In vitro DNA

AMPLFKASYONU
PCR
V
E

Uur DEM
 POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR

DNAnn oaltlabilecei bir teknik, 1983 de Kary Mullis adl bir

biyokimyacnn gelitirdii Polimeraz Zincir Reaksiyonudur. lk kez
baarl in virto DNA amplifikasyonu Saiki ve ark. Tarafndan 1985
ylnda gerekletirildi.

Kary Mullis c1983

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-
autobio.html
not amplifikasyon yntemlerinin gelimesinde iki nemli nokta;

1-) termofilik Thermus aquaticus tan sya stabil DNA polimeraz

2-) bilgisayar kontroll termal dng cihazlarnn gelitirilmesi

 PCRnun Kullanld Alanlar

PCRnin gelitirilmesi, molekler biyoteknolojinin ve kullanm alannn da

genilemesine yol amtr.

Molekler biyoloji ve biomedikal aratrmalar

Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalk etkenlerinin tehisi
Gda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmalarn tans
Genetik bozukluklar ve kanser taramalar
Prenetal tan ve cinsiyet belirlenmesi

Gen tedavisi ve DNA alar

Adli tpda sulu tehisi

Antropoloji
 PCRnun alma Prensibi

PCR kk volumlar halinde hazrlanr

(0.5 mllik mikrofj tpne, 100 ml hacminde materyal konur)
PCR iin gerekli malzemeler:

1- Hedef diziyi tayan kalp DNA

(az miktarda ve ilgisiz DNAlarla kontaminasyon sorun

deildir)

2- Kalp DNA ift iplikleri ile eleebilen 2 tr

oligonkleotid primeri (15-30 bazlk ve tek iplikli)

3- Drt tr dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)

4- Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)

Bu materyaller bir tampon zeltisi iinde kartrlr.
MgCl2 gereklidir.
Thermal Cycler ad verilen zel bir cihaz kullanlarak
DNAnn amplifikasyonu gerekletirilir.

Bu cihaz, PCR rneini programlanan s derecelerinde ve

istenilen srelerde tutmaya yarar.
Her bir PCR dngs aamada gerekletirilir.

1- Hedef DNAnn denatrasyonu (95 oC de 5 dak.)

ds DNA nn birka saniyede s ile ss DNA ya ayrlmasdr.
(dngye balamadan 3-5 dk n stma yaplabilir)

2- Primerlerin balanmas (42-52 oC de 5 dak.)

rnek 1-2dk bu sda tutularak primerlerin (spesifik sentetik

oligonkleotitler) ss DNA daki hedef blgelere hibridizasyonu salanr.

3- Polimerizasyon (65-72 oC de 5 dak.)

polimeraz enzimi yardm ile ss DNA kalplarna balanan primerlerin 5 3

ynde uzatlmasdr.

Her dngde elde edilen yeni DNAlar bir sonraki iin kalp grevi
grdklerinden, 25-30 dng sonunda, DNAnn milyonlarca kopyas elde
edilir.
 Taq DNA polimeraz optimal uzama
srasnda yani 72-78 C arasnda 2000
nkleotid/dakika hznda alr.
Polymerase Chain Reaction
In vitro DNA (gene) amplifikasyon teknii

5 3
5 3
5 3
5 3
5 3
>90
DNA
3 5
3 5
3 5
3 5
3 5
Polymerase Chain Reaction

5 3

4060

3 5
Polymerase Chain Reaction

5 3

72

3 5
Polymerase Chain Reaction
5 3
5 3
5 3

>90

4060

72

3 5
3 5
3 5
Polymerase Chain Reaction
5 3

>90

4060

72

3 5
Polymerase Chain Reaction

>90

4060

72
Polymerase Chain Reaction

2n x
PCR: 3 steps
 PCRnun Avantajlar

abuk

Duyarl

Yksek zglle sahip

 PCRnun Dezavantajlar

Pahal

Kros reaksiyonlar/non-spesifik DNA

amplifikasyonu Sterilite

Yalanc pozitif/negatif deerlendirme

Deneyimli personel
Her teknikte olduu gibi PCRda da optimizasyon arttr.

Yksek zgll ve duyarllna ramen;

dk rn miktar
primerlerden kaynaklanabilen non-spesifik rn eldesi
kontaminasyon sonucu yalanc pozitif sonular
gibi sorunlar yaanabilmektedir.

yi bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller kullanlarak bu

sorunlar giderildii taktirde PCR, biyoteknologlarn hayatn
kolaylatran bir tekniktir.
PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler

Bacillus antracis

Corynebacterium diphtheriae

Shigella sp

Vibrio cholerae

Mycobacterium avium

Mycobacterium tuberculosis
PCR ile Saptanan Viral Patojenler

Hepititis A,B,C,E,G

nsan papillomavirus

HIV-I,II

Influenza virus

Rubella virus

Herpes simplex virus

PCR ile Saptanan Fungal Patojenler

Blastomyces dermatitis

Histoplasma capsulatum

Candida albicans

Pneumocyctis carinii
PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler

Plasmodium falciparum

Leishmania sp

Toxoplasma gondii

Trypanosoma sp.
 Amplifikasyon rnlerinin Tespit
Edilmesi

PCR ile amplifiye edilen DNAy tespit

etmenin bir yolu :
Elektroforez
Elektroforez prensibi
Cathode Anode

powder
+ ion
 DNA proteinler ve birok biyomolekller gibi
elektriksel yk tar.
DNA negatif ykldr.Bu nedenle anoda doru
hareket eder.Ykleme katod tarafna yaplmaldr.
DNA moleklleri ekilsel ve elektrik yk
bakmndan benzer olduundan elektroforez
kriterlerine gre ayrlmaz
DNA moleklleri byklklerine gre ancak bir jel
iinde ayrlabilirler.
 DNA moleklleri genellikle agaroz ya da
poliakrilamid jel iinde elektroforez edilir.
Jellerin ierisinde DNA molekllerinin girip
hareket edebilecekleri porlar vardr.

Elektroforez ile ayrlan DNA y grmek iin

ise etidyum bromid ile boyanr.(UV boya)
PCR - analizi
Jel-elektroforez
PCR: Viral detection
Tm Aamalar zetleyecek
Olursak
 Thermal Cycler Elektroforez

3-4 hours

rinlerin deerlendirilmesi UV translminatr

(Agaroz jel)
PCR METOTLARI