13 Kromatografija

Povijest kromatografije
Profesor iz Bazela Friedrich Goppelsrder je 1861. objavio osvrt na rad M.
Schnbeina. Schnbein je utvrdio da filter papir upija otopine raznih supstanci
razliitom brzinom i raliitim intenzitetom. Goppelsrder je ovaj fenomen razradio
i doveo do nastanka preparativne papirne kromatografije. Izolirao je, izmeu
ostalog, azulen. Mihail Semenovi Cvet je botaniar, roen 1872. u Italiji, umro
1919 u Rusiji. Iako nije otkrio kromatografiju, Cvet je najznaajniji pionir
kromatografije koji je objavio prvi rad o razdvajanju klorofila 1906. Razliitim
prakovima je punio staklene cijevi i na njima odvajao komponente ekstrakta
lia.
Princip kromatografije
Kromatografija je metoda razdvajanja komponenti iz smjese, pri emu dolazi do
preraspodjele izmeu dvije faze koje se ne mijeaju i od kojih je jedna pokretna, a
druga nepokretna. Faze su odabrane tako da komponente smjese imaju razliit
afinitet prema njima. Razliito kretanje komponenti smjese omoguava njihovo
razdvajanje.
Osnovne faze procesa
Uspravna staklena cijev (kolona)b se ispuni fino spraenom vrstom supstancom
(stacionarna faza). Na vrh kolone se nanese mala zapremina otopine smjese koja
se razdvaja. Na kolonu se dodaje mobilna faza koja pod utjecajem gravitacije
putuje niz kolonu. Razliite supstance razliitom brzinom putuju u mobilnoj fazi.
Komponente smjese se identificiraju u razliitim frakcijama eluata.
TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)
Naelo metode
-

sastojci smjese noeni mobilnom fazom putuju razliitom brzinom du

tankog sloja stacionarne faze. Brzina ovisi o omjeru raspodjele sastojaka
izmenu faza. Omjer raspodjele povezan je s kemijskom prirodom
stacionarne i mobilne faze.
elektrostatske sile stacionarne faze
razliita topljivost sastojaka uzorka u mobilnoj fazi

Priprema tankog sloja

-

homogena suspenzija stacionarne faze

debljina sloja 0.1-0.3 mm
suenje na 100-105C 1 h

Nanoenje uzorka i razvijanje kromatograma

-

mikropipete i kalibrirane kapilare (~20 mg uzorka)

zatvorena komora sa zasienim parama razvijaa

jednodimenzionalna i dvodimenzionalna kromatografija

Aparatura za TLC
-

ploe presvuene slojem stacionarne faze (npr. Merck, Darmstadt,

Njemaka)
kromatografske komore
mikropipete, mikrotrcaljke i kalibrirane kapilare (npr. Hamilton, Reno, USA)
lampe za detekciju
reagensi za vizualizaciju odijeljenih sastojaka

Stacionarna faza
-

nanesena na ravnu plohu u tankom, jednolinom sloju

nosa: staklena ploa, plastina ili metalna folija (mogue rezati)
usitnjena vrsta tvar :
anorganska: silikagel, oksidi, hidroksidi, dijatomejska zemlja
organska: celuloza, dekstran, krobni praci, poliamidi

Modifikacije TLC adsorbensa

silanizacija silikagela

povrina silikagela postaje nepolarna

-

obrada slikagela s odgovarajuim otapalom ( npr. KOH u analizi bazinih

lijekova jer njihove soli ulaze u interakciju sa silanolnim grupama )

Mobilna faza - bolja odjeljivanja postiu se upotrebom smjesa otapala razliite

polarnosti.
Detekcija odijeljenih sastojaka
-

UV detekcija :
o analit apsorbira UV svjetlo pa gasi fluorescenciju ploe (254 nm)
o analit pokazuje fluorescenciju (356 nm)
Reakcija analita s reagensom
o pare joda, kalijev permanganat, otopina ninhidrina, .....
Radioaktivne metode
Bioloke metode detekcije
o antibiotici, enzimatske metode

Procjena kromatograma :
-

odrenivanje Rf vrijednosti (Rf x 100)

karakteristina boja produkta nastalog reakcijom ispitivane tvari s
odgovarajuim reagensom
usporedba s kromatogramom poredbene tvari

Primjena u farmaceutskoj analitici :

-

osnovna potvrda identiteta

vrlo zastupljena u farmakopejskim monografijama u identifikaciji
ispitivanje istoe farmaceutskih sirovina i ljekovitih oblika
razvijena kao osnovna tehnika u kontroli kvalitete za odrenivanje tragova
oneienja
veinom pol ukvantit ati vna anali za !!!!

Primjeri : Nifedipin
Ispitivanje istoe tankoslojnom kromatografijom
-

u farmakopejskim monografijama temelje se na usporedbi intenziteta mrlje

koncentrirane otopine analita i razrjenenje otopine oneienja
struktura oneienja poznata : usporedba s poredbenim otopinama
oneienja.
struktura oneienja nepoznata : obuhvaa niz oneienja sline
strukture ispitivanoj tvari usporedba s razrijenenom otopinom ispitivane
tvari.

Primjer : Kodein
Kvantitativna analiza
-

struganje sloja s uzorkom, ekstrahiranje sastojka sa stacionarne faze :

odrenivanje fizikalno-kemijskom metodom.
izravno odrenivanje na kromatogramu mjerenjem zraenja mrlje pomou
denzitometra
usporenivanje povrine mrlja ispitivanog uzorka s povrinom poredbene
tvari odrenene koncentracije.

Posebnosti metode
-

moe se primijeniti u analizi gotovo svakog spoja

mogu se detektirati sve komponente smjese, za razliku od kolonske
kromatografije u kojoj neke mogu ne eluirati iz kolone !!!!
izdrljiva i jeftina
moe se koristiti kao kvantitativna tehnika u kombinaciji s denzitometrom
za spojeve koji nemaju kromofore

Ogranienja metode
-

ogranien broj teorijskih tavana u rutinskim TLC sustavima

ograniena osjetljivost
nije prikladna za hlapljive spojeve

TLC VISOKE DJELOTVORNOSTI (HPTLC)

-

manja veliina estica silikagela (2-10 mm) = vei broj teorijskih tavana
horizontalno razvijanje kromatograma :
bre putovanje mobilne faze
manje isparavanje otapala s povrine ploe
jednakomjerno putovanje otapala

Primjena HPTLC kromatografije :

-

primjenjuje se kao kvantitativna metoda

denzitometrijsko odrenivanje apsorpcije ili fluorescencije UV svjetla

Primjer
-

odrenivanje farmakoloki aktivnih tiola (kaptopril) koji nemaju jaki

kromofor. (kaptopril)
odrenivanje aktivnih tvari u formulaciji ( izoniazid, Rimfapicin,
pirazinamid )

PAPIRNA KROMATOGRAFIJA
-

odjeljuju se sastojci smjese na papiru za kromatografiranje : raspodjela

izmenu dvije tekue faze
papir obranen s drugim tekuinama
papir obranen silikonskim uljem
sadri adsorbens ili ionski izmjenjiva
silazna ili uzlazna : Ph. Eur. - ispitivanje radiokemijske istoe
radiofarmaceutika

TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE EFIKASNOSTI (HPLC)

Naelo metode
tena mobilna faza pod pritiskom prolazi kroz elinu kolonu napunjenu
esticama stacionarne faze (3-10 mm) nosei komponente uzorka -> uzorak se
unosi preko ventila s vie izmjenjivih petlji -> mehanizam odjeljivanje ovisi o vrsti
stacionarne faze
Mehanizam odjeljivanja
-

Razdioba: stacionarna faza: tekuina adsorbirana na vrstoj tvari ili

organski spojevi vezani na vrsti nosa. Na odjeljivanje utjee: polarnost
sastojaka, polarnost mobilne i stacionarne faze.
Adsorpcija: stacionarna faza: polarna (silikagel)

Ionska izmjena
-

stacionarna faza: ionski izmjenjiva :

o
o

polimeri sa sulfonskim i karboksilnim kiselim skupinama

polimeri s bazinim aminskim funkcionalnim skupinama :
odjeljivanje tvari ionskog karaktera

Raspodjela prema veliini estica

-

stacionarna faza: polimerni gelovi razliitih veliine pora

smjesa tvari s razlikama u veliini estica

Stereokemijske interakcije
-

stacionarna faza: celulozni derivati, proteini i peptidi, ciklodekstrini

odjeljivanje enantiomera (kiralna kromatografija)

Tekuinski kromatograf :
1. spremnici mobilne faze
2. sistem za obradu otapala (otopljeni plinovi)
3. pumpa: visoki pritisci, do 300 bara (300x vei od atmosferskog p. !!)
4. sistem za unoenje uzorka: 1-200 ml
5. kolona: zrna punjenja kolone 3-10 mm
6. detektor
Razdjelna kromatografija

Stacionarna faza
-

reakcija organoklorsilana sa -OH skupinama na povrini silikagela

polarnost stacionarne faze ovisi o vezanim skupinama (R)

Uticaj strukture spoja na brzinu eluacije

Neutralni spojevi :
- polarne i lipofilne grupe molekule lijeka : kolona obrnutih faza najdue
zadrava lipofilan spoj = najpolarniji sastojak smjese eluira prvi

- redoslijed eluacije na koloni moe se predviditi iz strukture

Ionski spojevi
-

spojevi iji stupen ionizacije zavisi o pH : kontrola brzine elucije

podeavanjem pH vrijednosti mobilne faze
najvei uticaj promjene pH je 1 pH jedinica pKa vrijednosti lijeka

Moblna faza
-

sastav mobilne faze: smjesa otapala razliite polarnosti = koeficjent

selektvnosti
smanjenje koliine organskog otapala u mobilnoj fazi kod obrnutih faza =
poveanje tr
otopine pufera = dodatak organskog otapala potiskuje ionizaciju kiseline
izbor optimalne mobilne faze = vaan u ispitivanju profila istoe lijeka

Izokratino euliranje : ne mijenja se sastav mobilne faze tokom elucije

Gradijentno eluiranje : sastav mobilne faze se mijenja kontinuirano ili skokovito
Detektori
Diode array UV detektor (DAD)
-

istovremeno pokriva cijelo UV podruje (rezolucija 1 nm)

cijeli UV spektar svakog pika u kromatrogramu
primjenjuje se za analizu uzoraka u kojima (spojevi imaju veliku razliku u
apsorbanciji pikovi se prekrivaju kromatografski ali imaju razliit UV
spektar)

Elektrokemijski detektor
-

odijeljeni analiti se oksidiraju ili reduciraju promjenom potencijala izmenu

radne i referentne elektrode (mjeri struju koja tee izmenu radne i
pomone elektrode)

Detektor indeksa loma (indeksa refrakcije)

-

mjeri promjene u indeksu loma mobilne faze prolaskom analita

Fluorescentni detektor
-

mjeri fluorescencijsku emisiju nakon pobunivanja analita odrenenom

talasnom duzinom

Maseni detektor

Primjena HPLC u analitici lijekova

-

odrenivanje oneienja u farmaceutskim tvarima

tana, precizna i izdrljiva metoda za kvantitativnu analizu farmaceutskih
tvari i gotovih proizvoda; rutinska metoda u industriji i kontroli kvalitete
lijeka
praenje stabilnosti istih ljekovitih tvari i dozirnih oblika, te odrenivanje
razgradnih produkata
odrenivanje lijekova i njihovih metabolita u biolokim tekuinama
odrenivanje koeficijenta razdjeljenja i pKa vrijednosti molekule lijeka,
vezanje lijekova na proteine

Kvantitativna analiza lijekova u dozirnim oblicima

Kalibracija s eksternim standardom
-

za analizu aktivne tvari u formulaciji kalibraciju je potrebno izvesti u

koncentracijskom rasponu 20% od oekivane koncentracije
kalibracijska serija otopina standarda
ekstrakcija aktivne tvari iz formulacije (odrenivanje koncentracije ispitivane
tvari iz kalibracione krive)

Kalibracija s internim standardom ( IS )

-

analiza formulacija u kojima nije postignut zadovoljavajui prinos

(recovery, %) nakon ekstrakcije (masti, kreme, terapijski sistemi s
polimernim matriksom)
uzorak se ekstrahira s otopinom koja sadri interni standard
omjer povrine kromatografskog pika za jednaku koliinu analita i internog
standarda

Primjeri : Cefaleksin
HPLC analiza proteina
-

oneienja peptidnih lijekova sa srodnim peptidima

analiza proteina gradijentnom elucijom
C18 stacionarna faza s veim porama

Primjer : Inzulin
Ionska kromatografija
-

mobilna faza sadri:

metansulfonsku kiselinu za kationsku izmjenu
natrijev hidroksid za anionsku izmjenu

elektrokemijski detektor mjeri vodljivost mobilne faze

Gel kromatografija (size-exclusion)

-

odjeljivanje prema veliini molekula prisutnih u smjesi (ekskluzijska

kromatografija)

Gel permeacijska kromatografija (odjeljivanje nepolarnih spojeva)

hidrofobna stacionarna faza
nepolarne organske mobilne faze
Gel filtracijska kromatografija (odjeljivanje polarnih spojeva)
hidrofilna stacionarna faza
vodena mobilna faza
Stacionarna faza
-

unakrsno povezani polimeri (poliakrilamid, agaroza, dekstran)

izmjena otopljenih molekula izmenu otapala mobilne faze i istog otapala u
porama stacionarne faze
zadravanje molekula uzorka u porama ovisi o njihovoj veliini

Distribucijski koeficijent (KD)

-

opisuje elucijske karakteristike spoja na koloni

VR volumen zadravanja ispitivanog sastojaka

Vt ukupni permeacijski volumen (volumen zadravanja sastojka ije su molekule
dovoljno male da ulaze u sve pore)
Vo ekskluzijski volumen (volumen zadravanja sastojka ije su molekule vee od
pora pa se ne zadravaju)
Primjena gel kromatografije
-

odrenivanje sastava smjesa spojeva velike molekulske mase

relativne koliine svakog sastojka
sadraj iz kalibracione krive

odreivanje molekulske mase ( logaritam molekulske mase vs. volumen

zadravanja )
odrenivanje molekulskih masa polimera (kolona se kalibrira s polimerom
poznate molekulske mase)

Posebnosti HPLC metode

-

mogunost analize nehlapljivih i termolabilnih tvari, anorganskih iona,

makromolekula i slabo stabilnih prirodnih produkata
manja mogunost razgradnje uzorka od GC metode
precizna i automatizirana metoda
razliite kolone i detektori omoguavaju razvoj selektivne metode
kromatografska tehnika koja se najintenzivnije razvija !!

Ogranienja HPLC metode

-

potreban razvoj jeftinih detektora za praenje spojeva koji nemaju

kromofore
ljekovite tvari se moraju ekstrahirati iz dozirnog oblika prije odrenivanja
troi se velika koliina organskih otapala

Identifikacija peptidnih lijekova

-

cijepanje proteina u male peptidne jedinice (odjeljuju se tekuinskom

kromatografijom)
maseni spektar otkriva sekvence aminokiselina
identifikacija proteina pomou baza podataka proteinskih struktura

Koncept vremena zadravanja

Vrijeme koje u koloni provede supstanca koja ne stupa u nikakvu interakciju sa
stacionarnom fazom se zove vrijeme zadravanja nezadrane supstance (tM).
Vrijeme zadravanja (tR) se mjeri od momenta unoenja uzorka do maksimuma
signala. Reducirano vrijeme zadravanja (tR) je razlika vremena zadravanja i
vremena zadravanja nezadrane supstance.
Pik idealnog oblika ima izgled grafikog prikaza zakona normalne raspodjele
(Gaussova kriva).

= vrijeme zadravanja
= standardna devijacija
2= varijansa
y = odrziv detektora u funkciji vremena x

Idealno pikovi su opisani funkcijom vjerovatnoe:

Razlozi za odstupanje od idealnog sluaja

-

Nepravilnosti u koncentraciji uzorka na poetku kolone nastale pri

nanoenju uzorka.
Razliita brzina mobilne faze u sredini kolone i uz zidove kolone.
Difuzija analita u mobilnoj fazi.
Otpor pri prelasku analita iz stacionarne u mobilnu izmobilne u stacionarnu
fazu.

Dva naina izraunavanja asimetrije pika

-

Skewing faktor, a (prema USP), mjeri se na 10% visine od bazne linije.

Tailing faktor ili faktor simetrije, TF (prema Ph. Eur.) mjeri se na 5% visine
od bazne linije

Teoretski tavani
Model teoretskih tavana slui za objanjavanje kretanja supstanci kroz kolonu.
Sam naziv je preuzet iz teorije frakcione destilacije. Prema modelu teoretskih
tavana, itava duina kolone L podijeljena je na male, uske dijelove jednake irine
H. U svakom od ovih dijelova koncentracija analita u mobilnoj fazi je u ravnotei s
koncentracijom analita u stacionarnoj fazi. U svakom slijedeem uspostavljanju
ravnotee, supstanca putuje za duinu kolone H to odgovara visini teoretskog
tavana.
Efikasnost kolone kao broj teoretskih tavana
Kako supstanca putuje kroz kolonu, prostor u kojem se nalazi se stalno iri.
Linearna disperzija koja se izraava kao varijansa 2 na kraju kolone iznosi: 2 =
H.L. Broj teoretskih tavana u koloni duine L iznosi: N=L/H.