BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

TP.HCM
Khoa: CNSH & KTMT
MÔN: VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI
TRƯỜNG
ĐỀ TÀI: CÁCH ĐẾM SỐ LƯỢNG VI
SINH VẬT TRỰC TIẾP BẰNG BUỒNG
ĐẾM

GVHD:Nguyễn Duy Thanh

NHÓM: 6
 MỤC LỤC
• Cơ sở lý thuyết
I

• Cách tiến hành

II

• Ưu, nhược điểm của từng phương pháp

III

IV • Tài liệu tham khảo

 Mở đầu
Trong bất kỳ một loại mẫu vật nào, muốn biết số lượng
chung của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng
của mỗi nhóm thành phần, đều cần phải đếm số lượng tế
bào của chúng.

Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không
khí và dịch nuôi cấy … người ta có thể sử dụng nhiều
phương pháp khác nhau.
 Mở đầu
Trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả:
• Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng
phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu).
• Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng
cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
Phương pháp đếm trực tiếp bằng
buồng đếm
 Cơ sở lý thuyết
 Phương pháp đếm trực tiếp cho phép ta đếm số lượng vi
sinh vật có kích thước lớn như nấm men, tảo, bào tử vi nấm,
không dùng để đếm vi khuẩn

 Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, nhờ
buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm Hemocytometer
Cấu tạo của buồng đếm
Nguyên tắc cấu tạo của phòng đếm: đó là một phiến kính dày
hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2
khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất
nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông
nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10
mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay
1/4000.000 ml. Phòng đếm có 1 lá kính dày để đậy.
 Cách tiến hành
• Pha loãng mẫu đảm bảo không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ hơn 2,5 tế
bào

• Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu.

• Nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu vào giữa phòng đếm và đậy lại bằng lá kính,
chú ý không để tạo bọt khí.

• Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy các khoang.

• Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên 3 – 5 phút, sau đó tiến hành
đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở
chính giữa).
Sau khi cho lên kính hiển vi
Cách đếm số lượng vi sinh vật
• Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có
4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và
những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều,

• ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ
trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều.
Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con.
 Cách tính toán
• Gọi A là số lượng tế bào đếm được trong 80 ô nhỏ
• Số lượng tế bào trong 1mm3 được tính theo công thức
sau:
số tế bào trong 1mm3

• Trong đó: 4000 = 400*10 (1/400 mm2 : diện tích một ô

nhỏ ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm tới
lammelle)
APL : độ pha loãng
Ưu và nhược điểm của phương pháp
Nhược điểm:
• Ưu điểm : quá trình này • không phân biệt được tế bào
sống và tế bào chết.
cho phép xác định nhanh
• dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh
chóng mật độ vsv chứa vật với các vật thể khác trong
mẫu.
trong mẫu. • khó đạt được độ chính xác
cao.
• Không thích hợp với huyền
phù vi sinh vật có mật độ
thấp.
• Cho xem đoạn clip https://www.youtube.com/watch?
v=pP0xERLUhyc
The end
Xác định số lượng vi sinh
vật gián tiếp bằng phương
pháp đếm khuẩn lạc
 Nguyên tắc của phương pháp
Đếm số lượng vi sinh vật hiếu khí xuất hiện trong
mẫu
Cấy một thể tích mẫu nhất định lên một môi trường
đã tạo lập sẵn( hộp petri), thuận lợi cho việc phát
triển của vi sinh vật
Sau một thời gian nhất định thì mỗi khuẩn lạc được
tạo thành tương ứng với số lượng tế bào phát triển lên
Ta đếm số khuẩn lạc sau đó tính toán số lượng vi
sinh vật
 Nguyên Liệu và thiết bị

• Môi trường nuôi cấy PCA

• Chất hòa tan: Đệm PBP
• Mẫu
 Thiết Bị

Buồng nuôi cấy (incubarto)

Thiết bị đồng nhất mẫu (stomacher)

 Thiết Bị

Máy đếm khuẩn lạc

CÁCH TIẾN HÀNH
Xử lý mẫu

Chuẩn bị dung
dịch pha
Buồng nuôi
Đĩa petri
Chuẩn bị môi
trường

Tính toán

Đếm khuẩn lạc

 1. CÁC BƯỚC XỬ LÝ MẪU

Vận chuyển
• Mẫu ổn định được
và bảo quản giữ ở nhiệt độ
phòng
• Mẫu lạnh được giữ
Rã đông ở nhiệt độ 0-5 oC
• Mẫu lạnh đông
được giữ ở nhiệt độ
Phân tích lạnh đông
mẫu
2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG
CHUẨN BỊ ĐĨA PETRI

GIA NHIỆT MÔI TRƯỜNG

LÀM SẠCH BỀ MẶT LÀM VIỆC

ĐÁNH DẤU RÕ RÀNG

 3. CHUẨN BỊ DỊCH PHA LOÃNG
BPB
MẪU PHÂN TÍCH
VÔ TRÙNG DỊCH PHẢI ĐỒNG PHA LOÃNG
PHA LOÃNG NHẤT DUNG DỊCH

CHỈNH pH KHUẤY TRỘN

ĐỖ ĐĨA
Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng
vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng
que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy
tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho
đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi
trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha
loãng.
Đưa mẫu vào máy ủ

Lật ngược đĩa, đưa vào tủ trong 24 – 48

giờ đối với môi trường Baird Parker
 NUÔI CẤY

• 15-20oC Vi khuẩn ưa lạnh

• 30-35oC Vi khuẩn ưa ấm

• 55oC Vi khuẩn ưa nhiệt

- Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch
Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng,
có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
- Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc
điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ.
- Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng
1 – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục
hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn
lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo
các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và
đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
• Lấy bút chì kẻ 2 hoặc đường chéo ở đáy hộp petri (tuỳ theo số
khuẩn lạc mọc ít hay nhiều) chia hộp thành 4 hoặc 8 phần,
đánh dấu thứ tự từng phần từ 1 – 4 hoặc từ 1 – 8.

• Đếm số khuẩn lạc từng phần, nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã
đếm để tránh trùng lặp.

• Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 gam mẫu được tính theo
công thức sau: 1

N = X .V . M . K
• Trong đó:
N là số tế bào vi sinh vật hay số đơn vị hình thành khuẩn lạc
(CFU) trong 1 gam đất
X là số khuẩn trung bình trong mỗi hộp petri ở cùng độ pha
loãng.
V là thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi hộp petri.
M là độ pha loãng dùng để cấy.
K là hệ số khô kiệt của mẫu (K = 100/(100 – x), x là độ ẩm
của đất)
Chú ý: độ pha loãng thích hợp nhất là độ pha loãng mà số khuẩn
lạc đếm được trong mỗi hộp petri sau khi nuôi cấy là 50 – 150
3. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN
LẠC:
• Ưu điểm:
- Cho phép xác định số tế bào
sống.
- Định lượng chọn lọc vsv.
• Nhược điểm
- Không định lượng được những
vsv quá nhạy
- Không xác định được hình
dạng khuẩn lạc nất định
- Khó làm thuần một dòng
vsv
 Tài liệu tham khảo
• http://luanvan.net.vn/luan-van/phuong-phap-phan-tich-
tong-so-vi-khuan-hieu-khi-determination-aerobic-colony
-plate-count-44996
/
• http://thuvienso.cntp.edu.vn/
• http://
doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-mot-so-phuong-
phap-phan-tich-vi-sinh-vat-gay-benh-co-trong-thuc-pha
m-52608/
 GIÁO ÁN ĐIỆN TỬ
The End
MÔN:KHOA HỌC

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN

LỚP 4

ĐÃ THEO DÕI !