Fundamentals of MALDI ToF MS

Analysis Applications in Bio diagnosis

Tissue Engineering and Drug Delivery
1st Edition Samira Hosseini
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SPRINGER BRIEFS IN APPLIED SCIENCES AND
TECHNOLOGY  FORENSIC AND MEDICAL BIOINFORMATICS

Samira Hosseini
Sergio O. Martinez-Chapa

Fundamentals of
MALDI-ToF-MS
Analysis
Applications in Bio-
diagnosis, Tissue
Engineering and Drug
Delivery
SpringerBriefs in Applied Sciences
and Technology

Forensic and Medical Bioinformatics

Series editors
Amit Kumar, Hyderabad, India
Allam Appa Rao, Hyderabad, India
More information about this series at http://www.springer.com/series/11910
Samira Hosseini Sergio O. Martinez-Chapa
•

Fundamentals
of MALDI-ToF-MS Analysis
Applications in Bio-diagnosis, Tissue
Engineering and Drug Delivery

123
Samira Hosseini Sergio O. Martinez-Chapa
School of Engineering and Sciences School of Engineering and Sciences
Tecnológico de Monterrey Tecnológico de Monterrey
Monterrey, Nuevo León Monterrey, Nuevo León
Mexico Mexico

ISSN 2191-530X ISSN 2191-5318 (electronic)

SpringerBriefs in Applied Sciences and Technology
ISSN 2196-8845 ISSN 2196-8853 (electronic)
SpringerBriefs in Forensic and Medical Bioinformatics
ISBN 978-981-10-2355-2 ISBN 978-981-10-2356-9 (eBook)
DOI 10.1007/978-981-10-2356-9
Library of Congress Control Number: 2016948623

© The Author(s) 2017

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Printed on acid-free paper

This Springer imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer Nature Singapore Pte Ltd.
The registered company address is: 152 Beach Road, #22-06/08 Gateway East, Singapore 189721, Singapore
Preface

This book presents fundamentals of one of the well-recognized mass spectrometry

techniques, matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spec-
trometry (MALDI-ToF-MS). The book describes the basic principles of this
interesting analytical technique, the history of the invention as well as the mech-
anism of the ionization and mass determination. The book offers strategies on how
to analyze MALDI spectra, how to find the exact matched structure with the
resultant mass values of the spectra and how to determine end-groups for each
polymer chain. In particular, this book explains how MALDI analysis can be
essential in some of the key areas of research such as bio-diagnosis, tissue engi-
neering, and drug delivery. The current book not only helps to understand the
principles of these major areas of research but also provides examples of different
copolymer systems which were designed for these respective applications. In order
to simplify MALDI analysis, monomers in each chapter are shown in different
colors thus they can be easily identified in the structure of the molecules. The book
initially presents MALDI analysis of a copolymer chains with a linear structure
including two monomers. This copolymer system was developed for the purpose of
virus detection as one of the subcategories of bio-diagnostic applications.
Subsequently, a more complex system consists of linear copolymer chains
including three monomers is described in the following chapter. This copolymer
system was designed for the tissue engineering applications. Eventually, a more
complex copolymer system with branched molecular structures is explained that has
the application in drug delivery systems. As you progress with the book, it guides
you through the interpretation of data obtained from this complicated technique
(MALDI-ToF-MS) in the most simplified manner. Moreover, each chapter
describes how MALDI analysis can be essential to gain a better understanding
of the mentioned copolymer systems and their applicability in bio-diagnosis, tissue
engineering, and drug delivery domains.

Monterrey, Mexcio Samira Hosseini

Sergio O. Martinez-Chapa

v
Acknowledgment

Authors would like to acknowledge the financial support of Tecnológico de

Monterrey, Mexico, for the special grant (grant number: 002EICII01) awarded by
the Sensors and Devices Focus Group, School of Engineering and Sciences,
Tecnológico de Monterrey, Monterrey, Mexico.

vii
Contents

1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis . . . . . . . . . . 1

1.1 Background of MALDI-ToF-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Applications of MALDI-ToF-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.2 Organic Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.3 Polymer Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.4 Microbiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.5 Medicine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.6 Nanotechnology. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Ionization Mechanism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Time of Flight Mass Spectrometry Mechanism . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5 Detection Modes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5.1 Linear Mode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5.2 Reflection Mode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.6 Laser Range in MALDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.7 Matrix Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.7.1 Limitations of Matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8 Ionizing Agent Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.9 Fundamentals of Sample Preparation for MALDI Analysis . . . . . . 10
1.9.1 Analyzable and Non-analyzable Polymers . . . . . . . . . . . . . 11
1.9.2 Sample Preparation Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.10 Mass Discrimination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.10.1 Alternative Solutions for Overcoming Mass
Discrimination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 14
1.11 MALDI Coupling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 14
1.11.1 Ion-Mobility Time of Flight Mass Spectrometry
(IMS-ToF-MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 14
1.11.2 Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass
Spectrometry (FT-ICR-MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 15

ix
x Contents

1.11.3 Thin Layer Chromatography (TLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.11.4 Size Exclusion Chromatograph (SEC) . . . . . . . . . . . . . . . . 15
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2 Fundamentals of Biosensors and Application
of MALDI-ToF-MS in Bio-diagnostic Domain . . . . . . . . . . . . . . .... 21
2.1 Biosensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 22
2.2 Synthesis of Poly Methyl Methacrylate-Co-Methacrylic
Acid P(MMA-Co-MAA) and Preparation of the Biochips . . . .... 23
2.3 Sample Preparation for MALDI Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . .... 25
2.4 MALDI Data Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 25
2.4.1 Different Species as the Possible Products
of Soft Ionization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.2 General Structure of P(MMA-Co-MAA) . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.3 MALDI Analysis of PMMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.4 MALDI Analysis of P(MMA-Co-MAA) . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4.5 End-Group Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.5 Role of MALDI Analysis in Bio-sensing Application
of P(MMA-Co-MAA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.5.1 Reaction’s Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.5.2 Chemistry Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.5.3 Physical Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3 Fundamentals of Tissue Engineering and Application
of MALDI-ToF-MS in Analysis of the Scaffold Materials ......... 41
3.1 Tissue Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... 41
3.2 Synthesis of Poly Octanediol Citrate Acid-Sebacate
Acid P(OCS) and Preparation of the Scaffold . . . . . . . . ......... 43
3.3 MALDI Analysis of P(OCS) and Sample Preparation . ......... 44
3.4 MALDI Data Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... 44
3.5 Role of MALDI Analysis in Tissue Engineering
Application of P(OCS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.5.1 Reaction’s Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.5.2 Chemistry Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.5.3 Mechanical Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4 Fundamentals of Drug Delivery Systems and Application
of MALDI-ToF-MS in Drug Delivery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 53
4.1 Drug Delivery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 53
4.2 Synthesis of PCLT-CA and Preparation of Elastomeric
Films and Coatings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 55
4.3 Sample Preparation for MALDI Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . .... 57
4.4 MALDI Data Interpretation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 57
Contents xi

4.5 The Role of MALDI Analysis in Drug Delivery Application

of PCLT-CA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.5.1 Chemistry Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.5.2 Mechanical Aspect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Chapter 1
Principles and Mechanism
of MALDI-ToF-MS Analysis

Abstract This chapter reviews the history and the background of matrix assisted
laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-ToF-MS)
analysis. The chapter covers, application of this technique in variety of different
areas with the special focus on MALDI analysis of the synthetic polymers. Current
chapter describes the principles behind this technique in a great detail. Important
technical aspects such as soft ionization, sample preparation and mass discrimi-
nation are explained in this chapter. In that perspective, the suitable choices of
matrix, ionizing agent and solvents are also discussed. Furthermore, this chapter
reviews the coupled analytical techniques with MALDI analysis and their specific
applications and significances.

Keywords Matrix Ionizing agent Sample preparation Mass discrimination





Linear mode Reflection mode Detection mechanism Ionization mechanism

MALDI coupling

1.1 Background of MALDI-ToF-MS

Mass spectrometry (MS) is an analytical technique that relies on measuring

mass-to-charge ratios of the analyzed samples for the purpose of identifying the
amount and type of the chemical compounds that exist inside the molecules.
Old MS techniques took advantage from the ionization of the sample by bom-
bardment of the analyte with electron beams. This method of ionization typically
results in breaking the sample into thousands of charged fragments [1]. Molecules
in the analyzed sample could then be identified by correlating the known masses to
the resultant patterns of the fragments. Although conventional MS techniques were
quite common and applicable in many different areas of research, they were only
capable of offering “hard ionization”. Therefore, there was no available technique at
the time to preserve the molecules during the ionization or to minimize the chance
of fragmentation [1].

© The Author(s) 2017 1

S. Hosseini and S.O. Martinez-Chapa, Fundamentals of MALDI-ToF-MS Analysis,
SpringerBriefs in Forensic and Medical Bioinformatics,
DOI 10.1007/978-981-10-2356-9_1
2 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

In 1985, soft ionization technique was established by two scientists from

Germany named Hillenkamp and Karas [2]. These researchers discovered that
amino acid alanine could easily be ionized when mixed with amino acid tryptophan
and irradiated by a 266 nm laser pulse [3]. They have also found that other types of
peptides could be ionized after mixing with same kind of “matrix” [3]. More
importantly they have found that in this technique, the molecules are protected from
fragmentation during the ionization procedure by the presence of the matrix. For
that reason, the technique was named soft ionization. Soon after their discovery
opened its way to the scientific community, Koichi Tanaka and his colleagues from
Japan could successfully soft ionize a much bigger molecules by using nitrogen
laser for ionization. Later at 2002, Tanaka won one-quarter of the Nobel Prize in
Chemistry for his contribution in development of the soft desorption ionization
technique for mass spectrometric analysis of biological macromolecules [4]. Karas
and Hillenkamp have subsequently improved the technique based on the concept of
soft ionization and, as a results, first matrix assisted laser desorption ionization
(MALDI-MS) instrument was commercially available in the early 1990s [5].
Four decades before the birth of MALDI, in late 1950s, the technology of time
of flight (ToF) had already been invented; a technique in which charged ions were
forced to fly from a source to the detector so that they could be identified based on
the time of their flight to the ion detector. But ToF was suffering from its poor
resolution and did not find its application in MS techniques. Only later on, it was
realized that the combination of MALDI-MS and ToF technology can results in a
highly sensitive technique that today we know as MALDI-ToF-MS. The applica-
tion of ToF technology, in particular, plays an important role when the reflection
mode is applied for analyzing the specimen.
MALDI has opened numerous windows to the future of the mass analysis
domain. The valuable information that can be extracted from this single fast ana-
lytical technique enables researchers to develop their understanding of different
materials for variety of applications.

1.2 Applications of MALDI-ToF-MS

MALDI analysis has rapidly found variety of applications in many different sci-
entific areas. In particular, MALDI analysis provides essential information about
important parameters such as molecular weight (Mw) and polydispersity of the
compound that can be effectively used for variety of applications such as studying
the synthesis pathways, verifying degradation mechanisms, measurement of the
additives and impurities, product formulations, and identification of compositional
variations. Herein, a brief review on the main applications of MALDI-ToF-MS in
some of the important areas of science is provided:
1.2 Applications of MALDI-ToF-MS 3

1.2.1 Biochemistry

In the field of biochemistry, MALDI is commonly used for the rapid identification
of the proteins. One of the major analytical applications of MALDI-ToF-MS is
peptide mass fingerprinting. It has frequently been reported for revealing amino
acid sequence of the peptides by the aim of post-source decay or high-energy
collision-induced dissociation [6–12].

1.2.2 Organic Chemistry

Some of the organic macromolecules in chemistry such as catenanes, rotaxanes,

dendrimers and hyper-branched polymers have very high molecular weights.
Analyzing such macromolecules normally face limitations in many of the ionization
techniques as it is difficult to produce molecular ions from such microstructures.
Taking advantages of MALDI analysis, molecular weight and chemical structure of
such compounds can be carefully analyzed [13, 14].

1.2.3 Polymer Chemistry

In polymer chemistry, MALDI can be used for analysis of homopolymers,

copolymers and blended polymers. It determines number of key factors that are
crucial in subsequent applications of the polymers. Some of the major important
identifications that can be obtained by MALDI analysis are listed as follows:
1. Unlike other MS techniques at which a single molecular weight is normally
determined for the analyzed polymer compound, MALDI results in a molecular
weight distribution (MWD) for synthetic polymers.
2. MALDI provides information regarding the internal and terminal functional
groups of the polymer chains. Functionality type distribution (FTD) can also be
studied by MALDI analysis, which is essential in some applications.
3. Chemical composition distribution (CCD) of the polymer chains can be deter-
mined in the case of random polymerization. CCD analysis is of a great
importance as it provides information regarding participation of the monomers
in polymerization reaction.
4. MALDI also generates useful information in block copolymer and block-length
distribution analysis.
5. MALDI provides a clear picture of the polymer chain with its exact chemical
structure, number of the monomers involved in polymerization reaction and
possible association of the ionizing agents.
4 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

6. MALDI offers a direct method for identifying end-groups of the copolymer

chains. End-group analysis is critical for understanding the structural properties
of the material and its correlation with polymer formulations [15–21]. It also
plays a vital role when the interface between the end-groups of different
copolymer systems is concerned.

1.2.4 Microbiology

In the area of microbiology, MALDI-ToF-MS can be applied for identification of

microorganisms such as bacteria or fungi. This technique has a great potential for
species identification in the field of medical microbiology in its future develop-
ments [22].

1.2.5 Medicine

MALDI-ToF-MS, in addition to other analytical techniques, is often utilized for

diagnosis of special diseases. Due to the rapid identification of proteins and/or
changes in the structure of the proteins, MALDI holds a great potential in medical
and diagnostic applications [23–26].
MALDI-ToF-MS can also be useful for physicians to find the adequate treatment
as this technique can indicate drug resistance towards conventional antibiotics.
Therefore, physicians can decide if more aggressive antibiotics have to be pre-
scribed to cure the patient [27].

1.2.6 Nanotechnology

MALDI has established important position in the nanotechnology area in the last
few decades. Biopharmaceuticals including protein and peptide drugs became
increasingly important as therapeutic agents in modern nanotechnology and tar-
geted therapy [28]. Presence of the polymers in design and development of new
delivery systems for controlled/sustained drug release provided new means of
application for MALDI analysis in nanotechnology as well. MALDI-ToF-MS in
association with collision-induced dissociation (CID) tandem mass spectrometry
has the ability to detect traces of minimally modified bioactive compounds and to
identify the site of modification within the bioactive molecule [28].
1.2 Applications of MALDI-ToF-MS 5

Among different areas in which MALDI analysis can be a great mean of

assistance, the major focus of this book is on the application of MALDI-Tof-MS
in characterization of synthetic polymers and copolymers in respect to the struc-
tural, MWD, and end-group analysis of the polymer chains. Furthermore, the
importance of MALDI analysis in characterization of synthetic polymers/
copolymers for specific applications in bio-diagnostics, tissue engineering and
drug delivery will be discussed in a great detail.

1.3 Ionization Mechanism

For the first time in the history of MS techniques, MALDI introduced soft ion-
ization of the analyzed samples. When laser beam is irradiated to the targeted spot,
where the sample is mounted, laser pulse with the aim of matrix (and ionizing agent
in some cases) desorbs and ionizes the analyte of interest in an indirect manner. As
a result, a high-mass ion can be produced by this technique (soft ionization). In
order to achieve successful ionization of the sample, chosen matrix has to have a
considerable absorption coefficient at the specific applied wavelength [29]. Matrix
initially acts as a separator for the analyte as it reduces the intermolecular forces by
a phenomenon called matrix isolation [29]. Therefore, it prevents the cluster for-
mation inside the analyte as it is shown in Fig. 1.1. Upon laser irradiation, the
matrix starts its actual role in soft ionization of the analyte by absorbing majority of
the photon energy. Consequently, matrix preserves the analyte from the direct laser
irradiation. The absorbed energy leads to the matrix excitation. Through this
excitation, matrix changes the phase from solid to gas and a dense cloud of gas
expends in the vacuum chamber. The final product of ionized analyte forms as a
result of collision of the neutral analyte molecules and matrix ions [29].

Fig. 1.1 Schematic representation of the soft ionization mechanism of the analyte
6 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

Fig. 1.2 Schematic representation of the time of flight mechanism; the mixture of analyte and
matrix are targeted by laser beam and analyte ions are accelerated and led towards the ion detector
at the end of flight zone

1.4 Time of Flight Mass Spectrometry Mechanism

Soft ionization of the analyte molecules occurs by laser irradiation as it was

described in the previous section. Generated ions that can be matrix ions, analyte
ions or possibly ionized fragments of the analyte molecules are accelerated and led
towards the drift zone (Fig. 1.2). This region is much larger in comparison to the
ionization or acceleration zone. At the end of the flight path, the ion detector is
located that can register the flight time and the intensity of the individual ions that
arrive to the ion detector. As it is expected, heavier analyte ions take longer time to
reach to the detector while lighter ions travel the same distance in a shorter period
of time. Based on the recorded information by the instrument, the ratio of mass per
charge (m/z) can be carefully determined following the equation below:

m=z ¼ 2eEðt=dÞ2 ð1:1Þ

In this equation, m is the mass of the ionized molecule and z is the number of the
electrons that have been removed from the molecule. E in Eq. 1.1 is the accelerating
voltage, e is the elementary charge, t is the time of flight and d is the length of the
drift zone.

1.5 Detection Modes

1.5.1 Linear Mode

Early MALDI instruments were operating based on the linear ToF spectrometer. In
the linear mode, ions of different masses meet the detector based on the time that
1.5 Detection Modes 7

Fig. 1.3 Linear mode MALDI-ToF-MS; heavier ions arrive to the destination later than lighter
ions

they need to travel across the drift zone. As it is expected, ions of higher weights
reach to the detector later than the lighter ions. Therefore, heavier ions occupy
higher values of m/z than the lighter ones (Fig. 1.3).
In theory, since all the ions receive the same amount of kinetic energy, the ions
of same m/z should have the same time of flight and subsequently arrive to their
destination (ion detector) at the same time. In practice, however, the exact same
intensity of the laser irradiation is not felt by the ions of same m/z. For that reason,
there exist a distribution of kinetic energies in each discrete m/z. This phenomenon,
to a considerable extent, reduces the resolution of the spectrum by assigning a
distribution of m/z (Fig. 1.4) [30].

Fig. 1.4 Possible errors in linear mode MALDI-ToF-MS at which the ions of the same m/z reach
the ion detector with different flight time
8 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

Fig. 1.5 Reflection mode in MALDI-ToF-MS and application of mirror method in correcting the
error produced by linear mode

1.5.2 Reflection Mode

The lack of resolution in linear mode was corrected by a more advanced technique,
reflection mode. This sophisticated technique consists of ion mirrors and is
equipped with electric fields that repulse back the ions into the drift zone and force
them to fly back to the detector, which is now installed in the opposite side of the
flight path [31–33]. Figure 1.5 represents the schematic explanation of the reflec-
tion mechanism that refocuses the analyte ions by their masses hence results in
improved resolution.

1.6 Laser Range in MALDI

MALDI analysis requires the use of laser beam in different ranges as follows:
• UV-MALDI: Ultraviolet (UV) MALDI applies laser beam in the UV range such
as nitrogen lasers at 337 nm. UV lasers are the most widely applied laser range
in MALDI analysis.
• IR-MALDI: Although use of infrared (IR) range of laser beam is not as
common as UV, it founds its application as it offers softer mode of ionization.
IR-MALDI is also privileged with the greater material removal (in the case of
biological applications) and higher compatibility with other mass spectrometries
from the category of matrix-free laser desorption techniques [34].

1.7 Matrix Selection

A suitable matrix consists of crystal molecules that, typically, in association with

ionizing agent allows the analyte to be co-crystallized in a homogeneous manner.
When a mixture of matrix and analyte is mounted on the MALDI plate, solvents
1.7 Matrix Selection 9

evaporate leaving behind the crystallized analyte along with the recrystallized
matrix in the MALDI spot. This phenomenon is called co-crystallization. The
quality of the co-crystallization is of a major importance in matrix selection.
Desirable matrix should possess:
• Specific range of molecular weight that permits easy evaporation of the matrix
but not in the sample preparation process.
• Preferable acidic nature for the matrix that acts as the proton source and pro-
motes the ionization [35].
• Wide range of optical absorbance that covers either UV or IR range [36].
• Functionalization with polar groups and subsequent applicability in aqueous
medium [19].
Some of the commonly applied matrices in MALDI analysis are: (i) are
3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid); (ii) a-cyano-4-
hydroxycinnamic acid (CHCA, alpha-cyano or alpha-matrix); and (iii) 2,5-
dihydroxybenzoic acid (DHB).

1.7.1 Limitations of Matrices

Variety of matrix options has been investigated in MALDI analysis and different
levels of efficiencies have been described [19]. Many of the researchers, however,
reported frequent incompatibilities, background effects and limitations for the used
matrices, which are summarized in this section:
• Particular matrices in association with specific ionizing agents may offer limited
stability that can last only for few minutes [19].
• Obscurity in mass spectrum might occur as some of the matrices show
self-polymerization when mixed with analyte and ionizing agent [19].
• Specific matrices have proven to lead to a significant level of mass discrimi-
nation [37, 38].
• Liquid matrices in special cases might cause intense contamination of the ion
source [39].
• In peptides analysis, matrices with low protein affinity (PA) values have induced
more fragmentation than matrices with high PA values [40].

1.8 Ionizing Agent Selection

In the area of synthetic polymers, ionizing agent plays an equally important role as
matrix in analyte ionization. Therefore, selection of a suitable matrix, alone, is not
sufficient and a proper choice of ionizing agent should also be considered. Different
10 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

cations such as lithium, sodium, and cesium would effectively wrap the polymer
chain around them and further promote the soft ionization of the analyte in asso-
ciation with the matrix [41–43]. It is believed that larger ionizing salts produce
more solid conformation with the larger polymer chains if more oxygen atoms
present in the structure. Abundance of oxygen atoms in the polymer chain subse-
quently involves coordination with the salt and results in analyte ionization in a
more efficient manner [29].
Polymers with high cation affinity do not require high concentration of ionizing
agents. In the case of polar polymers, traces of the sodium and/or potassium can be
found in their MALDI spectrum. These elements are normally present in glassware,
solvents and other reagents and considered to be as impurities in MALDI analysis.
Almost all of the synthetic polymers with heteroatoms such as polyethers,
polyacrylates, polyesters and polyamides can be ionized by using sodium or
potassium salts as the ionizing agents. Since polyesters are less flexible than
polyethers and/or polyacrylates, the most probable interaction with the ionizing
agent expectedly occurs at higher molecular weight of the polymer chains.
Synthetic polymers such as polystyrene, polybutadiene, and polyisoprene, which
are polar polymers without heteroatoms, can successfully become ionized by
addition of silver or copper salts. These ionizing agents can interact with double
bonds of such synthetic polymers [42].
Synthetic polymers with neither heteroatoms nor double bonds like polyethylene
and polypropylene present significantly low binding energy between the ionizing
salt and the polymer chain. For that reason, such polymers are not amenable to
MALDI analysis [44].
Detailed investigation on ionization of polystyrene has shown that silver, copper,
and palladium yielded in the most efficient ionization among all the other ionizing
agents [45–47]. However, the isotopic forms of silver and copper complicate the
ionization of the polystyrene chains. In general, application of monoisotopic ion-
izing agents are highly recommended in the literature [48].

1.9 Fundamentals of Sample Preparation for MALDI

Analysis

Successful analysis of the synthetic polymers by MALDI-ToF-MS is strongly

dependent on sample preparation. Characterization of polymeric materials with
different chemical structures might require different types of sample preparation in
order to achieve an effective analysis. It is preferable to use the same solvent for
dissolving analyte and matrix as it minimizes the risk of segregation during the
co-crystallization [19]. Nevertheless, it is known that salts are typically insoluble in
most of the organic solvents used for nonpolar polymers [19]. Maybe the best
method for preparation of the fine mixture is to select a solvent that permits matrix
to crystallize simultaneously or prior to precipitation of the polymer [19].
1.9 Fundamentals of Sample Preparation for MALDI Analysis 11

Another important parameter in sample preparation is the molar ratio of the

analyte-matrix-salt. This factor, in turn, determines whether a mass spectrum will be
achieved or not. In the high mass ranges, formation of multimers might be the case,
which is another source of errors in MWD calculation. Increasing the concentration
of matrix in comparison to the analyte can be a solution to this undesirable effect
[49].

1.9.1 Analyzable and Non-analyzable Polymers

From a practical point of view, analyzable synthetic polymers can be categorized

into the different groups as follows [29, 50]:
• Water-soluble polymers such as polyacrylic acid (PAA) and polyethylene glycol
(PEG)
• Polar organic-soluble polymers such as polyacrylics (PA) and polymethyl
methacrylate (PMMA)
• Nonpolar organic-soluble polymers, such as polystyrene (PS), polyvinyl
chloride (PVC), and polyethylene (PE)
• Low-soluble polymers, such as cured polyimide (PI).
Non-analyzable polymers are generally polymers that are not soluble polymers
in any type of solvents such as polypyrrole (PPY). Such polymers cannot be
analyzed by MALDI as a desirable mixture of matrix, analyte and ionizing agent
cannot be yielded [29].

1.9.2 Sample Preparation Techniques

Variety of techniques for sample preparation has been explained in the literature
[19]. Herein, some of the commonly applied and successful methods for sample
preparation and MALDI spotting are summarized:

1.9.2.1 Dried-Droplet

This method is known as the oldest sample preparation technique [51]. In this
technique, solution of matrix, analyte and ionizing agent have initially been pre-
pared and then mixed by the volume. MALDI spotting can be performed by
depositing droplets of solution mixture on the MALDI plate and drying at ambient
temperature.
12 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

1.9.2.2 Fast Crystallization

This technique is based on rapid crystallization that normally takes place within few
seconds. This method, which is typically performed by the aim of vacuum chamber
results in the smaller scale crystals that subsequently cause less segregation and
significant improvement in reproducibility of the signals and resolution of the
spectrum [52, 53]. Rapid sample drying using nitrogen stream of high purity can
also be considered as an alternative for achieving the same goal [54, 55].

1.9.2.3 Spin Coating

MALDI spotting by using spin coating technique is another method for sample
preparation that results in a greater homogeneity [56]. In this technique, MALDI
plate is placed inside the spin coating chamber and the droplets of the solution
mixture is introduced from the top to the spinning plate under a specific rotation
speed. The solvent rapidly evaporates and a fine layer of coating on the MALDI
plate will be remained.

1.9.2.4 Layer by Layer

In this commonly applied method, a droplet of matrix solution is deposited as the

first layer. If sample preparation involves the use of an ionizing agent, it would be
deposited as the second layer as the salt assists matrix in soft ionization. The top
layer, in this technique, is dedicated to the polymer solution. Between each step of
the coating, deposited samples are allowed to crystallize and dry in room temper-
ature [15, 16]. Layer by layer technique is reported as the signal enhancer in its
application for peptides/proteins analysis [57], analysis of aromatic polyester [58]
as well as organic dendrimers [59].

1.9.2.5 Electrospray Deposition

Among all different technique for sample preparation, electrospray deposition is

perhaps the most promising method, which offers many advantages over other
techniques [60]. This technique results in a very fine and homogeneous
co-crystallization that can happen through one-layer or two-layer deposition of the
samples. In either case, electrospray deposition yields in greater signal intensities
and higher chance of reproducibility in shot-to-shot and/or spot-to-spot analysis
[60].
1.10 Mass Discrimination 13

1.10 Mass Discrimination

Mass discrimination is one of the frequently reported limitations of

MALDI-ToF-MS. This technique generally provides information for relatively
lower molecular mass polymer chains [16, 19, 29]. This phenomenon occurs as a
result of several different factors such as sample preparation, desorption/ionization
procedure, transmission, and detection. Selecting suitable matrix and ionizing agent
are expected to minimize the contribution of sample preparation in mass discrimi-
nation. Furthermore, optimizing the mixing ratios of matrix and salt, in turn, plays a
vital role in successful sample preparation and subsequent efficient co-crystallization
of polymer, matrix and salt. More importantly, the use of one solvent for all the
applied agents makes sample preparation highly effective. In general, all the ele-
ments involved in sample preparation should serve for achieving one goal: highest
level of homogeneousity [19].
With regards to the instrumental parameters, many different factors can be
responsible for mass discrimination. For instance, the channel plate detector with its
limited dynamic range might become saturated by low molecular weight ions such
as matrix ions, analyte ions of the shorter chains or even oligomers. There is an
abundance of lower mass ions in polydisperse polymers and they are capable of
flying faster than relatively heavier molecules. For that reason, the higher mass ions
are not able to reach to the detector before the smaller molecules that already
occupied the detector as Fig. 1.6 illustrates [61]. Despite known drawback of mass
discrimination, MALDI-ToF-MS is still a powerful tool in polymer analysis that
can provide a unique picture of the polymer chain with its structural details.

Fig. 1.6 Mass discrimination in MALDI-ToF-MS; smaller ions such as matrix ions and shorter
polymer chains or oligomers occupy the ion detector as they fly faster than heavier ions; therefore
the bigger ions lose the chance of meeting the detector due to the over saturation of the target
14 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

1.10.1 Alternative Solutions for Overcoming Mass

Discrimination

To increase the detector’s response to the higher molecular mass ions, the
application of higher laser powers can be introduced as an alternative solution [62].
In the ideal case, the laser power should be high enough to initiate complete
ionization but, at the same time, it should be low enough to avoid fragmentation.
From the practical point of view, higher laser powers are required in order to obtain
successful ionization of the higher mass molecules [63].
In that path, many researchers have reported the reduced mass discrimination
when higher laser powers were applied for MALDI analysis [19]. It was observed
that an increase in laser power outcomes in an enhanced ion intensity of the higher
mass molecules. It also results in an increase in the peak intensity of the matrix [19].
Application of stronger laser beams can also encourage dimerization due to the
clustering of the analyte ions in the gas phase, which in turn, yields in a shift in
MWD towards higher values of molecular mass [64]. In some cases, nonetheless,
an unintentional scission in polymer structure has also been reported due to the
higher laser power [65–67].

1.11 MALDI Coupling

Various MS techniques have been combined with MALDI, such as ToF, magnetic
sector, fourier transform (FT), Paul trap, and quadrupole, among which MALDI
ToF-MS and MALDI-FT-MS [29] have been commercialized. Majority of the
available MALDI instruments are equipped with the ToF technology [29]. MALDI
has also been coupled with some other external techniques in an off-line or on-line
mode in order to enhance the analysis. An overview of the MALDI coupled systems
and their significance are provided as follows.

1.11.1 Ion-Mobility Time of Flight Mass Spectrometry

(IMS-ToF-MS)

Ion mobility time of flight IMS-ToF mass spectrometry is an analytical method that
recognizes analyte ions in the gas phase according to their mobility in a carrier
buffer gas. This technique operates at high and low pressure that, in the case of high
pressure, the temperature can be increased up to 100 °C. Although the main
applications of IMS-Tof are in military and security areas, it has also been coupled
with MALDI for identification of phosphorylated and non-phosphorylated peptides
[68, 69].
1.11 MALDI Coupling 15

1.11.2 Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass

Spectrometry (FT-ICR-MS)

Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) is a mass analyzer technique

that measures m/z of the analyte ions based excitation of the ions in a magnetic
field. When the magnetic field is removed, ions that returned back to their original
magnetic momentums release the energy and travel on their specific cyclotron
frequency. Flying ions induce charge on a pair of electrodes as they pass by the
electrodes and produce signals. This signal is analyzed by fourier transform and
becomes translated into a mass spectrum. Combination of MALDI technique with
FT-ICR-MS was found to be a useful analytical method with significantly high
resolution [70].

1.11.3 Thin Layer Chromatography (TLC)

Thin layer chromatography (TLC) has application in different areas such as mon-
itoring reaction progress, identifying compounds, and purity determination of the
substances. The coupling of TLC with MALDI-ToF-MS is normally used for the
extraction purposes. In this combined technique, a TLC plate can be used for
MALDI spotting. By adding a droplet of extraction solvent, the analyte of interest
can be separated from the TLC spot into the solvent. By introducing MALDI matrix
in the next step, co-crystallization occurs on the TLC plate. Data can be analyzed in
an on-line or off-line mode by MALDI. In the literature, TLC/MALDI approach has
been used and reported by different researchers [19, 71, 72].

1.11.4 Size Exclusion Chromatograph (SEC)

Perhaps the most relevant technique to combine with MALDI-ToF-MS is size

exclusion chromatograph (SEC). As it was discussed earlier in the text, MALDI is
incapable of analyzing polymers of higher polydispersity. By joining these two
techniques, pre-fractionation is being used as a practical solution to this problem.
SEC can break the larger polymers into the several fractions that have the narrower
MWD ranges. And MALDI, in turn, is well-established method for fine charac-
terization of the smaller fractions. Another advantage of this joined technique could
be the fact that MALDI’s results can act as the calibration data to confirm SEC
analysis. SEC and MALDI can be coupled in either on-line or off-line mode.
Combination of these two techniques has been reported in the series of publications
[37, 73–75].
16 1 Principles and Mechanism of MALDI-ToF-MS Analysis

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Westmauer und einen Teil der Apsis gänzlich in Trümmern. Nördlich
davon stand eine kleine Kapelle mit vollständig erhaltener Apsis; der
nahe dabeiliegende Sarkophag läßt den Schluß zu, daß die Kapelle
ein Mausoleum gewesen ist. Das östliche Ende der Stadt enthielt
einen Komplex von Gebäuden, aus vieleckigen Steinblöcken
konstruiert; sie umschlossen eine viereckige Umfriedigung mit einem
viereckigen Raum in der Mitte, unter dem sich ein Gewölbe befand,
das jedenfalls ein Grab darstellt. Im äußersten Westen der Stadt
stand ein schöner Turm und einige große, wohlerhaltene Häuser
daneben. Diese Gruppe war durch eine kleine Kirche von der Stadt
selbst getrennt. Nahe bei meinem Lager befand sich ein
wunderliches Gebäude mit zwei unregelmäßig in die Ostmauer
eingebauten Altarplätzen. Meiner Meinung nach ist es vorchristlich.
Die Mauern trugen noch die vollständig erhaltene Wölbung.
Während Mūsa und ich dieses Bauwerk ausmaßen und den
Grundriß zeichneten, wurden wir von zwei Personen in langen
weißen Gewändern und Turbanen beobachtet, die das größte
Interesse für unsre Bewegungen an den Tag legten. Wie Mūsa
sagte, waren es Regierungsbeamte, die den Djebel Sim'ān
besuchten, um mit Rücksicht auf eine Steuererhöhung eine
Volkszählung vorzunehmen.
 Barād, Baldachingrab.

Der nächste Tag war einer der unangenehmsten, deren ich mich
entsinnen kann. Eine dicke Wolkenschicht lag unmittelbar über dem
Gebirge und hüllte uns in kalten, grauen Schatten, während nach
Norden und Süden hin Berge und Ebene im lieblichsten
Sonnenschein lagen. Wir ritten ungefähr eine Stunde nordwärts
nach Keifār, einem großen Dorfe am äußersten Ende des Djebel
Sim'ān. Über dem Tale des Afrīn drüben, der das Gebirge im
Nordwesten begrenzt, erhoben sich die ersten großen Strebepfeiler
des Giour Dagh. Nach Mūsas Aussage enthalten weder das Tal
noch die entfernteren Gebirge weitere verfallene Dörfer; sie hören an
der Grenze des Djebel Sim'ān ganz plötzlich auf, und die syrische
Zivilisation scheint nicht weiter nordwärts gedrungen zu sein. Aus
welchem Grunde ist nicht festzustellen. In Keifār fanden wir drei arg
verfallne Kirchen, an denen aber noch Spuren außerordentlich fein
gearbeiteter Verzierungen sichtbar waren, einige gut erhaltene
Häuser und ein Baldachingrab, ähnlich dem zu Barād. Eine
zahlreiche kurdische Bevölkerung bewohnte das Dorf. Wir kehrten
nach Barād zurück und ritten dann in bitter kaltem Regen und Wind
etwa 1½ Stunde in südöstlicher Richtung weiter nach Kefr Nebu.
Hier sahen wir eine Inschrift auf dem Oberbalken einer Tür, ein paar
kufische Grabsteine und ein sehr schönes, zum Teil wieder
hergestelltes Haus; ich litt aber viel zu sehr unter der Kälte, um
diesen historischen Denkmälern die gebührende Aufmerksamkeit
zuwenden zu können. Ich war bis aufs Mark erkältet und außerdem
so enttäuscht, daß meine Versuche, einige Aufnahmen zu machen,
infolge des Sturmes mißlungen waren, daß ich sofort mein eine
Stunde von Kefr Nebu entfernt in Bāsufān befindliches Lager
aufsuchte, ohne einige weiter südlich liegende Ruinen zu
besichtigen.
Bāsufān ist Mūsas Heimat; wir gingen an seinem Vater vorüber,
der auf dem Kornfeld arbeitete.
»Gott gebe deinem Körper Kraft!« rief Mūsa. Es ist dies der
übliche Gruß für jemand, der Feldarbeit tut.
»Und deinem Körper!« antwortete der Alte und blickte mit seinen
trüben Augen zu uns herüber.
»Er ist schon alt,« erklärte Mūsa im Weiterreiten, »und Kummer
hat ihn getroffen, aber einstens war er der schönste Mann und der
beste Schütze im Djebel Sim'ān.«
»Welcher Kummer?« fragte ich.
»Mein Bruder ist vor wenigen Monaten von einem Blutfeind
erschlagen worden,« antwortete er. »Wir wissen nicht, wer ihn
getötet hat, vielleicht war es ein Verwandter seiner Braut, denn er
wollte sie ohne die Zustimmung ihrer Familie heiraten.«
»Und was ist aus der Braut geworden?«
»Sie ist zu den Ihren zurückgegangen,« sprach er, »aber sie hat
bitterlich geweint.«
Bāsufān wird von gewissen Juden und Christen aus Aleppo als
Sommerfrische benutzt. Sie kommen heraus und wohnen während
der heißen Monate in den Häusern der Kurden, die um diese Zeit in
ihren Zelten hausen. Auch einige hohe Bäume stehen im Süden des
Dorfes, wo sie einen Kirchhof beschatten, auf dem zumeist
mohammedanische Tote ruhen, die oft viele Meilen weit hergebracht
worden sind. Das nahe Tal birgt einen berühmten Quell, der selbst in
regenlosen Jahren, wo alle seine Brüder erschöpft sind, nicht
versiegt.

Mūsa und seine Familie.

Die Kurden pflegten auf den benachbarten Hängen Tabak zu

bauen, und das Kraut wurde seiner Güte wegen hochgeschätzt, so
daß die Ernten immer schnellen Abgang fanden, bis die Regierung
das Tabaksmonopol einführte. Von da ab erhielten die Kurden so
geringe Preise, daß der Anbau nichts mehr abwarf. Andre
Erwerbsquellen hatten sie nicht, und somit hörte die Industrie ganz
auf; die Felder blieben brach liegen, höchstens wurde etwas Korn
angebaut — »und nun sind wir alle arm«, sagte Mūsa zum Schluß.
Noch war ich keine Stunde im Lager, als der Regen aufhörte und
die Sonne durchbrach. Damit war auch unser Lebensmut wieder
hergestellt. In Bāsufān befand sich eine große Kirche, die zu irgend
einer Zeit durch Hinzufügung dreier Türme in ein Fort verwandelt
worden war. Alle Überreste des ursprünglichen Gebäudes zeigten
vortreffliche Arbeit. Die eingebauten Säulen an der Apsis waren
spiralig kanneliert — das erste Beispiel, das ich sah — und die
korinthischen Kapitäle wiesen sorgfältige tiefeingeschnittene
Skulpturarbeit auf. Mūsa zeigte mir auf der Südmauer eine
altsyrische Inschrift, die ich mit vieler Mühe und wenig Erfolg
kopierte: möge der Kuckuck alle altsyrischen Inschriften holen oder
aber die Reisenden mit schärferem Witz begaben! Nachdem ich
alles besichtigt, blieben mir immer noch ein paar helle
Nachmittagsstunden, und ich beschloß, über die Berge nach Burdj
Heida und Kefr Lāb zu gehen, welche beiden Orte ich am Morgen
dank dem Regen und der Kälte links hatte liegen lassen. Mūsa
begleitete mich und nahm seinen »Kompagnon« mit — so wurde er
mir wenigstens vorgestellt —; an welchem Unternehmen sie beide
teilhatten, erfuhr ich nicht. Der Besuch von Burdj Heida war lohnend.
Es besaß einen viereckigen Turm und drei Kirchen, deren eine noch
außerordentlich gut erhalten, und der ein interessantes Gebäude
angefügt war, das vielleicht die Wohnung des Geistlichen gewesen.
Aber hauptsächlich wegen der Unterhaltung meiner beiden
Gefährten war der Ausflug bemerkenswert. Mit Mūsa hatte ich in den
drei Tagen, die wir zusammen verbracht, eine feste Freundschaft
geschlossen, die sich meinerseits nicht nur auf seine mir geleisteten
Dienste gründete, sondern auch auf eine warme Würdigung des
strahlenden Lächelns, mit dem er alles für mich tat. Wir waren
bereits so vertraut miteinander geworden, daß ich glaubte, mit Recht
von ihm einige Aufklärung über die Glaubenslehren der Jezīdi
erwarten zu können. Denn, mag man es auch in Europa damit
halten, wie man will, in Asien ist es nicht höflich, einen Mann nach
seinem Glauben zu fragen, solange er uns nicht für seinen
vertrauten Freund erachtet. Es ist auch nicht ratsam, denn man
macht sich nur verdächtig, ohne eine befriedigende Antwort zu
erzielen. Während wir auf der Schwelle der kleinen Kirche zu Kefr
Lāb saßen, begann ich meine Nachforschungen mit der vorsichtigen
Frage, ob die Jezīdi Kirchen oder Moscheen hätten.
»Nein,« erwiderte Mūsa, »wir verrichten unsre Andacht unter
freiem Himmel. Jeden Tag in der Dämmerung beten wir die Sonne
an.«
»Habt ihr,« fragte ich weiter, »einen Imām, der die Gebete
leitet?«
»An Festtagen,« sagte er, »tut es der Scheich, an anderen Tagen
betet jedermann für sich allein. Wir halten einige Tage für glücklich,
andre für unglücklich. Mittwoch, Freitag und Sonntag sind unsre
guten Tage, der Donnerstag aber bringt Unheil.«
»Warum?« forschte ich.
»Ich weiß nicht. Es ist so.«
»Seid ihr Freunde der Mohammedaner oder stellt ihr euch
feindlich?«
Mūsa antwortete darauf: »Hier in der Gegend von Aleppo, wo
unser nur wenige sind, fürchten sie uns nicht, und wir leben friedlich
miteinander; aber es kommt jedes Jahr ein sehr gelehrter Scheich
aus Mosul zu uns, um Tribut von uns zu erheben, der wundert sich,
daß wir so brüderlich mit den Muselmännern auskommen; denn in
Mosul, wo es viele Jezīdi gibt, herrscht bittre Feindschaft zwischen
ihnen. Dort wollen die Unseren nicht Heeresdienste leisten, wir hier
aber werden Soldaten wie die anderen auch. Ich bin es selbst
gewesen.«
»Habt ihr heilige Schriften?« fragte ich.
»Gewiß,« sagte er, »ich will Ihnen sagen, was sie uns lehren.
Wenn das Ende der Welt herannaht, wird Hadūdmadūd auf Erden
erscheinen. Bis dahin werden die Menschen an Größe so
zusammengeschrumpft sein, daß sie kleiner sind als Grashalme —
Hadūdmadūd aber ist ein mächtiger Riese. Und in sieben Tagen
oder sieben Monaten oder sieben Jahren wird er alle Seen und
Flüsse austrinken, so daß die ganze Erde ausgetrocknet wird.«
»Und dann,« fiel der Kompagnon ein, der Mūsas
Auseinandersetzung mit Eifer gefolgt war, »wird ein großer Wurm
aus dem Staub hervorkommen und Hadūdmadūd verschlingen.«
»Und wenn er ihn aufgefressen hat,« fuhr Mūsa fort, »kommt
eine Flut, die sieben Tage oder sieben Monate oder sieben Jahre
anhalten wird.«
»Und die Erde wird reingewaschen werden,« fügte der
Kompagnon hinzu.
»Und dann wird der Madi kommen,« fuhr Mūsa fort, »und die vier
Sekten zusammenberufen, Jezīdis, Christen, Mohammedaner und
Juden, und der Prophet jeder Sekte muß seine Gläubigen sammeln:
Jezīd die Jezīdi, Jesus die Christen, Mohammed die
Mohammedaner und Moses die Juden. Alle die aber, die während
ihres Lebens den Glauben gewechselt haben, werden im Feuer
geprüft, damit offensichtlich wird, welchem Bekenntnis sie in ihrem
Herzen anhangen. So wird jeder Prophet die Seinen kennen. Das ist
das Ende der Welt.«
»Haltet ihr alle vier Glaubensbekenntnisse für gleichwertig?«
fragte ich.
Mūsa erwiderte (etwas diplomatisch vielleicht): »Christen und
Juden erachten wir uns gleich.«
»Und die Mohammedaner?« erkundigte ich mich.
»Die halten wir für Schweine.«
Das waren Mūsas Glaubenssätze. Was sie bedeuten, will ich
nicht zu wissen behaupten. Hadūdmadūd aber ist wahrscheinlich
Gogmagog, wenn das der Sache zu größerer Klarheit verhilft.
Die Sonne sank, als wir uns von der Kirchenschwelle erhoben
und über die Ruinen von Kefr Lāb heimwärts zu klettern begannen.
Jenseits des Dorfes stießen wir auf brüchigen Boden, und auf der
Spitze des Hügels sah ich große Höhlungen unter den Felsen.
Mūsas Genosse machte Halt vor denselben und sprach:
»An solchen Stellen suchen wir nach Schätzen.«
»Und findet ihr sie?« sprach ich.
Er erwiderte: »Ich habe nie einen entdeckt, aber man hört viel
erzählen. So verlor einst, wie berichtet wird, ein Hirtenknabe eine
Ziege und durchsuchte das Gebirge nach ihr. Endlich fand er sie in
einer Höhle, die ganz mit Goldmünzen gefüllt war. Schnell verstopfte
er den Eingang und eilte heim, um einen Esel zu holen, den er mit
dem Golde beladen konnte. In seiner Hast aber ließ er die Ziege in
der Höhle, und als er zurückkam, fand er weder Höhle noch Ziege,
noch Gold, soviel er auch suchte.«
»Und ein andermal,« sagte Mūsa, »schlief ein Knabe in den
Ruinen von Kefr Lāb und träumte, er hätte einen großen Schatz in
der Erde gefunden und danach gewühlt. Als er erwachte, waren
seine Hände wirklich mit Goldstaub bedeckt, aber er hatte keine
Ahnung mehr von der Stelle, wo er gegraben.«
Keine dieser Erzählungen bot jedoch genügend Anhaltspunkte,
um die Ausrüstung einer Schatzgräberexpedition nach dem Djebel
Sim'ān zu rechtfertigen.
Als wir Bāsufān erreichten, fragte Mūsa, ob seine Schwester
Wardēh (die Rose) sich wohl die Ehre geben dürfte, mir ihre
Aufwartung zu machen. »Und bitte,« fügte er hinzu, »versuchen Sie
doch, sie zum Heiraten zu überreden!«
 Bāsufān, kurdisches Mädchen.

»Zum Heiraten?« fragte ich, »wen soll sie denn heiraten?«

»Irgend jemand,« entgegnete Mūsa gleichmütig. »Sie hat erklärt,
daß ihr die Ehe verhaßt ist, und daß sie in ihres Vaters Haus bleiben
will. Wir können sie nicht davon abbringen. Und doch ist sie jung und
schön.«
Sie sah wirklich sehr hübsch und überdies auch bescheiden aus,
als sie so in meiner Zelttür stand in der kleidsamen Tracht der
Kurdenfrauen, mit der Kaimakschüssel, dem mir zugedachten
Gastgeschenk, in der Hand, und ich muß gestehen, daß ich in dem
Glauben, sie könne ihre Angelegenheiten am besten selbst
versorgen, die Heiratsfrage nicht sehr dringlich betrieb. Sie brachte
mir frisches Brot zum Frühstück für den nächsten Tag und bat mich,
vor meiner Abreise auch ihres Vaters Haus zu besuchen. Das tat ich
und fand die ganze Familie, Söhne, Schwiegertöchter und Enkel zu
meiner Begrüßung versammelt. Obgleich ich erst kurz vorher
gefrühstückt hatte, bestand doch der alte Vater darauf, daß mir Brot
und Schüsseln mit Rahm vorgesetzt wurden, »damit das Band der
Gastfreundschaft uns verbinde«. Schöne, wohlgebildete Leute
waren sie alle; ihre angenehmen Gesichter wurden durch das
Lächeln verklärt, das auch Mūsas Hauptreiz war. Um ihretwillen soll
den Kurden künftighin ein Platz in meinem Herzen bewahrt bleiben.
 Dreizehntes Kapitel.
Am 4. April, früh 8 Uhr, verließen wir Bāsufān und ritten auf
unglaublich felsigen Pfaden südwärts. Wir ließen Kal'at Sim'ān
westlich liegen und umgingen die Ostflanke des Djebel Scheich
Barakāt. Mūsa erklärte, mich noch einen Teil des Weges begleiten
zu müssen, und kam mit bis Deiret Azzeh, einem großen, aus 300–
400 Häusern bestehenden mohammedanischen Dorfe. Hier verließ
er uns, und wir stiegen hinab in die fruchtbare Ebene von Sermeda,
die von den Hängen des Djebel Halakah eingeschlossen ist. Gegen
Mittag erreichten wir das große Dorf Dāna und speisten an dem
berühmten, dem dritten Jahrhundert entstammenden Grabe, das de
Vogüé beschrieben hat. Es ist meiner Meinung nach das lieblichste
unter den geschichtlichen Denkmälern Nordsyriens und könnte in
seiner zierlichen Einfachheit würdig dem choragischen Denkmal des
Lysicrates in Athen zur Seite gestellt werden. Es hielt uns nichts
weiter in Dāna zurück, und als auch unsre Lasttiere angekommen
waren, sandte ich sie mit Michaïl und einem heimischen Führer
voraus nach den Ruinen von Dehes, wo sie Nadjīb und mich
erwarten sollten. Nach einigem Beraten wurden sich Nadjīb und der
Eingeborene auch über die Lage des Ortes einig, der mir nur aus
den Berichten der Reisenden bekannt war. Erst als wir ihn erreicht
hatten, entdeckte ich, daß wir uns in Mehes statt in Dehes befanden.
Schließlich machte es keinen großen Unterschied. Hauptsache war,
daß wir einen bequemen Lagerplatz dort vorfanden. Von Dāna aus
führte mich Nadjīb die alte Römerstraße entlang an einem
römischen Triumphbogen, Bāb el Hawa, vorbei, der malerisch am
Eingange zu einem felsigen Tale erbaut ist. Wir ritten einige Meilen
weit in demselben aufwärts, sahen eine verfallne Kirche und
erstiegen dann den Westabhang durch eine Schlucht, die uns auf
ein weites Hochplateau, dicht an das verödete Dorf Ksedjba führte.
[16] Unser Weg führte uns durch eine Gegend, die mit Blumen und
Gruppen verfallner Häuser und Kirchen wie bestreut war, weiter
nach dem Dorfe Bābiska. Das Herz hüpfte vor Freude beim Anblick
so viel einsamer, unberührter Schönheit. Zwischen diesen Hügeln
war es schwierig, zu sagen, wo Bākirha, die Stadt, der mein
nächster Besuch galt, liegen mochte; aber in der Nähe von Bābiska
fanden wir einige Hirtenzelte, von deren Bewohnern wir den Weg
erfragten. Der Hirt, ein phlegmatischer Mann, behauptete, es gäbe
keinen Weg nach Bākirha, und der Nachmittag wäre für ein
derartiges Unternehmen zu weit vorgeschritten, überdies müßte er
einen Korb Eier nach einer andern Richtung tragen und könnte uns
nicht helfen. Ich aber war nicht so viele Meilen geritten, um so nahe
dem Ziele von meinem Vorhaben abzustehen, und mit etwas Poltern
und viel Überredungskunst brachten wir den Mann endlich dazu, uns
bis an den Fuß des Berges, der Bākirha trägt, zu führen. Er ging
ungefähr eine Stunde weit mit uns und zeigte dann nach dem Gipfel
des Djebel Bārischa. Mit den Worten »Das ist Bākirha« verließ er
uns eilends und kehrte zu seinem Eierkorb zurück.
[16] Die alten Stätten im Djebel Bārischa sind von der
amerikanischen Expedition bereist und beschrieben worden.
Grab zu Dāna.
 Bāb el Hawa.

Da wir uns vergeblich nach einem Pfad umsahen, der uns

hinaufführen sollte zu den Ruinen, die im leuchtenden
Nachmittagssonnenschein oben am Berghang lagen, lenkten wir
unsre Tiere endlich mitten in das Geröll und das blühende
Dornengestrüpp hinein. Aber selbst die Ausdauer der syrischen
Pferde kennt eine Grenze, und die unseren waren fast an derselben
angelangt, nachdem sie schon den ganzen langen Tag über
Felsgestein geklettert. Überdies stand uns noch ein wer weiß wie
langer Ritt bis zu unserm Lager bevor. Und doch mochte ich die
verlockend schimmernden Mauern, die so greifbar nahe über mir
lagen, nicht aufgeben; ich gebot daher dem widerwilligen Nadjīb,
unten mit den Pferden auf mich zu warten, und kletterte allein hinauf.
Schon neigte sich der Tag, und ich eilte schnell vorwärts, aber die
Erinnerung an diesen hastigen Stieg über die steilen Felsen, die halb
in Blumen begraben und von der Sonnenhitze durchglüht waren,
wird mir nicht so leicht aus dem Gedächtnis schwinden. Eine halbe
Stunde später stand ich am Eingang der Stadt vor einer prächtigen
Basilika mit der schönsten abwechslungsreichsten architektonischen
Ausschmückung. Jenseits derselben lagen die verfallenen Straßen,
alles Lebens bar, am Berghange die Häuser, die mit Skulpturen
geschmückten Balkone, die tiefen, überwölbten Torwege, die
säulenbestandenen Marktplätze, — alles war vom goldenen
Sonnenlicht überflutet. Aber ich strebte noch einem weiteren Ziele
zu. Ich stieg einen breiten, gewundenen Weg hinan, bis die Stadt
und die blumigen Wiesenhänge hinter mir lagen, und der Pfad an
einem tiefen Abgrund endete. Nichts mehr lag zwischen mir und
dem Kamme des Bergzuges als eine schroffe Felswand. Das
Gebirge war nämlich hier durch steile Schluchten zerrissen, deren
Böschungen sonnenbeglänzte, fruchtbare Ebenen einschlossen, der
obere Rand dieser Schluchten aber trug auf einem schmalen
Felsplateau einen kleinen lieblichen Tempel. Ich ließ mich an dem
Tore nieder, durch welches die Andächtigen in den Tempelhof
geschritten waren. Unter mir lagen der Nordabfall des Djebel
Bārischa, breite, schöne Täler und die schneegekrönten, von
warmem Dunst umschleierten Häupter des Giour Dāgh. Stadt,
Tempel und Berg, alle lagen sie gleich verödet, nur weit drüben auf
felsigem Pfad blies ein Hirtenknabe seiner zerstreuten Herde eine
wilde, süße Melodie. Der Ton der Rohrpfeife ist so recht die Stimme
der Einsamkeit: getragen von den Wellen der Gebirgsluft, die vom
Hauch der Blumen durchduftet, von den Strahlen der sinkenden
Sonne durchglüht war, schallte sie schrill, klar und leidenschaftslos
herüber zu dem Tore des Tempels. Menschen waren gekommen und
gegangen, das Leben war an den Flanken des Berges heraufgeflutet
und wieder geebbt, die alten Götter aber waren zurückgeblieben und
streckten ihre Zepter über die in friedlicher Einsamkeit und
Schönheit liegenden Felsen und den blühenden Dorn.
 Tempeltor, Bākirha.

Ein Loblied stieg hier, an der Schwelle des Heiligtums, aus

meinem Herzen empor, ehe ich dankerfüllten, freudigen Sinnes den
Rückweg antrat.
Nadjīb bewillkommnete mich mit Ausrufen der Erleichterung.
»Bei Gott,« sagte er, »nicht eine einzige Zigarette habe ich
geraucht, seit ich Ew. Exzellenz aus den Augen verloren. Die ganze
Stunde mußte ich unaufhörlich beten: Gefalle es Gott, daß sie auf
keinen Räuber in den Felsen stößt!«
Um das Versäumte nachzuholen, brannte er die Zigarette an, die
er trotz seiner Angst während meiner Abwesenheit gerollt hatte, und
wenn ich auch nicht zu behaupten wage, daß es wirklich die einzige
war, so muß man seinem Gefühl doch Anerkennung zollen. Ich
glaubte damals (der nächste Tag belehrte mich freilich eines
besseren), daß wir auf dem holperigsten Pfade der Welt in die
Ebene von Sermeda hinabritten. Am Fuße des Berges angelangt,
wandten wir uns südwärts einem Tale zu, das, ein schmaler Streifen
angebauten Bodens, sich zwischen steinigen Höhen dahinwand.
Weiterhin verbreiterte es sich, und wir kamen durch ein großes,
neues Dorf, in dem uns die willkommne Nachricht zuteil ward, daß
unsre Karawane uns bereits voraus war. ¼7 Uhr ritten wir todmüde
in Mehes oder Dehes, welches von beiden es auch gewesen ist, ein.
Es möchte eine harte Probe für unsre Tiere gewesen sein, hätten sie
noch eine Meile weiter aushalten sollen. Mehes war ein prächtiger
Lagerplatz. Es kam nicht oft vor, daß wir unsre Zelte so weit von
jeder menschlichen Wohnung entfernt aufschlagen konnten. Die
Maultiertreiber trauerten dem sauren Quark und anderm Luxus der
Kultur nach, und auch ich vermißte den Quark, aber der Reiz eines
einsamen Lagers vermochte mich über vieles zu trösten. Die Nacht
war still und klar; wir verbrachten sie in dem verfallnen Schiff einer
Kirche und schliefen nach unserm langen Ritt den Schlaf der
Gerechten.
Noch eine Ruine gedachte ich zu besuchen, ehe ich das Gebirge
verließ, und zwar die Kirche von Kalb Lōzeh, die der Beschreibung
nach das schönste Gebäude von ganz Nordsyrien sein mußte und in
Wirklichkeit auch war. Die Lasttiere schickte ich unten herum durch
die Täler und gab Fāris strenge, leider nutzlose Anweisung,
unterwegs nicht zu säumen. Ich selbst machte mich mit Michaïl und
Nadjīb auf, zwei Gebirgszüge, den Djebel Bārischa und den Djebel
el 'Ala zu überschreiten. Es ist am besten, Felsen zu Fuße zu
überklettern, wer aber die ganze gymnastische Leistungsfähigkeit
eines Pferdes kennen lernen will, der muß über den Djebel el 'Ala
nach Kalb Lōzeh reiten. Ich glaubte über diesen Punkt ganz genau
Bescheid zu wissen, muß aber gestehen, daß dieser Streifzug meine
Kenntnis um ein ganz Erhebliches erweitert hat. Nachdem wir einen
unerträglich steinigen Berg westlich von Mehes gerade
hinaufgeklommen waren, erreichten wir den Kamm des Djebel
Bārischa.
Der Boden war hier vielfach mit Felsblöcken bedeckt, aber
zwischen denselben erblickten wir kleine Olivenhaine, Weingärten
und winzige Kornfelder verstreut. Jeder Vorsprung, jede Vertiefung
war ein Garten voll wilder Blumen: große blaue Iris entfalteten ihre
schlanken Knospen im süßduftenden Lorbeerdickicht, und die Luft
war mit dem Wohlgeruch des purpurfarbenen Seidelbast erfüllt. Und
in diesem Paradies wohnte ein sauertöpfischer Bauer, der
unliebenswürdigste und schweigsamste Mensch, den man sich
denken kann. Nach viel erfolglosem Verhandeln (er verlangte
ungeheuerliche Preise für alle Dienste, und da wir in seiner Hand
waren, mußten wir auch schließlich nachgeben) willigte er ein, uns
nach Kalb Lōzeh zu bringen, und führte uns auf einem steilen, in den
Felsen gehauenen Pfad den Djebel Bārischa hinab. Er fiel so gerade
ab und war so schmal, daß wir uns nur mit größter Mühe an einigen
Frauen vorbeidrücken konnten, die mit Bündeln von Reisig —
Reisig! es war blühender Lorbeer und Seidelbast — vom unteren
Abhang heraufgestiegen waren. Am Fuße dieses halsbrecherischen
Abstiegs lag ein tiefes Tal, an dessen einem Ende ein See erglänzte,
und vor uns erhob sich der Djebel el 'Ala, meinem Ermessen nach
nicht mehr als eine Steinmauer, die kein Roß zu erklimmen
vermochte. Unser einsilbiger Führer — glücklicherweise habe ich
seinen Namen vergessen — gab uns zu verstehen, daß unser Weg
dahinauf lag, und da Nadjīb beizustimmen schien, folgte ich
sinkenden Mutes. Es war unbeschreiblich. Wir sprangen und
stolperten über die Steinblöcke, und unsre Tiere sprangen und
stolperten hinter uns drein; sie taumelten am Rande kleiner
Abgründe dahin, in denen ihnen beim Hinabstürzen jeder Knochen
zerschmettert worden wäre. Aber die Vorsehung wachte über uns,
und unversehrt gelangten wir hinauf, wo sich unseren Blicken eine
ebenso liebliche Landschaft zeigte, wie sie drüben auf dem Djebel
Bārischa hinter uns lag. Am Rande eines Olivenhaines machte unser
Führer kehrt, und wir erreichten nach wenig Augenblicken Kalb
Lōzeh.
 Kalb Lōzeh.

Ob die große Kirche je von einer umfangreicheren Niederlassung

umgeben gewesen ist, weiß ich nicht; jetzt finden sich nur noch
wenige Häuserruinen vor, die Kirche steht fast ganz isoliert. Kaum
ein anderes Denkmal syrischer Kunst kommt ihr gleich. Schon beim
ersten Blick wird das Auge des Beschauers gefesselt von dem
turmtragenden Narthex, den weiten Ausbuchtungen des Schiffes,
der mit Säulen geschmückten Apsis, der unvergleichlichen
Schönheit des architektonischen Bildwerkes und den tadellosen
Größenverhältnissen; schaust du aber näher hin, so wirst du
innewerden, daß du hier nicht nur die höchste, letzte
Vervollkommnung der syrischen Kunst, wie sie allein durch
Jahrhunderte währendes Streben erreicht werden konnte, vor dir
hast, sondern daß dieses Bauwerk den Anfang eines neuen Kapitels
in der Architektur der ganzen Welt bezeichnet. Der romanische Stil
in seiner edlen Einfachheit ist ein Kind Nordsyriens. Es ist ein
dankbares Feld für die Phantasie, zu überdenken, wie sich das
Genie dieser Architekten weiter entfaltet haben würde, wäre es nicht
durch die arabische Besitzergreifung gehemmt worden. Sicher ist,
daß sie eine große Künstlerschule gebildet hätten, die sich vielleicht
stark an die klassischen Muster und sicher mehr noch an den Orient
anlehnte, die aber allerorten unverkennbar ihre ebenso kühne wie
edle und schöpferisch tätige Eigenart bekundete. Ein kleiner Trost
liegt in dem Gedanken, daß die Schöpferkraft, die sich in Kalb Lōzeh
offenbart, nie Zeit gehabt hat, in Verfall zu geraten.

Apsis, Kalb Lōzeh.

Wie ich früher gehört oder gelesen, befanden sich in den Bergen
bei Kalb Lōzeh einige drusische Niederlassungen, die von
Auswanderern aus dem Libanon bewohnt wurden, da ich aber noch
keine gesehen, hatte ich ihr Dasein fast ganz vergessen. Nun
standen in der Nähe der Kirche ungefähr ein halbes Dutzend Hütten,
deren Bewohner herauskamen und mir beim Photographieren
zusahen. Und siehe da, es traf mich ein wohlbekannter Blick aus
kohlschwarzen Augen, es fielen mir gewisse Eigentümlichkeiten im
Benehmen auf, die zwar schwer zu beschreiben sind, die aber in