THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ

BUỔI 7:CHIẾT TÁCH PLASMID

pBLUESCRIPT TỪ E. COLI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MẪU
NHỎ
NGUYÊN TẮC CHUNG
NST dài, các
sợi không thể
Bằng nhiệt độ hay hóa chất nối lại hoàn toàn
thành mạch đôi
được nên nó
hình thành tủa
DNA plasmid
do kích thước
nhỏ (8% bộ
gen), sau khi
biến tính thì nó
vẫn hồi tính
được. Nó sẽ
hình thành lại
được trạng thái
sợi đôi và tan
trong dịch nước.
 MCS: vùng tạo dòng, là nơi các enzyme cắt giới hạn hoạt động.
 Điểm Ori: Khởi sự sao chép
 Yếu tố nhận diện: Vùng mang gen kháng kháng sinh ampiciline

Plasmid
pBluescript
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
Chuyện của ngày đầu tiên
Nuôi E.coli trong môi trường LB có bổ sung ampicillin,
37oC,12 – 16h)

Vì sao phải bổ sung ampicillin: plasmid pBluescript có

mang gen kháng kháng sinh ampicillin.
Trong môi trường có ampi thì VK không mang plasmid sẽ
chết, chỉ còn vi khuẩn mang plasmid.
VK có plasmid sẽ không mất plasmid mà còn tăng nhanh số
lượng plasmid.
 CÁC BƯỚC CHÍNH
- Phá vỡ cấu trúc tế bào, bộc lộ TBC
- Biến tính DNA rồi hồi tính, thu dịch nước có DNA
plasmid
- Tinh sạch DNA plamid thu được.

Thực hành chia làm 12 bước nhỏ sẽ có chú giải.

Phá vỡ cấu trúc tế bào, bộc lộ TBC

Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn

Phân tán cắn (hoàn toàn) vi khuẩn bằng GTE: GTE là glucose – tris –
EDTA
 Glucose: Duy trì áp suất thẩm thấu làm tế bào không bị đóng vón
 Tris: Ổn định pH
 EDTA: Bắt lấy cation 2+ (cation 2+ là cofactor của DNAse), làm bất
Phá vỡ cấu trúc tế bào, bộc lộ TBC
SDS – KIỀM:

Phá vỡ cấu trúc màng tế

bào bằng SDS.

SDS còn biến tính protein,

tạo phức SDS – protein khó
tan trong dung dịch.

Kiềm: Biến tính DNA (NST

lẫn plasmid)
Biến tính DNA rồi hồi tính, thu dịch nước có DNA
plasmid
Biến tính bằng SDS – Kiềm
(Đã nói ở trên)
Hồi tính bằng KOAc
KOAc làm hồi tính DNA
Ở pH 4,8 thì DNA hồi tính. Tuy nhiên chỉ có DNA plasmid
hồi tính được do kích thước nhỏ và sẽ tan trong dung dịch.
DNA NST thì không hồi tính được, sẽ hình thành đám rối và
tủa xuống khi ly tâm.
KOAc tác dụng với SDS – protein và tạo ra phức mới là
KDS – protein. KDS (tủa) nên kéo protein tủa theo.

Ly tâm lấy dịch nổi chứa DNA plasmid

Tinh sạch DNA plasmid thu được
Cồn tuyệt đối: tủa DNA
KOAC: tăng hiệu suất tủa DNA
DNA tích điện âm (gốc photphat) nếu nó bị trung hòa bởi điện tích
dương, nó sẽ tủa trong nước. Nhiệt độ càng thấp, càng dễ tủa
Cồn tuyệt đối lạnh háo nước, nó hút nước làm DNA mất nước càng
làm DNA dễ tủa hơn
Vì vậy dùng Cồn Tuyệt đối lạnh/Kali acetate để tủa DNA trong dịch
nước
Dùng cồn 70 lạnh li tâm lại để rửa sạch các Ion còn sót lại….. Cho
DNA sạch
E.Coli mang plasmid Li tâm bỏ dịch
( môi trường LB có Cắn tế bào vi khuẩn
13000 rpm/ 1 phút
ampi, 37oC,12 – 16h)
+ 100 μl GTE
+ 200 μl SDS – Kiềm , úp ngửa, ủ Voxter, ủ 5 phút
đá 5 phút (Phá màng, biến tính)
Dịch trong Dịch Đục
+ 150 μl KOAc
Trộn, ủ đá 5p Sau khi ủ đá, sẽ có tủa, ta
Li tâm 13000 ly tâm để lấy dịch
rpm, 5 phút
+1000 μl cồn tuyệt đối/lạnh
Đổ dịch qua Cắn DNA bộ gen
Ef mới. Úp ngửa, ly tâm (13000
rpm/15 phút), đổ bỏ dịch 100 μl cồn 70/lạnh
nổi Ly tâm (13000 rpm/1
phút)
Hong khô 10 phút ở 55oC Đổ bỏ dịch nổi
Sản phẩm trên máy hong khô
Cắn DNA sạch
sau cùng + 50 μl BDW

Ghi chú tên mẫu: Thứ tự nhóm + thứ tự cá nhân trong nhóm ví
dụ: E.1.1
 CÂU HỎI ÔN BÀI
1.Điều kiện nuôi E.coli để chiết tách DNA plasmid pBluescript?
Tại sao nuôi từ 12 – 16h? Vai trò của ampicilline?
2.Trở ngại khi cắn tế bào không phân tán hoàn toàn trong GTE? Giải
thích?
3.Hiện tượng sau khi cho SDS – Kiềm vào? Giải thích?
4.Hiện tượng sau khi cho KOAc vào? Giải thích? Thành phần có trong
dịch nổi, tủa trắng?
5.Có thể thay KOAc bằng NaOAc được không? Giải thích?
6.Biến tính và hồi tính DNA là gì? Các phương pháp biến tính và hồi tính
DNA trong bài?
7.Các bước trong nguyên tắc tách chiết DNA plasmid? Tên hóa chất
tương ứng?
8. Nguyên tắc loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid?
9. Nhận xét thời gian ly tâm trong bài? Giải thích?
10. Các plasmid kích thước lớn (hơn 10 kb) cho hiệu quả chiết suất thấp?
Giải thích?
 CÂU HỎI ÔN BÀI
11.Phương pháp thủy giải kiềm?
12.Phương pháp mẫu nhỏ?
13.DNA NST khác DNA plasmid? Nguyên tắc chiết DNA
NST khác gì chiết DNA plasmid?
 Quy định kiểm tra đầu giờ
1.Để tất cả tài liệu, điện thoại và các phương tiện nghe
nhìn khác lên tầng trên. Vi phạm: 0 đ
2.Mọi tài liệu có xuất hiện tại vị trí khác (gầm bàn, trên
bàn tay): 0 đ
3.Trên bàn làm bài chỉ có 1 cây viết và sổ làm bài: Vi
phạm trừ điểm tùy mức độ.
4. Chú tâm vào làm bài, không quay đi quay lại hay trao
đổi: Vi phạm trừ điểm tùy mức độ.
5.Đổi đề: 0 đ
6.Hết giờ làm bài, các nhóm từ 1 đến 8 tự thu bài và nộp.
Thời gian nộp bài là 1 phút. Sau 1 phút bài nộp trễ hay
nộp sai vị trí bị trừ 2 (hai) điểm.
 ĐỀ KIỂM TRA ĐẦU GIỜ - BỘ ĐỀ 1
THỜI GIAN: 10 PHÚT
ĐỀ 1.Điều kiện nuôi E.coli để chiết tách DNA plasmid pBluescript?
Tại sao nuôi từ 12 – 16h? Vai trò của ampicilline?
ĐỀ 2.Trở ngại khi cắn tế bào không phân tán hoàn toàn trong GTE? Giải
thích? Plasmid là gì?
ĐỀ 3.Hiện tượng sau khi cho SDS – Kiềm vào? Giải thích? Hiện tượng sau khi
cho KOAc vào? Giải thích? Thành phần có trong dịch nổi, tủa trắng?
ĐỀ 4.Có thể thay KOAc bằng NaOAc được không? Giải thích? Nguyên tắc
loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid?
ĐỀ 5.Các phương pháp biến tính và hồi tính DNA trong bài? Yếu tố nhận diện
của plasmid pBLUESCRIPT có đặc trưng gì để nhận diện sự có mặt của nó
trong tế bào?
ĐỀ 6.Các bước trong nguyên tắc tách chiết DNA plasmid? Tên hóa chất tương
ứng?
ĐỀ 7. Nhận xét thời gian ly tâm trong bài? Giải thích? Các plasmid kích thước
lớn (hơn 10 kb) cho hiệu quả chiết suất thấp? Giải thích? Nguyên tắc chiết
DNA NST khác gì chiết DNA plasmid?
ĐỀ 8.Vẽ sơ đồ mô phỏng ngắn gọn quá trình chiết DNA plasmid?
 ĐỀ KIỂM TRA ĐẦU GIỜ - THỜI GIAN: 10 PHÚT
ĐỀ 1.Điều kiện nuôi E.coli để chiết tách DNA plasmid
pBluescript? Tại sao nuôi từ 12 – 16h? Vai trò của
ampicilline?
ĐỀ 2.Vai trò của GTE? Plasmid là gì?
ĐỀ 3.Có thể thay KOAc bằng NaOAc được không? Giải
thích? Nguyên tắc loại DNA NST ra khỏi DNA plasmid?
ĐỀ 4.Biến tính và hồi tính DNA là gì? Các phương pháp
biến tính và hồi tính DNA trong bài?
ĐỀ 5.Các bước trong nguyên tắc tách chiết DNA
plasmid? Tên hóa chất tương ứng?
ĐỀ 6.Vẽ sơ đồ mô phỏng ngắn gọn quá trình chiết DNA
plasmid?
Được phép sử dụng tài liệu
 ĐỀ KIỂM TRA ĐẦU GIỜ - BỘ ĐỀ 3
THỜI GIAN: 10 PHÚT
ĐỀ 1. Trình bày bốn thông tin quan trọng trong quá trình nuôi E.coli để chiết
tách DNA plasmid pBluescript? Vai trò của từng yếu tố?
ĐỀ 2.GTE là gì? Vai trò của GTE? Trở ngại khi cắn tế bào không phân tán hoàn
toàn trong GTE? Giải thích cặn kẽ?
ĐỀ 3. Hiện tượng sau khi cho SDS – Kiềm vào? Giải thích?
Hiện tượng sau khi cho KOAc vào? Giải thích?
Thành phần có trong dịch nổi, tủa trắng?
ĐỀ 4.Có thể thay KOAc bằng NaOAc được không? Giải thích? Nguyên tắc loại
DNA NST ra khỏi DNA plasmid? Các phương pháp biến tính và hồi tính DNA
trong bài? Yếu tố nhận diện của plasmid pBLUESCRIPT có đặc trưng gì để
nhận diện sự có mặt của nó trong tế bào?
ĐỀ 5.Các bước trong nguyên tắc tách chiết DNA plasmid? Tên hóa chất tương
ứng cụ thể với mỗi bước? Có cần dùng lyzozyme để phá lớp peptidoglycan sau
khi xử lý với SDS không? Tại sao?
Đề 6: Nếu sau khi tủa DNA plasmid bằng cồn tuyệt đối xong vẫn còn lẫn muối/
ion kim loại thì ta phải làm sao? Giải thích? DNA plasmid khác gì DNA NST?
 ĐỀ KIỂM TRA ĐẦU GIỜ - THỜI GIAN: 10 PHÚT
ĐỀ 1.Điều kiện nuôi E.coli để chiết tách
DNA plasmid pBluescript? Tại sao nuôi từ
12 – 16h? Vai trò của ampicilline?
ĐỀ 2.Vai trò của GTE? Plasmid là gì?
ĐỀ 3.Biến tính và hồi tính DNA là gì? Các
phương pháp biến tính và hồi tính DNA
trong bài?
ĐỀ 4.Các bước trong nguyên tắc tách chiết
DNA plasmid? Tên hóa chất tương ứng?
Được phép sử dụng tài liệu