ELISA /sendvičová metóda/

/Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay alebo EIA

enzyme immunoassay/

Mgr. Katarína Olišová

Je imunoenzýmová sérologická reakcia na kvalitatívne a kvantitatívne
stanovenie Ag alebo PL.
Má široké využitie v praxi.
Metóda detekuje Ab konjugované enzýmami ( alkalická fosfatáza,
peroxidáza). Väzba enzýmom značenej Ab na Ag sa ozrejmí po aplikácii
vhodného substrátu a indikátora, ktorý signalizuje zmenou farby rozklad
substrátu enzýmom.
Princíp:
• Špecifická väzba Ag+ PL+ ENZÝM konjugát ( peroxidáza, alkalická
fosfatáza....)
• Enzým štiepi substrát (chromogénny substrát- tvoriaci farbivo), ktorý je
pridaný do reakcie a vzniká farebný produkt. Výsledok sa odčíta
spektrofotometricky na readri. Koncentrácia výsledku je úmerná
koncentrácii Ag alebo Ab vo vyšetrovanej vzorke.
• Väzba enzýmom značenej protilátky sa ozrejmí po aplikácii vhodného
substrátu s indikátorom. Enzým štiepi substrát, výsledný produkt
štiepenia sa zisťuje pomocou indikátora- farebná zmena.
Dôkaz protilátky ELIZA testom (sendvičová metóda)
1. na povrch jamky je naviazaný antigén
2. sérum, v ktorom hľadáme PL pridáme do jamky. Ak je v sére protilátka,
naviaže sa na antigén a vznikne komplex Ag+PL
3. nenaviazaná protilátka sa odplaví pri premývaní
4. pridáme ďalšiu protilátku proti hľadanej protilátke v sére- ENZYM
KONJUGÁT
5. nenaviazaný enzým sa odplaví pri premývaní
6. po pridaní substrátu nastáva farebná zmena
7. pridám STOP roztok a platničku odčítame na readri
Dôkaz antigénu ELIZA testom
1. na povrchu jamky je naviazaná špecifická protilátka napr. proti vírusu,
ktorý chceme dokázať
2. pridáme testovanú vzorku obsahujúcu antigén, vznikne komplex PL+Ag
3. nenaviazaný Ag je po inkubácii odstránený premývaním
4. pridáme ďalšiu protilátku proti hľadanej protilátke v sére- ENZYM
KONJUGÁT
5. nenaviazaný enzým sa odplaví pri premývaní
6. po pridaní substrátu nastáva farebná zmena
7. pridám STOP roztok a platničku odčítame na readri
Využitie napr.
• Stanovenie Ag- HBsAg
• Stanovenie PL- anti HBs, anti HAV, anti HCV, anti Borrelia burgdorferi.....
ELISA
Na steny mikrotitračných jamiek sú naviazané Ag alebo Ab
Postup:
1. Na nosič- stena jamky mikrotitračnej platničky sú naviazané Ag alebo Ab
2. Do jamky pridáme vyšetrovaný materiál a ak je v materiál prítomný
hľadaný Ag alebo Ab vznikne na nosiči pevne naviazaný komplex Ag+Ab
3. Po premytí jamiek je v ďalšej fáze aplikovaná emzýmom označená Ab
proti vytvorenému komplexu.
4. Po ďalšom premytí, kedy sa odstráni nenaviazaný konjugát sa pridá substrát
a indikátor, ktorý po účinku enzýmu na substrát mení farbu. Intenzita farebnej
zmeny je priamo úmerná množstvu naviazaných molekúl konjugátu a teda aj
množstvu hľadanej zložky imunokomplexu.
Farebné zmeny sa hodnotia fotometricky -reader
1. do každej jamky napipetujeme 50 µl Sample diluentu
2. pridáme 50 µl kontroly /+, -/ a 50 µl vyšetrovaných sér S1, S2,
S3....podľa schémy
H G F E D C B A
S6 S5 S4 S3 S2 S1 + -
3. inkubujeme 1. hodinu pri 37°C, premyjeme 3x
4. pridáme 50 µl KONJUGÁT, inkubujeme 30 minút pri 37° C
5. premyjeme 3x
6. pridáme 50 µl SUBSTRÁTU, inkubujeme 30 minút pri 37°C
7. pridáme 50 µl STOP roztoku, reakciu odčítame na readri
ELISA
ELISA- výsledok po pridaní STOP roztoku