Resistencia a la desecación

relacionada con la formación de

biopelı́culas en Pseudomonas
fluorescens

José David Pereiro

En cumplimiento parcial de los requisitos para el tı́tulo de

Fı́sico

Grupo de Biofı́sica de la Universidad de los Andes

Departamento de Fı́sica
Universidad de Los Andes
Bogotá, Colombia
Agosto, 2018
 Contents

1 Abstract 1

2 Agradecimientos 2

3 Resumen 3

4 Introducción 4

5 Materiales y métodos 10
5.1 Crecimiento celular bacteriano y desecado por aire . . . . . . . . . . . . . . . 10
5.2 Medición del porcentaje de humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
5.2.1 Medición del porcentaje de humedad por peso seco . . . . . . . . . . 12
5.2.2 Medición del porcentaje de humedad por espectroscopı́a infrarroja . . 12
5.3 Rehidratación de las células bacterianas y medición de viabilidad . . . . . . 12
5.4 Análisis por FTIR de los ácidos grasos asociadas a la membrana . . . . . . . 12
5.5 Análisis estadı́stico. Método ANOVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

6 Resultados 14

7 Análisis y conclusiones 24
7.1 Crecimiento celular bacteriano, desecado por aire y porcentajes de viabilidad 24
7.2 Medición del porcentaje de humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
7.2.1 Medición del porcentaje de humedad por peso seco . . . . . . . . . . 25
7.3 Espectroscopı́a infrarroja ATR-FTIR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
7.4 Análisis por FTIR de los ácidos grasos asociados a la membrana . . . . . . . 28
7.5 Análisis estadı́stico. Método ANOVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

iii
 CHAPTER 1

Abstract

In this monograph the desiccation processes for the bacterium Pseudomonas fluorescens
will be studied from a biophysical perspective. For this we want to study the relationship
between the formation of biofilms and the resistance to desiccation associated with the
bacteria, determining the viability (percentage of cells that remain functional) of the dried
and rehydrated cells in the presence and absence of biofilms. Likewise, we also want to
measure the humidity percentages of the dried bacterial cells by means of two methods:
method by dry weight and by means of infrared Fourier transform spectroscopy (FTIR).
Another way to study the processes of desiccation and which are also related to cell viability
is through the study of the fatty acid bands of the dried bacterial membranes to study
the physical properties of the membrane and, in turn, the conformational changes that this
could have presented. This fatty acid analysis is also performed from Fourier transform
spectroscopy (FTIR). Finally, by means of the comparison of the survival, the percentages
of humidity and the physical states of the membranes in the presence and absence of biofilms
and using a set of statistical methods that allow to know if a variable (presence of biofilms)
is a determining factor In the (viability) the relationship between biofilm formation and
resistance to desiccation in the bacterium Pseudomonas fluorescens will be studied.
According to the obtained results, it was concluded that the biofilms do confer resistance
to the drying in the bacterium Pseudomonas fluorescens by means of the statistical analysis
of the viability percentages for the two strains worked 89 and 141. The percentage of
humidity present in cells with biofilm is greater than that of planktonic cells. When studying
the fatty acid bands and the phase changes, the melting temperatures were determined for
each of the scenarios and it was found that the Tm for the cells in the planktonic state are
greater due to the packing of the lipids.

1
 CHAPTER 2

Agradecimientos

Quiero agradecer a todas las personas que me ayudaron en esta investigación. A Chad
Leidy por haberme tenido en cuenta para la realización de la misma y por su inmensurable
paciencia. A Elizabeth y a Rudy por haberme ayudado en el laboratorio. A Adriana Bernal
por haberme ayudado con las cepas y también por su paciencia conmigo. Agradezco al grupo
de investigacin de la Universidad del Valle, Laboratorio de catálisis aplicada y procesos que
me prestaron sus instalaciones y permitieron que desarrollara la parte de espectroscopı́a allá,
al doctor Julian Urresta Aragón y a los estudiantes Jesús David Morales y Valeria Valencia
Rengifo que me ayudaron en la toma de los espectros y en el análisis de los mismos. También
aprovecho para agradecerle a mi madre y a mi abuela que sin ellas esto no hubiese sido posible.
Y también agradecerle a Valeria y a Jesús por ayudarme con la parte de espectroscopı́a y el
análisis de la misma. Y a Juan Sebastián que fue una persona que me ayudó a lo largo de
toda la investigación con todo su conocimiento y apoyo.

2
 CHAPTER 3

Resumen

En esta monografı́a se estudiaron los procesos de desecación para la bacteria Pseudomonas

fluorescens desde una perspectiva biofı́sica. Para esto se quiere estudiar la relación entre la
formación de biopelı́culas y la resistencia a la desecación asociada a la bacteria determinando
la viabilidad (porcentaje de células que siguen siendo funcionales) de las células desecadas y
rehidratadas en presencia y ausencia de biopelı́culas. Ası́ mismo, también se quieren medir
los porcentajes de humedad de las células bacterianas desecadas por medio de dos métodos:
método por peso seco y por medio de espectroscopı́a infrarroja de transformada de Fourier
(FTIR). Otra manera de estudiar los procesos de desecación y que también están relacionados
con la viabilidad celular es por medio del estudio de las bandas de los ácidos grasos de las
membranas bacterianas en estado desecado para estudiar propiedades fı́sicas de la membrana
y, a su vez, los cambios conformacionales que esta pudo haber presentado. Este análisis
de ácidos grasos también se realiza a partir de espectroscopı́a de transformada de Fourier
(FTIR). Finalmente, por medio de la comparación de la supervivencia, los porcentajes de
humedad y los estados fı́sicos de las membranas en presencia y ausencia de biopelı́culas y
utilizando un conjunto de métodos estadı́sticos que permiten saber si una variable (presencia
de biopelı́culas) es un factor determinante en la (viabilidad) se estudiará la relación entre
la formación de biopelı́culas y la resistencia a la desecación en la bacteria Pseudomonas
fluorescens.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluyó que las biopelı́culas sı́ confieren
resistencia a la desecación en la bacteria Pseudomonas fluorescens por medio del análisis
estadı́stico de los porcentajes de viabilidad para las dos cepas trabajadas 89 y 141. El
porcentaje de humedad presente en las células con biopelı́cula es mayor al de las células
planktónicas. Al estudiar las bandas de ácidos grasos y los cambios de fase se determinaron
las temperaturas de melting para cada uno de los escenarios y se encontró que el Tm para
las células en estado planktónico es mayores debido al empaquetamiento que presentan los
lı́pidos.

3
 CHAPTER 4

Introducción

Pseudomonas fluorescens es un bacilo Gram-negativo, cuyo hábitat natural principalmente

está relacionado con aguas, suelos y la rizósfera de las plantas. Esta bacteria es aeróbica
(necesita oxı́geno para su crecimiento), su temperatura óptima de crecimiento oscila entre
los 25 a 30◦ C. Es una bacteria neutrófila, es decir, crece de manera óptima en un pH neutro.
Esta bacteria posee dos caracterı́sticas esenciales y de importancia biofı́sica, en primera
instancia, produce ciertos sideróforos (compuestos quelantes de hierro) que son utilizados
por el microorganismo para satisfacer la ausencia de hierro. Este sideróforo es conocido
como pioverdina siderópica y es el responsable de quelar las moléculas de hierro cuando se
encuentran en bajas concentraciones.
Ası́ mismo, cabe destacar la importancia del sideróforo y es producir la fluorescencia
(pigmento fluorescente) en la bacteria. Estas moléculas exhiben fluorescencia brillante fo-
toestable de forma relativa y con espectros de excitación y emisión caracterı́sticos que se
apagan rápida y fuertemente al unirse a su ligando natural, la molécula de hierro. Segundo,
la bacteria tiene la capacidad de producir alginato que es un exopolisacárido crucial en la
formación de biopelı́culas. Este es un copolı́mero de forma lineal que se encuentra acetilado
de forma parcial y se forma por unidades de ácido manurónico y ácido gulurónico que se
encuentran unidas por enlaces (β 1-4).
El alginato es el componente principal de la matriz extracelular de las biopelı́culas pro-
ducidas por la bacteria Pseudomonas fluorescens. Las biopelı́culas son organizaciones mi-
crobianas formadas por microorganismos que han sido previamente adheridos a superficies
debida a la producción de un exopolı́mero o exopolisacárido. Tienen como caracterı́sticas
principales: heterogeneidad (únicas organizaciones conformadas por bacterias, hongos y
parásitos), su diversidad depende de los ambientes en los que se desarrollan y le confieren
resistencia a las bacterias a antibióticos. El exopolisacárido forma una matriz extracelular
adherente en la que estos quedan atrapados y comienzan a organizarse en ciertas colonias
con diferentes requerimientos metabólicos.

4
 Se ha encontrado que los microorganismos que están relacionados con este tipo de or-
ganizaciones presentan microambientes con diferentes caracterı́sticas biofı́sicas como: con-
centración de iones, presión osmótica, pH y concentración de carbono y nitrógeno. Las
biopelı́culas están constituidas por los siguientes componentes: masa celular (formada por
una o más especies) que representa entre el 15-25% del volumen total, hay especies in-
tercelulares o canales, también está la matriz extracelular (compuesta de exopolisacáridos,
proteı́nas, sales minerales y material de la célula) que representa el 75-80% del volumen total.
De esta manera, se tendrá en cuenta la presencia de biopelı́culas como un factor protector
en condiciones de estrés ambiental (radiación ultravioleta, cambios en el pH, estrés osmótico
y desecación).
En las biopelı́culas (conjunto de células bacterianas embebidas en una matriz de ex-
opolı́meros), la adhesión a superficies causa una serie de cambios fisiológicos en las células
que lidera en parte la sobreproducción de exopolı́meros. Estos exopolı́meros no inmovilizan
las células solamente en las superficies de las colonias, sino que también facilitan el arreglo
espacial de diferentes especies en la biopelı́cula. Estos arreglos le dan a la biopelı́cula ha-
bilidades metabólicas y fisiológicas que no son posibles para las células individuales o no
adheridas. Una propiedad única notable de las biopelı́culas es su alta resistencia a una
diversidad de agentes antimicrobianos.
Por lo tanto, la habilidad de una bacteria de adherirse a una superficie y formar la
biopelı́cula es un factor importante para la supervivencia en una variedad de ambientes. La
formación de biopelı́culas por parte de los pseudomonados, en este caso especı́fico, Pseu-
domonas fluorescens se ha demostrado que ocurre en una serie de eventos secuenciales. Para
empezar, la bacteria interactúa con necesita interactuar con el sustrato. Cada célula bacte-
riana individual primero se somete a una adhesión reversible que involucra el contacto del
polo de la célula con la superficie; esta interacción que se da es débil relativamente y se puede
romper fácilmente.
Con el tiempo, la célula se adhiere por el eje más largo y se da la conocida unión ir-
reversible, en la que la bacteria queda firmemente adherida a la superficie resultando en
la formación de una monocapa de células. Se procede la formación de microcolonias que
posteriormente compondrán la biopelı́cula madura o lo que se conoce comúnmente como
biopelı́cula. También es importante tener en cuenta que hay procesos que están asociados
con la pérdida de la biomasa en la biopelı́cula debida a la eliminación o removimiento de
células por erosión o simplemente desprendimiento de las células por factores externos del
ambiente extracelular (flujo hidrodinámico y estrés mecánico). A continuación se encuentra
un esquema de cómo se da la formación de biopelı́culas en células bacterianas con producción
de una matriz de exopolisacáridos (EPS):

5
 Figure 4.1: Esquema de formación de biopelı́cula

Por otra parte es importante tener en cuenta la resistencia asociada a otros factores
biofı́sicos como la cantidad de agua presente en el medio. De esta manera, se puede estudiar
el proceso de desecación en ciertos microorganismos; la desecación según la biologı́a y la
ecologı́a, se define como el proceso de secado de un organismo vivo por medio de la eliminación
de agua. La eliminación de agua de las células, el almacenamiento de las células en el estado
desecado y la recuperación de agua imponen constantes fisiológicas que ciertos organismos
pueden tolerar. Las moléculas de agua son componentes crı́ticos en los mecanismos de
reacciones moleculares y contribuyen a la estabilidad de proteı́nas, ácidos nucleicos y lı́pidos,
macromoléculas o biomoléculas fundamentales en los diferentes procesos bioquı́micos de la
naturaleza.
Ası́ mismo, las moléculas de agua le confieren una organización estructural a las células.
El agua a su vez tiene una serie de propiedades que determinan sus caracterı́sticas fisi-
coquı́micas y la importancia que esta tiene en las células bacterianas: la molécula de agua
tiene dipolos producidos por la electronegatividad dada por el átomo de oxı́geno situado en
el centro de los dos átomos de hidrógeno y sus pares de electrones no enlazados. A su vez,
esta forma redes tridimensionales que están enlazadas mutuamente por puentes de hidrógeno
y otra caracterı́stica fı́sica importante es la energı́a requerida para pasar una molécula de
agua en fase lı́quida a fase vapor sin cambios en la temperatura que va a estar dada por la
entalpı́a de vaporización o Hvap .
El agua tiene el Hvap más alto de vaporización permitiendo que sea el único solvente
no volátil encontrado en células en cantidades apreciables. Este valor de entalpı́a está rela-
cionado con la energı́a requerida para romper los puentes de hidrógeno y superar las fuerzas
de dispersión de London asociadas a las nubes electrónicas de la molécula o mayormente
conocidas como fuerzas de Van der Waals. Como estas moléculas de agua son desplazadas
desde el interior a la fase acuosa en la interfase aire-agua, la energı́a requerida para expandir
una superficie por unidad de área es otra propiedad biofı́sica que se define como tensión
superficial. Esta tensión superficial es la responsable de mantener el agua lı́quida afuera de
las vesı́culas gaseosas que se ven afectadas por las diferentes cantidades de solutos disueltos

6
y que finalmente, contribuirá a la hidrofobicidad de la superficie celular.
Introduciendo otra variable fı́sica importante, está el potencial quı́mico que es una medida
asociada a la tendencia que tiene un compuesto quı́mico a cambiar a una fase determinada.
Por lo tanto, si este potencial quı́mico es alto, el compuesto va a cambiar fácilmente de fase
y viceversa.
La actividad del agua aw se relaciona con su concentración a través de un coeficiente de
actividad γw donde aw = γw Nw (Nw es la fracción molar de agua en el sistema). A su vez,
el potencial quı́mico (µw ) en el sistema se expresa con la siguiente ecuación:

µw = µw ∗ +RT ln aw + V w P + zw F E + mw gh (4.1)

En la ecuación, el término RT lnaw proporciona la actividad del agua en términos de energı́a

por mol. V w es el volumen molal del agua, asociado con el aumento o disminución difer-
encial del volumen de la célula bacteriana cuando una cantidad diferencial es adicionada o
removida, expresada en volumen por mol. P es la presión hidrostática en exceso de la presión
atmosférica, de tal forma que el término V w P muestra los efectos de la presión en el potencial
quı́mico del agua y se expresa en energı́a por mol. zw F E es el término del potencial elec-
troquı́mico y como el agua no posee carga, este término puede ser ignorado. El término mw gh
representa el trabajo requerido para mover una masa molar de agua, mw = 18.016g/mol a
una altura dada bajo una aceleración gravitacional (g).
Las células bacterianas contienen cantidades finitas de solutos disueltos y se pueden
considerar las transiciones entre los potenciales de agua por medio del estudio de la presión
osmótica. La adición de un soluto a una cantidad de agua causa un desplazamiento en las
moléculas de agua para equilibrar el gradiente electroquı́mico que se genera. Al disminuir
el potencial quı́mico µw causa una disminución en la actividad del agua aw y el término
RT lnaw se vuelve más negativo.
Esto se puede dar por medio de la adición de un soluto que conlleva a la disminución
del potencial quı́mico y un aumento de la presión osmótica presente Π. Cuando una célula
bacteriana se ve sometida a cambios en la cantidad de agua, el equilibrio se dirige a las re-
giones de mayor presión osmótica dependiendo de la actividad de agua, se utiliza la siguiente
relación entre actividad del agua y presión osmótica:

RT ln aw = V w Π (4.2)

Una ecuación más utilizada para definir la presión osmótica debida a la presencia de solutos
es la relación de Van’t Hoff:
Πs ≈ RT Σj cj (4.3)
De esta manera, se introduce el concepto de potencial quı́mico del agua que será prepon-
derante al tratar las bacterias productoras de capas de exopolisacáridos que permitirán la
formación de biopelı́culas. El potencial quı́mico con el término de presión osmótica seguirá
la siguiente ecuación:
µw = µw ∗ +V w P + V w Π + mw gh (4.4)

7
Reorganizando los términos se puede llegar a la definición del potencial de agua de un sistema
fı́sico:
µw − µw ∗
= P − Π + mw gh = Ψ (4.5)
Vw
Este potencial de agua de un sistema representado por la letra Ψ es proporcional al cambio
en el potencial quı́mico y es útil cuando se habla de relaciones de agua en células bacteri-
anas. Este término representa el trabajo involucrado en mover 1mol de agua de un punto
del sistema (presión y temperaturas constantes) a otra región a diferentes presiones y tem-
peraturas. De esta manera se utiliza la siguiente relación de potencial de agua que relaciona
el porcentaje de humedad relativa factor que puede ser medido por medio de peso seco y
espectroscopı́a infrarroja:
RT
Ψ= ln(%RH/100) + ρw gh (4.6)
Vw
Por otra parte, la desecación genera una reducción sustancial en el potencial quı́mico del
agua que genera daños en las diferentes macromoléculas presentes en las células bacterianas
(ácidos nucleicos, proteı́nas, membranas), lo cual reduce la viabilidad celular durante el
proceso de desecación y rehidratación. Las biopelı́culas debido a la presencia de la matriz
extracelular compuesta de exopolisacáridos y la agregación de células puede mantener un
potencial quı́mico alto que retenga agua durante el proceso de desecación, reduciendo los
daños causados por la deshidratación. Adicionalmente, la reducción de tasas metabólicas en
la biopelı́cula puede mejorar la supervivencia a la desecación.
Se pueden utilizar diversas técnicas de desecación para la eliminación de agua en sistemas
biológicos; por ejemplo la desecación por aire permite la eliminación de agua dentro de las
células bacterianas a partir de la utilización de una pistola de aire que extrae las moléculas
de H2 O. Para ası́ poder rehidratar las células, estudiar cuáles siguen siendo funcionales y
permiten la reproducción celular y medio su viabilidad (porcentaje de células funcionales)
para poder determinar si el microorganismo es resistente o no a la desecación.
Para estudiar cómo afecta la desecación a nivel molecular se puede estudiar la estabilidad
y la composición de la membrana. La membrana de bicapa lipı́dica es uno de los principales
componentes celulares que se ve afectado cuando la cantidad de agua en la célula varı́a
dependiendo de los niveles de hidratación. Debido al empaquetamiento de los lı́pidos que
puede tener efectos negativos en la viabilidad celular. La espectroscopı́a FTIR se puede
utilizar para revisar los cambios en el comportamiento de la membrana.
Las membranas celulares pueden adoptar una variedad de conformaciones que incluyen
las fases lamelares cristalinas lı́quidas (Lα) y las fases lamelares gel (Lβ) que dependerán
de la organización de los lı́pidos de membrana y a su vez de la temperatura a la que esté
expuesta. La fase Lα se caracteriza por una mayor fluidez de membrana como resultado del
espaciamiento entre las cabezas polares de los ácidos grasos, disminuyendo el ordenamiento
de la cadena acilo y a su vez disminuyendo el grosor de la membrana. En la fase Lβ la fluidez
de la membrana disminuye debido a que las cabezas polares están más empaquetadas y se
incrementa el ordenamiento de las cadenas acilo y aumenta el grosor de la membrana.
Al remover agua de la bicapa lipı́dica durante la desecación, las cabezas polares de los
ácidos grasos que conforman la bicapa son forzadas a empaquetarse por medio del aumento

8
del empaquetamiento lipı́dico y por las interacciones Van der Waals entre los hidrocarburos
acı́licos y las cadenas de lı́pidos vecinas. Este aumento en la atracción entre las moléculas
de los lı́pidos favorece la transición entre las fases Lα y Lβ, resultando en una disminución
de la fluidez de membrana. Después de la rehidratación proceso que se quiere llevar a cabo
en esta investigación, la fluidez de membrana aumenta mientras la célula absorbe agua del
medio extracelular y se vuelven a dar transiciones para volver a la fase Lα.
Por otra parte, la estructura de la membrana y la fluidez también se ven afectadas por la
composición de los lı́pidos de la membrana. Pues, un aumento en la fluidez de la membrana
también está directamente relacionado con un aumento en la cantidad de ácidos grasos
insaturados, debido a que por la presencia de los enlaces dobles esto genera mayor movilidad
entre los ácidos grasos y permite mayor fluidez. Debido a esto, si hay mayor número de
ácidos grasos insaturados esto antecede a un menor empaquetamiento de la membrana y por
ende favorece la fase Lα. Por el contrario, si hay menor cantidad de ácidos grasos insaturados
la membrana tendrá menor fluidez y se favorecerá la fase Lβ.
Diversos estudios en bacterias han determinado que la composición de los lı́pidos de
membrana también resultan de cambios y estreses ambientales tales como: cambios en la
temperatura, cambios en el pH, falta de nutrientes y desecación. De esta forma, por medio
de la espectroscopı́a transformada de Fourier infrarroja (FTIR), se pueden determinar los
cambios estructurales de la mayorı́a de los componentes biológicos de las células en diferentes
condiciones de temperatura y condiciones osmóticas. Más allá, FTIR puede identificar y
distinguir entre las moléculas de las membranas lipı́dicas y las proteı́nas citoplásmicas basado
en el análisis espectral de las bandas que corresponden especı́ficamente a la estructura de las
proteı́nas, las cadenas acilo de las moléculas lipı́dicas y los enlaces fosfodiéster de los ácidos
nucleicos.

9
 CHAPTER 5

Materiales y métodos

5.1 Crecimiento celular bacteriano y desecado por aire

Para este estudio se utilizaron dos cepas de la bacteria P. fluorescens. Las cepas se mantu-
vieron a -80◦ C en un stock de glicerol y se cultivó en Agar King’s B medio suplementado
con 15 g agar/L en platos 1-2 dı́as antes de cada experimento. Se estudiarán los procesos de
desecación para las bacterias en la fase estacionaria (fase de producción de la biopelı́cula).
Por consiguiente, es necesario realizar una curva de crecimiento y conteo de unidades
formadoras de colonias para las cepas trabajadas. Esto se realiza a partir del aislamiento
de las colonias y del espectrofotómetro que por medio de la densidad óptica (medición de la
cantidad de luz absorbida por una suspensión bacteriana que a su vez está relacionada con
la cantidad de bacterias presentes).
Para los estudios de desecación, serán necesarias dos tipos de muestras: 1) formadora
de biopelı́cula y 2) células planctónicas (células libres no adheridas a la matriz de ex-
opolisacáridos). Las placas de Petri con biopelı́culas se llevan a la cámara de flujo laminar
y con la pistola de aire (previamente suplementada con un filtro para evitar contaminación)
en intervalos de tiempo, se realiza la desecación por aire.
Las células se dejarán desecadas en diferentes intervalos de tiempo: 5h, 10h, 20h, 40h y
una semana. Para la obtención de las células planctónicas es necesario el crecimiento de las
células en medio lı́quido. Con una fiola de 500mL, con 150mL de medio lı́quido King’s B
se agregó una alı́cuota de 1mL de un overnight previamente crecido y se dejó por 12 horas,
posteriormente se centrifugaron las muestras en tubos falcon de 50mL (8500rpm, 4 grados
centı́grados, 10min) y ası́ se obtuvo el pellet de células (en estado planctónico).
Estas células también fueron desecadas. Para medir la viabilidad de las mismas y de
las células formadoras de biopelı́cula dependiendo del tiempo de desecación. Se harán seis
duplicados de cada una de las mediciones para cada uno de los estados y se rehidratarán las

10
células con PBS durante 1hora y 3 horas para estudiar si el tiempo de rehidratación afecta
la viabilidad de las mismas.
Después de la rehidratación de las células se sembraron de tal forma que se pudiesen
obtener diferentes diluciones en un mismo plato. Esto se realizó por medio del método
single plate-serial dilution spotting. Por medio de la siembra de 20 µL en cada uno de
las divisiones previamente hechas en el agar, se puede determinar la cantidad de unidades
formadoras de colonias, por medio del cálculo teniendo en cuenta el inverso del factor de
dilución y el volumen de la siembra. Finalmente, se trabajó con un control negativo es decir
un control sin ningún tipo de tratamiento para poder determinar el crecimiento de las células
en condiciones normales dependiendo de si hay producción de biopelı́cula o no. Con este
control negativo y teniendo en cuenta la cantidad de unidades formadoras de colonias que
fueron viables se calculó el porcentaje de viabilidad para cada uno de los escenarios y se
procedió a graficar.

Figure 5.1: SP-SDS en planctónico, 5h, 10h, 20h, 40h y 1 semana

Para biopelı́culas

Figure 5.2: SP-SDS en biopelı́cula, 5h, 10h, 20h, 40h y 1 semana

5.2 Medición del porcentaje de humedad

Para medir el porcentaje de humedad es necesario determinar la cantidad de agua que está
presente en las células después del desecado, con el contenido de agua se puede determinar
el porcentaje de humedad relativa de la muestra estudiada. Para medir los porcentajes de
humedad se realizará por peso seco.

11
5.2.1 Medición del porcentaje de humedad por peso seco
A partir de las placas de Petri previamente desecadas se va a determinar la masa inicial de
las mismas y por medio de la utilización del horno se eliminará la cantidad de agua presente
después de la desecación y de esta manera se va a determinar el porcentaje de humedad
relativa que está presente después del desecado.

5.2.2 Medición del porcentaje de humedad por espectroscopı́a in-

frarroja
La medición del porcentaje de humedad por espectroscopı́a infrarroja no se realizó debido a
que no es posible la obtención de una curva de calibración que proporcione una proporción
entre una cantidad de agua conocida vs absorbancia o transmitancia de los picos obtenidos
con relación a las bandas de los OH del agua.
Esto está asociado a la complejidad de la muestra, pues se encontró que en este tipo de
muestras (células bacterianas) en estudios in situ es necesario utilizar una matriz que funcione
como blanco que sea similar a la muestra y estas muestras presentan concentraciones altas de
diferentes biomoléculas como carbohidratos, proteı́nas, en este caso exopolisacáridos como
alginato que pueden llegar a influir en la determinación de la cantidad de agua.
La gran variedad de moléculas en las muestras tratadas puede afectar en los diferentes
picos asociados al OH y por esta razón, es difı́cil determinar si la absorbancia o transmitancia
(dependiendo de la medición) está asociada únicamente a la cantidad de agua y no otros OH
que presente la célula de otras especies moleculares.
No obstante, por medio de la obtención de los diferentes espectros infrarrojos y el análisis
de los picos se pueden encontrar relaciones y la presencia de diferentes moléculas carac-
terı́sticas de las células bacterianas.

5.3 Rehidratación de las células bacterianas y medición

de viabilidad
Por medio de la adición de PBS a las placas de Petri previamente desecadas de tal forma
que cubra las colonias, se rehidratan las células para medir la viabilidad directamente por
medio de la estimación del número de unidades formadoras de colonia presentes después de
la rehidratación con relación a la cantidad inicial de colonias en función de tiempo (dı́as)
para los dos casos: 1) placas de Petri con biopelı́culas y 2) placas de Petri sin biopelı́culas.

5.4 Análisis por FTIR de los ácidos grasos asociadas a

la membrana
Para esta sección se utilizarán cuatro tipos de muestras: 1) biopelı́culas sometidas a dese-
cación, 2) células planctónicas sometidas a desecación, 3) células planctónicas no desecadas

12
y 4) biopelı́culas no desecadas.
Estos tipos de muestras, el análisis a realizar es in situ es decir con las células sin ningún
tipo de modificación en su estado natural. Esto es debido a la utilización del ATR-FTIR,
espectroscopio que permite la obtención de espectros de muestras sólidas sin ningún tipo
de tratamiento para ası́ obtener información de los diferentes modos de vibración de las
moléculas y enlaces presentes, para estudiar la composición de los lı́pidos de membrana en
los cuatros escenarios y ver los posibles cambios conformacionales y de fase en las membranas
lipı́dicas de la célula bacteriana.
La espectroscopı́a FTIR se basa en la capacidad que tienen las moléculas de absorber
energı́a a ciertas longitudes de onda, conocida como frecuencia de resonancia (vibración).
Da como resultado un espectro de absorción de infrarrojo que determina la estructura y
concentración molecular. Basándose en las bandas de absorción asociadas a un movimiento
de vibración a un enlace especı́fico en las moléculas. Las moléculas como lı́pidos tienen un
espectro de infrarrojo caracterı́stico.
Las bandas de absorción de los lı́pidos están entre 3000 a 2800 cm−1 de los enlaces C-
H (metilo) y las vibraciones CH2 están entre 2922-2852cm−1 . Otra banda de absorción
importante es la de 1750-1720cm−1 asociada al grupo éster de los lı́pidos.
Para el análisis de los cambios conformacionales de la membrana relacionados con las
transiciones entre las fases cristalinas lı́quida y gel es necesario contar con un control de
temperatura.
De esta manera, se procede a tomar el espectro en el espectroscopio ATR-FTIR y por
medio del aumento de temperatura conocido se estudian los picos asociados a los carbonos
asimétricos CH2 acı́licos para ası́ poder determinar la temperatura de transición entre las
dos fases anteriormente mencionadas.

5.5 Análisis estadı́stico. Método ANOVA

ANOVA consiste en un conjunto de modelos estadı́sticos y procedimientos de estimación
que permite analizar y evaluar la importancia de uno o más factores al comparar mediciones
de cierta variable en respuesta a diferentes niveles. La varianza observada en una variable
particular es fraccionada en las diferentes fuentes de variación para ver la incidencia del
factor.
ANOVA establece dos tipos de variables, una dependiente (porcentaje de supervivencia)
y una independiente (presencia de biopelı́cula) están relacionadas entre sı́, si las medidas de
viabilidad son diferentes de la variable independiente, es decir, establece si las medias entre
dos mediciones son lo suficientemente similares o diferentes.
Este análisis estadı́stico en especı́fico permite determinar si una hipótesis nula es falsa,
de tal forma que permitirá saber si la presencia de biopelı́culas es un factor determinante en
la resistencia a la desecación en la bacteria trabajada.

13
 CHAPTER 6

Resultados

La curva de crecimiento obtenida fue la siguiente:

Figure 6.1: Curva de crecimiento

Se realizó el crecimiento de las células bacterianas en el medio King’s B de tal manera

que se obtuvieron dos tipos de muestras: 1) células en estado planctónico y 2) células con
biopelı́culas. Ambos tipos de muestras se sometieron a desecación por aire, se dejaron a
diferentes tiempos de desecación de tal manera que se pudiese estudiar la supervivencia o
viabilidad de las células.
Es importante mencionar que la rehidratación de las células se realizó por medio de la
adición de 5mL de PBS (buffer fosfato salino). La adición de este compuesto está relacionada

14
con la estabilidad de las muestras, pues es necesario que se mantenga un pH constante y
que haya sales disueltas que permiten que la biopelı́cula se disuelva de tal manera que el
agua puede penetrar en la matriz de exopolisacáridos e hidratar las células para su posterior
conteo. Posteriormente, por medio del método SP-SDS (plate-serial dilution spotting) ... se
obtienen
Por otra parte, se calculó el log10 de las UFC y teniendo en cuenta el control negativo se
determinó el porcentaje de células viables con respecto a la muestra inicial. Se obtuvieron
diferentes valores para los porcentajes de viabilidad en contra de los valores determinados
de tiempo para obtener las curvas de viabilidad. La siguiente gráfica obtenida es la curva de
viabilidad para la cepa 89.

Figure 6.2: Porcentaje de viabilidad vs tiempo cepa 89

La siguiente gráfica obtenida es la curva de viabilidad para la cepa 141.

15
 Figure 6.3: Porcentaje de viabilidad vs tiempo cepa 141

A continuación están los resultados para la determinación del porcentaje de humedad en

contra del tiempo por medio del cálculo de contenido de agua en las células por peso seco
para la cepa 89.

Figure 6.4: Porcentaje de humedad vs tiempo de desecación cepa 89

El porcentaje de humedad vs el tiempo para la cepa 141 es el siguiente:

16
 Figure 6.5: Porcentaje de humedad vs tiempo de desecación cepa 141

Los diferentes espectros infrarrojos obtenidos por medio del espectroscopio ATR-FTIR
son los siguientes para biopelı́cula:

(a) Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo (b) Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo
de desecado 5h de desecado 10h

17
(a) Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo (b) Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo
de desecado 20h de desecado 40h

Figure 6.8: Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo de desecado 168h

Los espectros infrarrojos obtenidos para las células en estado planctónico son los sigu-
ientes:

18
(a) Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo (b) Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo
de desecado 5h de desecado 10h

(a) Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo (b) Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo
de desecado 20h de desecado 40h

19
 Figure 6.11: Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo de desecado 168h

Por medio de los diferentes picos obtenidos para las diferentes temperaturas con el proce-
samiento de señales, ajuste de la gaussiana, normalización y determinación del punto máximo
(Tm) se obtuvieron las siguientes gráficas.

(a) Primera derivada de número de onda vs tem- (b) Primera derivada de número de onda vs
peratura para biopelı́cula 5h temperatura para biopelı́cula 10h

20
(a) Primera derivada de número de onda vs tem- (b) Primera derivada de número de onda vs
peratura para biopelı́cula 20h temperatura para biopelı́cula 40h

Figure 6.14: Primera derivada de número de onda vs temperatura para biopelı́cula 168h

Por medio de los diferentes picos obtenidos para las diferentes temperaturas con el proce-
samiento de señales, ajuste de la gaussiana, normalización y determinación del punto máximo
(Tm) se obtuvieron las siguientes gráficas.

21
(a) Primera derivada de número de onda vs tem- (b) Primera derivada de número de onda vs
peratura para planctónico 5h temperatura para planctónico 10h

(a) Primera derivada de número de onda vs tem- (b) Primera derivada de número de onda vs
peratura para planctónico 20h temperatura para planctónico 40h

22
Figure 6.17: Primera derivada de número de onda vs temperatura para planctónico 168h

(a) Tabla de referencia para los ajustes de las

gráficas obtenidas

23
 CHAPTER 7

Análisis y conclusiones

7.1 Crecimiento celular bacteriano, desecado por aire

y porcentajes de viabilidad
De acuerdo con la curva de crecimiento de la bacteria se observó que la bacteria se encuentra
en estado de latencia durante las primeras cinco horas. Esto quiere decir que las bacterias
inoculadas no han empezado a dividirse. Fase en la que los microorganismos empiezan a
adaptarse al medio y aumentan sus actividades enzimáticas para poder empezar a dividirse.
A continuación, en las siguientes diez horas, la bacteria se encuentra en la fase exponencial.
Dicha fase se caracteriza por un crecimiento que está basado en duplicar la cantidad de
bacterias que habı́a en la fase anterior. Esta fase se caracteriza por ser la fase en la que
la actividad metabólica es mayor, es decir, el consumo de diferentes sustratos aumenta por
parte de las bacterias. La última fase dada es llamada fase estacionaria, en esta la población
no puede crecer más y se limita por la cantidad de nutrientes o metabolitos presentes en
el medio de cultivo. En esta fase se da la producción de metabolitos secundarios, como la
producción de alginato el polisacárido sintetizado para la formación de biopelı́culas. Por esta
razón, se trabajó con las células en fase estacionaria.
Las células fueron desecadas en ambas condiciones por medio de la pistola por aire y
se encontraron diferencias en los diferentes tipos de muestras trabajados. Las muestras con
biopelı́culas al ser desecadas se observaron de una coloración más oscura y se observó una
textura cristalina en la superficie de la placa de Petri, en cambio, las células planctónicas al
ser desecadas se adherı́an a la superficie del vidrio con una textura diferente, una coloración
más clara y no se observaba la estructura cristalina que en las biopelı́culas. Esto está asociado
a la estructura molecular del alginato.
En ambas curvas de porcentaje de viabilidad se observa que las células formadoras de
biopelı́cula y tratadas a 3h con PBS obtuvieron la mayor eficiencia. Pues sobrevivı́an más

24
células en esta condición que las células planctónicas, esto está asociado a la cantidad de
agua que hay presente en las células, la resistencia que ejerce la biopelı́cula para evitar la
pérdida de agua, la estabilidad de las membranas y la protección que la misma ejerce sobre
las células ante el estrés osmótico y mecánico ejercido por la pistola de aire.
En el caso de las curvas, se observó una tendencia en las cuatro muestras estudiadas,
permitiendo ver que las células disminuyen su viabilidad con el aumento de las horas de
desecación.
De forma cualitativa, al trabajar con las dos cepas (89 y 141), se observó que la cepa 89
es más resistente a la desecación pues los valores de viabilidad son mayores y la forma de
las curvas permite ver un patrón de disminución que es menor al de la cepa 141. Esto puede
estar asociado a la diversidad metabólica de las bacterias, pues a pesar de tener la misma
morfologı́a y caracterı́sticas macroscópicas la cepa 89 es más compleja de manipular debido
a que esta es más densa y espesa. Esto a su vez puede estar asociado a la producción de
biopelı́cula y se podrı́a suponer que la cepa 89 produce más biopelı́cula y por eso la dificultad
para manipularla y a su vez su resistencia a la desecación.
Desde un punto de vista fı́sico, las biopelı́culas crean microambientes para múltiples
células que no están en medios saturados con agua, el potencial total del agua Ψ es una me-
dida de la energı́a libre del agua que a medida que se va realizando la desecación el potencial
mátrico se vuelve un factor predominante al potencial del agua total. Las biopelı́culas vis-
tas como una matriz de exopolisacáridos que rodea las bacterias pueden atrapar nutrientes,
alterar la difusión de sustancias desde y hacia afuera de las células y pueden concentrar enz-
imas que aumenten la actividad microbiana y, en este caso, pueden actuar como una barrera
fı́sica que protege a las bacterias de estreses mecánicos, quı́micos o ambientales.
Ası́ mismo, hay que tener en cuenta la naturaleza quı́mica de los biofilms, estos al estar
compuestos de alginato que es un compuesto higroscópico (compuestos que atraen agua
debido a su estructura molecular) de tal manera que su presencia crea un microambiente más
hidratado entre bacterias vecinas y de esa manera contribuye a la tolerancia a la desecación.

7.2 Medición del porcentaje de humedad

7.2.1 Medición del porcentaje de humedad por peso seco
El porcentaje de humedad en la biopelı́cula por el comportamiento de la curva se observa que
es mayor para las diferentes horas trabajadas a excepción de la medición realizada para una
semana. El porcentaje de humedad para los escenarios de biopelı́cula es mayor que teniendo
en cuenta las células planctónicas. Esto está relacionado con las ventajas que le confieren las
biopelı́culas a las células bacterianas, pues en este caso las protegen del ambiente para ası́
no generar mayores cambios en las macromoléculas indispensables para su viabilidad, pero
también le confieren una ventaja molecular para atrapar las moléculas de agua. Como se
mencionó anteriormente, el alginato es un material higroscópico que puede atrapar moléculas
de agua por su estructura molecular, permitiendo que estas queden retenidas en la red
cristalina producida por las estructuras moleculares de los exopolisacáridos. Ası́ mismo,

25
teniendo en cuenta las curvas de viabilidad se puede concluir que la cantidad de agua y, por
ende, el porcentaje de humedad es un factor determinativo en la viabilidad de las células. Se
observó que el cambio no fue tan significativo para los cambios de 5 horas, sin embargo, para
las horas 20, 40 y 168 la caı́da de la curva de porcentaje de humedad fue mayor. Mostrándose
que las células sı́ están perdiendo agua por factores entrópicos con el medio externo. Esto
concuerda con lo esperado, debido a que la matriz de exopolisacáridos que rodea a las células
no permite que estas pierdan agua a una tasa mayor que las planctónicas. Finalmente, se
encontró que la cepa 89 presenta una mejor eficiencia en términos de la retención de agua,
pues en todos los casos los valores de porcentaje de humedad fueron mayores con excepción
del valor de 168 horas. Esta cepa puede presentar una mayor resistencia a la desecación
asociada a producción de biopelı́culas.

7.3 Espectroscopı́a infrarroja ATR-FTIR

Por medio de los diferentes espectros obtenidos en el infrarrojo y con los respectivos picos
se les pueden asignar diferentes formas de vibración como las zonas de vibración asociadas a
la membrana. Entre 2960 y 2850 cm−1 se encuentran las siguientes bandas: νa CH3 , νa CH2
, νCHterciario, νs CH3 , νs CH2 . Diferentes bandas asociadas a los ácidos grasos.
Estos son los principales componentes de la membrana celular. En las bandas carac-
terı́sticas encontradas en los espectros para ambos casos: biopelı́cula y planctónico se en-
contró un pico a aproximadamente 1730cm−1 , pico asignado a las vibraciones carbonı́licas:
νC = O (ésteres de los lı́pidos) y en 1710cm−1 están los otros modos de vibración car-
bonı́licos: νC = O (ésteres y ácidos carboxı́licos).
Los primeros tipos de ésteres están relacionados a la estructura de los lı́pidos y por
consiguiente la función de los mismos se relaciona con la membrana. Por otra parte, los
ésteres y ácidos carboxı́licos de la otra banda hacen parte del nucléolo (donde se concentra
la mayor parte de DNA de la célula bacteriana) y los ribosomas.
Ası́ mismo, en todos los espectros encontrados para ambos casos, se encontraron unas
bandas de 1700 a 1580, estas bandas están asociadas a las siguientes estructuras moleculares:
νC = O, νC = N , νC = C y al doblamiento δN H, vibraciones moleculares caracterı́sticas
de los ácidos nucleicos presentes en la muestra (es decir bases de DNA y RNA).
De acuerdo con los picos entre 1690 y 1620cm−1 correspondiente a las bandas de las
amidas primarias (νC = O acoplado con δN H, δH2 O estas bandas están asociadas a las
diferentes proteı́nas presentes en las células, agua 81640cm−1 , estas biomoléculas tienen
diferentes funciones en la célula como membrana citoplasmática, citoplasma, flagelos, pili,
ribosomas.
Las amidas secundarias están asociadas a otras bandas que están entre 1568-1531 cm−1 y
aquı́ hay un acoplamiento entre δN − B acoplada con ν C-N , estas bandas sı́ están asociadas
únicamente a proteı́nas. Hay otras bandas que también permiten obtener información acerca
de los lı́pidos de membrana y son las bandas asociadas al doblamiento de los enlaces CH2 y
CH3 . Caracterizando otros picos se pueden encontrar otras formas de vibración y moléculas
presentes que son funcionales en las células. En 1400cm−1 el νs COO− estas bandas de

26
doblamiento entre el enlace carboxilo, asociados con los aminoácidos y ácidos grasos.
Otros picos que están entre 1317-1281cm−1 asociados a los giros entre los enlaces CH2 y
amida terciaria (C-N acoplado con el doblamiento entre los enlaces N-H) estas bandas están
relacionadas con proteı́nas y ácidos grasos, funciones (membrana, citoplasma, flagelo, pili y
ribosomas).
Hay una banda cercana 1240cm−1 con enlaces P O2 con un doblamiento asimétrico, estos
modos de vibración están asociados al enlace fosfodiéster que se presenta entre los ácidos
nucleicos, fosfolı́pidos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos y ribosas (componentes importantes
en la membrana, nucléolo y ribosomas).
Hay otras bandas relacionadas con otras biomoléculas como lo son las bandas cercanas a
1220cm−1 C-O-C, 1200 cm−1 enlaces C-O, C-C que son bandas caracterı́sticas de polisacáridos
o enlaces glicosı́dicos (enlaces presentes en monosacáridos). Otra banda de suma importan-
cia que se encontró en todos los espectros obtenidos fue la banda cercana 1170-1150cm−1 ,
estas bandas tienen enlaces C-OH y C-O diferentes formas de doblamiento entre los enlaces
carbono y oxı́geno, estas bandas a su vez están asociadas a proteı́nas, carbohidratos, ésteres,
RNA y DNA moléculas presentes y funcionales en el nucléolo y el ribosoma.
Cerca de 1118cm−1 está la banda de la vibración entre dos átomos de carbono enlazados
de forma simétrica (enlaces que se dan entre los ácidos nucleicos como DNA y RNA) de
forma que se da un enlazamiento entre los nucleótidos y se crea el enlace covalente no polar
entre los mismos carbonos.
Otra banda cercana asociada al grupo funcional fosfato es la cercana a 1080cm−1 pero
esta tiene un modo de vibración simétrico. Entre las bandas de 1058 y 1014 cm−1 , C-O-C,
P-O-C y doblamiento entre O-H relacionados principalmente con los polisacáridos y a la
presencia de cápsula y al peptidoglicano presente en la pared bacteriana.
Por otra parte, también es importante notar que los espectros presentan una orma carac-
terı́stica en la banda del agua, esto es congruente con lo esperado pues las moléculas de agua
tienen menor movimiento y, por lo tanto, vibración en la fase desecada en comparación a la
fase planktónica. Por otra parte, también se observa que esta forma se acerca más a la del
agua congelada en el caso del estado planktónico, aspecto que también es congruente con lo
esperado pues las células en estado planktónico tienden a perder más agua que las células
formadoras de biopelı́culas.
Por otra parte, en los espectros caracterı́sticos de las células en estado de biopelı́cula se en-
contraron los picos caracterı́sticos para la estructura molecular y quı́mica del alginato que en
este caso son: picos observados cercanos a 1610cm−1 , 1416cm−1 y 1306cm−1 que se atribuyen
a las vibraciones simétricas y asimétricas de las vibraciones de los aniones carboxı́licos car-
acterı́sticos del alginato. Y por otra parte, se vio que en las células con biopelı́culas en sus
espectros habı́a un pico cercano a 3430cm−1 que se atribuye a las vibraciones atrayentes entre
los grupos hidroxilos. Factor que permite demostrar la presencia del alginato caracterı́stico
en las biopelı́culas de las bacterias pertenecientes a la familia Pseudomonaceae.

27
7.4 Análisis por FTIR de los ácidos grasos asociados a
la membrana
Por medio de espectroscopı́a ATR-FTIR se pueden realizar múltiple análisis biológico debido
a que muchas sustancias se pueden caracterizar, identificar e incluso cuantificar.
El accesorio relacionado con la atenuación de la reflexión total opera de tal forma que
mide los cambios que ocurren en un rayo infrarrojo que se encuentra totalmente reflejado
internamente y que está en contacto con una muestra. Este rayo infrarrojo es dirigido a un
cristal denso ópticamente con un ı́ndice de refracción alto y a cierto ángulo.
Esta reflectancia interna crea una onda evanescente que se extiende a lo largo de la
superficie del cristal. En ciertas regiones del espectro IR donde la muestra absorbe energı́a,
la onda evanescente va a ser atenuada y el rayo atenuado retorna al cristal y sale por el lado
opuesto del cristal y se dirige al detecto en el espectrómetro infrarrojo.
Este último detecta el rayo infrarrojo y mide la señal en un interferograma que posteri-
ormente se utiliza para generar el espectro infrarrojo.
En este caso se utilizó ATR para realizar el análisis bacteriano por diversas razones.
En primera instancia, la versatilidad que tiene el espectroscopio ATR-FTIR para utilizar
diferentes muestras que sean gruesas que generalmente producen picos intensos cuando son
medidas por medio de transmisión.
Este espectroscopio funciona bien debido a que la intensidad de la onda evanescente
decae exponencialmente con la distancia desde la superficie del cristal ATR, haciendo que la
técnica no sea sensible al grosor de la muestra.
Por otra parte, se requiere una preparación mı́nima de la muestra, en este caso, se tiene
que poner la muestra en el cristal y se procede a hacer la medición. Ası́ mismo, es fácil
eficiente para la toma de diferentes espectros pues es una técnica rápida y fácil de limpiar,
simplemente se remueve la muestra y se limpia la superficie del cristal.
El análisis de las muestras en sus estados naturales, es una de las principales razones
por las que se utilizó este tipo de espectroscopı́a en esta investigación, puesto que, no hay
necesidad de calentar, adicionar diferentes sustancias quı́micas u otro tipo de tratamiento
para tratar la muestra.
En este caso, se utilizó un análisis de células in situ esto quiere decir que el análisis espec-
troscópico se realizó directamente en la muestra y sin ningún desplazamiento o tratamiento.
Permitiendo obtener mejores resultados debido a que en el desplazamiento de las muestras
se pueden generar diferentes cambios en el ambiente celular, ası́ mismo, cambios en la con-
formación de la membrana, cambios en el contenido de agua y generar estrés mecánico en
las células bacterianas.
La funcionalidad propia de las membranas celulares es crucial para la protección y esta-
bilización de sistemas vivos. La bicapa lipı́dica compuesta de fosfolı́pidos de membrana es
uno de los componentes más importantes a nivel estructural y funcional de las membranas
celulares, muchos estudios han mostrado que cambios en la membrana especı́ficamente en
el empaquetamiento de los lı́pidos como resultado de la pérdida de agua tiene efectos irre-
versibles en la viabilidad de las células bacterianas.

28
 Las membranas celulares adoptan una gran variedad de conformaciones, incluyendo las
fases lı́quidas lamelares cristalinas Lα y la fase lamelar gel Lβ que son inducidas por liotropı́a
(inducidas osmóticamente) y termotrópicamente (inducidas por cambios en la temperatura).
La fase Lα está caracterizada por una mayor fluidez en la membrana como resultado del
espaciamiento en las cabezas polares de los lı́pidos, decrecimiento en el ordenamiento de los
grupos acilos en los lı́pidos y disminución en el grosor de la membrana. Por otra parte, la
fluidez de la membrana disminuye en la fase Lβ fase en la que hay un empaquetamiento más
denso de las cabezas lipı́dicas, aumento en el ordenamiento de los grupos acilo y aumento
en el grosor del grosor de la membrana.
A medida que se remueve agua de las membranas lipı́dicas por desecación, las cabezas
polares de los lı́pidos se ven forzadas hacia ellas y se incrementa el empaquetamiento de los
lı́pidos, por lo tanto al aumentar el empaquetamiento de los lı́pidos y de las interacciones de
van der Waals entre las cadenas acilo de los hidrocarburos entre los lı́pidos vecinos.
Este aumento en las interacciones entre las moléculas lipı́dicas forzar una transición de
la Lα a la fase Lβ , resultando en una disminución en la fluidez de la membrana. Después de
la rehidratación la fluidez de la membrana aumenta a medida que la célula absorbe el agua
que se encuentra en el medio extracelular y vuelve de nuevo a la fase Lα .
La estructura de la membrana y fluidez son afectadas por la composición de los lı́pidos,
el aumento en la fluidez de la membrana está directamente relacionada con el aumento en la
cantidad relativa de los ácidos grasos insaturados. Debido a un aumento en el desorden de
ácidos grasos insaturados, el empaquetamiento caracterı́stico en la fase Lβ es prevenido y la
membrana celular se mantiene en la fase Lα . Diversos estudios en bacterias han mostrado
que cambios en la composición de lı́pidos de la membrana resultado de diferentes estreses
ambientales como temperatura, pH, inanición y desecación.
Algunas bacterias son conocidas por entrar en un estado VBNC (viable but non-culturable)
esto quiere decir que las células son viables pero no se pueden cultivar debido a diferentes
cambios en el ambiente. En este estado, el crecimiento celular está restringido y la actividad
metabólica está reprimida en comparación a las bacterias que se encuentran en condiciones
normales.
Después de quitar las células de estas condiciones adversas, estas células pueden recu-
perarse y la proliferación celular y las funciones metabólicas normales son recuperadas. En
Pseudomonas fluorescens se ha encontrado que las células llegan a este estado por medio de
la desecación de las células y la mayorı́a de las células pueden volver a su estado cultivable
después de cierto tiempo de rehidratación.
De esta manera, por medio de espectroscopı́a infrarroja de transformada de Fourier
(FTIR) se puede utilizar para examinar cambios estructurales en la mayorı́a de componentes
biológicos bajo diferentes condiciones temperaturas y osmóticas.
Siguiendo con este orden de ideas, FTIR puede identificar y distinguir entre lı́pidos de
membrana y proteı́nas citoplasmáticas por medio del análisis de bandas espectrales que cor-
responden especı́ficamente al tipo de moléculas (proteı́nas en estructura secundaria, cadenas
acı́licas de las moléculas lipı́dicas y enlaces fosfodiéster entre los ácidos nucleicos).
Por medio del estudio de las vibraciones entre las cadenas simétricas acı́licas de CH2 a

29
2850 cm-1 y de asimétricas de CH2 cercanas a 2920cm-1 se pueden estudiar los cambios en
las transiciones de las membranas y de esta manera determinar la temperatura de transición
Tm. Diversos estudios en bacterias, liposomas, partı́culas y polen y células eucariotas son
sometidas a estrés por desecación.
Esta temperatura se caracteriza por el cambio de la fase entre la fase Lα (lı́quida cristalina)
y la fase Lβ (gel). El análisis por FTIR se utiliza para monitorear la fluidez de las membranas
y calcular el valor Tm de las muestras. Esto está relacionado con los cambios conforma-
cionales que se dan entre los lı́pidos que componen la membrana celular (bicapa lipı́dica).
La fase Lα que se caracteriza por una mayor fluidez y espaciamiento entre las cabezas
polares de los lı́pidos, al remover agua de las células, el espaciamiento entre los lı́pidos
disminuye y las interacciones de van der Waals que están asociadas a moléculas covalentes
no polares no cargadas que interactúan por medio de dipolos inducidos entre ellas causando
una interacción que suele ser atractiva.
Los lı́pidos al estar compuestos por cadenas polares y colas apolares (cadenas hidrofóbicas
acı́licas) presentan este tipo de interacciones para las colas hidrofóbicas pues estas son ap-
olares y no presentan dipolos permanentes. Al aumentar el empaquetamiento en los lı́pidos
se aumentan estas interacciones y se favorece la fase gel Lβ .
Para realizar este análisis se utilizará el pico cercano a 2920 que está asociada a los CH2
asimétricos acı́licos, en este caso se estudia el comportamiento de los picos cercanos a este
valor a medida que aumenta la temperatura, pues esta está asociada a los cambios de fase.
Estudiando el valor de los picos con aumentos de 1C se obtuvieron los diferentes cambios
y posteriormente se graficó la primera derivada de los números de onda obtenidos en contra
a la temperatura. Para ası́ estudiar la pendiente y por lo tanto los cambios asociados a este
pico de los carbonos asimétricos con relación a la temperatura.
Utilizando un filtro pasa bajas Seguido esto, para ajustar y suavizar los diferentes datos
experimentales y evitar el ruido, teniendo en cuenta que se tienen suficientes datos para
obtener una curva teórica con una ecuación y parámetros calculables.
Para un mejor ajuste de los datos, se utilizó un filtro pasa baja FFT que permite selección
las frecuencias más bajas a una frecuencia cutoff determinada y atenúa las frecuencias más
altas que este frecuencia.
Seguido esto, para ajustar y suavizar los diferentes datos experimentales y evitar el ruido,
teniendo en cuenta que se tienen suficientes datos para obtener una curva teórica con una
ecuación conocida y parámetros.
Se realizó una normalización de los datos para que el valor máximo se ajustara a un valor
de referencia en este caso 1 para ası́ poder comparar entre las diferentes gaussianas obtenidas
para las diferentes muestras.
Finalmente, se encontró el valor máximo de la gaussiana para ası́ poder determinar la
temperatura de transición para ası́ poder estudiar las propiedades de membrana. Para el caso
de las biopelı́culas, los valores de Tm fueron menores en todos los tiempos en comparación
para las células en planctónico. Esto demuestra que el espaciamiento entre los lı́pidos es
mayor y por lo tanto los lı́pidos de la membrana están menos compactados.
Esto se puede analizar desde el punto de vista molecular, pues al extraer el agua presente

30
en las células los lı́pidos se aproximan entre sı́, en presencia de biopelı́culas esta aproximación
no se ejerce con tanta fuerza debido a la presencia de otras macromoléculas en el medio
extracelular.
Estas moléculas también se van a aproximar entre sı́ y no va a afectar tanto la membrana
celular. En el caso de las células planctónicas al no tener la matriz de exopolisacáridos las
membranas se van a ver más afectadas por la pérdida de agua en las células debido a que los
lı́pidos de la bicapa están totalmente expuestos y al ejercer estrés sobre ellas se verán más
afectadas.
De la misma manera, se observó que el valor Tm en ambos tipos de muestras biopelı́culas
y planctónico aumentó con la cantidad de tiempo de desecación. Mostrando que la com-
pactación en los lı́pidos va aumentando de manera simultánea con la pérdida de agua en las
células y el tiempo que se encuentran desecadas.
Por medio de diferentes técnicas térmicas se pueden estudiar las propiedades de mem-
branas lipı́dicas y biológicas. Se pueden estudiar estas transiciones de fase que se han men-
cionado anteriormente, pues según el modelo hay una transición entre una fase más ordenada,
cristalina a una temperatura baja a una fase más desordenada lı́quida cristalina a una tem-
peratura mayor.
Esta transición de fase entre gel y lı́quido cristalino es una transición altamente coop-
erativa. El efecto endotérmico observado por el calentamiento del sistema a través de la
transición de fase es causado por cambios en la energı́a interna del sistema como el aumento
del número de conformaciones gauche en las cadenas acı́licas de los ácidos grados, también
hay cambios en las interacciones de van der Waals entre las cadenas y las interacciones
polares entre la bicapa lipı́dica y el agua aumentan.
Por otra parte, se habla de un ”melting” o derretimiento de las cadenas de los ácidos
grasos o los carbonos acı́licos que está acompañada por un aumento en el volumen total
de la bicapa lipı́dica. Hay una producción de una expansión lateral que en la bicapa se
experimenta como un fenómeno más grande y se produce un aumento en el área molecular
en la que la interface bicapa-agua se compensa con un adelgazamiento de la membrana en
el estado lı́quido-cristalino.
Ası́ mismo, se puede realizar un análisis semicuantitativo teniendo en cuenta cantidades
fı́sicas termodinámicas para estudiar mejor el proceso de transición de fase. Los cambios
en los picos cercanos a 2920 variando la temperatura tienen muestran cómo las diferentes
cadenas acı́licas asimétricas van cambiando con el aumento de la energı́a del sistema. En este
caso, esta proporción entre los cambios de los picos está asociada con la capacidad calorı́fica
del sistema. Esta capacidad calorı́fica también varı́a con la temperatura y estos cambios
también están asociados con la distribución y conformación que presentan los lı́pidos.
La temperatura de melting en términos de calorimetrı́a está definida como el punto
máximo de la curva ∆Cp (exceso de entalpı́a) vs temperatura. En otras palabras, es la
temperatura en la que el exceso de entalpı́a es 50%, es decir, el número de lı́pidos en fase gel
y fase lı́quida cristalina es igual) debido a que la diferencia en las energı́as libres de los dos
lı́pidos es cero.

31
 La entalpı́a de la curva se puede calcular con la siguiente relación:
Z T1
∆H = ∆Cp ∗ dT (7.1)
T0

Esto muestra que la entalpı́a de melting se puede determinar por medio del área de la curva
para ∆Cp vs T. En este caso y teniendo en cuenta que la relación entre el cambio de los
picos y la capacidad calorı́fica en exceso se mantiene, se puede determinar la entalpı́a para
cada uno de las transiciones de fase para los dos escenarios: biopelı́cula y planctónico.
Ası́ mismo, se puede determinar otra constante fı́sica de importancia termodinámica que
es la entropı́a. Z T1
∆Cp ∗ dT
∆S = (7.2)
T0 T
Si el pico es razonablemente pronunciado (en este caso sı́ por la forma de la Gaussiana) se
establece que T=Tm y la relación para la entropı́a será:
∆H
∆S = (7.3)
Tm
La constante de equilibrio es una función de la temperatura y depende de la entalpı́a:
−∆G
K = exp( ) (7.4)
RT
La entalpı́a seguirá la siguiente relación:
−∆H ∆S
lnK(T ) = + (7.5)
RT R
dlnK
∆H = RT 2 ∗ (7.6)
dT
Y teniendo en cuenta las diferentes probabilidades de encontrar la membrana en cierto
estado, se sabe por la revisión del estado del arte que la probabilidad de encontrar un lı́pido
en el estado lamelar gel es:
1
Pgel = (7.7)
1+K
La probabilidad de encontrar un lı́pido en el estado lı́quido-cristalino es:
K
Pliq = (7.8)
1+K
Con una entalpı́a media por mol de lı́pido dada por la siguiente relación y teniendo en cuenta
las probabilidades de cada una de las fases:

K(T )
< ∆H(T ) >= ∆H ∗ (7.9)
1 + K(T )

32
Utilizando la definición de capacidad calorı́fica:

d < ∆H > K(T ) ∆H 2

Cp = = (7.10)
dT (1 + K(T ))2 RT 2
Para hallar las entalpı́as de transición o de melting se obtuvo el área bajo la curva de la
función gaussiana obtenida para determinar el valor de la temperatura de transición. Esta
área bajo la curva es directamente proporcional a la entalpı́a de transición, es decir la energı́a
requerida para que la conformación de los lı́pidos cambie de fase. A continuación se muestran
las gráficas de las funciones normalizadas con sus respectivas áreas:

(a) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a (b) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a
de transición o melting células crecidas en de transición o melting células crecidas en
biopelı́cula desecadas 5h biopelı́cula desecadas 10h

33
(a) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a (b) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a
de transición o melting células crecidas en de transición o melting células crecidas en
biopelı́cula desecadas 20h biopelı́cula desecadas 40h

Figure 7.3: Área bajo la curva asociada a la entalpı́a de transición o melting células crecidas
en biopelı́cula desecadas 168h

Por medio de los diferentes picos obtenidos para las diferentes temperaturas con el proce-
samiento de señales, ajuste de la gaussiana, normalización y determinación del punto máximo
(Tm) se obtuvieron las siguientes gráficas.

34
(a) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a (b) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a
de transición o melting células crecidas en de transición o melting células crecidas en
planctónico desecadas 5h planctónico desecadas 10h

(a) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a (b) Área bajo la curva asociada a la entalpı́a
de transición o melting células crecidas en de transición o melting células crecidas en
planctónico desecadas 20h planctónico desecadas 40h

35
Figure 7.6: Área bajo la curva asociada a la entalpı́a de transición o melting células crecidas
en planctónico desecadas 168h

Por medio de las áreas obtenidas en las diferentes curvas se puede concluir que la entalpı́a
de necesaria para hacer una transición de fase en las células con biopelı́culas es menor a la
entalpı́a de melting que presentan las células en planctónico. La entalpı́a de melting está
relacionada con la energı́a necesaria para que los lı́pidos de la membrana presenten mayor
fluidez y se pueda generar la transición de fase gel a fase lı́quida-cristalina. En este caso,
los lı́pidos de las células en estado planctónico se encuentran más compactados debido a
que no tienen macromoléculas en su medio extracelular que los protejan de la compactación
de los lı́pidos asociada a la pérdida de agua. Por otra parte, también se observó por las
diferentes gráficas obtenidas que las entalpı́as para las células en planctónico son mayores y
la temperatura de transición o melting sı́ aumentó considerablmente en los dos escenarios
estudiados. Mostrándose ası́ que la entropı́a para las células en estado planctónico son
menor a la entropı́a las células crecidas en biopelı́cula. Resultado esperado, pues la entropı́a
es una función de estado que proporciona información acerca del desorden o aleatoriedad
de un sistema, también puede ser vista como la energı́a térmica que no ejerce trabajo pues
la energı́a se distribuye en mayor proporción si el sistema está más desordenado. En este
caso, el sistema que presenta más desorden es el sistema de las células crecidas en biopelı́cula,
estos lı́pidos se encuentran menos empaquetados y se pueden mover libremente o cambiar las
conformaciones. Por otra parte, la entropı́a también se puede interpretar estadı́sticamente
de la siguiente manera:
S = −k ∗ Σi ∗ Pi ∗ lnPi + const (7.11)
Donde Pi son las probabilidades de los estados individuales del sistema. Donde p1 es la
probabilidad de encontrar al sistema con una entalpı́a H1 y relativo a la probabilidad P0 de
encontrarlo en el estado base con una entalpı́a H0. Es decir está asociado con la probabilidad
que tiene el sistema de cambiar de fase de membrana. Una menor probabilidad estará
asociada a un sistema con mayor entropı́a y viceversa. De esta manera, con los valores de
entropı́a se puede encontrar la probabilidad que tiene la membrana de pasar de una fase a

36
otra.
Los cambios de entalpı́a y entropı́a dependen de las cabezas polares y de la longitud
de las cadenas de los lı́pidos. Las cabezas polares contribuyen a una contribución negativa
a la entalpı́a mientras que las cadenas de los ácidos grasos contribuyen positivamente y la
contribución de la entropı́a depende linealmente de la longitud de la cadena.
La dependencia lineal de la longitud de las cadenas se basa en los diferentes isómeros que
presentan las cadenas entre las conformaciones que se encuentran en los lı́pidos (configura-
ciones gauche y trans). Ası́ mismo, también es importante mencionar que las transiciones
entre las fases de la membrana no están asociadas a lı́pidos individuales sino a clusters de
lı́pidos.

7.5 Análisis estadı́stico. Método ANOVA

El análisis estadı́stico se aplicó para las muestras representativas de datos experimentales,
por ejemplo, en el caso de los experimentos de desecación se obtuvieron seis datos para cada
una de las horas y se realizó un duplicado del mismo.
De esta manera, se obtuvieron 60 datos para cada uno de los tratamientos: biopelı́cula
PBS 1hora, biopelı́cula PBS 3horas, planctónico PBS 1hora y planctónico PBS 3horas. Por
medio del análisis de las varianzas y las gráficas que comparan cada una de las medias se
obtuvo un valor de 1 en el caso del sig. Este valor indica que la diferencia de las medias sı́
es significante ante un nivel escogido.
Para el método ANOVA por un factor es necesario tener en cuenta que el resultado que
arroja si la hipótesis nula (las medias en todos los niveles de medición son las mismas) es
nula en sı́ o no. También está la hipótesis alternativa que dice que las medias de uno o más
niveles son diferentes.
El análisis se realiza con base en un valor dado que de manera estándar para este tipo de
muestras biológicas y en general en estadı́stica se trabaja con un valor de 0,05. Por medio
del cálculo de las medias, la suma de los cuadrados, la raı́z cuadrada media se determina
una probabilidad que en este caso es muchı́simo menor a 0,05.
Por medio de la comparación de medias y utilizando el test Tukey, con la diferencia entre
las medias, el valor de la probabilidad y el valor dado de α = 0, 05 se determinó que el valor
de la significancia es de 1, esto quiere decir que la hipótesis nula es falsa y que los valores
trabajados sı́ son significativamente diferentes.
En este caso, como se está tratando con una sola variable independiente que es biopelı́cula
o no, este análisis estadı́stico permite concluir que la resistencia a la desecación sı́ está
asociada a la formación y presencia de biopelı́culas.
De igual manera, se realizó el análisis estadı́stico ANOVA para determinar los valores
de significancia para los porcentajes de humedad y para los valores de Tm y se encontró
que en ambos los valores de significancia son iguales a uno permitiéndose afirmar que son
valores que son significativamente diferentes estadı́sticamente hablando y que su diferencia
se da por una variable independiente intrı́nseca del sistema que en este caso es la presencia
y formación de biopelı́culas.

37
7.6 Trabajo futuro
Como trabajo futuro y para continuar con la investigación serı́a pertinente buscar la forma de
cuantificar la producción de alginato o la producción de biopelı́cula para ver cómo ésta afecta
la viabilidad de las células. Por otra parte, también se podrı́a buscar la forma de simular
la matriz compleja de las células para ası́ por medio de espectroscopı́a FTIR cuantificar la
cantidad de agua y a su vez, el porcentaje de humedad presente en las células en los dos
escenarios. De la misma manera, se podrı́an repetir los experimentos para determinar otros
valores de temperaturas de melting para ası́ por medio de varias mediciones determinar
estadı́sticamente si este valor es preponderante a la hora de hablar de desecación en células
bacterianas Gram (-) negativas como lo es la bacteria Pseudomonas fluorescens. Ası́ mismo,
se podrı́a analizar a fondo la presencia del otro pico encontrado que puede estar asociado a
una transición de fase en la membrana externa compuesta por lipopolisacáridos caracterı́stica
de estas bacterias. Finalmente, por medio de la cuantificación y determinación de la cantidad
de alginato presente obtener las diferentes temperaturas de melting para ası́ determinar cómo
podrı́a afectar la presencia de las biopelı́culas en la estabilidad de la membrana y por ende,
en su viabilidad.

38
 Bibliography

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40
 List of Figures

4.1 Esquema de formación de biopelı́cula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

5.1 SP-SDS planctónico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

5.2 SP-SDS biopelı́cula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

6.1 Curva de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

6.2 Porcentaje de viabilidad en el tiempo de desecación cepa 89 . . . . . . . . . 15
6.3 Porcentaje de viabilidad en el tiempo de desecación cepa 141 . . . . . . . . . 16
6.4 Porcentaje de humedad en el tiempo de desecación cepa 89 . . . . . . . . . . 16
6.5 Porcentaje de humedad en el tiempo de desecación cepa 141 . . . . . . . . . 17
6.8 Espectro infrarrojo de biopelı́cula, tiempo de desecado 168h . . . . . . . . . 18
6.11 Espectro infrarrojo en planctónico, tiempo de desecado 168h . . . . . . . . . 20
6.14 Primera derivada de número de onda vs temperatura para biopelı́cula 168h . 21
6.17 Primera derivada de número de onda vs temperatura para planctónico 168h 23

7.3 Área bajo la curva asociada a la entalpı́a de transición o melting células cre-
cidas en biopelı́cula desecadas 168h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
7.6 Área bajo la curva asociada a la entalpı́a de transición o melting células cre-
cidas en planctónico desecadas 168h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

41