy w ko m ó rk ach jest ciągle
niekom pletna.
O bserw acje, że w k o m ó rk ach białaczkow ych T N F
pow oduje fragm entację D N A p row adzącą do a p o p ­
tozy, zw róciły uw agę n a udział w tym procesie jednego
z p ro d u k tó w hydrolizy sfingom ieliny — ceram idu
[44]. Syntetyczny ceram id C2 d o dany do kom órek
U937 białaczki m onoblastycznej (w jak ich T N F pow o­
duje apoptozę) wywoływał internukleosom ałną frag­
m entację D N A , co jest uw ażane za wczesny objaw
apoptozy. W k o m ó rk ach H L-60, U937, L929/LM
i W E H I164/13, działanie sfingom ielinazy i ceram idu
było znoszone przez fosfolipazę C i syntetyczne diacy-
loglicerole, co świadczy, że ceram id działa antagoni-
stycznie do D A G . Stw ierdzono, że fosfolipaza A2,
kw as arachidonow y i fosfolipaza D nie pow odow ały
uszkodzeń D N A [45] . D ziałanie cytotoksyczne cera­
m idu jest stereospecyficzne i ogranicza się do D -
erytro-ceram idu i odpow iadających m u syntetycznych
agonistów ; d ih y droceram id jest nieaktyw ny [46].
Przebieg reakcji cytotoksycznych indukow anych
przez ceram id był analogiczny do w yw ołanych działa­
niem T N F w tych sam ych liniach kom órkow ych
i w p o d o b n y ch w arunkach. Q u i n t a n s i w s p . [47]
opisali udział ceram idu w apoptozie kom órek W E-
HI231 pow odow anej przez przeciwciała, kortykoste-
roidy i prom ieniow anie UV. Są też dow ody n a rolę
ceram idu w procesie apoptozy kom órek T indukow anej
zakażeniem wirusem H IV [48]. Również egzogenny
ceram id indukow ał apoptozę w tych kom órkach [49].
P ozbaw ienie k o m ó rek białaczkow ych M olt4 su ro ­
wicy, pow odow ało zatrzym anie przebiegu cyklu k o ­
m órkow ego i apoptozę, czem u tow arzyszył d ra m a ty ­
czny i długotrw ały w zrost poziom u w ew nątrzkom ór­
kow ego ceram idu. Te sam e efekty pow odow ał eg­
zogennie d o d an y ceram id. P raw d o p o d o b n ie w za­
trzym aniu cyklu k o m órkow ego n a granicy faz G o /G l
przez ceram id pośredniczy defosforylacja p ro d u k tu
genu R b (uw ażanego za w ażny reg u lato r cyklu k o m ó r­
kowego), gdyż linie kom órkow e, któ ry m b ra k R b lub
w k tórych on nie funkcjonuje n a skutek działania
indukow anych adenow irusem białek w iążących Rb
302
http://rcin.org.pl
[50], nie podlegają ham ow aniu przebiegu cyklu k o ­
m órkow ego w yw oływ anem u przez ceram id. Co więcej,
estry forbolu lub D A G nie przeciw działają zależnem u
od ceram idu ham ow aniu cyklu kom órkow ego, n a to ­
m iast zapobiegają apoptozie indukow anej ceram idem ,
co sugeruje w ystępow anie różnych dróg przenoszenia
sygnału przez ceram id w tych procesach. M ożliwe, że
to, czy proces apo p to zy w kom órce będzie przebiegał
zależy nie tyle od bezwzględnych stężeń ceram idu
i diacyloglicerolu, ale od ich stosunku [51].
O statn io S a w a i i w s p . w ykazali [52], że w ludz­
kich k o m ó rk ach białaczkow ych H L-60 ceram id in ­
dukuje aktyw acje c-jun/A P-1 we wczesnym etapie
apoptozy. A utorzy udow odnili, że poziom m -R N A
genu c-jun, poziom białka c-Jun i aktyw ność w iązania
AP-1 do fragm entów D N A (wiążących czynnik AP-1
po stym ulacji estram i forbolow ym i) w zrastają p o d
wpływem ceram idu. K u rk u m in a (inhibitor aktyw acji
czynnika AP-1) znosiła zaham ow anie w zrostu k o m ó ­
rek i fragm entację D N A , k tó re obserw ow ano p o d
wpływem ceram idu. P o d o b n ie działały nukleotydy
antysensow ne dla c-jun. W yniki te w skazują, że w k o ­
m ó rk ach H L -60 czynnik transkrypcyjny AP-1 m a
kluczow e znaczenie w przebiegu procesu apoptozy i że
w ew nątrzkom órkow y przekaźnik sfingolipidow y
— ceram id m oduluje przenoszenie sygnału in d u k u ją­
cego apo p to zę poprzez aktyw ację tego czynnika. Z k o ­
lei B r a c h i w s p . [53] w ykazali pow iązanie a k ­
tywacji szlaku sfingom ielinow ego przez T N F i n a ­
g rom adzania ceram idu z pojaw ieniem się aktyw ności
wiążącej czynnika AP-1 w kom órkach.
D ro g a za pośrednictw em której ceram id pow oduje
aktyw ację czynnika transkrypcyjnego AP-1 nie jest do
końca poznana. S pośród wielu kinaz serynow o/treoni-
now ych, kinazy M A P są aktyw ow ane przez ceram id
[54]. O statn io postuluje się istnienie grupy kinaz
aktyw ow anych stresem (SA PK , JN K kinazy lub k in a ­
zy N -k o ń c a białka c-Jun) [55]. W łaśnie te kinazy m ogą
stym ulow ać aktyw ność transkrypcyjną c-jun poprzez
fosforylację N -końcow ych am inokw asów [56]. W y d a­
je się, że ceram id m oże pośredniczyć w przenoszeniu
sygnału do indukcji apo p to zy aktyw ując czynnik
transkrypcyjny AP-1 za pośrednictw em JN K , p o n ie­
waż T N F -a i prom ieniow anie U V zw iększają poziom
ceram idu i aktyw ują kinazy JN K . W yniki te pozw alają
w nioskow ać, że ceram id pośredniczy w reakcjach
stresow ych w kom órkach.
N ajnow sze b ad a n ia w ykazują udział aktyw o w a­
nych przez ceram id kinaz [5 7 ,5 8 ] i fosfatazy białkow ej
[59, 60], k tó re m ogą pośredniczyć w apoptozie stym u­
low anej przez ceram id (Ryc. 2). U dział C A P P został
potw ierdzony w bad an iach W o l f f a i w s p . [61],
którzy wykazali, że kw as okadajow y (inhibitor C A P P)
ham uje ap optozę in d u k o w an ą ceram idem i znosi
ham ow anie ekspresji p ro to o n k o g en u c-myc.
N ależy podkreślić, że pośredniki przenoszenia syg­
nału do ap o p to zy m ogą być różne zależnie od typu
kom órek. W ludzkich neutrofilach trak to w an y ch T N F
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 TNFR 55 Fas/APO-1

Ryc. 2 U dział metabolitów sfingomieliny w postulowanym mechaniźmie przenoszenia sygnału receptorów T N F i Fas/APO -1. Receptor T N F
(TNF-R55), aktywując w błonie komórkowej sfingomielinazę (nSM-azę), powoduje uwolnienie ceramidu, który z kolei aktywuje
specyficzną kinazę białkową (CAPK) inicjującą kaskadę przenoszenia sygnałów od kinazy Raf, przez kinazę M A PK (MEK) lub kinazy
aktywowane strestem (SAPK), do kinazy M A P (MAPK). M A PK stymuluje aktywność fosfolipazy A 2 (PLA 2) oraz czynników
transkrypcji AP-1 i NFkB, stymulujących proliferację i apoptozę. Ceramid indukuje również aktywność specyficznej fosfatazy białkowej
(CAPP), uczestniczącej w procesie apoptozy. Białko TRADD, homologiczne do domeny śmierci TNF-R55, pośredniczy w apoptozie
oraz aktywacji i translokacji NFkB. Jednocześnie TNF-R55 stymuluje aktywność lizosomalnej aSM-azy przez D AG uwolniony po
aktywacji PC-PLC. Ceramid powstający w tym przedziale komórkowym jest odpowiedzialny za przenoszenie sygnału wyłącznie do
apoptozy. Fas/APO -1 aktywuje również obie sfingomielinazy, ale potwierdzono tylko przenoszenie sygnału do apoptozy (generowanego
analogicznie jak po aktywacji TNF-R55), natom iast nie stwierdzono indukcji ekspresji genów.

[62] sfingozyna in d u k o w ała apoptozę. C eram id i S P P
nie działały w tych ko m órkach. D im etylosfingozyna
i H -7 (inhibitor P K C ) także indukow ały ap optozę co
sugeruje, że zjaw isko to m oże być zw iązane z h am o w a­
niem P K C przez sfinogozynę. W niestym ulow anych
ludzkich neutrofilach stężenie ceram idu jest bardzo
wysokie (ok. 200 pM ) co poddaje w w ątpliw ość
znaczenie egzogennie dodaw anego ceram idu. W ynika
z tego, że w tych k o m ó rk ach endogennym m o d u la to ­
rem pośredniczącym w yw oływ aniu ap o p to zy przez
T N F m oże być sfingozyna.
IY. Wpływ sfingozyno-l-P na ruchliwość
komórek nowotworowych
Ze w zględu n a fakt, że S P P pod o b n ie ja k czynniki
w zrostu, zw iększa poziom w apnia i kw asu fosfatydo-
wego w ko m ó rk ach , zb ad an o wpływ S P P n a w zrost
i różnicow anie dw óch linii kom órkow ych ra k a piersi:
M C F -7 i M D A -M B -231 [63]. K o m ó rk i M C F -7
m ają funkcjonujące receptory estrogenow e i in
vitro ich w zrost zależy od estrogenu, zaś kom órki
M D A -M B-231 nie m ają takich receptorów i są oporne
n a działanie antyestrogenów [64]. S P P w stężeniu
1-10 pM ham ow ał w zrost kom órek obu linii. P o d
wpływem S P P kom órki M D A -M B-231 zm ieniały fe­
notyp n a bardziej praw idłow y i charakteryzow ały się
zm niejszoną znacznie inw azyjnością [63]. Sfingozyna
nie m iała wpływu n a te cechy. W yniki b ad a ń nad
wpływem S P P n a ruchliw ość chem otaktyczną i in-
wazyjność kilku linii kom órkow ych, mysiego i ludz­
kiego czerniaka oraz ludzkiego kostniakom ięsaka d o ­
w odzą ham ującego wpływu S P P n a inw azyjność k o ­
m órek now otw orow ych. Z drugiej strony, S P P nie
w pływał n a ruchliw ość ludzkich kom órek śródbłon k a
i w łókniakom ięsaka [65]. Zreferow ane wyżej wyniki
b ad a ń n ad pozytyw nym oddziaływ aniem S P P z k o ­
m órkam i niektórych linii now otw orow ych sugerują, że
ta nietoksyczna ufosforylow ana p o ch o d n a sfinogozy-
ny m oże zm niejszać inw azyjność now otw orów . Takie
działanie p ośrednika sfingom ielinow ego szlaku prze­
syłania sygnału m oże otw ierać now e m ożliwości tera-

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 303

 pii przeciw no w otw orow ej.
V. Regulacja homeostazy wapniowej w komór­
ce przez metabolity sfingomieliny
R egulacja m obilizacji w ew nątrzkom órkow ego
C a2+ należy niew ątpliw ie do istotnych oddziaływ ań
m etabolitów sfingomieliny, k tó re m ogą mieć znaczenie
dla procesów fizjologicznych i patologicznych [8].
Liczne b ad a n ia p rzeprow adzone n a różnych m ode­
lach: izolow anych kom órkach, uprzepuszczalnianych
k o m ó rk ach i izolow anych pęcherzykach retikulum
endoplazm atycznego wskazywały, że sfingozyna m oże
działać n a m obilizację jo n ó w C a 2+ zarów no przez
aktyw ację fosfolipazy C i hydrolizę fosforanów fos-
fatydyloinozytolu [66] ja k i bez w łączania tego m echa­
nizm u [67, 68].
Najw cześniej u stalono rolę egzogennej sfingozyny
w uw alnianiu jo n ó w w apnia z w ew nętrzkom órkow ej
puli zarów no zależnej ja k i niezależnej od I P 3 [p raca
przeglądow a: 69] oraz w ham ow aniu napływ u C a2 +
przez błonę k o m ó rk o w ą [70]. D ziałanie to m oże być
realizow ane poprzez stym ulację m etabolizm u fosfora­
nów fosfatydyloinozytolu i nagrom adzanie I P 3 [60]
lub przez ufosforylow any p ro d u k t sfingozyny, S PP,
ja k to stw ierdzono w hodow li kom órek m ięśni gład­
kich uprzepuszczalnianych sap o n in ą [40]. T a o statn ia
dro g a jest niezależna od hydrolizy fosforanów fosfa­
tydyloinozytolu i uw alniania kw asu arachidonow ego
[66, 71], jak kolw iek kilku badaczy uzyskało dane, że
egzogenny S P P m oże pow odow ać produkcję I P 3 [72].
Być m oże S P P działa bezpośrednio n a kanały w ap­
niow e pozostające p od k o n tro lą receptorów rianidy-
now ych lub I P 3 [71].
B adacze z grupy S a b b a d i n i e g o wykazali, że
w stężeniu su b m ik rom olarnym sfingozyna ham uje
uw alnianie C a 2+ z błon retikulum sarkoplazm atycz-
nego (SR) mięśni szkieletow ych w w yniku oddziaływ a­
n ia n a recep to r rianidynow y, zm niejszając jego pow i­
n ow actw a do rianidyny, bez udziału fosforylacji tego
receptora. Sfingozyna pow odow ała rów nież w yraźne
ham ow anie u w alniania w apnia p o d wpływem fizjo­
logicznych czynników stym ulujących. W wyższych
stężeniach zarów no sfingozyna ja k i SPC indukow ały
bezpośrednio uw alnianie w apnia z SR [73]. Jest m oż­
liwe, że sfingozyna stanow i fizjologiczny regulator
p oziom u w ap n ia w sercu.
R ów nież SPC jest silnie działającym czynnikiem
uw alniającym jo n y w apnia z w ew nątrzkom órkow ej
puli zależnej od I P 3 [40]. W k o m ó rk ach Swiss 3T3
D e s a i i w s p . [31] nie stwierdzili akum ulacji
inozytolofosforanów po stym ulacji przez SPC. Inni
au to rzy jed n ak w ykazali [72], że w k o m ó rk ach H L-60
SPC w daw ce poniżej 30 pM aktyw uje fosfolipazę C,
p o w odując następnie m obilizację C a 2 + . Sfingozyno-
1-P działa p raw d o p o d o b n ie poprzez niezidentyfiko­
w any jeszcze recep to r sprzężony z białkiem lub biał­
kam i G ham ow anym i to ksyną ksztuśca.
304
http://rcin.org.pl
W ydaje się, że drogi uw alniania w ew nątrzk o m ó r­
kow ego C a 2+ przez sfingozynę, S P P i SPC są różne,
zależnie od rodzaju kom órek i stopnia ich zróżnicow a­
nia. O k a j i m a i K o n d o [72] w ysuw ają hipotezę,
że tylko w niezróżnicow anych ko m ó rk ach SPC działa
poprzez aktyw ację fosfolipazy C. N ależy zaznaczyć, że
jakkolw iek SPC m oże być p ro d u k o w a n a w pew nych
w aru n k ach experym entalnych oraz w patologii np.
w śledzionie chorych z syndrom em N iem ann -P ick a
oraz w k o m ó rk ach now otw orow ych [31], nie po tw ier­
dzono n ag ro m ad zan ia tego zw iązku w w aru n k ach
fizjologicznych.
N ależy zaznaczyć, że nie znaleziono wpływu ceram i­
du ani n a uw alnianie w apnia ani n a akum ulację I P 3
w k o m ó rk ach [66]. N a to m iast stw ierdzono, że cera-
m id oraz S P P i SPC h am u ją w zrost w ew nątrzk o m ó r­
kow ego [C a 2 + ] i w yw oływ anego aktyw acją recep to ra
E G F w ludzkich k o m ó rk ach A431, co sugeruje, że
odpow iedź n a sygnał E G F m oże być m odulo w an a
przez sfingolipidow e w tórne przekaźniki sygnału [74].
M echanizm uw alniania C a 2+ z puli w ew nątrzk o ­
m órkow ej przez sfingolipidy nie jest jeszcze w yjaś­
niony. W yniki O k a j i m a i K o n d o [72] sugerują,
że SPC pow oduje w zrost cytosolow ego C a2+ na
drodze m echanizm u włączającego aktyw ację P L C
poprzez receptor sprzężony z w rażliw ym n a toksynę
ksztuśca białkiem G. O statn io K i n d m a n i w s p .
[69] opisali now y rodzaj k an ału w apniow ego zależ­
nego od sfingolipidów i zlokalizow anego w endoplaz-
m atycznym retikulum kom órek bazocytow ej białaczki
szczura oraz w ludzkich k o m ó rk ach śródbłonkow ych
[75, 76].
VI. Rola metabolitów sfingomieliny w przeno­
szeniu sygnałów cytokin i czynników
wzrostu w komórkach
Isto tn e dla rozw oju b ad a ń n ad sfingom ieliną prace
O k a z a k i e g o i w s p . [1, 12] wykazały, że ró ż ­
nicow anie kom órek ludzkiej białaczki prom ielocyto-
wej H L -60 pod wpływem 1-a, 25-dihydroksyw itam iny
D 3 zachodzi ze w zrostem poziom u ceram idu i SPC
w w yniku stym ulacji nSM -azy. K i m i w s p . p rzeb a­
dali następnie wpływ innych czynników indukujących
różnicow anie kom órek H L-60, co doprow adziło do
odkrycia, że m etabolizm sfingom ieliny m oże być w aż­
nym m echanizm em pośredniczącym w przekazyw aniu
sygnału T N F -a i IN F -y w procesie różnicow ania
kom órek. Procesow i tem u tow arzyszyło ham ow anie
ekspresji m R N A dla p ro to o n k o g en u c-myc.
O statn ie b ad a n ia dostarczają coraz więcej danych
dotyczących w yjaśnienia m echanizm u przenoszenia
sygnału cytokin w k o m ó rk ach docelowych. Dwie
cytokiny IL-1 i T N F -a , w ykazujące plejotropow e
działanie o podo b n y m i nakładającym się zakresie
oddziaływ ań biologicznych, pow odują szybkie i przej­
ściowe tw orzenie dw u w tórnych lipidow ych p rzek aź­
ników sygnałów: diacyloglicerolu produkow an eg o
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 przez specyficzną dla fosfatydylocholiny fosfolipazę
C (P C -P L C ) i ceram idu, tw orzonego przez dwie różne
sfingomielinazy: nSM -azę, zlokalizow aną w błonie
kom órkow ej i aSM -azę, zlokalizow aną w lizosom ach
i endosom ach [p ra c a przeglądow a: 77].
D o najlepiej p oznanych należy niew ątpliw ie udział
sfingom ielinaz i ich m etabolitów w przenoszeniu syg­
nału przez receptory należące do grupy receptorów
czynnika m artw icy no w o tw orów (TN F). Schem at tych
reakcji jest p o k azan y n a rycinie 2.
C zynnik m artw icy n o w otw orów indukuje w zrost
i różnicow anie wielu rodzajów ko m ó rek oraz jest
ważnym p arak ry n n y m i endokrynnym m o d u lato rem
reakcji zapalnych i im m unologicznych. P ow oduje
rów nież nekrozę pew nych typów now otw orów i jest
cytotoksyczny w sposób synerergistyczny z IN F -y dla
wielu ko m ó rek now otw orow ych in vitro. Jest też
jednym z czynników w yw ołujących apoptozę [prace
przeglądowe: 78, 79]. P lejotropow e działanie T N F
w procesach im m unologicznych i zapalnych spraw ia,
że jest on w ażnym czynnikiem w patogenezie wielu
chorób. P o znanie m echanizm ów przekazyw ania syg­
nałów przez tę cytokinę jest więc istotne nie tylko ze
względów poznaw czych, ale także ja k o istotny elem ent
terapii ch o ró b autoim m unologicznych i raka.
VI-1. Receptory dla TNF
R eceptory d la T N F w ystępują w błonach k o m ó r­
kow ych praw ie w szystkich jąd rzasty ch kom órek.
S charakteryzow ano i sklonow ano dw a różne typy
receptorów dla T N F [prace przeglądow e: 79, 80].
R eceptory T N F -R 5 5 i T N F -R 75 różnią się m asą
cząsteczkow ą i stałą dysocjacji dla T N F , której w a rto ­
ści w ynoszą odpow iednio 500 pM i 100 pM . E kspresja
genów kodujących te receptory jest w różny sposób
regulow ana i niska ko n sty tucyjna ekspresja T N F -R 55
i indu k o w an a ekspresja T N F -R 75 p row adzą do zróż­
nicow anych odpow iedzi fizjologicznych. Biologicznie
czynną form ą T N F są jego trim ery. A ktyw acja obu
receptorów zachodzi poprzez ich oligom eryzację po
przyłączeniu h o m o trim eru T N F -a lub T N F -(3 (lim-
fotoksyny-a). O bie cytokiny aktyw ują obydw a typy
receptorów T N F , po czym następuje szybka in ter­
nalizacja i d eg radacja tych kom pleksów w en d o so ­
m ach. T N F -R 7 5 w ykazuje p o d o b n ą aktyw ność bio­
logiczną ja k T N F -R 55, zw łaszcza w k o m ó rk ach T i k o ­
m órkach ze zw iększoną ekspresją białka p75, ale
w większości k o m ó rek ro la T N F -R 75 polega n a
w iązaniu T N F i przekazyw aniu tego ligandu n a recep­
to r T N F -R 55, ch arakteryzujący się m niejszym pow i­
now actw em do ligandu. Stw ierdzono w ystępow anie
specyficznych regionów receptorów T N F odpow ie­
dzialnych za w ytw arzanie różnych sygnałów. R egion
błonow y recep to ra pow oduje aktyw ację nS M -azy p ro ­
w adzącą do aktyw acji „ukierunkow anych p ro lin ą”,
serynow o/treoninow ych kinaz białkow ych (P D P
— proline directed protein kinases), pow odujących
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl
aktyw ację kinazy Raf, fosfolipazy A2 i czynnika tra n s­
krypcji AP-1 [81, 82]. Z kolei odcinek około 80
am inokw asów końca C receptora, tzw. dom ena syg­
nału śmierci, jest odpow iedzialny za sygnał pro w ad zą­
cy do cytotoksyczności i apo p to zy [83, 84], stym ulacji
syntezy N O i p raw dopodobnie do aktyw acji aSM -azy
i czynnika transkrypcji N F k B [81].
O statn io opisano białka, nazw ane F A D D i T R A D D
zaw ierające dom eny hom ologiczne w obec dom en
śmierci w receptorach odpow iednio F as/A P O -1
i T N F-R 55.
Zwiększenie ekspresji T R A D D indukuje apoptozę
i aktyw uje N F k B, c o spraw ia, że białko to jest uw ażane
za ogniwo sygnału T N F -R 55 dla o b u tych procesów
[p raca przeglądow a: 85].
VI-2. Receptor Fas/APO-1
B łonowy receptor F as/A P O -1 należy do rodziny
receptorów T N F i posiada hom ologiczny region w czę­
ści zawierającej dom enę śmierci, analogicznie do T N F -
R55, k tó ry generuje sygnał do apoptozy [83]. R eceptor
F as/A P O -1 jest jednym z najistotniejszych czynników
regulacji czynności u k ładu im m unologicznego, ponie­
waż um ożliw ia on ograniczenie w zrostu klonów i n a ­
grom adzania lim focytów po w niknięciu antygenu do
narządów limfatycznych. Jest on rów nież odpow ie­
dzialny za procesy elim inacji, przez ko m ó rk i w yposa­
żone w ligandy dla tego receptora, zaktyw ow anych
i proliferujących lim focytów obw odow ych, a także
kom órek, k tó re uległy transform acji now otw orow ej
lub infekcji wirusowej [86]. P o d o b n ie ja k w p rzypadk u
T N F -R 55, aktyw acja F a s/A P O -l-R przez ligandy m o ­
że rów nież prow adzić do aktyw acji kom órek [87].
VI-3. Różne drogi przenoszenia sygnału pocho­
dzącego od nSM-azy i aSM-azy
W yróżnienie regionów T N F -R 55 odpow iedzialnych
za aktyw ację nSM -azy i aSM -azy i ró żn a lokalizacja
tych enzym ów w kom órce sugeruje różne funkcje tych
dw u enzym ów w przenoszeniu sygnału T N F -R 55, co
znalazło potw ierdzenia w bad an iach W i e g m a n n a
i w s p. [81]. Z grom adzone obecnie dane pozw oliły na
zaproponow anie sekwencji reakcji zilustrow anych na
rycinie 2.
P o aktyw acji nSM -azy pow stający ceram id aktyw u ­
je zw iązaną z błonam i specyficzną kinazę białkow ą
(CAPK), k tó ra fosforyluje receptor nabłonkow ego
czynnika w zrostu (EG F-R ) w k o m ó rk ach A431 [88].
W zrost aktyw ności tej kinazy obserw ow ano również
w pierw szych m inutach po podziałaniu T N F -a na
kom órki HL-60. Szybka aktyw acja, zdolność a n a lo ­
gów ceram idu do w yw oływ ania efektów ligandu oraz
rekonstytucja kaskady reakcji w układzie bezkom ór-
kow ym pozw oliły uznać ten szlak sfingom ielinow y za
isto tn ą drogę przenoszenia sygnału pochodzącego od
T N F [4]. C A P K należy do grupy kinaz P D P , które
305
 fosforylują fragm ent X -S er/T re-P ro-X substratu. D o
grupy tej należą rów nież kinazy M A P (M A PK ) i k in a ­
zy cdc2. C A P K w ym aga do fosforylacji najm niejszego
fragm entu zaw ierającego L eu-T re-P ro [89, 90].
Rów nocześnie w ykazano, że T N F -a aktyw uje k in a­
zę M A P w fibroblastach [91], a w k o m ó rk ach H L-60
trak to w an y ch sfingom ieliną lub ceram idem dochodzi
do fosforylacji i aktyw acji kinazy p42 M A P [54].
K inazy M A P są kinazam i serynow o/treoninow ym i,
k tó re odgryw ają w ażną rolę w przenoszeniu sygnału
m itogennego pochodzącego od wielu receptorów sty­
m ulow anych przez różne ligandy, w łączając w to
kinazy tyrozynow e receptorów i receptory sprzężone
z białkiem G. K inazy M A P, do których należą n aj­
lepiej p o znane 42 k D a E R K I czyli p42 M A P K i
44 k D a E R K 2 czyli p44 M A P K , są aktyw ow ane na
skutek fosforylacji reszt tyrozyny i treoniny przez
specyficzne kinazy M A P K : M E K 1 i M E K 2. Z kolei
kinazy M E K są regulow ane przez fosforylację seryny
w ich cząsteczce przez kinazy kinazy M E K i kinazę
Raf. Z różnicow anie kinaz kinazy M E K uw aża się za
główny czynnik um ożliw iający zróżnicow anie dróg
sygnałow ych prow adzących do M A P K [92-94].
W następnych b ad an iach stw ierdzono, że stym ula­
cja ko m ó rek H L -60 przez T N F pow oduje w przeciągu
sekund fosforylację kinazy Raf, kinazy serynow o/treo-
ninowej, k tó ra bierze udział w przenoszeniu sygnału
m itogennych cytokin, co sugeruje, że R af m oże po śred ­
niczyć w przenoszeniu sygnału generow anego przez tę
cytokinę [82]. P o d o b n y efekt uzyskano działając na
k o m ó rk i ceram idem lub sfingom ielinazą. G ru p a K o -
l e ś n i c k a w ykazała, że C A P K tw orzy kom pleks
z R af i fosforyluje tą kinazę pow odując w zrost jej
aktyw ności w obec M E K kinazy w k o m ó rk ach HL-60.
W ten sposób d ro g a przenoszenia sygnału sfingomieli-
now ego została pow iązana ze szlakiem M A P K [95].
B e l k a i w s p. [82] uzyskali w yniki sugerujące, że
nSM -aza, a nie aS M -aza, bierze udział w wywoływanej
przez T N F -a fosforylacji i aktyw acji kinazy Raf.
K in aza M A P z kolei fosforyluje i aktyw uje cyto-
solow ą fosfolipazę A2 [96] w odpow iedzi n a ceram id
utw orzony przez nSM -azę [81]. A ktyw acja P L A 2
wydaje się być odpow iedzialna za nagrom adzanie
kw asu arachidonow ego i jego m etabolitów , leuko-
trienów i prostag lan d yn, pow odujących reakcje zapal­
ne w w yniku działania T N F .
B ad an ia in vitro w pływ u ceram idu n a fosforylację
białek doprow adziły do w ykrycia serynow o/treonino-
wej fosfatazy białkow ej (C A PP) aktyw ow anej bezpo­
średnio i w specyficzny sposób przez ceram id [59].
F osfataza ta należy do grupy fofataz P P 2A w skład
któ ry ch w chodzą trzy podjednostki: A — o nieziden­
tyfikowanej funkcji, B — regulatorow ej i C — k atality ­
cznej, m ogących w ystępow ać w form ie m ono-di-, lub
trim eru. C eram id aktyw uje wyłącznie form ę trim eru
działając n a p o d jed nostkę B. C A P P jest ham ow ana
przez niskie stężenia kw asu okadaj owego, specyficz­
nego in h ib ito ra tego typu fosfataz [60]. N an o m o larn e
306
http://rcin.org.pl
stężenia kw asu okadaj owego pow odują zaham ow anie
wywoływanej przez ceram id apo p to zy i ekspresji c-
m yc w k o m ó rk ach HL-60, podobnie ja k to ob ser­
w ow ano po trak to w a n iu T N F -a , co potw ierdza rolę
C A P P w tych procesach [61].
M etabolity sfingom ieliny b io rą rów nież udział
w przenoszeniu sygnału do aktyw acji i translokacji
czynnika transkrypcji N F k B. K r o n k e i w s p . [97]
wykazali, że egzogenna sfingom ielinaza i ceram id
pow oduje degradację I- k B, fizjologicznego in h ib ito ra
N F k B i aktyw ację tego czynnika transkrypcji. N ie jest
jasn e czy aktyw acja kinazy R af w ystarcza do aktyw acji
i translokacji N F k B ja k to sugerow ały b ad a n ia
F i n c o i B a l d w i n a [98]. O statn io uzys­
kan o dane św iadczące o tym, że ceram id n ag ro m ad zo ­
ny w k o m ó rk ach w w yniku aktyw acji aSM -azy przez
D A G , utw orzony przez zaktyw ow aną P C -P L C , jest
odpow iedzialny za aktyw ację N F k B. A ktyw acja aSM -
azy jest zależna od tej samej dom eny receptora, k tó ra
jest odpow iedzialna za aktyw ację P C -P L C [81]. A u to ­
rzy ci sugerują, że aktyw acja aS M -azy zachodzi w en-
dosom ach, w których znajduje się D A G utw orzony po
aktyw acji P C -P L C i internalizow any razem z T N F -
R55.
C o raz więcej danych dotyczy w ystępow ania nowej
drogi przenoszenia sygnału, k tó ra jest specyficznie
w łączana w odpow iedzi n a stres np. pod wpływem
T N F lub uszkodzenie tk an ek w w yniku hipoksji,
prom ieniow ania U Y czy chem ioterapii. C zynniki te
aktyw ują zarów no nSM -azę i aSM -azę ja k i ak ty w o ­
wane stresem kinazy białkow e (SAPK, JN K ). W e s t -
w i e k i w s p . [99, 100] wykazali aktyw ację S A PK
przez T N F , co pow oduje stym ulację zależnej od AP-1
transkrypcji genów i indukcję translokacji N F k B do
ją d ra i transkrypcji genów zależnych od tego czynnika.
P otencjalnym pośrednikiem tych procesów jest cera­
m id pow stający w w yniku aktyw acji sfinogom ielinaz.
S tw ierdzono n ato m iast tylko niew ielką stym ulację
aktyw ności M A P K przez T N F -a i ham ow anie tych
kinaz przez ceram id [100].
S tosunkow o mniej danych dotyczy udziału sfin-
golipidów w przenoszeniu sygnału F as/A P O -1 . C i -
f o n e i w s p . [101] wykazali aktyw ację nSM -azy,
aSM -azy, P L A 2 i P C P L C po stym ulacji F as/A P O -1
i udział ceram idu w inicjacji ap optozy przez ten
receptor. U zyskano rów nież dane o aktyw acji kinazy
M A P i udziale kinazy R af w tym procesie [101].
N a to m iast nie udało się stwierdzić aktyw acji N F k B
przez sygnał F as/A P O -1 [102]. W ydaje się, że sygnał
recep to ra F as/A P O -1 do apoptozy przenoszony przez
ceram id nie w ym aga i nie jest zależny od ekspresji
genów [103].
VI-4. Receptor PDGF
B adania przeprow adzone przez K e s t e r a i w s p .
[104] w skazują n a pow iązanie sfingozyny z procesem
m itozy niezależnym od kinazy białkow ej C. N a m odelu
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 in vitro ko m ó rek m ezangialnych oraz w układzie PDGF
bezkom órkow ym w ykazano, że płytkow y czynnik
w zrostu stym uluje tw orzenie m itogennych m etab o li­
tów sfingolipidów poprzez aktyw ację ceram idazy dzia­
łającej w zasadow ym zakresie pH , degradującej cera-
midy, oraz sfingom ielinazy dostarczającej ceram idu,
podczas gdy cytokiny IL-1 i T N F -a aktyw ują sfin-
gom ielinazę p o zostając bez wpływu n a ceram idazę
[104]. A u to ro m tym udało się uzyskać oddzielenie
zależnej od czynnika w zrostu m itogenezy od p o w o d o ­
w anych przez cytokiny różnicow ania i ap o p to zy k o ­
m órek, zależnie od ro d zaju m etab o litu sfingolipidow e-
go nagro m ad zan eg o w w yniku specyficznej aktyw acji
odpow iednich enzym ów szlaku sfingom ielinowego.
W yniki O l i v e r a i S p i e g e l [105] pokazały, że
P D G F pow oduje gw ałtow ny i przejściow y w zrost
poziom u sfingozyny i S P P w fibroblastach Swiss 3T3,
podczas gdy nie obserw ow ano tych zm ian w obecności
E G F . A u torki stw ierdziły przejściowy w zrost aktyw ­
ności cytosolowej kinazy sfingozynowej, co w k o nsek­
wencji reguluje w ew nątrzkom órkow y poziom S P P
i potw ierdza rolę tego czynnika w przenoszeniu syg­
nału P D G F (Ryc. 4). R ów nież w k o m ó rk ach m ięśni
gładkich naczyń P D G F podnosi poziom sfinogozyny
przy rów noczesnym obniżeniu w ew nątrzkom órkow e­
go poziom u ceram idu. P o n a d to L-cykloseryna, in­
h ibito r syntezy sfingolipidów , a także D L -treo-dihyd-
rosfingozyna, in h ib ito r kinazy sfingozynowej h am ują Ryc. 3 Udział m etabolitów sfingomieliny w przenoszeniu sygnału
indukowanego aktywacją receptora PD G F. Przyłączenie
stym ulow aną przez P D G F syntezę D N A , pozostając
P D G F do receptora powoduje fosforylację tyrozyny białka
bez w pływu n a prolifercję ko m ó rek w yw oływ aną E G F receptorowego, co umożliwia przyłączenie białek ad ap te ro­
[106]. Z b ad a ń S u i w s p . [107] wynika, że S P P wych Grb2, fosfolipazy C.f (PLCy) i białka aktywującego
G TP-azę (GAP). W iązanie G rb2 prowadzi do aktywacji
indukuje syntezę D N A i podziały kom órkow e przez układu Ras i rozpoczyna kaskadę kinaz białkowych od
aktyw ację czynnika transkrypcyjnego AP-1. In h ib ito r kinazy Raf do M APK, powodując aktywację czynnika
kinazy sfingozynowej (D L -treo-dihydrosfingozyna) transkrypcyjnego AP-1. Jednocześnie P D G F -R aktywuje
fosfolipazę D (PLD), kinazę sfingozynową (SPK), która
znosił zdolność w iązania AP-1 do D N A . S P P p o w o d u ­ katalizuje powstanie sflngozyno-l-P (SPP). SPP również
je rów nież gw ałtow ny w zrost stężenia kw asu fosfa- aktywuje PLD, powodując nagrom adzenie kwasu fosfaty-
tydow ego oraz w zrost stężenia w ew nątrzkom órkow e­ dowego (PA), prowadzące do wzrostu cytosolowego stęże­
nia wapnia, niezależnie od inozytolotrisfosforanu (IP 3) gro­
go w apnia [C a 2+]¡, ja k to zostało opisane wcześniej.
madzonego w wyniku aktywacji PL C r SPP hamuje także
Kw as fosfatydow y jest w ażnym ak tyw atorem Ras polimeryzację aktyny w kom órkach nowotworowych.
[108] i k ask ad y kinaz M A P, a także stym uluje zdol­
ność AP-1 do w iązania D N A [107]. P ro p o n o w an y tyrozynow ych. O bserw acja ta stanow i p u n k t wyjścia
przez S p i e g e l i w s p. [8] schem at udziału m etabo- do spekulacji n a tem at różnorodnych odpow iedzi
liów sfingom ieliny w przenoszeniu sygnału P D G F jest kom órek n a działanie czynników w zrostu i cytokin.
p okazan y n a rycinie 3.
O statn io H u d s o n i w s p . [74] wykazali, że VII. Uwagi końcowe
w ludzkich k o m ó rk ach ra k a n ask ó rk a A431 sfin-
gozyna nie m a w pływu n a w ew nątrzkom órkow e stęże­ P odsum ow ując, m ożna stwierdzić, że sfingozyna,
nie w olnego w apnia [C a 2+] ; n ato m iast znacznie sty­ S P P i ceram idy posiadają właściwości predestynujące
m uluje napływ w apnia stym ulow any przez E G F . T o ­ je do roli w tórnych pośredników przekazyw ania syg­
warzyszy tem u fosforylacja reszt serynow ych dw u nału pom iędzy b łoną kom órkow ą, w której są zlokali­
niezidentyfikow anych białek, k tó re praw d o p o d o b n ie zow ane receptory czynników w zrostu i cytokin, pulą
są w łączone w przenoszenie sygnału receptora E G F . w ew nątrzkom órkow ego w apnia, kaskadam i kinaz
Inni badacze stwierdzili, że ceram id stym uluje fos­ i fosfataz białkow ych i czynnikam i regulującym i eks­
forylację recep to ra E G F w tych sam ych kom órkach, presję genów w procesach prow adzących do podzia­
co sugeruje udział ceram idu w tym procesie [109]. łów, różnicow ania i apoptozy kom órek. M etabolity
B adan ia K e s t e r a i w s p . [104] sugerują, że P D G F sfingom ieliny wyw ołują zróżnicow ane odpow iedzi k o ­
stym uluje nSM -azę w m ezangialnych k o m ó rk ach kłę­ m órkow e, w ystępują w kom órce w niskich stężeniach,
bkow ych nerek szczura poprzez fosforylację reszt które po stym ulacji ulegają gw ałtow nem u i przejś­

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 307

 ciow em u podw yższeniu pow odując uw alnianie w ap­
nia z puli w ew nątrzkom órkow ej przez m echanizm
niezależny od I P 3, aktyw ację P D P kinaz i specyficznej
fosfatazy oraz czynników transkrypcji. M ogą one rów ­
nież w zm acniać lub osłabiać kaskadę reakcji poprzez
efekt pozytyw nej lub negatyw nej k o n tro li zw rotnej.
A rty k u ł otrzym ano 25 kwietnia 1996 r.
Z aakceptow ano do druku 16 maja 1996 r.
Piśmiennictwo
1. O k a z a k i T, B e l l R M, H a n n u n Y A (1989) J Biol Chem
264: 19076-19080
2. K im M Y , L i n a r d i c C, O b e i d L, H a n n u n Y (1991)
J Biol Chem 266: 484-489
3. H a n n u n Y A (1994) J Biol Chem 269: 3125-3138
4. K o l e s n i c k R N, G o l d e D W (1994) Cell 77: 325-328
5. B e y a e r t R, F i e r s W (1994) FEBS L ett 340: 9-16
6 . K w i a t k o w s k a J (1994) Post Biochem 40: 130-134
7. R a k o w s k a M, Z b o r o w s k i J (1992) Post Biol Kom 19:
369-384
8 . S p i e g e l S, M i l s t i e n S (1995) J Membrane Biol 146:
225-237
9. M a t h i a s S K o l e s n i c k R N (1993) Adv Lipid Res 25:
65-90
10. H a n n u n N Y , B e l l R M (1989) Science 243: 500-507
11. K o v a l M, P a g a n o R M (1991) Biochim Biophys Acta 1082:
113-125
12. O k a z a k i T, B i e l a w s k a A, B e l l R M, H a n n u n Y A
(1990) J Biol Chem 265: 15823-15831
13. O l i v e r a A, B u c k l e y N E , S p i e g e l S (1992) J Biol Chem
267: 26121-26127
14. W a k i t a H, T o g u r a Y, Y a g i H, N i s h i m u r a K,
F u r u k a w a F, T a g i k a w a M (1994) Arch Dermatol Res
286: 350-354
15. H a n n u n YA, L o o m i s CR, M e r r i l A H Jr , B e l l R M
(1986) J Biol Chem 261: 12604-12609
16. M e r r i l l A H (1991) J Bioenerg Biomembr 23: 83-104
17. H a n n u n YA, B e l l R M (1987) Science 235: 670-674
18. Z h a n g H, B u c k l e y N E , G i b s o n K, S p i e g e l S (1990)
J Biol Chem 265: 78-81
19. D e s a i N N , Z h a n g H, O l i v e r a A, M a t t i e ME ,
S p i e g e l S (1992) J Biol Chem 267: 23122-23128
20. Z h a n g H, D e s a i N N , M u r p h e y J M, S p i e g e l
S (1990) J Biol Chem 265: 21309-21316
21. J a m a l Z, M a r t i n A, M u n o z A G, B r i n d l e y D N
(1991) J Biol Chem 266: 2988-2996
22. Y a m a d a K, S a k a n e F, I m a i S- I , T a k e m u r a
H (1993) Biochim Biophys Acta 1169: 217-224
23. A r n o l d RS, N e w t o n A C (1991) Biochemistry 30: 7747-
7754
24. P u s h k a v e r a MY , K h a n WA, A l e s s e n k o A V, S a -
h y o u n N, H a n n u n Y A (1992) J Biol Chem 267: 15246-
15251
25. I g a r a s h i Y, H a k a m o r i S, T o y o k u n i T, D e a n B,
F u j i t a S, S u i m o t o M, O g a w a T, E l G h e n d y , R a c ­
k e r E (1989) Biochemistry 28: 6796-6800
26. I g a r a s h i Y, K i t a m u r a K, T o y o k u n i T, D e a n B,
F e n d e r s o n B, O g a w a T, H a k a m o r i S (1990) J Biol
Chem 265: 5385-5389
27. Z h a n g H, D e s a i N N , O l i v e r a A, S e k i T, B r o o k e r
G, S p i e g e l S (1991) J Cell Biol 114: 155-167
28. B u e h r e r B M, B e l l R M (1992) J Biol Chem 267: 3154-
3159
29. O l i v e r a A, S p i e g e l S (1993) Nature (Lond) 365: 557-560
30. D e s a i N N , S p i e g e l S (1991) Biochem Biophys Res Comm
181: 361-366
31. D e s a i N N , C a r l s o n R O , M a t t i e M E , O l i v e r a A (19
Buckley NE, S e k i T, B r o o k e r G, S p i e g e l S (1993) J Cell
Biol 121: 1385-1395
32. L a v i e Y, P i t e r m a n O, L i s c o v i t c h M (1990) FEBS
L ett 277: 7-10
308
http://rcin.org.pl
33. S a k a n e F, Y a m a d a K, K a n o c h H (1989) FEBS Lett
255 : 409-413
34. M u r a y a m a T, U i M (1987) J Biol Chem 262: 5522-5529
35. Y u C l, T s a i M H , S t a c e y D W (1988) Cell 52 : 63-11
36. B a r b a c i d M (1981) Annu Rev Biochem 56 : 119-821
37. B e n - A v P, L i s c o v i t c h M (1989) FEB S L ett 259 : 64-66
38. E x t o n J H (1990) J Biol Chem 165: 1-4
39. M u r a y a m a T, U i M (1992) J Biol Chem 267: 12463-12467
40. G h o s h T K, B i a n J, G i 11 D L (1990) Science (WASH. DC)
248: 1653-1656
41. M c C a f f r e y P G , R o s n e r M R (1987) Biochem Biophys
Res Comm 146: 140-146
42. N i z h i z u k a Y (1992) Science 256 : 607-614
43. S i k o r a E (1994) Post Biochem 40: 150-160
44. H a n n u n YA, O b e i d L M (1995) TIB S 20: 73-77
45. J a r v i s W D , K o l e s n i c k R N, F o r n a r i F A, T a y l o r
RS, G e w i r t z DA, G r a n t S (1994) Proc N atl Acad Sei 71:
73-77
46. B i e l a w s k a A, C r a n e H M , L i o t t a D, O b e i d L M,
H a n n u n Y A (1993) J Biol Chem 268: 26226-26232
47. Q u i n t a n s J, K i l k u s J, M c S h a n CL, G o t t s c h a l k
AR, D a w s o n G (1994) Biochem Biophys Res Commun 202:
710-714
48. V a n Y e l d h o v e n P P , M a t t h e w s TJ , B o l o g n e s i
D P, B e 11 R M (1992) Biochem Biophys Res Commun 187:
209-216
49. O b e i d L M i H a n n u n Y A (1995) J Cell Biochem 58:
191-198
50. D b a i b o GS , P u s h k a r e v a MY, J a y a d e v S,
S c h w a r z J K, H o r o w i t z J M, O b e i d L M, H a n n u n
Y A (1995) Proc N atl Acad Sei USA 92 : 1347-1351
51. O b e i d L M, L i n a r d i c C M, K a r o l a k LA, H a n n u n
Y A (1993) Science 258: 1769-1771
52. S a w a i H, O k a z a k i T, Y a m a m o t o H, O k a n o H,
T a k e d a Y, T a s h i m a M, S a w a d a H, O k u m a M,
I s h i k u r a H, U m a h a r a H, D o m a e N (1995) J Biol Chem
270: 27326-27331
53. B r a c h MA , G r u s s H J, S o t t C, H e r r m a n n F (1993)
M ol Cell Biol 13: 4284-4290
54. R a i n e s M A, K o l e s n i c k R N, G o l d e D W (1993) J Biol
Chem 268: 14572-14575
55. D e r i j a r d B, H i b i M, W u I - H, B a r r e t t T, S u B,
D e n g T, K a r i n M, D a v i s R J (1994) Cell 76: 1025-1037
56. M i n d e n A, L i n A, S m e a l T, D e r i j a r d B, C o b b M,
D a v i s R, K a r i n M (1994) M ol Cell Biol 14 : 6683-6688
57. M a t h i a s S , D r e s s i e r K A , K o l e s n i c k R N (1991)Proc
N atl Acad Sei USA 8 8 : 10009-10013
58. L i u J, M a t h i a s S, Y a n g Z, K o l e s n i c k R N (1994)
J Biol Chem 269 : 3047-3052
59. D o b r o w s k y RT, H a n n u n Y A (1992) J Biol Chem 261 :
5048-5051
60. D o b r o w s k y RT, K a m i b a y a s h i C, M u m b y MC ,
H a n n u n Y A (1993) J Biol Chem 268: 15523-15530
61. W o l f f R A, D o b r o w s k y RT, B i e l a w s k a A, O b e i d
L M, H a n n u n Y A (1994) J Biol Chem 269 : 19605-19609
62. O h t a H (1994) FEBS L ett 355: 267-270
63. S p i e g e l S, O l i v e r a A, Z h a n g H, T h o m p s o n E W,
S u Y, B e r g e r A (1994) Breast Cane Res Treatm 31: 337-348
64. L i p p m a n ME , D i c k c o n R B (1989) Rec Prog Horm Res
45 : 383-439
65. S a d a h i r a Y, R u a n F, H a k o m o r i S, I g a r a s h i
Y (1992) Proc N atl Acad Sei USA 89: 9686-9690
6 6 . C h a o C P , L a u l e d e r k i n S J F , B a l l o u L R (1994)JBiol
Chem 269: 5849-5856
67. W o n g K, K w a n Y L (1993) Cell Calcium 14: 493-505
68 . Y u l e DI , W u D, E s s i n g t o n TE, S h a y m a n J A,
W i l i a m s J A (1993) J Biol Chem 268: 12353-12358
69. O l i v e r a A, Z h a n g H, C a r l s o n R O, M a t t i e ME ,
S c h m i d t RR, S p i e g e l S (1994) J Biol Chem 269 : 17924-
17930
70. B r e i t t m a y e r J - P , B e r n a r d A, A u s s e i C (1994) J Biol
Chem 269 : 5054-5058
71. M a t t i e M, B r o o k e r G, S p i e g e l S (1994) J Biol Chem
269 : 3181-3188
72. O k a j i m a F, K o n d o Y (1995) J Biol Chem 270: 26332-
26340
73. S a b b a d i n i RA, B e t t o R, T e r e s i A, F a c h e c h i -
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 - C a s s a n o G, S a l v i a t i G (1992) J Biol Chern 267: 15475-
15484
74 . H u d s o n P L, P e d e r s e n W A, S a l t s m a n WS , L i s -
c o v i t c h M, M a c L a u g h l i n DT , D o n a h o e P K ,
B l u n s z t a j n J K (1994) J Biol Chem 269: 21885-21890
75 . K i n d m a n LA, K i m S, M c D o n a l d TV, G a r d n e r
’ P (1994) J Biol Chem 269: 13088-13091
76. K im S, L a k h a n i V, C o s t a DJ , S h a r a r a Al , F i t z J G,
H u a n g L W, P e t e r s K G , K i n d m a n L A (1995) J Biol
Chem 270: 5266-5269
77. S c h u t z e S, M a c h l e i d t T, K r o n k e M (1994) J Leukoc
Biol 56: 533-541
78. V i l c e k J, L e e T H (1991) J Biol Chem 266: 7313-7316
79 . W a l a j t y s - R o d e E (1995) Kosmos 44: 451-464
80. V a n d e n a b e l l e P, D e c l e r q W, B e y a e r t R, F i e r s
W (1995) Trends in Cell Biology 5: 382-399
81. W i e g m a n n K, S c h u t z e S, M a c h l e i d t T, W i t t e D,
K r o n k e M (1994) Cell 78: 1005-1015
82. B e l k a C, W i e g m a n n K, A d a m D, H o l l a n d R,
N e u l o c h M, H e r r m a n F, K r o n k e M, B r a c h M A
(1995) EM BO J 14: 1156-1165
83. T a r t a g l i a LA, A y r e s T M , W o n g G H W , G o e d d e l
D V (1993) Cell 74: 845-853
84. I t o h N, N a g a t a S (1993) J Biol Chem 268: 10932-10937
85. T e w a r i M, D i x i t V M (1996) Curr Opin Genet Dev 6 : 39-44
86 . N a g a t a S, G o l d s t e i n P (1995) Science 267: 1449-1456
87. A l d e r s o n MR , A r m i t a g e RJ , M a r a s k o w s k y E,
T o u g h T W, R o u x E, S c h o o l e y K, R a m s d e l l F,
L y n c h D H (1993) J Exp M ed 176: 2231-2235
88 . D a v i s R J (1993) J Biol Chem 268: 14553-14556
89. K e n n e l l y PJ , K r e b s E G (1991) J Biol Chem 266:
1555-1558
90. J o s e p h C K , B y u n HS, B i t t m a n R, K o l e s n i c k R N
(1993) J Biol Chem 268: 20002-20006
91. V a n L i n t J, A g o s t i n i s P, V a n d e v o o r d e V, H a e -
g e m a n G, F i e r s W, M e r l e v e d e W, V a n d e n h e e d e
J R (1992) J Biol Chem 267: 17997-17801
92. E g a n SE, G i d d i n g s BW, B r o o k s M W , B u d a y I,
S i z e l a n d A M, W e i n b e r g R A (1993) Nature (Lond)
363: 45-51
93. G a l e N W, K a p l a n S, L o w e n s t e i n EJ , S c h l e s s i n -
g e r J, B a r - S a g i D (1993) Nature (Lond) 363: 88-92
94. R o z a k i s - A d c o c k M, F e r n l e y R, W a d e J, P a w -
s o n T, B o w t e l l D (1993) Nature (Lond) 363: 83-87
95. Y a o B, Z h a n g Y, D e l i k a t S, M a t h i a s S, B a s u S,
K o l e s n i c k R (1995) Nature (Lond) 378: 307-310
96. L i n L L , W a r t m a n n M, L i n AY, K n o p f I L, S e t h A,
D a v i s R J (1993) Cell 72: 269-278
97. M a h l e i d t T, W i e g m a n n K, H e n k e l T, S c h ü t z e S,
B a e u e r l e P, K r ö n k e M (1994) J Biol Chem 269: 13760-
13765
98. F i n k o TS, B a l d w i n AS, J r (1993) J Biol Chem 268:
17676-17679
99. W e s t w i c k J K, W e i t z e l C, M i n d e n A, K a r i n M,
B r e n n e r D A (1994) J Biol Chem 269: 26396-26401
100. W e s t w i c k J K, B i e l a w s k a A, D b a i b o G, H a n n u n
YA, B r e n n e r D A (1996) J Biol Chem 270: 22689-22692
101. C i f o n e M G , R o n c a o l i P, D e M a r i a R, C a m a r d a
G, S a n t o n i A, R u b e r t i G, T e s t i R (1995) EM BO J 14:
5859-5868
102. S c h u l z e - O s t h o f f K , K r a m m e r P, D r o g e W (1994)
EM BO J 13: 4587-4596
103. W o n g G H W , G o e d d e l D V (1994) J Immunol 152:
1751-1755
104. C o r o n e o s E, M a r t i n e z M, M c K e n n a S, K e s t e r
M (1995) J Biol Chem 270: 23305-23309
105. O l i v e r a A, S p i e g e l S (1993) Nature (Lond) 365: 557-560
106. J a k o b s LS, K e s t e r M (1993) Am J Physiol 265: c740-c747
107. S u Y, R o s e n t h a l D, S m u l s o n M, S p i e g e l S (1994)
J Biol Chem 269: 16512-16517
108. T s a i M, Y u C, S t a c e y D W (1990) Science 250: 982-985
109. G o l d k o r n T, D r e s s i e r KA, M u i n d i J, R a d i n NS,
M e n d e l s o h n J, M e n a l d i n o D, L i o t t a D, K o l e s ­
n i c k R N (1991) J Biol Chem 266: 16092-16098

Nagrody Polskiego Tow arzystw a Biochemicznego

w 1996 roku
Z przyjemnością informuję naszych Czytelników o przyznaniu przez Zarząd Główny Towarzystwa:
dorocznej nagrody im. Jakuba Karola Parnasa za najlepszą pracę doświadczalną wykonaną całkowicie
w laboratoriach krajowych i opublikowaną w minionym roku;
dorocznej nagrody im. Bolesława Skarżyńskiego za najlepszy artykuł opublikowany w kwartalniku Postępy
Biochemii w roku poprzednim;
dorocznej nagrody za najlepszy wykład akademicki wygłoszony w b.r. w ramach Konkursu organizowanego
przez Sekcję Dydaktyki P.T. Bioch.;
po raz pierwszy nagrody im. Antoniego Dmochowskiego za szczególne osiągnięcia dydaktyczne w dziedzinie
biochemii.

Nagroda im. J. K. Parnasa:

Kol. Kol. Alicja Wawrzynów i Maciej Żylicz z Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego za pracę
pt. " D ivergent effects of ATP on binding of the DnaK nad DnaJ chaperones to each other, or to
th e ir various native and denaturated protein substrates” , J. Biol. Chem. 270 (33), 19300— 19306,
1995.

Nagroda im. B. Skarżyńskiego:

Kol. Barbara Grzelakowska-Sztabert z Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego w Warszawie za
artykuł pt. „Regulacja cyklu kom órkow ego — udział białkow ych in h ib ito ró w kinaz cyklinozależ-
nych", Post. Bioch. 41 (2), 80— 93, 1995.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 309

http://rcin.org.pl
 Nagroda za wykład akademicki:
Kol. Hanna Czeczot z Katedry i Zakładu Biochemii Akademii Medycznej w Warszawie za wykład pt.
„Biochem ia nasienia".
Kol. Zygmunt Pojda z Wojskowego Instytutu Higieny i Epidemiologii w Warszawie, za wykład pt. „C ytokiny
w regulacji odpow iedzi układu krw io tw ó rczeg o ".

Laureaci konkursu na najlepszy wykład akademicki w roku 1996: dr Hanna Czeczot, prof. dr hab. Zygmunt Pojda.

Nagroda im. A. Dmochowskiego:

Kol. Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz z Uniwersytetu Łódzkiego za podręcznik pt. „C ytob iochem ia",
opublikowany w 1995 r. przez PWN.
Kol. Grzegorz Bartosz z Uniwersytetu Łódzkiego za podręcznik pt. „ D w a oblicza tle n u " opublikowany
w 1995 r. przez PWN (wyróżnienie).

Wszystkim Laureatom składamy serdeczne gratulacje i najlepsze życzenia.

Redakcja

SPRAWOZDANIA I KOMUNIKATY

Sprawozdanie z VII Sympozjum Fluorowego

W dniach 26-27 kwietnia 1996 r. odbyło się w Szczecinie siódme sympozjum z cyklu Metabolizm Fluoru
zorganizowane przez Katedrę i Zakład Biochemii i Chemii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie oraz
szczeciński oddział Polskiego Towarzystwa Biochemicznego. W obradach uczestniczyły 64 osoby. Tematem
wiodącym sympozjum była analityka związków fluoru. Po raz pierwszy oprócz części teoretycznej zor­
ganizowano warsztaty będące częścią praktyczną sympozjum.

310 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 Spotkanie rozpoczęło się referatem Prof. dr hab. Zygmunta Machoya pt. „25 lat kompleksowych badań
metabolizmu fluoru w Szczecinie", podsumowującym stan badań prowadzonych w Katedrze Biochemii
i Chemii w Szczecinie oraz omawiającym wcześniej organizowane sympozja fluorowe.
Kolejne referaty dotyczyły analityki związków fluoru. W pierwszym Prof. dr hab. Wojciech Czarnowski
z Katedry Toksykologii AM w Gdańsku, przedstawił różne sposoby przygotowania próbek materiału
biologicznego do analizy fluoru, zagadnienie niezwykle ważne dla tych, którzy zajmują się tą problematyką.
W drugim referacie, przedstawionym przez dr Tadeusza Ogońskiego z Katedry Biochemii i Chemii PAM
w Szczecinie zostały omówione metody stosowane w analityce fluoru ze szczególnym uwzględnieniem
dwóch z nich — potencjometrycznej i chromatografii gazowej — stosowanych rutynowo w PAM
w Szczecinie. Kolejny referat nt. oznaczania fluoru potencjalnie przyswajalnego z żywności wygłosiła dr hab.
Anna Wędzisz z Zakładu Bromatologii IBŚB AM w Łodzi. Część referatową zakończyło wystąpienie mgr
Andrzeja Sudera, przedstawiciela firmy Jenoptik Polska z Poznania, na temat zastosowania wyrobów firmy
Eppendorf w mikroanalityce. Wyroby te (pipety, wyroby polietylenowe) ze względu na bardzo wysoką jakość
oraz dużą niezawodność bardzo dobrze nadają się do prac wymagających wysokiej dokładności dając pełną
gwarancję uzyskania precyzyjnych i powtarzalnych wyników.
W drugiej części sympozjum przedstawiono streszczenia z 17 prac doświadczalnych. Wszystkie prezen­
towane prace zostały uprzednio poddane recenzji oraz ogłoszone drukiem w wydawnictwie pt. „Analityka
związków fluoru" (ISBN 83-86342-19-6) wydanym przez organizatorów pod redakcją Tadeusza Ogoń­
skiego, Doroty Samujło oraz Zygmunta Machoya. Tematyka prezentowanych prac obejmowała zagadnienia
z zakresu biochemii oraz ekologii związków fluoru ze szczególnym uwypukleniem zagadnień metodycznych.
Prace zostały wykonane w następujących ośrodkach akademickich Polski — Gdańsk, Kraków, Lublin, Łódź,
Poznań, Sosnowiec, Szczecin, Tychy.
Sympozjum zgromadziło również wiele osób zainteresowanych aktualnym stanem wiedzy w dziedzinie
badań nad metabolizmem fluoru w Polsce lub uczestnictwem w warsztatach praktycznych w dniu 27 kwietnia
1996 r. Ku zadowoleniu organizatorów w zajęciach praktycznych wzięło udział 20 osób. Uczestnikom
warsztatów przedstawiono zestawy aparatury oraz omówiono sposoby przygotowania próbek do oznaczania
fluoru w materiale biologicznym. Pracownicy Katedry omawiali zasady postępowania analitycznego oraz
prezentowali praktyczne możliwości wykorzystania chromatografii gazowej oraz metod potencjometrycznych
(elektrod fluoroselektywnych) do oznaczania fluoru w różnorodnym materiale biologicznym. W pod­
sumowaniu sympozjum Pracownia Analityki Fluoru Katedry Biochemii i Chemii PAM w Szczecinie, przyjęła
na siebie zobowiązanie okresowego organizowania sympozjów fluorowych oraz utworzenia w Szczecinie
ośrodka koordynującego całokształt prac z zakresu metodyki badań związków fluoru na terenie Polski.

Tadeusz Ogoński
K ierow nik Katedry

SEKCJA K W A S Ó W NUKLEINOW YCH

POLSKIEGO TO W A R Z Y S T W A BIO CHEM ICZNEG O

W grudniu 1995 r. Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, na mój wniosek, powołał do
życia Sekcję Kwasów Nukleinowych. Celem tej inicjatywy jest integracja środowiska badaczy podejmujących
tematykę kwasów nukleinowych, ich funkcji, struktury i właściwości. Powinna to być również płaszczyzna
rzeczowych dyskusji nie tylko teoretycznych ale również szczegółowych problemów warsztatowych. Formą
działalności sekcji będą spotkania i konferencje naukowe organizowane w różnych ośrodkach naukowych.
Będą one dotyczyły różnych aspektów biologii molekularnej kwasów nukleinowych. Będzie to również
platforma prezentacji i promocji młodych biochemików oraz laureatów konkursów organizowanych przez
Polskie Towarzystwo Biochemiczne.
W celu przyspieszenia obiegu informacji otwarta została w sieci Internet strona WWW (Word Wide Web), na
której umieszczane będą wszelkie wiadomości i komunikaty dotyczące aktualnych zamierzeń i działalności
sekcji. Jest możliwość nadsyłania i umieszczania na tej stronie własnych wypowiedzi, uwag i komentarzy na
temat aktualnych zadań badawczych, udoskonaleń technicznych, ciekawych wyników. Jest możliwość
zamieszczania wszelkich sugestii, notatek, informacji o konferencjach, nowych książkach, metodach,
wizytach gości zagranicznych, własnych pracach opublikowanych, seminariach lokalnych oraz wszelkich
innych sprawach, które mogą być interesujące dla biochemików kwasów nukleinowych i nie tylko. Można
podzielić się swoimi przemyśleniami dotyczącymi ogólnych problemów nauki. Materiały te mogą stanowić
podstawę do publikacji na WWW biuletynu informacyjnego naszej sekcji. Strona WWW i jej adres widoczne
są na ryc. 1.

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 311

 F0e Edit View Go Bookmarks Options Directory W indow Help
___
■ .
.<fa O A ft ijjjl
Back
Ili li Ifll i i IM
I Forward' Home Edit R^old Open Find Stop

......
0
¡ \ Location: jhttp: //rose. man. poznan. pl/~rnszyman/skn_ptbio. html
___ ■■■■ i u

Polskie Towarzystwo Biochemiczne

Sekcja Kwasów Nukleinowych

Przewodniczący: Prof, dr hab. Jan Barciszewski

Instytut Chemii Bioorganicznej PA N

Noskowskiego 12/14
61-704 Poznan mk

mm
tel: (061) 52-85-03
fax: (061) 52-05-32
i
Si

e-m a il: jba rcisz(cbibch .poznan.pl

«J

Informuję jednocześnie, że pierwsze spotkanie naukowe już się odbyło. Konferencja miała na celu
podkreślenie ważności i uczczenie 30 rocznicy odkrycia kodu genetycznego. Oprócz referatów dotyczących
problemów rozpoznawania kwasów nukleinowych i białek, które wygłosili: Dr hab. G. Węgrzyn, Prof. dr hab.
R. Adamiak, Dr hab. J. Zakrzewska-Czerwińska, Prof. dr hab. T. Twardowski, Dr hab. Z. Szweykowska-
Kulińska, Doc. dr hab. K. Szyfteri Dr A. Przykorska, odbyła się sesja otwarta, w której każdy z uczestników mógł
w ciągu 5 minut przedstawić własne wyniki badawcze. W sesji tej wystąpili: Doc. dr hab. W. Baer-Dubowska,
Prof. dr hab. R. Oliński, Prof. dr hab. A. Małkiewicz, Dr M. Figlerowicz, Mgr M. Oczkowski, Mgr K. Lesniewicz
i Mgr W. Kaczmarek.
Zapraszam do czytania stron WWW.

Jan Bar c i szewski

Uprzejmie informujemy, że nasze pismo Acta Biochimica

Polonicajest indeksowane przez Biochemistry &Biophy­
sics Citation Index (ISI, U.S.A.), BIOSIS (U.S.A.), Chemi­
cal Abstract (Columbus, U.S.A.), Current Awareness in
Biological Sciences (England), Excerpta Medica (Else­
vier, Holland), Medline (U.S.A.).

312 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
 SEKCJA M IK R O SK O PII ELEKTRONOWEJ
i
O DDZIAŁ POZNAŃSKI T O W A R Z Y S T W A PATOLOGÓW

organizują Sympozjum Mikroskopii Elektronowej. Odbędzie się ono 6 grudnia 1996 r. w Katedrze i Zakładzie
Patomorfologii Klinicznej A.M. w Poznaniu, ul. Przybyszewskiego 49. Planujemy sympozjum jednodniowe
w godzinach od 9.00 do 17.00.
Tematem przewodnim będą; ultrastruktura płuca w fizjologii i patologii oraz diagnostyka ultra-
strukturalna. Przewidujemy także tematy wolne. Termin nadsyłania zgłoszeń uczestnictwa czynnego
i biernego upływa z dniem 30 października.
Streszczenia należy nadesłać także do dnia 30 października. Streszczenia będą drukowane jako w ydaw ni­
ctwo Patologii Polskiej w języku angielskim. Akceptujemy także streszczenia polskie (czasopismo posiada
własnego tłumacza).
Koszt uczestnictwa wyniesie 15 zł. Noclegi w cenie ok. 80 zł możemy zabezpieczyć w Hotelu „O lim pia”
w pobliżu miejsca obrad.
Serdecznie zapraszamy do wzięcia udziału.

Prof, dr hab. W. S alw a-Żurawska Prof, dr hab. W. Biczysko

Prace prosimy nadsyłać na adres:

Pracownia Mikroskopii Elektronowej
Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej
Akademia Medyczna w Poznaniu
ul. Przybyszewskiego 49
60-355 Poznań
tel. 0-61/673-481
lub 0-61/67-68-41 wewn. 481, 482, 483
fax. 0-61/673-481
Nr konta bankowego Oddziału Poznańskiego Polskiego Towarzystwa Patologów:
PKO BP I Oddz. w Poznaniu nr 63513-9827-132

W . M ejbaum -K atzenellenbogerTs
Seminars on M olecular Biology
4. Nuclear O rganization and
Intracellular Transport
(ARF and Protein 14-3-3)
W roclaw /Szklarska Poręba, June 23— 25
Info: Prof. Jan Szopa
Uniwersytet Wrocławski, Inst. Biochemii
ul. Przybyszewskiego 63/77
51-148 Wrocław, Poland
Fax (48) +71 252-930

POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 313

http://rcin.org.pl

W skazówki
dla a u to ró w
Wydawany przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne kwar­
talnik „Postępy Biochemii" publikuje prace przeglądowe oma­
wiające bieżące osiągnięcia, koncepcje i kierunki badawcze
w dziedzinie biochemii i nauk pokrewnych; publikuje też noty
z historii biochemii, zasady polskiego słownictwa biochemi­
cznego, recenzje nadesłanych książek oraz sprawozdania ze
zjazdów, konferencji i szkół, w których biorą udział członkowie
Towarzystwa.
Prace przeznaczone do publikacji w „Postępach Biochemii"
mogą mieć charakter artykułów monograficznych (do 20 stron
tekstu licząc piśmiennictwo i tabele), minireviews (do 10 stron
tekstu), oraz krótkich not o najnowszych osiągnięciach i po­
glądach (do 5 stron tekstu).
Autorzy artykułu odpowiadają za prawidłowość i ścisłość poda­
wanych informacji oraz poprawność cytowania piśmiennictwa.
Ujęcie prac w inno być syntetyczne, a przedstawione zagadnienie
zilustrowane za pomocą tabel, rycin, (wykresy, schematy, reak­
cje), wzorów i fotografii.
Wskazany jest podział artykułów monograficznych na rozdziały
i podrozdziały, których rzeczowe tytuły tworzą spis treści. Zgod­
nie z przyjętą konwencją rozdziały noszą cyfry rzymskie, podroz­
działy odpowiednio rzymskie i arabskie np. 1-1, I-2. Poprawność
logiczna i stylistyczna tekstu warunkuje jego jednoznaczność
i czytelność. Autorzy przeto winni unikać składni obcojęzycznej,
gwary laboratoryjnej, a także ograniczać stosowanie doraźnie
tworzonych skrótów, nawet jeżeli bywają używane w pracach
specjalistycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac podlega
ocenie specjalistów i opracowaniu redakcyjnemu. Redakcja
zastrzega sobie możliwość skrócenia tekstu i wprowadzenie
zmian nie wpływających na treść pracy, deklaruje też gotowość
konsultowania tekstu z Autorami.
Przekazanie artykułu do redakcji jest równoznaczne z oświad­
czeniem, że nadesłana praca nie była i nie będzie publikowana
w innym czasopiśmie, jeżeli zostanie ogłoszona w „Postępach
Biochemii". W przypadku, gdy Autor(zy) zamierza(ją) włączyć
do swego artykułu ilustracje publikowane przez autorów prac
cytowanych, należy uzyskać i przekazać nam odpowiednią zgodę
na przedruk.
Redakcja prosi A u to ró w o przestrzeganie następujących
w skazów ek szczegółowych:
TEKST: Maszynopis powinien być napisany jednostronnie
czcionką wielkości standartowej, z podwójną interlinią, z lewym
marginesem ok. 4 cm.
W tekście nie należy stosować żadnych podkreśleń, ani roz­
strzelonego druku. Ewentualne sugestie co do charakteru czcion­
ki drukarskiej mogą Autorzy zaznaczyć ołówkiem na marginesach
maszynopisu. W przypadku stosowania w tekście liter alfabetu
greckiego trzeba na marginesie wpisać ołówkiem ich fonetyczne
brzmienie.
Strona inform acyjna maszynopisu jest nienumerowana, za­
wiera imiona i nazwisko (a) autora (ów ), nazwy, adresy wraz
z numerem telefonu zakładów (w języku polskim i angielskim),
w których pracują autorzy, adres do korespondencji, nr telefonu
314
http://rcin.org.pl
i ewentualnie fax, adresy prywatne autorów, tytuł artykułu
w języku polskim i angielskim oraz — w prawym dolnym rogu
— liczbę tabel, rycin, wzorów i fotografii oraz skrót tytułu pracy
(do 25 znaków).
Strona 1 (ty tu ło w a ) zawiera imiona i nazwiska autorów, tytuł
pracy w języku polskim i angielskim, rzeczowy spis treści też
w obu językach, tytuł naukowy każdego z autorów i ich miejsce
pracy z adresem pocztowym oraz wykaz stosowanych skrótów.
Kolejno num erow ane dalsze strony obejmują tekst pracy,
piśmiennictwo, tabele, podpisy i objaśnienia rycin, wzorów
i fotografii.
P IŚ M IE N N IC T W O : Wykaz piśmiennictwa obejmuje prace
w kolejności ich cytowania w tekście, zaznacza się je liczbami
porządkowymi ujętymi w nawiasy kwadratowe, np. [3 ,7 ,9 — 26].
Odnośniki bibliograficzne winny mieć nową uproszczoną formę.
Sposób cytowania czasopism (1), monografii (2), rozdziałów
z książek jednotomowych (3), rozdziałów z tom ów serii opraco­
wanej przez tych samych redaktorów (4), rozdziałów z tom ów
serii opracowanych przez różnych redaktorów (5) wskazują
poniżej podane przykłady:
1. Hildenbrandt GR, Aronson NN (1980) Biochim Biophys
Acta 631: 499-502
2. Bostock CJ, Sumner AT (1978) The Eukaryotic Chromo­
some, Elsevier, N orth-Holand, Amsterdam
3. Norberth T, Piscator M (1979) W: Friberg L, Nordberg GF,
Von VB (red) Handbook on the Toxicology of Metals.
Elsevier, North-Holland, Amsterdam, str. 541-553
4. Delej J, Kesters K (1975) W: Florkin M, Stotz EH (red)
Comprehensive Biochemistry t 29B. Elsevier, N orth-H ol­
land Amsterdam, str. 1 -77
5. Franks NP, Lieb WR (1981) W: Knight CG (red) Research
Monographs in Cell and Tissue Physiology, t 7. Elsevier,
North-Holland, Amsterdam, str. 243-272
ILUSTRACJE: Ryciny w inny być gotowe do reprodukcji. Foto­
grafie czarno-białe (kontrastowe), powinny być wykonane na
papierze matowym. Po porozumieniu z Redakcją można propo­
nować reprodukcję fotografii barwnych. Pozostałe ryciny należy
wykonać tuszem na białym papierze lub kalce technicznej.
Wskazane jest, aby ryciny były dwukrotnie większe od przyszłej
reprodukcji, tj. w skali 2 :1 . Cyfry i litery służące do opisu rysunku
powinny mieć wysokość nie mniejszą niż 5 mm. Na rysunkach nie
należy umieszczać opisów słownych, lecz posługiwać się skróta­
mi. Osie wykresów winny być opatrzone napisem łatwo zro­
zumiałym. Decyzję o stopniu zmniejszenia ryciny podejmuje
wydawca. Ilustracji nie należy włączać w tekst maszynopisu, lecz
odpowiednio ponumerować: tabele i ryciny noszą cyfry arabskie,
wzory zaś rzymskie. Na marginesie tekstu należy zaznaczyć
ołówkiem preferowane miejsce umieszczenia tabeli, ryciny czy
wzoru. Tabele odpowiednio porubrykowane, winny być opat­
rzone jednoznacznym tytułem i ewentualnie także niezbędnymi
objaśnieniami. Słowne objaśnienia znaków graficznych można
umieścić w podpisie pod ryciną, rysunkowe zaś jedynie na
planszy ryciny. Tytuły i objaśnienia rycin sporządza się w postaci
oddzielnego wykazu. Ilustracje należy podpisać nazwiskiem
pierwszego z autorów i pierwszym słowem tytułu pracy oraz
oznaczyć „g ó ra -d ó ł" (ołówkiem, na odwrocie). Ze względu na
wewnętrzną spoistość artykułu wskazane jest konstruowanie
oryginalnych rycin i zbiorczych tabel na podstawie danych
z piśmiennictwa.
Maszynopis i załączniki (w dwu egzemplarzach), właściwie
zabezpieczone przed uszkodzeniem w czasie transportu, należy
przesłać na adres:
Redakcja kwartalnika „Postępy Biochemii"
Polskie Towarzystwo Biochemiczne
ul. Pasteura 3,
02-093 Warszawa
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996
 UWAGA
Zawiadamiamy o zmianie numeru konta prenumeraty Postępów Biochemii.
Nowy numer konta: PBK XIII O/Warszawa 370044-1225-2720-3-69

Aby zaprenumerować „P o ­ sanie imienia, nazwiska (lub

stępy Biochemii” w 1996 r. nazwy instytucji) i dokładne­
należy wpłacić odpowiednią go adresu wraz z kodem po­
kwotę na konto bankowe w y ­ cztowym (DRUKOWANYMI
dawcy (Polskiego Towarzys­ LITERAMI) na wszystkich
twa Biochemicznego) za po­ trzech odcinkach przekazu.
mocą przekazu zamieszczo­ P ren u m eru jąc
Prenum erata krajow a dla
nego na odwrocie. Zamówio­
ne egzemplarze będziemy
instytucji: „P o s tę p y
60.00 zł
wysyłać pocztą na adres po­ B io c h e m ii”
dany nam na przekazie. Po­ Prenum erata krajow a in­
nieważ odcinek przekazu do­ dywidualna: w sp ierasz
cierający do nas jest jedno­
cześnie zamówieniem, prosi­
28.00 zł (50% zniżki dla
członków Polskiego Towa­
s w o je
my o bardzo w yraźne napi­ rzystwa Biochemicznego). czasopism o!
POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996 http://rcin.org.pl 315
 ----------------------------------
Pokwitowanie dla wpłacającego Odcinek dla posiadacza rachunku Odcinek dla poczty lub banku

z ł , ............................................ . z ł....... ..... ........ z ł ...........................................

słownie.................................... słownie............................... .

w płacający w p łacający w p ła c a ją cy ...................................

im ię, nazw isko, dokładny adres z kodem pocztow ym im ię, nazw isko, dokładny adres z kodem pocztowym im ię, nazw isko, dokładny adres z kodem pocztow ym

na rachunek na rachunek na rachunek

Polskie Towarzystwo Biochemiczne Polskie Towarzystwo Biochemiczne Polskie Towarzystwo Biochemiczne

02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3
P.B.K. X IIl/O W-wa. Al. Jerozolimskie P.B.K. X Ill/O W -wa. Al. Jerozolimskie P.B.K. X Ill/O W-wa. Al. Jerozolimskie
37 00 44-1225-2720-3-69 37 00 44-1225-2720-3-69 37 00 44-1225-2720-3-69

stem pel stem p el stem p el

Pobrano op łatę Pobrano op łatę Pobrano op łatę

Zł................. Z ł............................ Zł.................

p odp is przyjm ującego p od p is przyjm ującego podp is przyjm ującego

316 POSTĘPY B IO C H E M II 4 2 ( 3 ) , 1996

http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl