FUNGAL GENOMDA

NTENLER VE
SELFISH GENETK
ELEMENTLER
 1970lerin sonlarndan beri genomun araya giren
diziler olarak adlandrlan genetik elementler
Araya giren diziler inteinler ve intronlar olarak
snflandrlabilir.
ntronlar, primer RNA transkriptlerinden splicing ad
verilen bir srele kesilir.
ntronlarn aksine inteinler, konak proteinler ile
birlikte transkribe edilen ve translasyondan sonra
protein seviyesinde genomdan temizlenen internal
ereve ii insersiyonlardr.
internal protein ve eksternal protein dizilerin
ncleri iin terim olarak intein ve ekstein
 Genin yukarsndaki eksteinler N-ekstein,
aasndaki ekstein diziler ise C-ekstein
olarak isim alr.
N- ve C-ekstein ligasyonu ile bir nc
proteinden internal blgelerin ayrlmasn
salayan translasyon sonras sre ise
protein splicing olarak isimlendirilir.
Yani protein splicing srecinde tek genin
ekspresyonu olgun protein ve insteinden
oluan iki stabil protein retimi ile sonulanr.
 bakteri,arkea, virs ve karyot
genomlarnda 350den fazla intein
tanmlanmtr.
Bu tanmlamalar baskn olarak prokaryot
genomlarnda yaplmtr fakat 70den fazla
karyotik taksonda da bulgular mevcuttur.
karyotik inteinler funguslarn nklear
genomlarnda ve tek hcreli alglerin
nklear genomlar ile plastomlarnda
kodlanmtr.
 simlendirilmeleri
Kabul gren terminolojiye gre intein
isimleri bir cins ve bir tr tanmlamas
( harf olarak ksaltlm) ve bir konak
gen tanmlamas ierir.
rnek olarak S. cerevisiae VMA1 intein
Sce VMA1 olarak adlandrlr.
Bir protein birden fazla protein
ierdiinde ise inteinler roma rakamlar
ile verilir.
 nteinlerin Genel
zellikleri
(makro) ve minimal (mini-) inteinler.
Bu snflandrma inteinlerin bir hedef
endonkleaz domaini ierip iermemesine
dayal yaplr.
Hedef endonkleazlar inteinlerin ve
intronlarn iine yerleik ak okuma
erevelerince kodlanr.
Endonkleazlar blge spesifiktir ve ift
iplik endonkleaz DNAlar genomlar
arasnda kendi kodlama yapan blgeleri ile
komu dizilerin rekombinasyona dayal bir
sre ile lateral transferini destekler.
Bu sre homing (hedef) olarak bilinir
 Potansiyel olarak intein tayan genin inteinsiz
bir allelini kodlayan genomik DNA hedef
endonkleazca kesilir, DNA tamiri srasnda
intein bo allele kopyalanr.
Mini inteinler bifonksiyonel deildir yani
endonkleaz fonksiyonlar yoktur, sadece bir
splicing domaine sahiptir.
Birka splicing etkili mini intein byk
inteinlerden merkezi endonkleaz domainlerin
delesyonu ile olumutur bu yzden splice
mekanizmasnda endonkleaz aktivitesine gerek
olmad aktr.
 Byk inteinlerin splice domainleri endonkleaz
domain tarafnda N-terminal ve C-terminal alt
domainlerine blnmtr.
Her iki alt domain korunmu amino asit
kmeleri ierir; N- terminal alt domaini A, N2, B,
N4 kmeleri; C-terminal alt domaini G ve F
kmeleri ierir.
Bu domainler mini inteinlerde de
tanmlanmtr fakat endonkleaz domaininin C,
D, E ve H motifleri kayptr. Bunlarn yerine mini
inteinler kk bir balayc blge ierirler.
 Btn bilinen inteinler N-terminallerinde Ser,
Cys ya da Ala ve sonlarnda His-Asn ya da
His-Gln tarlar.
N-eksteinin C-terminalinde inteine nclk
eden korunmu bakiye yoktur fakat btn
inteinler C-eksteinin N-terminalinde
deimeyen bakiyeler ierirler ( Ser, Thr ya
da Cys).
En yaygn amino asit numaralama sistemine
gre intein nclerinde N-ekstein ve C-ekstein
bakiyeleri iin srasyla eksi ve art iaretleri
kullanlr.
Numaralama C-ekstein ve inteinin N-
terminalinde balar ve C-terminaline ilerler. N-
ekstein numaralamas C-terminalde balar ve
N-terminale ilerler.
 nteinlerin boyutlu yaps N-terminal
ve C-terminal splicing domainlerin
yaygn bir U benzeri (horseshoe-like)
12- -iplikik yapsndan olutuunu
gstermitir.
Bu yap Hedgehog/(Hint) modl
olarak adlandrlr.
 lgin olarak geliimsel protein GmGIN1,
arbuscular mycorrhizal mantarlardan
Glomus mossae de tanmlanmtr.
Bu proteinin N-terminal domaininde GTP-
balayan proteinlerin yeni bir ailesi ile dizi
benzerlii gsterirken, C-terminali
metazoalardan Hedgehog protein ailesinin
C-terminal blgesiyle arpc bir
homolojiye sahiptir.
Hedgehog proteinlere ek olarak fungal
inteinler ayn zamanda bakteriyal intein-
benzeri diziler (BIL) ile de yapsal zellikler
ve dizi benzerlikleri paylar.
 inteinleri dier ereve ii
insersiyonlardan ayrt etmek iin drt
ana kriter
1) protein ierikli bir intein dier
organizmalardaki homologlardan yoksun bir
diziye sahiptir
2) araya giren dizi 100 amino asitin
zerindedir
3) bu dizi korunmu intein motiflerini (A, B, F
ve G) tar
4) ortaya kan protein rn, inteinsiz ak
okuma erevesinde tahmin edilen protein ile
ayn boyuttadr.
 Protein Splicing
Mekanizmalar
Protein splicing son derece hzldr ve bilindik
sistemlerde ncleri bugne kadar henz
tanmlanamamtr.
Bu ynde ilk dorudan kant Pyrococcus trleri
GB-Dnin sya duyarl DNA polimerazlarndan
kken alan bir intein iin gsterilmitir.
Bu intein klonlanmtr ve prifiye edilen
ncln dier proteinlerin ve kofaktrlerin
yokluunda in vitro protein splicing yapabildii
ispatlanmtr.
Protein splicing drt basamaktan oluur

1) N-ekstein/intein balant noktalarnda N-O veya

N-S sil deiimi
2) transesterefikasyon (C-ekstein ilk bakiyesinin
(+1) yan zincirine N-ekstein transferi)
3) inteinin C-terminalindeki korunmu bir asparjin
bakiyesinin halka halini almas ve inteinin salnm
ile sonulanan peptid bann ayrlmas
4) N ve C-eksteinleri balayan ester/tioester
bann bir peptid bana yeniden dzenlenmesi.
Bu kimyasal srecin detaylar daha kapsaml bir
ekilde tanmlanmtr.
 Pek ok intein iki fragment olarak ortaya
kar, transkripsiyonlar ve translasyonlar
ayr yaplan iki gen tarafndan kodlanr.
Krk intein olarak da bilinen bu inteinler
kendi kendilerine birleip trans- protein
splicing aktivitesini katalizler
.Bu aktiviteyi katalizleyebilen bilinen ilk krk
intein siyanobakterium Synechocystis
PCC6803 rklarnn DNA polimeraz 3 katalitik
alfa alt nitesinde tanmlanmtr.
 Doal ya da yapay inteinler ounlukla
N-terminal intein fragmentte 25-40
amino asit, C-terminal inteinde yaklak
100 amino asitle sonulanan B ve F
motiflerine ayrlr.
Ek olarak dier blgelerde de inteinlerin
yapay olarak ayrld kantlanmtr.
Ssp DnaB mini inteini -iplikleri
arasnda farkl ilmek blgelerinde
ayrlabilir ve protein trans-splicingde
para intein fonksiyon gsteriyor olsa
bile bu farkl ayrlan molekl trans-
splice yapabilirliini korur.
 Mantarlarda nteinler
Fungal organizmalarda sadece cis-splicing inteinler
tespit edilmitir ve bu molekllerin tm nkleer
genom tarafndan kodlanr.
Gnmze kadar mantarlarda 73 tane intein
saptanmtr.
Bunlar chytridlerde, zigomyceteslerde,
ascomyceteslerde ve basidiomyceteslerde
tanmlanmtr.
Bu trlerdeki inteinlerin ou S. cerevisiae VMA1
geni ya da prp8 geni homologlar iindedir fakat
baz inteinler
glutamat sentaz, kitin sentaz, treonil-tRNA sentetaz ve
DNA-baml RNA polimeraz alt nite genlerinde de
bulunmaktadr.
 Saccharomycete mayalarnn ounda VMA1 geni
bu genin ve 67kDa katalitik vakuolar H-ATPaz alt
nitesi genetik bilgisi iin gerekli iki bamsz
blgeden oluan bir tek ak okuma erevesi ierir.
nteinler 394ten 517 amino asit bakiyesine kadar
deien uzunluklarda olabilir.
VMA1 geninin intein elementlerden yoksun allelleri
blnen maya Schizosaccharomyces pombede ve
Neurospora crassay da ieren filamentli
ascomyceteslerde bulunmaktadr.
En iyi karakterize edilen VMA1 inteini S. cerevisiae
(Sce VMA1) VMA1 dir.
 Koufopanou 2002 ylnda yapt almada
24 tr saccharomycete mayasnn 14
trnde VMA1 inteini saplam fakat
inteinlerin amino asit dizileri birbirlerinden
farkl olduunu tespit etmitir.
Saccharomycete mayalarnda bulunan
inteinlerin tm byk inteinlerdir ve iki ayr
domain tarlar:
bir splice domaini ve bir de endonkleaz domaini
 Mantarlarda PRP8
nteinleri
VMA1 inteinin kefinden sonra mantarlarda ikinci bir
non-allelik intein tanmlanmtr, bu intein
basidiomycete Crytococcus neoformans PRP8 proteini
iindedir.
nsan patojeni C. neoformans (Cne) n iki rknda
(Cn3511 ve JEC 21) prp8 geninin iinde nkleer
kodlanan bir intein tanmlanmtr.
PRP8 proteini splisozom kompleksinin ana bileenidir ve
karyotlarda yksek derece korunmutur.
Bu yzden PRP8 proteini hcre canll iin gereklidir ve
PRP8 inteini aktif olmaldr nk inaktivite konakta letal
etkilere yol aar.
Cne PRP8 inteini 172 amino asitlik, VMA1 inteinde
bulunan endonkleaz domaininden yoksun mini
inteindir.
 PRP8 inteinleri zellikle Neosartorya, Aspergillus
ve Penicillium cinslerine ait trlerde
bulunmaktadr.
A. famigatus ve A. nidulansn PRP8 inteinleri
byk inteinler olup endonkleaz domainleri tar.
Afu PRP8 istisna olarak olduka uzun bir
inteindir; 819 (Afu-FRR0163) ve 820 aadan (Afu-
Af293) oluur.
455 aalk endonkleaz domainine ek olarak Afu-
FRR0163da blok Dden sonra 222 aalk bir dizi
araya girer.
 Fungal PRP8 nteinlerin
Aktiviteleri
nteinlerin, olgun proteinin ilevini yapabilmesi iin
ncl proteinden uzaklatrlmalar gerekir nk ou
intein nkleik asit metabolizmasnda grev alan
esansiyel proteinlerin iine lokalize olmutur.
Fungal inteinlerin fonksiyonellii zerine pek ok
deney heterolog sistemlerin ekspresyonuyla
yaplmtr ve konak olarak da E. coli kullanlmtr.
nteinler yabanc proteinlerin iine yerletiinde
kendilerini dar splice edebilirler bylece maltoz
balayc protein gibi heterolog ekstein dizileri, GST
ya da His etiketleri ve tioredoksin bazen etiket olarak
grev yapar.
Tm bunlar Western Blot ile kolayca tespit edilebilir.
 Teekkrler