PEWARNAAN

MIKROBIOLOGI

SESI ILMIAH , Maret 2019

 Ziehl- Neelsen
Gram
Difteri
Malaria
Filariasis
Tinta India

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Ziehl Neesen

Pulasan Ziehl Neelsen termasuk dalam teknik

pulasan diferensiasi untuk mendeteksi
adanya batang tahan asam (BTA) termasuk
Mycobacterium tuberculosis.
BTA memiliki lapisan lipid yang sulit untuk
diwarnai dan didekolorisasi dengan
pulasan sederhana.

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Prinsip
•
Pewarnaan
Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri
yang memiliki lapisan dinding lipid (mycolic
acid) yang bersifat tahan terhadap asam.
Pemberian pewarna carbol fuchsin disertai
pemanasan akan mempermudah carbol fuchsin
masuk ke dalam dinding sel. Dinding sel akan
tetap mengikat zat warna carbol fuchsin
walaupun didekolorisasi dengan asam alkohol.
Struktur lain seperti epitel, lekosit tidak dapat
menahan pewarna carbol fuchsin saat
didekolorisasi sehingga pewarna tanding
(methlyn blue) yang akan terserap.

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Principle of ZN Stain - 1
AFB Non
AFB
carbol fuchsin
+
HEA
T

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Principle of ZN Stain - 2
AFB Non
AFB
carbol fuchsin

decolouriser

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Principle of ZN Stain - 3
AFB Non
AFB
carbol fuchsin

decolouriser

counterstain
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
 Alat dan
reagen
• Bunsen
• Kaca Objek
• Lidi/Tusuk gigi
• Wadah pembuangan lidi bekas, berisi disinfektan (lisol 5%,
alkohol 70%, hipoklorit 0.5%)
• Akuadest untuk pencuci/pembilas
• Reagen Ziehl Neelsen :
• Pewarna primer: carbol fuchsin 1 %
Zat dekolorisasi: asam alkohol 3%
• Pewarna tanding (counterstain) :
methylene blue 0.1%

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Bahan pemeriksaan yang dapat diperiksa

• Sputum
• Urin
• Cairan tubuh : cairan pleura, cairan
bilas lambung, cairan bilas bronkus,
pus
• Apus sekret mata, vagina, luka
• Cairan serebrospinal (LCS)

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Prosedur
1. Labelling Kerja
2. Pilih bagian
slide purulent

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

Bagian purulent
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
Coiling system
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
 Setting up Slides on Staining Rack

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Carbol Fuchsin

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Heating Carbol Fuchsin to Steaming

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Rinsing Slides

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Don’t Splash Adjacent
Slides

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Decolorisation Step

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Rinsing Slides

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Counterstaining

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Rinsing off Counterstaining

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Drying the Stained Slides

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Pemeriksaan
mikroskopik

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
 Pelaporan menurut IUATLD
Hasil Penilaian
Negatif Tidak ditemukan BTA minimal dalam 100
LP
Scanty 1-9 BTA dalam 100 LP (Jumlah BTA yang
ditemukan harus dituliskan)
1+ 10-99 BTA dalam 100 LP
2+ 1-10 BTA setiap 1 LP (periksa minimal 50
LP)
3+ ≥ 10 BTA dalam 1 LP (periksa minimal 20
LP)
BTA = batang tahan asam
LP= lapang pandang

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Contoh format pelaporan hasil pulasan ZN:

• “Ditemukan BTA +1 menurut skala

IUATLD
• Lekosit > 25 LPK
• Epitel < 10 LPK
• Yeast (+)”

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Remove Oil from
Smears

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Storage of
Smears

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Pewarnaan Definisi

Gram Berupa pewarnaan differensiasi untuk

membedakan Gram positif dan negatif

Prinsip

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Pewarnaan Alat dan Bahan

Gram 1. Alkohol 95%(dekolorisasi)

2. Larutan kristal violet (Primary
stain)
3. Larutan Garam Iodine (penahan
warna primer)
4. Safranin (counterstain)
5. Sarung tangan
6. Masker
7. Kaca objek
8. Ose
9. Alas tempat pewarnaan (rangka
besi)

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Pewarnaan Prosedur
1. Bahan pemeriksaan diapuskan pada slide dan
Gram dibiarkan kering di udara.
2. Fiksasi sediaan dengan cara melewatkan di atas
api bunsen 2-3 kali
3. Apusan diletakkan di rak pewarnaan kemudian
ditambahkan cairan kristal violet dan dibiarkan
selama 1-2 menit. Cuci slide dengan air mengalir.
4. Ditambahkan larutan Garam Iodine dan
dibiarkan selama 1-2 menit. Kemudian segera cuci
dengan air mengalir.
5. Apus di-dekolorisasi dengan alkohol 96%
sampai warna biru violet pada slide hilang. Hati-
hati dengan pemberian alkohol ini tidak boleh
lebih atau kurang. Kemudian cuci dengan air
mengalir.
6. Ditambahkan safranin sampai seluruh slide
tertutup selama 1-2 menit, lalu dibilas perlahan
dengan air.
7. Diperiksa di bawah mikroskop.
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
 Pelaporan
Pewarnaan Gram
Batang Gram Positif
+1 (<10/seluruh lp), susunan: rantai/dua dua/berkelompok
+2 (1-5/lp), susunan
+3 (6-30/lp),
+4 (>30/lp),

Lekosit
+1 (<2/lp objektif 10x)
+2 (2-9/lp)
+3 (10-24/lp)
+4 (>25/lp

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

Tinta India
Pewarnaan Tinta India
adalah pewarnaan yang
digunakan untuk melihat
jamur Cryptococcus
neoformans yang
dikelilingi kapsul dengan
latar belakang gelap

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 PEWARNAAN
DIFTERI

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Definisi
Pewarnaan Pewarnaan Albert adalah tehnik pewarnaan
Difteri yang biasanya digunakan untuk melihat
granula metakromatik dari Corynebacterium
Diphtheriae dimana granula akan terlihat
berwarna hitam kebiruan sedangkan
bakterinya terlihat hijau kebiruan.

Reagen:
Albert A dan B
Prinsip
Pewarnaan Albert yang mengandung Toluidine
blue dan Malachite Green akan mewarnai
granula metakromatik pada Corynebacterium
diphteriae.

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

 Prosedur
Pewarnaan 1. Sediaan difiksasi dengan dilewatkan di atas api

Difteri 2. Beri pewarna Albert A selama 3-5 menit

3. Cuci dengan air mengalir
4. Tuangi dengan pewarna Albert B selama 1- 3
menit
5. Cuci dengan air mengalir
6. Keringkan di udara dan lihat di bawah mikroskop
dengan pembesaran 100 X

Interpretasi
1. Positif: ditemukan bakteri batang berhalter
(dengan formasi seperti huruf kanji),warna batang
hijau telur asin dan warna granula ungu
2. Negatif: tidak ditemukan bakteri batang
berhalter
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
FILARIA

20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi

Teknik
Pemeriksaan
secara
Mikroskopis

Tetesan darah pertama yang keluar dihapus, tetesan darah selanjutnya diteteskan sebanyak
tiga tetes pada slide.

Tetesan darah dilebarkan dengan ujung kaca benda lain sehingga membentuk SDJ tebal, yang
berbentuk tiga garis paralel (masing-masing berukuran 0,5x4 cm / 20μl)

Spesimen darah jari dikeringkan selama 24-72 jam pada suhu kamar dengan menyimpannya di
slide box
40
 Cara Membuat Larutan
Giemsa 1:20

Larutan Giemsa yang digunakan yaitu cairan buffer (pH 7,2)

Cairan buffer pH 7,2 dibuat dengan melarutkan satu tablet buffer forte ke 1000 ml air. Cairan buffer
bisa diganti dengan air mineral (pH 7,2).

Larutan Giemsa dibuat dengan melarutkan cairan Giemsa dengan cairan buffer pH 7,2 dengan
perbandingan 1 : 20.

Pewarnaan untuk 500 SDJ yaitu larutan Giemsa sebanyak 500 mL (25 mL cairan Giemsa dan 500
mL cairan buffer pH 7,2).
41
 Pewarnaan

Sediaan darah jari diletakkan berjajar di tempat yang datar (meja, lantai, papan, atau
pelepah/batang pisang).

Spesimen darah jari diwarnai dengan cara ditetesi larutan Giemsa sampai semua permukaan
sediaan tergenang larutan Giemsa (kurang lebih 20 tetes) dan didiamkan selama 30 menit.

Spesimen Darah Jari dibilas dengan air bersih dan dikeringkan dalam suhu kamar selama 24-72
jam.

Setelah kering, SDJ disusun dan disimpan dalam slide box.

42
 Cara
Pembacaan
Sediaan

Sediaan diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran rendah (10x10).

Jumlah mikrofilaria yang tampak pada seluruh lapangan pandang dihitung dengan cara
menggeser sediaan.

Jumlah dan jenis mikrofilaria yang ditemukan dicatat pada tepi sediaan. Cara pembacaan
sediaan secara zig-zag

43
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi
 Thank you

Teknik dan Interpretasi Pewarnaan

ZN, PRODIA Jkt 28-29 Nov 2013
20180820 Pembuatan Sediaan Mikrobiologi