16S rRNA Analizi

Do. Dr. Zeynep Ceren KARAHAN

Ankara niversitesi Tp Fakltesi Tbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal

Sunum ierii
Genel bilgi Uygulan Kullanm alanlar

Avantajlar
Dezavantajlar

Neden molekler (genetik) tan?

Fenotipik identifikasyon
Uzun zaman alr
24-48 saat Bazen gnler, haftalar, aylar

Bazen sonu vermez

Atipik biyokimyasal zellikler Biyokimyasal olarak inaktivite zel retim artlarna ihtiya

Laboratuar ortamnda retilememe

Hedef Genler
Fonksiyonu evrim boyunca deimemi olmal Tm bakteriler iin korunmu bir blgeye sahip olmal Korunmu blgeyi evreleyen ileri derecede deiken blgeler bulunmal

Hedef Genler
16S rRNA 23S rRNA 16S-23S rRNA ITS groEL rpoB gyrA gyrB hsp65 tuf sodA

recA

ospA
fla

Neden 16S rRNA Geni?

Btn bakterilerde bulunur Fonksiyonel olarak korunmutur Uygun byklktedir (~1550 b) zerinde iyi korunmu ve heterojen blgeler ierir
PZR primerleri oluturulabilir Cins/tr dzeyinde ayrm salar

Neden 16S rRNA Geni?

Yeterli veritaban vardr
Gen Blgesi 16S rRNA 23S rRNA 16S-23S rRNA ITS groEL rpoB recA gyrB Kaytl Dizi Says 2.344.816 45.121 27.445 14.478 23.532 18.662 17.410

Nasl Uygulanr?
1. DNA Ekstraksiyonu 2. 16S rRNA PZR 3. Prifikasyon 4. Sekans dngs 5. Prifikasyon

6. Sekans analizi
7. Elektroferogramlarn deerlendirilmesi 8. Verilerin yorumlanmas

1. DNA Ekstraksiyonu
Klinik rnekten Kltr kolonisinden Basit yntemler tercih edilmeli

2. 16S rRNA PZR

500 b
Sklkla yeterli

1500 b
Birden fazla sekans analizi

< 500 b
DNAnn hasarl olma ihtimali varsa

Kullanlan primerler
sim 27f 355f 338r 533f 515r 556r 806f 787r 926f 907r 930f 911r 1194f 1175r 1371r 1391r 1492r 1525r Dizi (5-3) AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG ACT CCT ACG GGA GGC AGC GCT GCC TCC CGT AGG AGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A TTA CCG CGG CKG CTG GCA C CTT TAC GCC CAR TRA WTC CG ATT AGA TAC CCT GGT AGT CC GGA GTA CCA GGG TAT CTA AT AAA CTY AAA KGA ATT GAC CG CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT GAG GAA GGT TGG GGA TGA CGT ACG TCA TCC CCA ACC TTC CTC AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC TGA CGG GCG GTG WGT RCA GGT TAC CTT GTT ACG ACT T AAG GAG GTG WTC CAR CC Lokalizasyon 8-27 338-355 338-355 515-533 515-533 556-575 787-806 787-806 907-926 907-926 911-930 911-930 1175-1194 1175-1194 1390-1371 1391-1408 1492-1510 1525-1541 Y: C/T M: A/C W: A/T R: G/A K: G/T S: G/C

3. Prifikasyon
Standart yntemler Ticari kitler Jelden PZR rnnden

4. Sekanslama Dngs (Cycle sequencing)

Yaklak 25 dng Yeni PZR rn olumaz Farkl uzunluklarda rnler oluur
Tek primer
dNTP Sonlandrc boyalar (Farkl dalga boyunda floresans veren boyalarla iaretli ddNTP)

CA CAG CAGT CAGTC CAGTCG CAGTCGG CAGTCGGT CAGTCGGTA

http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/ student/animations/dna_sequencing/index.html

5. Prifikasyon
Standart yntemler Ticari kitler

6. Sekans Analizi
Kapiller elektroforez sistemli otomatik sekans cihazlar Sanger yntemiyle alr Sonlandrc boyalar okur Elektroferogram oluturur

ddNTP G

Dalga boyu 540 nm

Floresans yeil

Pik rengi siyah

A
T C

570 nm
595 nm 620 nm

yeil/sar
krmz turuncu/krmz

yeil
krmz mavi

7. Elektroferogramlarn Deerlendirilmesi
Otomatik rapor Gzle deerlendir!!! Karlatr

Veri Tabanlaryla Karlatrma

GenBank
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

RDP-II
http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp

Ticari MicroSeq 500 (Applied biosystems) 500 b ktphane Tm 16S rRNA geni 1818 tr/alt tr 1396 tr/alt tr

%100 BENZERLK!

Eleen nkleotid says Total nkleotid says

8. Verilerin Yorumlanmas ve simlendirme

Cins? Tr?
CNS TR : %97 dizi benzerlii : %99 dizi benzerlii

Bu oranlar mikroorganizma trne (genetik heterojenite oranna) bal olarak deiiklik gsterebilir

Problemler
Trler aras yksek dizi benzerlii
Baz Mycobacterium trleri (%100 benzerlik) Baz Bacillus trleri (>%99.5 benzerlik) Edwardsiella trleri (%99.35-99.81) Streptococcus mitis/oralis/pneumoniae (>%99)

ntragenomik heterojenite
A. veronii: %1.5

Tr dzeyinde sorun yaanan dier bakteriler:

Achromobacter spp., Actinomyces spp., Aeromonas spp., A. baumanii-calcoaceticus kompleksi, Bordetella spp., Burkholderia spp., Campylobacter spp., Enterobacter spp., Neisseria spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas spp.,

Ne Yapmal?
En yakn cins nedir? O cinste 16S rRNA deikenlii nedir? En fazla benzerlik tayan dizi ile bir sonraki seenek arasnda fark?

Bu cinsin btn trleri veri tabannda yer

alyor mu?

Ne Yapmal?
Tm dizi sekanslama? Bir baka hedef gen? Ek biyokimyasal testler? Yeni tr?
Tm dizide > %1 dizi fark Tm dizide %1 dizi fark + fenotipik zgnlk

Kullanm Alanlar
Yeni patojenlerin kefi
Bartonella henselae Tropheryma whipplei Mycobacterium genavanse Molekler Koch Postlatlar !

Kullanm Alanlar
Taksonomik gncellemeler, yeni cins ve trlerin belirlenmesi Kltrde retilemeyen/ zor reyen mikroorganizmalarn tans Klinik nemi olan patojenlerin tanmlanmas Antibiyotik tedavisi altnda etken belirlenmesi Steril rneklerde etkenin hzl belirlenmesi

Avantajlar
Seici deildir Hzldr Sonular net ve kesindir Antibiyotik tedavisi altnda kullanlabilir Klinik rnekten direkt allabilir Sonular arivlenebilir Epidemiyolojik almalar iin uygundur

Dezavantajlar
Pahaldr

Teknik donanm gerektirir

Deneyimli personel gerektirir Dikkatli uygulama gerektirir Baz tr/alt trler iin tanmlaycl azdr
Tr ii deikenliin az olmas Tek tre ait ok sayda genomovar bulunmas Veritabannda yer almamas Dorulayc biyokimyasal testlerin olmamas Taksonomik deiiklikler

Dezavantajlar
Uygulama ve yorumlamada standart metodoloji ve klavuzlar yoktur
Cins/tr tanm tartmaldr

deal bir veritaban yoktur

Kullanma ak olmal Yeterli sayda sula temsil edilmeli Denetlenmeli Gncellenmeli

Sonu
Rutin mikrobiyoloji laboratuarnda 16S rRNA analizi; standart identifikasyon yntemlerine alternatif olarak deil, bu yntemlerle beraber kullanlmal, sonular dikkatle yorumlanmal ve zellikle allmadk trlerin bildirimi dikkatle yaplmaldr!