Univerzitet Demal Bijedi Mostar

Nastavniki fakultet
Studijska grupa: Hemija

Predmet: Hromatografija
Predmetni nastavnik: prof. dr. Boo Banjanin

SEMINARSKI RAD
Gasna hromatografija

SADRAJ:
1.UVOD ........................................................................................................................3
2.GASNA HROMATOGRAFIJA ...............................................................................6
3.UREAJI ZA GASNO TENU HROMATOGRAFIJU .....................................10
4.1.Gas nosa .................................................................................................................11
4.2..Sistem unoenje uzoraka..........................................................................................11
4.3.Izbor kolone .............................................................................................................13
4.4.Punilo za kolone .......................................................................................................15
4.5.Nepokretna tena faza ..............................................................................................16
4.6.Termostatiranje kolona .............................................................................................18
4.7.Detektori ...................................................................................................................19
4.7.1.Detektor toplinske provodljivosti ..........................................................................19
4.7.2.Plamenojonizacioni detektor .................................................................................20
4.7.3.Elektron-privlaei detektor...................................................................................21
4.7.4.Sumpor-heliuminscentni detektor..........................................................................21
4.7.5.Plamenofotometrijski detektor...............................................................................21
4.7.6.Atomski emisioni detektor.....................................................................................22
4.7.7.Fotojonizujui detektor..........................................................................................23
4.7.8.Azot fosfor detektor...............................................................................................24
4.8.Registracija signala-gasni hromatogram........................................... ........................24
5.PRIMJENA GASNE HROMATOGRAFIJE ............................................................25
5.1.Kvalitativna analiza ..................................................................................................25
5.2.Kvantitativan analiza ................................................................................................25
6.GASNA HROMATOGRAFIJA-SPEKTROMETRIJA MASA.................................25
7.LITERATURA ...........................................................................................................28

1.UVOD
2

Hromatografija je analitika metoda koja slui za preiavanje i odvajanje organskih i

neorganskih supstanci. Pogodna je za frakcionisanje kompleksnih smjesa, za izolaciju
nestabilnih supstanci i odvajanje veoma bliskih spojeva po strukturi kao to su izomeri.
Hromatografija kao metoda razdvajanja primjenjuje se za identifikaciju, ispitivanje istoe i
odreivanje sadraja preparata.
Hromatografija moe biti analitika i preparativna. Preparativna hromatografija se bavi
razdvajanjem komponenti iz smjese radi dalje obrade, te se moe smatrati metodom
preiavanja. U analitikoj hromatografiji se obino radi sa malim uzorcima te se pokuava
izmjeriti relativni omjer komponenti u smjesi.
Otkrie hromatografije kao metode odvajanja pripisuje se ruskom botaniaru M. Cvetu, koji
je 1903. godine ovom metodom razdvojio hlorofil i druge pigmente biljnog ekstrakta. Za
odvajanje je upotrijebio staklenu kolonu ispunjenu vrstim kalcijum-karbonatom kao
adsorpcionim sredstvom. U gornji dio kolone unio je biljni ekstrakt i kolonu zatim ispirao
petrol-etrom. Prilikom ispiranja, pojedine komponente biljnog ekstrakta kretale su se kroz
kolonu razliitom brzinom i meusobno se razdvojile u obojene trake ili zone. Sadraaj
kolone je tada paljivo izvaen, pojedine trake su razdvojene i obraivane su odgovarajuim
rastvaraem, pri emu su sorbovane supstance desorbovane i analizirane.
Trebalo je da proe dosta vremena da bi se shvatili znaaj i mogunosti otkrivene metode
odvajanja. U prvim primjenama metoda je bila ograniena na razdvajanje obojenih jedinjenja,
koja su se mogla identifikovati po svojoj obojenosti. Prema tome je M. Cvet 1906. godine
metodi dao ime hromatografija (prema grkim rijeima hroma i grafein koje znae
boja i pisati).
Pod hromatografijom danas podrazumijevamo metode odvajanja koje se zasnivaju na
razliitoj raspodjeli komponenti uzorka izmeu dvije faze, od kojih je jedna nepokretna
(stacionarna), a druga pokretna (mobilna). Stacionarna faza moe biti vrsta ili tena, a
mobilna faza tena ili gasovita supstanca. Komponente uzorka moraju biti rastvorljive u
mobilnoj fazi ali isto tako moraju na neki nain djelovati i sa stacionarnom fazom (rastvarati
se, adsorbovati ili hemijski reagovati). Posljedica toga je da se komponente razliito
raspodjeljuju izmeu dvije faze, pa se pod uticajem mobilne faze kreu kroz stacionarnu fazu
razliitom brzinom, to se i primjenjuje kod njihovog hromatografskog razdvajanja.
Mogunosti hromatografskog razdvajanja supstanci su danas ogromne. Hromatografski se
mogu razdvajati i izolovati organske supstance sline strukture, kao i anorganske supstance
vrlo slinih hemijskih osobina. Hromatografija danas spada meu najvie i najire
primjenjivane analitike metode i nezamjenljiva je u modernoj hemijskoj analizi.
Njenoj irokoj primjeni u velikoj mjeri je pridonijela i injenica da se za vrijeme
hromatografskog razdvajanja supstanci moe izvesti i njihovo odreivanje bez nekih posebnih
dopunskih operacija. Zato se hromatografija danas esto posmatra i kao metoda odreivanja
Podjela hromatografskih metoda moe se izvriti na vie naina:
1. Prema fizikoj prirodi mobilne i stacionarne faze:
3

teno-teno
teno-vrsto
gas-teno
gas-vrsto

esto se prema fizikoj prirodi mobilne faze pod gasnom hromatografijom obuhvataju sistemi
gas-teno i gas-vrsto, a pod tenom hromatografijom sistemi teno-teno i teno-vrsto.
2. Prema mehanizmu odvajanja:
particiona (podiona) hromatografija
adsorpciona hromatografija
jonoizmjenjivaka hromatografija
gel (ekskluziona) hromatografija
Particija ili raspodjela je mehanizam dominantan kod teno-teno i gas-teno hromatografije,
i predstavlja proces raspodjeljivanja u cjelini faze, pri emu komonente uzorka grade
homogene rastvore u svakoj od faza ( tenoj ili gasnoj).
Adsorpcija je mehanizam karakteristian za gas-vrsto i teno-vrsto hromatografiju, i
predstavlja interakciju ili vezivanje komponenti uzorka na nekoj vrstoj povrini ili na
odreenim aktivnim mjestima.
Jonska izmjena je osnov jonoizmjenjivake hromatografije i predstavlja reakciju izmjene jona
istog naboja izmeu jonoizmjenjivake smole i rastvora.
Ekskluzija je mehanizam na kome se zasniva gel-hromatografija, a ima vanu ulogu (pored
adsorpcije) i u hromatografiji na molekularnim sitima. U oba sluaja stacionarna faza je
porozna vrsta supstanca ija je veliina pora slina veliini molekula uzorka. Razdvajanje
komponenti ekskluzijom vri se prema veliini njihovih molekula.
3. Prema nainu smjetaja stacionarne faze
hromatografija u koloni (kolonska hromatografija)
planarna (plona) hromatografija
Kod hromatografije u koloni stacionarna faza se nalazi u staklenim ili metalnim cijevima koje
se nazivaju kolonama. Stacionarna faza u koloni moe biti fino usitnjena vrsta supstanca ili
tenost koja kao tanki sloj prekriva fino usitnjenu vrstu supstancu, a moe biti i tenost koja
je kao tanki sloj adsorbovana na unutranjim zidovima kolone.
Kod planarne hromatografije kao stacionarna faza se upotrebljava list ili traka poroznog filterpapira, pa govorimo o papirnoj hromatografiji, ili neka fino usitnjena vrsta supstanca
nanesena kao tanki sloj na neku plou, pa govorimo o tankoslojnoj hromatografiji.
4. Prema tehnici rada:
hromatografija eluiranjem
hromatografija istiskivanjem
frontalna analiza
4

Kod hromatografije eluiranjem uzorak se unosi u kolonu ili na jedan kraj papira ili tankog
sloja vrste stacionarene faze i nakon toga ispire mobilnom fazom. Kod kolonske
hromatografije ispiranje mobilnom fazom se vri dok se sve komponente uzorka postepeno ne
izaperu iz kolone. Postupak ispiranja se naziva eluiranjem, mobilna faza kojom se vri
ispiranje naziva se eluent, a rastvor koji izlazi iz kolone eluat. Na izlazu iz kolone pogodan
detektor kontinuirano mjeri komponente onako kako prolaze, to se registruje kao
odgovarajui hromatogram.
Kod hromatografije istiskivanjem na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a zatim dodaje
rastvor pogodne supstance koja istiskuje komponente uzorka i tako ubrzava njihovo kretanje.
Kod frontalne analize na stacionarnu fazu se stalno dodaje rastvor uzorka, tako da se samo
komponenta koja se najbre kree dobije u istom stanju.

2. GASNA HROMATOGRAFIJA
Pod gasnom hromatografijom podrazumjevamo sve hromatografske metode u kojima je
mobilna faza gas.
Zavisno od stacionarne faze, razlikujemo:
5

- Gasno-tenu hromatografiju/Gas-liquid chromatography (GLC) ;

-Gasno-vrstu hromatografiju/Gas-solid chromatography (GSC).
Gasna hromatografija se primjenjuje za analizu gasovitih jedinjenja ili jedinjenja koja mogu
lako isprati na radnoj temperaturi kolone (do 300o ili neto vie), a da pri tome ne doe do
njihove razgradnje. Broj takvih jedinjenja je vrlo velik ( mnoge masne kiseline, alkoholi,
aldehidi, amini, estri, etri, ketoni, ugljovodonici, halogenirani ugljovodonici, fenoli, sumporna
jedinjenja, metalni kompleksi, interni gasovi itd...), pa je gasna hromatografija vjerovatno
najvie primjenjivani oblik hromatografije prilikom analize niza prirodnih i umjetnih spojeva.
Kod nekih analiza samo visokoefikasna tena hromatografija (HPLC) konkurie gasnoj
hromatografiji, mada je ispravnije rei da ove dvije metode dopunjuju jedan drugu.Neke od
prednosti gasne hromatografije proizilaze iz koritenja gasa kao mobilne faze. Gasovi, naime,
u poreenju s tenostima imaju malu viskoznost, to omoguuje koritenje drugih
hromatografskih kolona, kao i postizanje velike brzine mobilne faze uz umjerene pritiske.
Pored toga, koeficijent difuzije u gasovima su znatno vei nego u tenostima, pa je optimalna
brzina gasovite mobilne faze ( u smislu irenja hromatografskih pikova) dosta visoka, tako da
se razdvajanje i analiza mogu izvesti vrlo brzo ( za nekoliko minuta, a nekad i sekundi).
U osnovnoj raspodjeli kod gas-vrste hromatografije jeste adsorpcija gasovith supstanci na
povrini vrste stacionarne faze. Stacionarna faza je adsorbens velike specifine povrine, kao
to su silikagel, aktivni ugalj i sl., ali se najvie primjenjuju tzv. molekularna sita i neki
porozni polimeri. Adsorpciona (gas-vrsta) hromatografija se naroito koristi pri razdvajanju
komponenti koje se ne zadravaju u kolonama s tenom stacionarnom fazom, a takvi su npr.
mnogi neorganski gasovi.

3.OSNOVNI PRINCIPI GASNO-TENE HROMATOGRAFIJE

Gasno tena hromatografija je tehnika sa najveom primjenom za odjeljivanje i kvantitativno
odreivanje veine sloenih smjesa. Stacionarna faza je u gasno tekuinskoj hromatografiji je
tekuina nanesena na povrinu vrstog nosaa adsorpcijom ili hemijskim vezanjem. Brzinu
prolaza analita kroz kolonu odreuje njegov omjer raspodjele izmeu pokretne gasovite faze i
imobilizirane tene faze.Kod gas-tene hromatografije iz rezervoara pod pritiskom prolazi
kroz kolonu i kroz cijeli sistem konstantnom brzinom. Uzorak koji se analizira unosi se u
6

specijalnu komoru ispred kolone ili u kolonu direktno. Temperatura komore ili kolone u koju
se uzorak unosi mora biti konstantna i dovoljno visoka da teni uzorak potpuno ispari i da
njegove komponente itavo vrijeme analize ostanu u parnom stanju. Gas nosa nosi isparene
komponente uzorka kroz kolonu, gdje se zbog razliite rastvorljivosti u tenoj stacionarnoj
fazi komponente razliito raspodjeljuju izmeu dvije faze i kroz kolonu kreu razliitom
brzinom, a njihov izlazak iz kolone se automatski registruje odgovarajuim detektorom. Svaki
dio gasnog hromatograma utie na efikasnost sistema ali posebno mjesto zauzimaju kolone i
detektori.
Detektor registruje prisustvo supstanci, a automatski ureaj biljei rezultate u obliku gasnog
hromatograma koji predstavlja odziv detektora u funkciji vremena ili volumena dodane
mobilne faze. Kada su u gasnoj fazi, komponente uzorka se kreu prema izlazu iz kolone ali
ih stacionarna faza relativno usporava. Otuda komponente smjese prolaze kroz kolonu
razliitim brzinama i iz kolone izlaze u razliito vrijeme. Vrijeme prolaska kroz kolonu jako
adsorbovanih ili rastvorenih komponenti moe se skratiti povienjem temperature kolone.
Povienjem temperature kolone pojaava se desorpcija odnosno isparavanje odgovaajuih
komponenti tako da se na taj nain smanjuje vrijeme eluiranja.
Vrijeme zadravanja ili retenciono vrijeme, t R predstavlja karakteristinu velinu za svaku
izeluiranu komponentu smjese. Vrijeme zadravanja je vremenski period od momenta
injiciranja uzorka do momenta kada je pik ispitivane supstance dostigao maksimum. Ova
velina se koristi za identifikaciju pojedinih komponenti uzorka, ali na nju utiu mrtvi
volumen u koloni i gasni volumeni u hromatografskoj koloni, pa je mnogo bolje koristiti tzv.
reducirano vrijeme zadravanja, t'R, koje predstavlja vrijeme koje eluirana supstanca
provede u stacionarnoj fazi. Reducirano vrijeme zadravanja se dobije kada se od vremena
zadravanja, tR, odreene supstance oduzme vrijeme zadravanja tzv.nezadrivog uzorka tM.
Vrijeme koje je potrebno da supstanca koja se ne zadrava na koloni proe kroz kolonu
ponekad se zove mrtvo vrijeme. Osim vremena zadravanja i reduciranog vremena
zadravanja kao mjerilo za identifikaciju supstanci u gasnoj hromatografiji se koriste i
volumen zadravnja, VR, odnosno reducirani volumen zadravnja, VR. Ove veliine su
ponekad bolje za identifikaciju supstanci, jer uzimaju u obzir efekte pritiska i temperature u
gasnoj hromatografiji. Volumen zadravanja predstavlja produkt vremena zadravanja i brzine
protoka gasa nosaa.

Na slici 1. su prikazani karakteristini podaci jednog hromatograma koji sadri pik inertne
supstance koja se nije zadrala na koloni (A) i pik supstanci koja se zadtala na koloni (B). Sa
W je oznaena irina pika na baznoj liniji, a sa Wh je oznaena irina pika na polovini visine
pika.

Slika 1

Slika1. Gasni hromatogram sa oznakom tR vrijeme zadravanja, t*R reducirano vrijeme

zadravanja, tM vrijeme zadravanja uzorka koji se ne zadrava ,Wb irina pika na
baznoj liniji, Wh irina pika na polovini visine
Najvaniji dio gasno hromatografskog sistema predstavlja hromatografska kolona na kojoj
se odvija proces razdvajanja supstanci.
Efikasnost razdvajanja za pojedinu vrste kolone zavisi od vie faktora a to su:
1.Broj teoretskih tavana (N) koji je definisan izrazom:
2

N=16

2.Visina ekvivalentna teoretskom tavanu (H) predstavlja suinu koja odgovara jednom
teoretskom tavanu i moe se izraunati iz duine kolone (L) i broja teoretskih tavana (N):
H= L/N
3.Koeficijent selektivnosti ili koeficijent separacije () neke hromatografske kolone za dva
analita A i B definie se :

=KB/KA=kB/kA=
gdje je KB omjer raspodjele za snanije zadrani analit, a KA omjer raspodjele za slabije
zadrani analit, odnosno bre eluirani analit. k'A i k'B su faktori kapaciteta za analit A i B.
Prema toj definiciji uvijek vei od jedinice. Koeficijent selektivnosti se moe izraunati iz
hromatograma.
8

4.Razdvajanje kolone ili faktora rezolucije (R) je kvantitativna mjera kojom se izraava
sposbnost razdvajnja dva analita na toj koloni, odnosno razdvajanje predstavlja vrijednost
koja pokazuje koliko su dva susjedna pika razdvojena. Vanost tog izraza prikazuje slika 2. sa
dva hromatograma za sastojke A i B na tri kolone razlite moi razdvajanja. Razdvajanje
svake kolone definisano je izrazom:

R=

U hromatografiji postoji mnogo razliitih veliina, izraza i odnosa koji ponekad mogu stvarati
zabune. Pregled najvanijih definicija i jednaina koje se koriste u hromatografiji dat je u
Tabeli 1. i Tabeli 2.

Tabela 1. Vane eksperimentalne hromatografske veliine i odnosi

Tabela 2. Vane izraunate veliine i odnosi

4. UREAJI ZA GASNO-TENU HROMATOGRAFIJU

Na slici su prikazane osnovne komponente gasnog hromatograma sa sistemom za detekciju
zasnovanom na mjerenju promjene osobine gasa nosaa u prisustvu molekula analita zbog
ega se koristi razvodnik gasa nosaa prije ulaska u kolonu.

10

Slika 2. Shematski prikaz gasnog hromatografa

4.1.Gas nosa
Gas nosa nosi uzorak kroz kolonu do detektorskog sistema. Gas nosa ne smije uticati
detektorski sistem, mora biti vrlo velikog stepena istoe jer i najmanje neistoe mogu
dovesti u pitanje tanost analize. Izbor gasa nosaa zavisi od izbora detektorskog sistema.
Najee se kao gasovi nosai koristi hidrogen, nitrogen, helijum, argon, ili smjese argonmetan i drugi.
Kada se upotrebljava detektor toplotne provodljivosti, kao gas nosa se koristi helijum ili
hidrogen jer ovi gasovi imaju najbolju toplotnu provodljivost.
Kod plamenjonizacionog detektora mogu se kao gasovi nosai sa podjenakom efikasnou
upotrijebiti nitrogen, helijum ili argon.
Za elektron apsorbirajui detektor najpodesniji gas nosa je nitrogen, pod uslovom da ne
sadri tragove oksigena.
Pri izboru gasa nosaa vodi se posebno raun o njegovom stepenu istoe, kao i drugim
osobinama od kojih zavisi brzina i efikasnost razdvajanja. Brzina analize i vrijeme
zadravanja supstance u koloni zavise od brzine protoka gasa nosaa kroz kolonu, kao i
difuziju uzoraka u gasu nosau.

4.2.Sistem unoenje uzoraka

Gasnom hromatografijom mogu se razdvajati uzorci u sva tri agregatna stanja. Gasoviti uzorci
unose se u hromatografsku kolonu pomou specijalnih gasnih kiveta odreene zapremine.
Teni uzorci i rastvori unose se pomou injekcionih prica raznog volumena, i to najee od
1, 10 ili 100l. Prikaz injekcione price imamo na slici 3.
11

Slika 3. Prikaz injekcione price

Za rastvaranje vrstih uzoraka koriste se lahko isparljivi rastvarai kao etar, hloroform,
benzen, alkohol, nekad i voda. vrsti uzorci se mogu direktno unositi u sistem injiciranja uz
upotrebu tehnike kapsule. vrsta supstanca se unese u metalnu kapsulu, kapsula se zatvori i
ubaci u dio za unoenje uzoraka pomou posebnog dodatnog sistema. Zatim se probui tako
da gas nosa istjera supstancu iz kapsule i unese u kolonu. Ovaj dio se posebno zagrijava da
supstanca pree u gasovito stanje. Kolina uzorka koji se aplicira zavisi od dimenzije kolone,
osjetljivosti detektora i koncentracije supstance u uzorak. S obzirom na to da su detektori vrlo
osjetljivi dovoljna je kolina supstance od 10-10 do 10-15g u volumenu od 1-5l.
Bolja reproduktivnost veliine uzorka i za tene i za gasovite uzorke se pri kvantitativnom
odreivanju postie ako se uzorak u kolonu unosi pomou rotirajuih ventila odreenog
volumena. Sa ovim ureajem greke nastale zbog veliine uzorka mogu biti smanjene od 0,5%
do 2% relativno.

12

Slika 4. Sistem za direktno unoenje uzorka u punjene kolone

4.3.Izbor kolone
U gasnoj hromatografiji obino se upotrebljavaju dva tipa kolona i to:
- punjene kolone,
-kapilarne kolone
Najee se upotrebljava punjene kolone. Pri formiranju hromatografske kolone mora se
pravilno izabrati vrsta vrstog nosaa, zatim vrsta i kolina tene nepokretne faze, dimenzije
kolone i materijal od koga je napravljena kolona.
Kolone mogu biti napravljene od raznog materijala, kao to su: aluminijum, nehrajui elik,
bakar i staklo. Staklo i nehrajui elik se najee upotrebljavaju. Staklene kolone su
podesne za razdvajanje nestabilnih supstanci kao to su stereoidni hormoni, koji se mogu u
procesu hromatografiranja razlagati u kontaktu sa metalima. U navedenoj Tabeli 3 data su
svojstva i osobine tipine gasno hromatografske kolone.

Vrsta hromatografske kolone

13

FSTO*

WCOT**

SCOT***

Punjene

Duina m

10-100

10-100

10-100

1-6

Unutranji
prenik mm

0,1-0,3

0,25-0,75

0,5

2-4

Dejstvo,tavan/m

2000-4000

1000-4000

600-1200

500-1000

Kolina
uzorka,ng

10-75

10-1000

10-1000

10-106

Relativni
pritisak

nizak

nizak

nizak

visok

Relativna
brzina

brzo

brzo

brzo

sporo

Hemijska
inertnost

najvea

Fleksibilnost

da

najmanja
ne

ne

ne

Tabela 3. Svojstva i osobine tipicne gasno hromatografske kolone

Punjene kolone koje se koriste u analitike svrhe obino su dimenzije od 1-3m, a unutranjeg
promjera 3 ili 6 mm izgraene su od staklenih , metalnih ili teflonskih cijevi. U njih se stavlja
jednolino, sitnozrnasto punilo ili vrsti nosa na koji je nanesen tanki sloj stacionarne tene
faze. vrsti nosa u punjenoj koloni nosi tenu stacionarnu fazu. Stacionarna faza se nanosi
tako da to je mogue vea povrina te faze bude u dodiru sa mobilnom fazom.
Kapilarne kolone su duine 10-50m, unutranjeg promjera oko 0,25mm. Postoje dvije vrste
kapilarnih kolona. Jedna vrsta su cijevi kod kojih je unutranja stijenka prevuena tankim
slojem stacionarne faze koje nazivamo kapilarnim kolonama. Drugu vrstu ine mikro punjene
kolone koje su takoer kapilarnih dimenzija ali je unutranja stijenka prevuena punilom
poput dijatomejske zemlje na kojoj je nanesena stacionarna faza.Ovaj tip kapilarne kolone
sadri nekoliko puta veu koliinu stacionarne faze od predhodnih kolona pa zato imaju vei
kapacitet za uzorak. Na Slici 5dati su hromatogrami dobijeni primjenom kapilarne kolone.

14

Slika 5.Tipicni hromatogrami dobijeni primjenom kapilarne kolone sa: a)

polidimetoksiloksanom, b) 5 % fenil polidimetoksiloksanom, c) polietilen glikolom, f)
50% cijanopropilpolidimetioksanom

4.4.Punilo za kolone
U gasnoj hromatografiji gdje se vri raspodjela, punilo kolone je neisparljiva tenost (tena
faza), nanesena na vrsti nosa. Kao nosa najee se koristi specijalno prireena
dijatomejska zemlja, teflon, staklene kuglice, aluminijum-oksid, aktivni ugalj i silikagel.
Aluminijum-oksid i aktivni ugalj najee se koriste kod gasno-vrste hromatografije. Gore
nabrojani materijali posebno obraeni i odreenih dimenzija estica dolaze u promet pod
razlitim imenima kao: Chromosorb G, Chromosord W, Celit i drugi. Kao nosai koriste se i
razni polimeri etilvinilbenzen, stiren, divinilbenzen, sa komercijalnim oznakama kao Poropak
Q ili Poropak R, S, T. Prije nanoenja nepokretne tene faze, vrsti nosa se moe pripremiti
obradom sa kiselinom, bazama ili reagensima za siliniziranje.
vrsti nosa ne smije utjecati na preraspodjelu. Nosa mora biti inertan, dovoljno kompaktan
da se ne raspada prilikom obrade i punjenja kolone, sa to veom aktivnom povrinom da na
sebe moe vezati veu kolinu tene faze i mora imati uniformnu velinu estica.

15

Dimenzije zrna nosaa- kao to prikazuje Slika 6 dejstvo gasno - hromatografske kolone
naglo se poveava sa smanjenjem prenika zrna punjenja. Razlika u pritisku koja odrava
zadati protok poveava se sa kvadratom prenika zrna. Zbog te razlike postoji donja razlika
prenika zrna. Razlika u pritisku vea od 3,5 x 10 5 Pa pa nije pogodan za rad u gasnohromatografskoj koloni. Optimalni prenici zrna punjenja su prema tome 170 do 250m.
H=B/u + Csu + Cmu (1)
Jednaina 1 za izraunavanje visine tavana moe se primjeniti za gasnu i za tenu
hromatografiju. Longitudinalna difuzija iz te jednaine ima vei uticaj kad je mobilna faza
gas, jer su brzine difuzije u gasovima 10 4 puta vee od onih u tenostima. Zbog toga je
minimum u dijagramu na kojem se prikazuje visina tavana u odnosu prema brzini protoka
mnogo iri u gasnoj hromatografiji nego u tenoj. To se takoe odnosi i na krive sa Slike 6 na
kojoj je pokazano kako smanjenje obima zrna punjenja poveava visinu tavana.

Slika 6. Uticaj veliine zrna na visinu tavana. Brojevi sa desne strane oznaavaju
precnik zrna

4.5.Nepokretna tena faza

Postoji irok izbor supstanci koje se koriste kao nepokretna tena faza. Ove supstance moraju
biti neisparljive na temperaturi na kojoj se vri hromatografiranje, hemijski stabilne, da ne
podlijee procesu oksidacije, dobro rastvorljive i da stvaraju fini omota oko
nosaa.Nepokretne faze se mogu podijeliti na nepolarne i polarne. Za hromatografiranje
nepolarnih supstanci izabere se i nepolarna tena faza, a za polarne supstance polarna
nepokretna faza. Formirana hromatografska kolona se smjesti u termostat koji se vrl brzo
moe podesiti na eljenu temperaturu u dosta irokom podruju od -70 oC do 400oC.Kolona je
jednim krajem prikljuena na injekcioni sistem a drugim na dektorski sistem. Prije
hromatografiranja kolona se grije na odreenoj temperaturi 12 - 24 sata,uz protok samo gasa
nosaa. Ova operacija se zove kondicioniranje kolone ija je svrha da se iz kolone prije
hromatografiranja uklone razne neistoe. Hromatografija se moe provesti na odreenoj
ustaljenoj temperaturi ili se temperatura moe poveavati u odreenim vremenskim
razmacima.
16

U Tabeli 4 dat je primjer nekoliko uobiajnih stacionarnih faza za gasno tenu

hromatografiju.
Stacionarna faza

Uobiajno
trgovako ime

Maksimalna
temperatura C

Uobiajne
primjene

polidimetilsiloksan

OV-1

350

Neplarna
faza
opte namjene:
ugljovodonici,
polinuklearni
aromati, droge,
stereodi, PCB-i

350

Metalni
estri
masnih kiselina,
alkaloidi, droge,
halogena
jedinjenja

SE-30

5% fenilpolidimetilsiloksan

OV-3
SE-52

50% fenilpolidimetilsiloksan

OV-17

250

Droge, stereodi,
pesticidi, glikoli

50%

OV-210

200

Hlorirani
arommati,
nitroaromati,
alkilsupstituirani
benzeni

Carbowax

250

Slobodne
kiseline,
esencijlna
glikoli

trifluoropropilpolidimetilsiloksan

polietilenglikol

200M

50%
cijanopropilpolidimetilsiloksan

OV-275

240

etri,
ulja,

Nezasiene
masne kiseline,
kisele
smole,
slobodne
kiseline, alkoholi

Tabela 4. Nekoliko uobiajnih stacionarnih faza za gasno-tenu hromatografiju

4.6.Termostatiranje kolona

17

Za precizan rad potrebno je temperaturu kolone odravati u granicama nekoliko desetina

stepeni. Kolona je najee smjetena u termostatikom prostoru. Optimalna temperatura
kolone zavisi od vrenja uzorka i stepena traenog odvajanja. Pri temperaturi
jednakoj prosjenom vrenju uzorka ili neto vioj postie se prihvatljivo vrijeme eluacije (od
2 do 30 minuta). Uzorke irokog raspona vrenja poeljno je analizirati uz
programiran porast temperat ure, tako da se temperatura kolone poveava
neprekidno ili promenljivo tokom o d v a j a n j a .
Slika 7c prikazuje dejstvo programiranog termostatiranja u pogled
poboljanja odvajanja. Uopteno optimalno odvajanje povezano je sa minimalnom
temperaturom. Meutim pri nioj temperaturi trajanje eluacije je due, a time i vrijeme
potrebno za analizu. Slike 7a i 7b pokazuju taj princip.

Slika 7.Uticaj temperature na gasne hromatograme a) izotermno na 45oC, b) izotermno

na 145oC,c) programirano na 30 180oC

4.7. Detektori
18

U gasnoj hromatografiji se koristi oko 40 raznih detektora. U principu postoje dvije vrste
detektora i to:
a) detektori koji registruju razlike u fizikim karakteristikama izmeu samog gasa nosaa i
gasa nosaa kome je prisutan uzorak, kao to je sluaj kod detektora sa toplinskom
provodljivou,
b) detektori koji mjere samo svojstva uzoraka kao to je grupa detektora sa jonizirajuim
karakteristikama.

4.7.1.Detektor toplinske provodljivosti/Thermal Conductivity Detektor (TCD)

Detektor toplinske provodljivosti registruje prisustvo supstance u gasu naosau iz razlike u
toplinskoj provdljivosti u termalnoj niti, pri prolazu gasa nosaa i supstance i provodljivosti u
referentnoj ugrijanoj niti preko koje prolazi samo gas nosa. Temperatura i otpor uarene niti
zavisi o toplotnoj provodljivosti okolnog gasa. iani otpornici u mjernoj i referentnoj eliji
spojeni su sa otpornicima u Wheatstonov most, pa svaka razlika u provodljivosti gasova,
odnosno u otporu niti pokazuje otklon na registrirajuem instrumentu ili pisau. Velina
razlike u provodljivosti zavisi od prirode supstance u odnosu na gas nosa. Hidrogen
posjeduje toplotnu provodljivost bolju od svih gasova, ali ga je nekada nepodesno upotrijebiti
usljed njegove zapaljenosti. Kao gasovi nosai za detektor toplinske provodljivosti pogodan je
jer ne dolazi do razgradnje uzorka koji se na kraju kolone moe sakupiti. Detektor se sastoji
od metalne nitiuvijene u spiralu smjetenu u metalni cilindar preko koje prolazi gas. Kada se
supstanca nalazi u gasu nosau, temperatura gasa se mijenja i mijenja se provodljivost niti. Na
Slici 8 dat je prikaz detektora toplinske provodljivosti.

Slika 8. Detektor toplinske provodljivosti

4.7.2.Plamenojonizacioni detektor/Flame Ionistation Detektor (FID)

19

Kod plamenojonizacioni detektora supstanca koja izlazi iz kolone sa gasom nosaem mijea
se sa hidrogenom i vazduhom i sagorijeva u plamenu. Prilkom sagorijevanja supstance dolazi
do stvaranja jona i naglog protoka struje, to se registruje kao hromatografski signal u onom
momemtu kada je supstanca napustila kolonu. Kada iz kolone izlazi samo gas nosa, postoji
vrlo mali protok struje.
H2 + O2 + organska supstanca CO2 + H2O + e- + jon+ +jon e- +jon- struja
Plamenojonizacioni detektor je vrlo osjetljiv na sve organske supstance, a neosjetljiv na
neorganske gasove i vodu. Osjetljivost plamenojonizacioni detektora data formulom br. 2

S=

(2)

h- visina signala
Wh- irina signala na polovini visine
m- teina injiciranog uzorka koja odgovara dotinom signalu

Slika 9. Plamenojonizacioni detektor

4.7.3.Elektron-privlaei detektor /Elektron Capture detektor (ECD)

20

Elektron-privlaei detektor je posebna vrsta detektora koji se upotrebljava za supstance koje

sadre atome ili atomske grupe sa velikim afinitetom za elektrone, kao to su spojevi sa
halogenim elementima.
Elektron-privlaei detektor moe se predstaviti kao jedna komora kroz koju prolazi, kao gas
nosa, nitroge ili argon koji se podvrgava jonizaciji. Jonizacija se provodi sa nekim
radioizotopm kao Ni63 od 15 mCi ili H3. Pri prolazu gas nosaa, uspostavi se standardni protok
struje kroz detektor. Pri prolazu gasa nosaa sa uzorkom smanjuje se protok struje, i to
smanjenje se registruje kao signal.

Slika 10. Elektron- privlaei detektor

4.7.4.Sumpor heliuminiscentni detektor/Sulfur Chemiluminescence Detektor (SCD)

Sumpor-heliuminjscentni detektor se temelji na mjerenju inteziteta luminiscencije nastale kao
rezulatat reakcije nekih spojeva koji sadre sumpor i jakog oksidirajueg sredstva kao to je
fluor ili ozon. Intezitet luminiscencije je proporcionalan koncentraciji sumpora. Ovaj detektor
se naroito koristi za odreivanje polutanata kao to su merkaptani. Eulent iz kolone se mijea
sa vodonikom i vazduhom i sagorijeva kao kod plamenojonizacionog detektora. Nastali
gasovi se mijeaju sa ozonom i intezitet nastale emisije se mjeri.

4.7.5.Plamenofotometrijski detektor/Flame Photometric Detektor (FPD)

Plamenofotometrijski detektor se koristi kod gasne hromatografije organskih spojeva koji
sadre sumpor i fosfor. Pri hromatografiranju na izlazu iz kolone dolazi do sagorijevanja
supstance u plamenu i zavisno od prisustva fosfora ili sumpora, do emisije karkatristinog
zraenje. Ovo zraenje se selektira pomou odgovarajuih filtera i njegov intezitet registruje
fotoelija.

21

Slika 11. Plamenofotometrijski detektor

4.7.6.Atomski emisioni detektor/Atomic Emission Detektor (AED)

Ovaj detektor je mnogo skuplji od drugih komercijalno raspoloivih detektora, ali ima mnogo
iru primjenjivost, jer se temelji na detekciji zraenja koje emitiju atomi mnogih elemenata ua
analitima euliranim iz kolone. Kod ovog detektora (Slika 12) eulent se iz kolone uvodi u
helijevu plazmu nastalu pod djelovanjem jakog mikrovalnog zraenja. Djelovanjem energije
plazme dolazi do atomizacije svih elementa u uzorku i do pobuivanja njihovog
karakteristinog sprktra. Ovaj spektar se zatim posmatra spektrometrom koji koristi pokretni,
ravni diodni niz sposoban da detektuje emitirano zraenje od oko 170 d0 780 nm.

Slika12. Atomski emisioni detektor

4.7.7.Fotojonizujui detektor/Photoionization Detektor (PID)
22

Fotojonizujui detektor se sastoji od elije detektora kroz koju protie efluent, i UV lampe
koja usmjerava UV svjetlost unutar elije. Kod ovog ureaja se koristi UV svjetlo kao
sredstvo za jonizaciju analita koji izlazi iz kolone. Emitovana svjetlost se usmjerava na struju
noseeg gasa koji protie kroz kolonu. Stalno elektronsko polje se odrava
izmeu emitujue i kolektorske elektrode eliji fotojonizujueg detektora. Kada su jednom
jonizovani pod dejstvom UV svjetlosti molekuli u detektoru se kreu u elektronskom polju
stvarajui naelektrisanje koje je proporcionalno koncentraciji jonizovanih molekula u eliji
detektora.
Elektrometar konvertuje trenutnu vrijednost naelektrisanja u voltau, koja se
dalje konvertuje u digitalni signal koji amplificira mikroprocesor. Pravac
kretanja elektrona kroz eliju detektora moe se videti na slici 13.

Slika 13. Fotojonizirajui detektor

4.7.8.Azot fosfor detektor/The Nitrogen Phosphorus Detektor (NPD)

23

Azot-fosforni detektor ili termojonski detektor / Thermoionic Detektor (TID) je selektivan za

organske supstance koje sadre fosfor i/ili azot. Njegov odziv na atom fosfora je priblino
deset puta vei nego na atom azota, a 104-106 puta vei nego na atom ugljika. U poreenju sa
plamenojonizacionim detektorom ovaj detektor ima priblino 500 puta bolju osjetljivost na
supstance koje sadre fosfor i 50 puta bolju osjetljivost na supstance koje sadre azot. Ove
osobine ine termojonski detektor naroito pogodnim za detekciju i kvantitativno odreivanje
mnogih pesticida koji sadre fosfor.
Termojonski detektor ima slinu konstrukciju kao plamenojonizacioni detektor prikazan na
slici 9. Kod ovog detektora osjetljivi element je kuglica izraena od rubidijeva ili cezijea
silikata koja se zagrijava elektrinim putem. Eluent iz kolone se mijea sa vodonikom, prolazi
kroz mlaznicu i zapali se. Nastali topli gas struji oko zagrijane rubidijeve kuglice ijii se
potencijal odrava na oko 180V s obzirom na kolektorsku elektrodu. Zagrijana kuglica stvara
plazmu koja ima temperaturu od 600-800oC. Nije poznao ta se stvarno deava u plazmi da se
stvara neuobiajeno veliki broj jona iz molekula koje sadre fosfor i azot, ali posljedica toga
su velike jonske struje koje se koriste za odreivanje spojeva koji sadre ova dva elementa.

4.8.Registracija signala-gasni hromatogram

Registrovani signali koji dolaze sa detektora na sistem za registraciju- pisa, predstavljaju
gasni hromatogram. Registrovani signali na gasnom hromatogramu pruaju kvalitativne i
kvantitativne podtke o ispitivanom uzorku. Prilikom hromatografiranja potrebo je ustaliti neke
uslove i navesti tane podatke za temperaturu, brzinu protoka gasa nosaa, brzinu protoka
drugih gasova potrebnih za rad detektora, vrstu punila kolone, kocentraciju tene faze, vrstu i
veliinuzrna vrstog nosaa, dimenziju kolone, vrste detektora, osjetljivosti sistema za
detekciju i drugo. Na snimljeni hromatogram obavezno se unose svi gore navedeni podaci
kako bi se dobiveni rezultati mogli reproducirati.

5.PRIMJENA GASNE HROMATOGRAFIJE

Da bi se procjenila vanost gasne hromatografije, valja razlikovati dvije uloge te metode.
Jedna uloga hromatografije jest odjeljivanje, i u toj je ulozi ona neizbjean dio cjelokupne
analize sloenih organskih organometalnih i biohemijskih smjesa. Njezina druga, bitno
razlita uloga jest sama analiza. Vremena zadravanja pritome slue za kvalitativnu
identifikaciju.
Gasna hromatografija ima mnogo vea ogranienja kvalitativne analize od veine
spektroskopskih metoda. Da bi se uklonila ta nepogodnost, ulau se veliki napori za
kombinaciju izvanrednih sposobnosti odjeljivanja koje posjeduje tehnika gasne
hromatografije s izvanrednim sposobnostima odreivanja masene, IR ili NMR spektroskopije.

24

5.1.Kvalitativna analiza
Identifikacija komponenata koje se razdvoje u toku hromatografske analize obino se vri na
taj nain da se poredi vrijeme zadravanja ispitivanja supstance sa vremenom zadravanja test
supstance. Vrijeme zadravanja tR je vremenski period od momenta iniciranja uzroka do
momenta kada je pik ispitivane supstance dostigao maksimum. Osim vremena zadravanja
moe se kao mjerilo upotrijebiti volumen zadravanja (V R), koji predstavlja produkt vremena
zadravanja i brzine poticanja gasa nosaa. Za identifikaciju se upotrebljava reducirano
vrijeme zadravanja t,R ili reducirani volumen zadravanja V'R odnosno relativno vrijeme
zadravanja. Reducirano vrijeme (volumen) zadravanja je razlika izmeu vremena
(volumena) zadravanja uzorka i tzv.nezadrane, inertne komponente, obino vazduha.
Relativno vrijeme zadravanja predstavlja odnos reduciranog vremena (volumena)
zadravanja nepoznate supstance i reduciranog vremena (volumena) zadravanja standardne
supstance. Osim vremena zadravanja koristi se i indeks zadravanja.

5.2.Kvantitativan analiza
Kvantitativan i semikvantitativna analiza temelje se na odzivu detektora smjetenog na izlazu
iz hromatografske kolone. Pri briljivo nadziranim uvjetima gasno hromatografske analize
moe se postii tanost od 1 do 3%. Vaan udio pri odreivanju mogue tanosti ima priroda
uzorka.
Openito rasprave o kvantitativnoj hromatografskoj analizi odnose se na gasnu
hromatografiju, pa prema tome nije nuno daljnje razmatranje navadene teme.

6.GASNA HROMATOGRAFIJA- SPEKTROMETRIJA MASA

Povezivanjem gasnog hromatografa sa spektrom masa dobijen je idealan analitiki sistem
kojim se u toku analize provede razdvajanje supstanci u gasnom hromatografu i detekcija u
spektrometru masa kao specifinom detektoru. Ovakav sistem povezan sa raunarima i sa
bogatom bibliotekom (bankom) podataka, omoguava sakupljanje svih podataka iz gasnog
hromatografa i spektrometra masa u toku analize, detaljnu viestruku analizu, obradu i
komparaciju dobivenih nalaza sa podacima u biblioteci raunara.Gasni hromatograf koji se
vezuje na spektrometar masa moe biti sa punjenim ili kapilarnim kolonama. Najee se
upotrebljavaju kapilarne kolone velike selektivnosti duine 10-50 metara. Primjenom
kapilarnih kolona postie se efikasnije razdvajanje a pogodne su kod vezivanje za
spektrometar masa jer se unosi mali volumen uzorka, odnosno rastvaraa i tako ne dolazi do
veih promjena pritiska u jonizacionoj komori. Hromatografiranje se izvodi uz helijum kao
gas nosa i najee uz temperaturni program. Izlazni dio kolone direktno ulazi u jonizacionu
komoru tako da poslije eluiranja supstance dolazi do jonizacije i stvaranja molekulskog i
fragmentnih jona.
25

Hromatograf moe biti sa razliitim spektrometrima masa, odnosno razliitim masenim

detektorima. Veza se moe ostvariti sa jednostruko fokusirajuim sektorskim ili kvadrupolnim
instrumentima, sa dvostruko fokusirajuim sektorskim instrumentima visoke moi
razluivanja te sa viestruko fokusirajuim instrumentima razlite izvedbe. Posljednih godina
upotrebljavaju se ureaji poznati pod nazivom jon trap detektor i jon selektivni detektor.
Vezani sistem gasna hromatografija-spektrometrija masa naroito dolazi do izraaja kada se
ispituje struktura supstance u uzrocima koji sadre vie komponenata sline strukture i kada je
za analizu dostupna mala kolina supstance. Zato je primjena ove metode neophodna prilikom
ispitivanja lijekova pri stavljanje u promet, pri parenju farmakokinetike supstanci, ispitivanju
strukture metabolita, resorpcije, distribucije i izluivanja lijekova. U kontroli gotovih
preparata koristi se pri ispitivanjima oneienja, razgradnih produkata i drugih istraivanja u
tehnologiji pripreme raznih farmaceutskih oblika. Ispitivanje malih kolina supstance
masenom spektrometrijom provodi se tehnikom praenja pojedinanih jona SIR (Signal Ion
Recording). Tehnika se sastoji u tome da se promjenom napona akceleracije, odnosno RF
napona kod kvadrupolnih instrumenata u fokus jonskog kolektora dovode samo predhodno
odabrani joni, i pri tome se ne snima cjelokupni spektrogram masa, ve se izaberu samo mase
karakteristinih fragmenata, koje se u kratkim vremenskim intervalima naizmjenino
registruju i tako se dobije fragmentogram odabranih jona.
Prilikom izbora jona koji e se pratiti treba voditi rauna da oni budu to veeg relativnog
inteziteta, jer se na taj nain postie vea osjetljivost kao i da budu to vee mase, tj. da im
m/z bude to vea poto se na taj nain postie visoka selektivnost i zbjegava registrovanje
mnotva signala koji su prisutni ukoliko se prate manje mase. Fragmentogrami dobiveni na
ovaj nain su isti prisutni su samo signali koji potiu od ispitivane supstance a osjetljivost je
vea i za dva reda veline u odnosu na snimanje klasinih spektrograma masa. Praenje toka
analize u vezanom sistemu gasnu hromatografija spektrometrija masa razlikuje se od praenja
u gasnoj hromatografiji i spektrometriji masa.Na osnovu svih snimljenih spektrograma masa
primjenom raunara konstruie se tzv. hromatogram totalne jonske struje, na kojem pojava
hromatografskog signala oznaava da je neka supstanca dospjela u jonizacionu komoru.
Hromatogram totalne jonske struje je, po analogiji, najsliniji hromatogramu koji se dobije na
plamenojonizacionom detektoru gasnog hromatografa, s tom razlikom to kod
plamenojonizacionog detektora supstanca, dospjevi u detektor, sagori dajui elektrone koji se
registruju kao signal a ovdje se supstanca fragmentira i daje jone, odnosno spektrogram masa.
Svi signali znaajnijeg inteziteta koji se dobiju na hromatogramu totalne jonske struje kasnije
se podvrgne evaluaciji i detaljnom ispitivanju njihovih spektrograma masa.

26

Slika 14. Shema aparature za GC-MS

27

7. LITERATURA
1. B.Nikolin, M. ober Analitika lijekova Drugo dopunjeno izdanje (Sarajevo Publishing,
Sarajevo, 2003)
2. Jelena Savic, Miomir Savic Osnovi analitike hemije III izdanje (Svjetlost, Sarajevo,
1990)
3. M. Sikirica, B. Korpar-Colig Praktikum iz ope kemije II izdanje (kolska knjiga,
Zagreb, 2003)
4. Skoog,D.A., West, D.M., Holler, F.J. Osnove analitike kemije (kolska knjiga, Zagreb,
1999)

28