1

Rekombinantna
Rekombinantna
DNK
DNK
Predavanja iz opte biohemije
Integrisane akademske studije:
Farmacija-medicinska biohemija
kolska 2011/2012. godina
2
Ciljevi predavanja
Ciljevi predavanja
rekombina
rekombina
ntna
ntna
DNK
DNK
Tipovi rekombinacije
Reversna transkripcija
Primena tehnologije rekombinantne DNK
Literatura
1. Mati G: Osnovi molekularne biologije
strana 70-80 i 90-103.
2. Prezentacija
3
Genetika rekombinacija
Proces u kome dolazi do reaniranja
genetike informacije izmeu dva ili
unutar jednog molekula DNK
4
Kasna profaza I mejoze
Nesestrinske hromatide u okviru tetrada
Rekombinacija
Crossing-over
Razmena homolognih
segmenata molekula DNK
izmeu nesestrinskih hromatida
5
Genetika rekombinacija
Homologna rekombinacija
Specijalna rekombinacija
Transpoziciona rekombinacija
6
Homologna
rekombinacija
ili
opta rekombinacija
Mesto ukrtanja
heterodupleks
7
8
Homologna
rekombinacija
eukariota
Razreavanje
Holidejeve
strukture
Konzervativan proces
Hibridni molekuli
imaju isti redosled
gena
9
Homologna rekombinacija
izmedju dva kruna
molekula DNK bakterija
Rekombinacija dva plazmida
Struktura 8
Rezultat
-dva rekombinovana
molekula DNK originalne veliine
- jedan molekul dvostruko vei
10
Homologna rekombinacija
Enzimi rekombinacije:
Rec BCD
Odvija dvolananu zavojnicu i prekida
jedan lanac
Rec A protein
U formiranju Holidejevog intermedijera i
migriranju mesta ukrtanja
Resolvaze
Nukleaze zaduene za razreavanje
Holidejevog intermedijera
11
Homologna rekombinacija
Mehanizam delovanja proteina RecBCD i
RecA:
RecBDC jednolanani prekid u
bakterijskoj DNK
RecA se vezuje za jednolananu DNK
Kooprerativno vezivanje RecA grade se
polimeri spiralni desnogirni filamenti
RecA se vezuje za jednolananu u
dvolananoj DNK
12
Model delovanja RecA
proteina i Rec BDC
proteina
Redosled delovanja
I faza RecBDC
II faza RecA
13
Hipotetiki model delovanja
RecBCD
Hidroliza ATP
Struktura
hi
hi 5 GCTGGTGG 3
Utie na uestalost
rekombinacije
Delovanjem RecBDC nastaje
jednolanaani prekid
14
Model delovanja
Rec A proteina
Vezivanje RecA za
prekid na jednom lancu
Stvaranje polimera
Desnogirni spiralni
filamenti
15
Hipotetiki model delovanja RecA
Polimerazacija RecA i katalizacija rekombinacije
a. izmeu jednolanane i dvolanane DNK
b. izmeu dva dvolanana molekula DNK
Monomerna jedinica RecA vezuje po tri nukleotida
16
Specijalna rekombinacija
Rekombinacija samo u odreenim
regionima hromozoma koji se odlikuju
specifinim redosledom nukleotida u DNK
Rekombinaza - reverzibilna endonukleaza
Rekombinativna mesta (20-200 bp)
17
Specijalna rekombinacija
Rekombinaza
Rekombinantna mesta
Dva rekombinantna mesta na
istom molekulu DNK
Rezultat rekombinacije:
Inverzija segmenta ili
Delecija segmenta
18
Specijalna rekombinacija
Integracija genoma lambda faga u hromozom E.coli
Hidroliza oba lanca DNK
Integraza virusni enzim
reverzibilna endonukleaza vezuje se za:
DNK virusa i DNK bakterije
19
Transpoziciona rekombinacija
Transpozoni mobilni elementi
Pokretni segmenti DNK
Premetaju se sa donorskog na akceptorsko
mesto
Dva tipa transpozona u bakterijama
Prosti
Nukleotidni niz koji se prenosi
Informaciju za sintezu enzima transpozaze
Sloeni
I dodatne gene
Terminalni ponovci
20
Struktura prostog transpozona
Insercioni segmenti IS
Terminalni ponovci na krajevima
Transpozaza specifino prepoznaje
21
Ugraivanje transpozona
u akceptorsko mesto
22
Struktura sloenog transpozona
Terminalni ponovci na krajevima
Transpozaza specifino prepoznaje
Geni za rezistenciju na antibiotike
23
Tehnologija rekombinovane DNK
Genetiko ininjerstvo
Primena
medicina, farmacija, veterina, agronomija,
umarstvo, itd.
Kloniranje DNK
Umnoavanje, dobijanje veeg broja
identinih kopija
Klon - skup identinih elija
Cilj kloniranja dobijanje vee koliine
materijala za ispitivanje
24
Postupak kloniranja DNK
-faze kloniranja-
1. Isecanje eljenog fragmenta DNK uz pomo enzima
restrikcione endonukleaze
2. Spajanje fragmenata DNK sa malim molekulom DNK -
vektorom za kloniranje
Enzimi ligaze
Hibridni molekuli DNK iz ispitivanog fragmenta sa vektorom -
rekombinovani molekuli DNK
3. Unoenje rekombinovanih molekula DNK u eliju gde se
odvija replikacija umnoavanje ispitivanog fragmenta
DNK
4. Identifikacija elije domaina u kojoj se nalazi
ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.
25
1. Faza: Isecanje fragmenata DNK
pomou restrikcione endonukleaze
Bakterijski enzimi tite eliju od stranih DNK
Katalizuju hidrolizu fosfodiestarske veze
Specifian nukleotid 4 do 6 bp
Restrikciona mesta
Palindromska struktura
Dvostruka rotaciona simetrija
5 -GAATTC- 3
3 -CTTAAG- 5
26
restrikcioni
enzim
Restrikcione endonukleaze
Nomenklatura restrikcionih endonukleaza:
Eco E coli
Bam Bacillus amyloliquefaciens
Hae III trea generacija restrikcione endonukleaze iz
Haemophilus aegyptius
27
Restrikcione endonukleaze
Nain isecanja dvolanane DNK 2
Restrikcioni fragmenti
Fragmenti Ravni lanci
dvolanani i spareni
Fragmenti sa jednolananim krajevima
lepljivi ( cohesive, stuky ends)
28
....G G C C...
....C C G GT...
Restrikciona mesta
....T C G A...
....A G C T...
....T
....A G C
C G A...
T...
+
....G G
....C C
C C...
G G...
+
TaqI 4 baze lepljivi krajevi
HaeIII 4 baze ravni krajevi
Ravni krajevi
Lepljivi krajevi
29
2. Faza: Spajanje fragmenata DNK i
stvaranje vektora za kloniranje
Fragment DNK ugraen u plazmidnu ili
virusnu DNK predstavlja vektor za
kloniranje
Tipovi vektora za kloniranje:
Plazmidi
Lambda FAG
30
Vektori za kloniranje
Plazmid
Plazmidi
Mali kruni molekuli dvolanane DNK
Bakterije i elije kvasca
31
Vektori za kloniranje
Plazmid
Svojstva plazmidnog vektora:
1. Replikativni poetak
2. Gen za otpornost elije domaina na
odreeni antibiotik
3. Restrikciona mesta
Polilinker skup vie restrikcionih mesta
32
Fig. 7.4,
pUC19
Polylinker:
restriction
sites
Origin
sequence
Ampicillin
resistance
gene
lacZ+
gene
33
Hibridizacija i ligacija
Hibridni molekul DNK
Plazmid koji sadri fragment strane DNK
Isecanje plazmida i ispitivane DNK
molekule istom restrikcionom
endonukleazom
Izolacija plazmida iz elije bakterije,
preiavanje i modifikacija
(unoenje restrikcioni mesta,
gena za otpornost na antibiotike)
Izolovanje vektora za kloniranje
34
3. Faza transformacije
Unoenje vektora u eliju domaina
(bakteriju ili eukariotsku eliju)
transformacija
Replikacija vektorske DNK u eliji
domaina njegovom replikativnom
mainerijom
35
Faza transformacije
Postupak transformacije:
Unoenje plazmida u bakterijsku eliju
Postupak diferencijacije rekombinantne
DNK
Otpornost na antibiotike
Bakterijske kolonije
36
Postupak kloniranja
sa plazmidom za
sintezu insulina u
bakterijama
Overview of gene
cloning.
37
Vektor za kloniranje
lambda fag
Svojstva bakteriofaga lamda
Dui segmenti DNK
Genom ovog virusa je linearan
Strukturni geni za proteine virusnog
omotaa su na krajevima
Sredini deo virusne DNK moe se koristiti
za potrebe kloniranja
Ubacivanje restrikcionih mesta za razne
enzime
Krajevi virusnog genoma su jednolanani
Pakuju se u proteinski omota
38
Struktura vektora za kloniranje
lambda FAG
Lepljivi kraj
Restrikciono mesto
39
Vektori za kloniranje
Segment DNK u genom virusa
Hibridni molekul
Pakuje se u proteinski omota in vitro
Virulentan virus
Ubacivanje u bakteriju virulentnog virusa
Replikacija virusnog genoma
Liza bakterijske elije
Formiranje plaka na agaru
40
Kloniranje strane DNK
u lambda fagama
41
Vektori za kloniranje
Kozmidi
kombinacija plazmida i lambda faga
Mali kruni molekuli
42
4. faza: Identifikacija elije domaina u kojoj se
nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo
izolovanje.
DNK biblioteka skup fragmenata DNK koji
predstavlja ceo genom
Postupci
Transformacije vektor plazmid
Infekcija bakterija - vektor lambda fag
Bakterijske kolonije ili virusni plakovi
Genomska biblioteka
43
Izolovanje fragmenata DNK za
kloniranje
Genomska biblioteka:
geni koji se transkribuju
Geni koji se ne eksprimiraju (ne
transkribuju)
Izolacija ukupne iRNK
Matrica za sintezu komplementarnih DNK
(cDNK)
44
Reversna transkripcija
Reversna transkripcija
cDNK su jednolanane dobijene
reversnom transkripcijom
Reversna transkriptaza (iz retrovirusa)
cDNK biblioteka
45
46
Faze u sintezi cDNK
Sinteza lanca cDNK
na osnovu iRNK
reversnom transkripatazom
Degradacija iRNK sa RNazom
DNK polimeraza I sintetie novu
DNK u segmentima i uklanja
RNK prajmere
Fragmenti DNK se povezuju
sa
DNK ligazom
Dupli lanac cDNK
47
1. Radioaktivne probe poznata struktura
2. Antitela na proteinski produkt
ispitivanog gena - nepoznata struktura
gena
4. Faza: Identifikacija klona koji
nosi ispitivani fragment DNK
48
Izolacija klonirane DNK
Primena radioaktivnih proba
Hibridizacija kolonija
identifikuje klone koji sadre
odreene DNK
49
Antitela na proteinski produkt ispitivanog gena
(nepoznata struktura gena)
Ekspresioni vektori gen, promoterski region i
restrikciona mesta
Transkripcija iRNK
Sinteza proteina
Identifikacija proteina u plaku pomou specifinog
antitela
Tehnike genetskog ininjeringa u sintezi
proteina za potrebe medicine i veterine
(humani insulin, hormon rasta, interferon, itd)
4. faza Identifikacija klona koji nosi
ispitivani fragment DNK
50
Izolacija klonirane cDNK
Primena proba sa antitelima
51
Budunost medicinske biohemije ?