GENETICKI INZENJERING I

BIOTEHNOLOGIJA

DNA SEKVENCIRANJE

Mr. sc Emina Atikovic, dipl. biolog

 Zasto DNA Sekvenciranje?
Proces brzog odredivanja tacnog redoslijeda nukleotida
DNA molekule

Poznavanje DNA sekvence omogucava bolje

razumjevanje bioloskih procesa i molekularne osnove
zivota
Redoslijed baza DNA odreduje redoslijed baza RNA
informacija proteina
Omogucava odredvanje moguce promjene DNA
molekule i utvrdivanje uticaja te promjene na biolosku
organizaciju organizma
Moze dati informaciju o specificnosti nekog organizma
Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE
DNA je izgradena od dvije molekule koje su
u obliku spiralne ljestvice - dvojna
zavojnica
Sastoji se od miliona podjedinica -
nukleotida
Svaka nukleotida se sastoji od:
1. Fosfatne grupe
2. Secera od 5 C atoma (deoksiriboze)
3. Nitrogenove baze

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE

Fosfat

Nitrogenova
Baza

Deoksiriboza

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE

Skeletni dio DNA grade fosfatna grupa i

deoksiriboza koje su povezane
nitrogenovim bazama

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE
Postoje cetiri tipa nitrogenovih baza (NUKLEOTIDA)

A T

Adenine
adenin Thymine
Timin

C G
Guanine
Cytosine
citozin guanin
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE
Svaka baza se specificno veze sa drugom
specificnom bazom

Adenin (A) Komplementarni bazni

Timin (T) par

Citozin (C) Komplementarni bazni

Guanin (G) par

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE

Komplementarni bazni parovi poznavanje

sekvence u jednom lancu automatski omogucava
odredivanje sekvence baza u drugom lancu

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
STRUKTURA DNA MOLEKULE
Dva lanca DNA molekule imaju
antipararelnu orijentaciju 53 i 35
5 i 3 se odnosi na skelet (backbone) DNA
molekule vrlo bitan u odredivanju
rasporeda baza
Prema konvenciji odredivanje baza DNA
koristi 53 smijer pise se s lijeva na
desno
Ako znamo sekvencu jednog lanca lako je
odrediti sekvencu drugog
Emina Atikovic
A T

C G

T A

C G

A T

G C

T A
 DNA Sekvenciranje
2 metode odredivanja DNA sekvence:

1. Koristi hemikalije za specificnu razgradnju

DNA molekule Maxam Gilbert DNA
sekvenciranje kraj reakcije oznacava 5 ili
3

2. Koristi specificne inhibitore enzimske

sinteze DNA Sanger sekvenciranje
kraj fragmenta oznacava 5

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija

Metoda razvijena 1976-1977 (Allan Maxam i

Walter Gilbert)
Zahtjeva radioaktivno obiljezavanje na 5
kraju DNA fragmenta koji treba sekvencirati
(obicno reakcija kinaze sa gama 32P ATP)
Hemijski tretman izaziva pucanje na manjim
dijelovima od 1, 2 ili 4 nukleotide u svakoj
od 4 reakcije

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija
Hemikalije za izazivanje loma DNA (samo
jedne baze lanca):

1. Dimethilsulfate DMS (lomi G nukleotide)

2. Sodijum hidroksid NaOH (lomi A nukl.)
3. Formna (mravlja) kiselina (lomi G i A
nukl.)
4. Hidrazin (lomi C i T nukl.)
5. Hidrazin u prisutnosti NaCl (lomi C nukl.)
Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija

DMS FA H H+S

G G C C
G A T C
G G T
G G C C
C
A T
G C
A C
A T

Maxam-Gilbert sekvenciranje se izvodi tako sto se

lomi lanac na specificnim nukleotidama.
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija

Modifikacija ili elminicaija baza stvara

slabu tacku na DNA molekuli

DNA se izlaze piperidin-u pod visokom

temperaturom kako bi se lanac slomio na toj
slaboj tacki

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija - Elektroforeza
Elektroforezom se stvara ladder puknutih
fragmenata koji odgovaraju poziciji te baze na DNA
lancu
Puknuti (modifikovani) fragmenti se stavljaju na gel
u zasebne dzepove (well)
Manji fragmenti daju identitet baze koja je blize
oznacenom kraju
Duzi fragmenti daju identitet baza koje su udaljenije
od oznacenog kraja
U zavisnosti koji je kraj DNA molekule oznacen
raspored baza se cita sa dna do vrha
autoradiograma u smijeru 53 ili 35
 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija - Elektroforeza

3
A
A
G
G G+A T+C C
C
Dugi fragmenti A
A A
C
G
T
G
Kratki fragmenti C
G
A
G
5

Sekvencioni gel se ocitava sa dna prema vrhu (53).

 DNA Sekvenciranje
MAXAM GILBERT SEKVENCIRANJE
Hemijska Degradacija

Ova metoda sekvenciranja se sve manje

koristi prvenstveno zato sto ukljucuje rad sa
opasnim hemijskim i radioaktivnim
substancama

Ova metoda daje relativno male sekvence

tako da je zahtjevnija od Sanger
sekvencione metode

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza

Najcesce koristena metoda sekvenciranja

Za reakciju je potrebno:

1. jednolancana DNA (template)

2. DNA primer
3. DNA polimeraza
4. normalna deoxynucleosidetriphosphat (dNTP
dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
5. modifikovana nukleotida (dideoxyNTP ddNTP
ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) koja ce zaustaviti
elongaciju DNA lanca
Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza
ddNTP su inkorporirane u DNA lanac od
strane polimeraze koristeci ista pravila
ubacivanja normalnih baza

Ubacivanje ddNTP zaustavlja elongaciju

lanca

ZASTO?
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza
Terminalne nukleotide
(ddNTP) nemaju 3OH
grupu koja je potrebna
za formaciju
fosfodiesterskih veza
izmedu nukleotida
DNA polimeraza
zaustavlja elongaciju
DNA molekule
ubacivanjem ddNTP
polimeraza nemoze
ubaciti niti jednu drugu
bazu za nastavljanje
sinteze
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza
Da bi se odredila jedna DNA sekvenca izvode se 4
reakcije po template-u svaka se reakcija koristi za
odredivanje relativne pozicije specificne baze na
DNA lancu

Dodaje se razlicita ddNTP u svaku reakciju koja

sadrzi DNA polimerazu, DNA primer, i dNTP

Omjer izmedu ddNTP i dNTP je bitan za

odredivanje koliko nukleotida je polimeraza
sposobna ubaciti u DNA prije ubacivanja ddNTP i
tako zaustavi elongaciju lanca

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza

DNA primer, ddNTP ili dNTP mogu biti

radio-labeled ili oznaceni na neki drugi
nacin, kako bi omogucili detekciju tek
sintetiziranih DNA lanaca
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza - Elektroforeza

Rezultirajuci fragmenti su toplotom denaturirani i

razdvojeni po velicini gel elektroforezom
Denaturirajuci poliakrilamidni urea gel svaka od
4 reakcije se nalazi u 4 razlicita dzepa (wells) (linije
A, T, G, C)
DNA bandovi su vizualizirani autoradiografijom ili
UV svjetlom DNA sekvenca se moze direktno
ocitati na X-ray filmu ili gel slici

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza - Elektroforeza
Tamni fragmenti u gelu pokazuju DNA fragmente
koji su rezultat terminacije lanca nakon dodavanja
ddNTP-a

Pozicija razlicitih band-ova u 4 linije, od dna prema

vrhu, se koristi za citanje sekvence

Manji fragmenti ukazuju na identitet baze koja je

bliza 5 kraju citanje identiteta proizvoda ide u
53 smijeru

Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
SANGER SEKVENCIRANJE
Enzimska Sinteza - Elektroforeza

3
G
G A T C G
Dugi fragmenti T
A
ddG
A
A
T
C
Kratki fragmenti A
ddG T
G
5

Sekvencirani gel se ocitava sa dna prema vrhu

(53)
 DNA Sekvenciranje
AUTOMATIZOVANO SEKVENCIRANJE

Znacajan napredak u DNA sekvenciranju

Automatizovani sekvencer se koristi za
razdvajanje proizvoda sekvencione reakcije,
detektuje i prikuplja podatke reakcije, i
analizira raspored baza kako bi automatski
deducirao baznu sekvencu DNA fragmenta
Detektuje elongirane proizvode koji su
fluorescentno oznaceni na taj se nacin
eliminira radioaktivnost iz DNA
sekvencionog procesa
Emina Atikovic
 DNA Sekvenciranje
AUTOMATIZOVANO SEKVENCIRANJE
Tipicna duzina sekvenci ocitana auto. sekvencerom
je 500 1000 baza

Neki auto sekvenceri koriste razlicite fluorescentne

boje kako bi oznacili identitet baza

Ovo omogucava da jedna linija ima podatke za DNA

template i 4X povecava kolicinu podataka koji se
nalaze na gelu

Fluorescentne oznake se vezu za DNA primer ili za

ddNTP
 DNA Sekvenciranje
AUTOMATIZOVANO SEKVENCIRANJE
Software za analizu sekvenci daje podatke u vidu teksta i u
formi elektroferogram-a

T/T T/A A/A

5 AGTCTG 5 AG(T/A)CTG 5 AGACTG

 DNA Sekvenciranje
FLUORESCENTNE BOJE

Boje koje absorbuju i emituju fluorescentnu

svijetlost specificnih talasnih duzina

Primjer: fluorescein i derivati rhodamina

U sekvencioniranju ove molekule mogu biti

kovalentno vezane za nukleotide
 DNA Sekvenciranje
FLUORESCENTNE BOJE
U sekvenciranju obojenim primer-ima primer sadrzi
fluorescentnu boju konjugovanu nukleotidu,
oznacavajuci sekvencioni lanac na 5 kraju

ddA

U sekvenciranju obojenih zaustavnih krajeva,

fluorescentne boje su kovalentno vezane za ddNTP,
oznacavajuci sekvencioni lanac na 3 kraju

ddA
 DNA Sekvenciranje
OBOJENI PRIMER-i
Fluorescentna oznaka na sekvencionom primer-u
Primer je sintetiziran 4X i razlicita oznaka (koja
odgovara odredenoj bazi) je vezana za primer tokom
svake sinteze
Izvode se 4 razlicite reakcije, svaka ukljucuje DNA
template, specificni ddNTP, bojom kodirani primer i
reagense neophodne za elongaciju proizvoda
Primeri definisu pocetak produzenog proizvoda (5) a
inkorporiranu ddNTP definise identitet baze 3 kraja
molekule
Nakon zavrsetka reakcije bojom kodirani proizvod je
prikupljen i pripremljen za postavljanje u jednu liniju
na auto sekvenceru
 DNA Sekvenciranje
Bojenje Zaustavnih Krajeva
Identitet baza odreden na osnovu fluorescentnih
oznaka na ddNTP-u
Reakcija se odvija u jednoj tubi koja sadrzi DNA
template, primer, 4 fluorescentno oznacene ddNTP i
ostale reagense potrebne za odvijanje reakcije
Primer oznacava pocetak (5) produzenog proizvoda
a ubacene, bojom kodirane, ddNTP definisu identitet
baze na 3 kraju molekule
 DNA Sekvenciranje
Bojenje Zaustavnih Krajeva
Nakon zavrsetka reakcije produzeni proizvodi su
pripremljeni za stavljanje u jednu liniju na auto
sekvenceru
Prednost ove metode je da su produzeni proizvodi
vizualizirani jedino ako su zaustavljeni sa bojom
obiljezenom ddNTP proizvod zaustavljen prije
vremena nije detektovan
Smanjuje se signal pozadine (dobija se cistiji signal)
 DNA Sekvenciranje
Bojenje Zaustavnih Krajeva
Svaka od 4 ddNTP je obojena drugom bojom
Sobzirom da se zaustavne nukleotide mogu
razlikovati po bojama, sve cetiri reakcije se mogu
izvesti u istoj tubi

T Fragmenti se razlikuju po
AC boji i velicini
GT
G

T
 DNA Sekvenciranje
Bojenje Zaustavnih Krajeva
DNA ladder je vizualiziran na jednoj liniji gela
ili na kapilari

GA
G A T C TC

G
T
C
T
G
A

Slab gel Capillary

 DNA Sekvenciranje
Bojenje Zaustavnih Krajeva
DNA ladder je ocitan na elektroferogramu

Slab gel Capillary

Electropherogram

5 AGTCTG
PITANJA