HPTLC (High

Performance
Thin Layer
Cromatography)

KELOMPOK 3
 HPTLC merupakan metode peningkatan KLT yang
menggunakan teknik konvensial KLT dengan cara lebih
dioptimalkan.
hal ini juga dikenal sebagai Kromatografi planar atau
kromatografi Flat-bed
KEUNTUNGAN
– Kromatogram visual
– Mudah digunakan
– Dapat digunakan pada
banyak sampel
– Biaya operasional dan
pemeliharaan rendah, dll.
KEKURANGAN
– Peralatan HPTLC sangat
mahal dan cukup rumit. Oleh
karena itu, perlu adanya
pengembangan analisis
kuantitatif kromatografi lapis
tipis dengan biaya murah
dengan hasil yang akurat.
Prinsip

Pemisahan menggunakan prinsip adsorpsi atau

partisi, prinsip tersebut bergantung pada sifat adsorben
pada plat dan sistem pelarut yang digunakan.
 HPTLC TLC
1000ům 250ům

Keefektifan Tinggi karena ukuran Kurang

partikelnya lebih kecil
Daya pisah 3-5 cm 10-25 cm
Pembaca Menggunakan UV/Visibel, Tidak memungkinkan
berflourosensi. Pembaca
merupakan tipe lanjutan
dari densitometer
Spot sampel Otomatis Tebal lapisan
Waktu analisis Jarak perpindahan zat lebih Lambat
pendek sehingga waktu
analisis lebih sedikit

Padatan pendukung Berbagai pilihan dari fase Silika gel, keiselguhr,

stasioner seperti silika gel alumina
untuk pH normal dan c8, c18
atau mkode pH sebaliknya
Perkembangan chumber Fase gerak lebih sedikit Lebih banyak
Prosedur dalam HPTLC

a) Persiapan Sampel f) Pra – pengkondisian

b) Pemilihan lapisan g) Fase bergerak
kromatografi h) Perkembangan kromatografi
c) Penotolan i) Deteksi noda
d) pencucian j) Pembacaan dan pencatatan
e) Pengkondisian hasil
 Preparasi Sampel
Tidak sama seperti kromatografi lainnya.
Beberapa langkah untuk pra-perlakuan sampel mungkin diperlukan
seperti Sampling, Perekatan mekanis, Ekstraksi, Filtrasi & penambahan
senyawa kecil.
Untuk kromatografi fase normal menggunakan plat silika gel / yang
telh dilapisi alumina sebelumnya, pelarut umumnya bersifat non-polar
dan mudah menguap.
Karena pelarut polar cenderung memberi bentuk melingkar pada
awalnya.
Untuk kromatografi fase terbalik pelarut polar yang digunakan sebagai
pelarut sampel.
Pemilihan Lapisan Kromatografi

Bergantung pada sifat material yang dipisahkan

Bahan yang biasa digunakan adalah Silica gel 60 F, Alumina, Selulosa dan lain-
lain.
Bahan ini bisa dilapisi dengan plat tangan dengan atau tanpa pengikat
Plat berlapis tersedia secara luas & umum digunakan.
Plat berlapis lebih mahal daripada plat buatan tangan
 Plat
Ukuran: 20 × 20 cm, 10 × 20 cm, 5 × 10 cm, 5 × 7.5 cm
Jenis plat:
A) Plat buatan tangan:
Ukuran: 20 × 20 cm.
Bahan yang digunakan: selulosa, selulosa dengan pati sebagai pengikat,
silika gel, silika gel G, gel silika dengan pati, selulosa actik dengan kalsium
sulfat.
B) Plat berlapis:
Plat berlapis dengan bahan pendukung yang berbeda (Kaca, Aluminium,
plastik) & dengan lapisan sorbent yang berbeda tersedia.
Sorbent thickness 100 - 250 μm digunakan untuk analisis kualitatif &
kuantitatif.
Ukuran Plat
Perbedaan dasar pada TLC & HPTLC
Plat TLC: ukuran partikel 5-20 μm.
HPTLC: ukuran partikel 4-8 μm.

Plat HPTLC berlapis berukuran 20 × 20 cm dengan orium atau

poliester.
Sebelum menangani plat berlapis, perhatikan arah penotolan
sampel karena pengembangan dari kromatografi harus dipetakan
hanya pada satu arah.
Tepi lembaran yang bagus penting untuk mendapatkan nilai Rf
yang konstan.
Pencucian
Plat harus dicuci terlebih dahulu untuk menghilangkan uap air
atau kotoran mudah menguap lainnya.
• Terutama digunakan metanol.
• Untuk menghindari kemungkinan gangguan karena pengotor dengan
pemisahan kromarografi terutama dalam hal pengerjaan kuantitatif,
selalu disarankan untuk membersihkan plat sebelum kromatografi
aktual, proses inidikenal dengan pencucian plat.
Pelarut yang digunakan:
1.Methanol
2.Chloroform: metanol (1: 1)
3.Choloroform: Methanol: Amonia (90: 10: 1)
4.Metilena klorida: Metanol (1: 1)
5.Ammonia solution (1%)
Pengkondisian Plat

Pencucian plat atau Plat yang terkena kelembaban &

sekitarnya perlu diaktifkan dengan menempatkannya
inoven pada 110-120ᴼC selama 30 menit, proses ini disebut
pengkondisian plat/
Plat ditempatkan di oven pada suhu 110-120ᴼC selama
30 menit sebelum digunakan sampel.
Fase Gerak

Fase gerak harus bernilai tinggi.

Dihindari penggunaan fasa gerak yang mengandung lebih dari tiga
atau empat komponen.
Sifat kimiawi, analit dan lapisan sorbent harus dipertimbangkan
saat pemilihan fase gerak.
Pengoptimalan fase gerak diperlukan untuk melakukan HPTLC.
Ruang yang berisi komponen multi MP tidak umum digunakan.
Jenis-jenis Chamber

1. Melalui chamber kembar

2. Chambers persegi panjang
3. Chamber berbentuk V
4. Sandwitch chamber
5. Horizontal chamber
6. Automatic chamber
Masalah yang mungkin timbul
selama perkembangn kromatografi:

Tailing:
• Hal ini terjadi karena adanya jejak kotoran atau adanya lebih dari
satu jenis ionik yang dikromatografi.
• Hal ini dikurangi dengan menyangga sistem fase gerak dengan
larutan asam (asam 1-2% asetat) atau larutan dasar (amonia).
Difusi:
• Ini mungkin karena ketidakseragaman dari fase gerak, difusi
longitudinal antara fasa gerak & fase diam.
Pendeteksian Noda

• Umumnya, deteksi dengan uap yodium Atau dengan

• Deteksi visual pada 254nm lampu UV. Sensitivitas deteksi
bergantung pada spesifikasi untuk reagen yang digunakan.
• Yodium adalah reagen deteksi universal.
• Baik penyemprotan & pencelupan digunakan untuk mengevaluasi
reagen deteksi.
Penggunaan HPTLC
Industri farmasi: Kontrol kualitas, keseragaman konten, uji
keseragaman, pengecekan identitas / kemurnian.
Analisis Makanan: Kontrol kualitas, aditif, pestisida, uji stabilitas,
analisis tingkat sub-mikron aflotoxins dll
Aplikasi Klinik: Studi metabolisme, skrining obat, uji stabilitas dll
Aplikasi Industri: Proses pengembangan dan optimasi, pemeriksaan
dalam proses, validasi dll.
Forensik: Investigasi keracunan