8-2 Ekstrakcije u analitici lijekova

Razdvajanje komponenata najee je izuzetno komplikovano zbog njihove velike

slinosti i sloenosti sastava uzorka. Kod prirodnih uzoraka kompleksnost
postupka poveava i osjetljivost komponenata na uticaje zraenja (svjetlosti),
temperature, pH vrijednosti, razliitih oksidansa i dr.
VRSTE EKSTRAKCIJA:
1. Teno tena ekstrakcija (TTE) (rastvaraima)
Ekstrakcija predstavlja metodu razdvajanja kojom se vri djelimino ili potpuno
razdvajanje komponenata smjee koje imaju razliitu rastvorljivost u razliitim
rastvaraima. Smjei supstanci dodaje se rastvara, kako bi se iz nje izdvojila
komponenta koja se bolje rastvara u datom rastvarau - i time izdvaja kao
rastvorak. Lake rastvorljiva komponenta smjee prelazi u rastvor. TTE - zasniva
se na difuziji mase usljed prisustva gradijenta koncentracije.
Efikasnost ekstrakcije vrstih supstanci se postie poveanjem:
-

dodirne povrine izmeu faza tj.

usitnjavanjem i mukanjem a u sluaju veih koncentracija,
duim trajanjem ekstrakcije ili
poveanjem zapremine rastvaraa

FAZE:
1. Smjea koja podlijee ekstrakciji dovodi se u kontakt sa rastvaraem
mukanje 5-10min.
2.Razdvajanje nastalih novoformiranih faza
3. Uklanjanje i regeneracija rastvaraa iz svake faze.

2. Teno vrsta ekstrakcija (na vrstoj podlozi - patrone)-SPE

Postoji:
-

Ekstrakcija vrstih supstanci tenostima

Ekstrakcija tenih supstanci tenostima
Ekstrakcija teno-vrstih sistema - suspenzija

Ekstrakcije mogu biti: jednostuke i viestruke.

VRSTE SMJEA - PREMA DISTRIBUCIJI KOMPONENATA:

voda + alkohol = homogena tena = smjea rastvor

voda + rastvorene sup. + pulpa = heterogena smjea = suspenzija

JEDNOSTAVNE METODE SEPARACIJE HETEROGENIH TENO/VRSTIH DISPERZNIH

SISTEMA SUSPENZIJA
Tehnoloke operacije:
-

Dekantiranje
Filtracija pomou filtracionog medija
Vakuum filtracija efikasnost poveava p (atm/vakuum)

EKSTRAKCIONE TEHNIKE - EKSTRAKCIJA VRSTIH SUPSTANCI TENOSTIMA

Aparat za filter kafu odgovarajui rastvara (vrela voda) dodaje se vrstoj
smjei (mljevena kafa ) sa ciljem da se jedna ili vie komponenti vrste faze
rastvore u tenom rastvarau.
Vrela voda poveanje brzine difuzije i rastvaranja

TENO-TENA EKSTRAKCIJA
Primjena: farmaceutski oblici
Mehanizam : raspodjela analita u binarnom sistemu rastvaraa S1/S2
Kp = CS1/CS2
Kp = podioni koeficijent
CS1= koncentracija analita u rastvarau (S1)
CS2 = koncentracija analita u rastvarau (S2)

ODREIVANJE PODIONOG KOEFICIJENTA (Kp)

a) Kvantitativna analiza poznatih koncentracija supstance u gornjoj i donjoj fazi
nakon ekstrakcije poznatim zapreminama ekstraktanta
b) Interpolacijom iz distribucione izoterme

Linearnost potvruje konstantnu vrijednost Kp! Distribuciona

izoterma.

EFIKASNOST EKSTRAKCIJE
Zavisi od:
-

koliine uzorka,
podionog koeficijenta,
stepena meusobnog mjeanja rastvaraa i ekstraktanta (manji stepen
mjeanja - bolja efikasnost)
volumena upotrijebljenog ekstraktanta (poveava se sa volumenom
rastvaraa kao i poveanjem broja ekstrakcija)

mukanje 5-10 min. (Ne jako i ne predugo da se ne stvore emulzije). NH4(SO4)2

se dodaje da sprijei nastajanje emulzija kod npr. ekstrakcija ionskih jedinjenja
organskim rastvaraima iz vodenih uzoraka. Za kvantitativnu analizu potrebno je
da efikasnost ekstrakcije bude najmanje 97%

PRIMJER IZRAUNAVANJA KOLIINE EKSTRAHOVANE SUPSTANCE

Teno-tena ekstrakcija
dvije ljekovite supstance zajedno istim ekstraktantom mogua samo ako su
vrijednosti Kp bliske! Tj. ~ 1
Mehanizam: viekratna ekstrakcija
Raspodjela ljekovitih supstanci P i Q u binarnom sistemu rastvaraa S 1/S2
Kp1 = C1P (S1)/C2P (S2) Kp2 =C1Q (S1)/C2Q (S2)
= Kp1 / Kp2 ~ 1
= separacioni faktor
Kp1 = podioni koeficijent supstance P
Kp2 = podioni koeficijent supstance Q
Teno-tena ekstrakcija meusobno razdvajanje dvije ljekovite supstance
uslov: dovoljno razliiti Kp,
1 >> >>1

Uslovi za dobro razdvajanje dvije supstance

I

Kp1 >> Kp2

Kp1<< Kp2
1 >> >>1

II

razliit pH i razliita polarnost ljekovitih supstanci

FAKTORI KOJI UTIU NA TENO TENU EKSTRAKCIJU I IZBOR

RASTVARAA
a) Fiziki: temperatura i prisustvo drugih supstanci
b) Hemijski: - hemijske reakcije izmeuaktivnih supstanci i rastvaraa
(aceton/keton stvara sa primarnim aminima Shifove baze; aldehidi i ketoni sa
alkoholima poluacetale i acetale - problem!!!)

I. Polarnost rastvaraa, po principu "slino se u slinom otapa"

Izbor rastvaraa (ekstraktanta S1) kada je S2 voda
1. ne rastvaraju se u vodi i ne mijeaju se sa vodom
2. nepolarni nedisocirajui (inertni): hloroform, cikloheksan, ugljentetrahlorid,
dietiletar.
polarni rastvarai alkoholi - amil alkohol
1. ne rastvaraju se u inertnim (nepolarnim) rastvaraima
2. amfiprotonski rastvarai (amfoterni): voda, metanol, etanol, acetonitril,
etilacetat (pri pH manjem od 9), superkritine tenosti (CO2), pod pritiskom je
suhi led, a kad pitisak opadne direktno prelazi u gasovito stanje; postepenim
poveavanjem pritiska nastaje teni CO2 koji je dobar rastvara za dosta
supstanci (selektivna ekstrakcija, netoksian, nezapaljiv, na niskoj krit.t.31.1C,
pogodan za termolabilne supstance, isparava i ostavlja ist uzorak).
Mehanizam :
S1 (gornja faza) } nepolarni rastvara
S2 (donja faza) } voda
S1 (gornja faza) } voda
S2 (donja faza) } nepolarni rastvara

Izbor rastvaraa zavisi i od tehnike koja e se koristiti za kvantitativnu analizu. Za

UV/VIS analizu ne smije apsorbovati u toj oblasti! Za HPLC analizu mora biti HPLC
istoe! Ukoliko je potrebno uparavanje rastvaraa potrebno je upotrijebiti lahko
isparljiv rastvara.
II Jonska jaina - znaaj u ekstrakciji neelektrolita
-

smanjuju rastvorljivost neelektrolita u vodi,

smanjuje mijeanje rastvaraa uzorka i ekstraktanta (etar, aceton u vodi)
smanjuju zapremine potrebnog ekstraktanta u sluaju velike koncent.
aktivne supstance u vodenoj fazi. Jonska jaina : 2M 4M rastvori soli KCl,
NaCl, CaCl2, KNO3

Mehanizam :
S1 (gornja faza) } nepolarni rastvarai
S2 (donja faza) } micelarni rastvor (voda + so)
salting out efekat efekat isoljavanja H2O + ion soli = jake jon-dipol sile
micela { hidratisani omota oko jona } = smanjuje se rastvorljivost ljekovite
supstance u vodi =
organska supstanca prelazi u S1 fazu (org.rastvara). Primjeri: Antibiotici - velika
koncentacija ljekovite supstance u S2 fazi, estri

III Uticaj pH na ekstrakciju

Dodavanje pufera : u S2 fazu i u S1 fazu
Mehanizam je podjeljen prema hemijskoj prirodi ljekovite supstance :
ljekovite supstance slabe organske kiseline: karboksilna grupa, enolna, fenolna
ljekovite supstance slabe organske baze: amino grupe, heterociklusi sa dusikom
ljekovite supstance soli organskih kiselina: K, Na, Ca
ljekovite supstance soli slabih organskih baza: hidohloridi, sulfati, citrati,
tartarati
Soli slabih organskih kiselina
S1 - organski nepolarni rastvara a S2 - voda + pufer
Mehanizam rastvaranja u vodi:HA + H2O

->

H3O+ + A-

Soli slabih organskih baza

S1 - organski nepolarni rastvara a S2 - voda + pufer
Mehanizam rastvaranja u vodi: B + H2O -> HB+ + OH-

EKSTRAKCIJA CIKLIZIN LAKTATA IZ INJEKCIJA

Uzorak se razblai sumpornom kis. I komponente ekscipijensa ekstrahuju eterom.

Rastvor se zaalkalie, ciklizin ce prei u bazu (molekulski oblik) i ekstrakcija se
izvri eterom, laktat ostaje u vodenom sloju (ionski oblik). Nakon razdvajanja
slojeva, ponovo se ciklizin zakiseli sumpornom kiselinom, razblai i mjeri UV/Vis
spektrofotometrijski.
Drugi vidovi:
-

anioni organ. kis. ako mogu da grade komplekse - helatni agensi- prevee
se u helate koji e se ekstrahovati nepolarnim organskim rastvaraem.
Kationi org. baza ili anioni org. kis. mogu da grade ionske parove koji se
mogu ekstrahovati nepolarnim organskim rastvaraem.

Ion par ekstrakcija za kationske surfaktante kao npr. Cetrimid. Moe se ispitivati
kao lipofilni ion par sa bromkrezol crvenim, ekstrakcija hloroformom, u VIS
oblasti. Primjeri: Clonidin injekcije, Benzhexol tablete. Amini i fenoli kao polarni

mogu da se acetiluju za Ion par ekstrakciju. Primjer: acetilovanje taurina (amino

kiselina) sa benzoilhloridom i prevoenje u amid, sa tetrabutilamonijum sulfatom
gradi se ion par i ekstrakcija vri sa hloroformom za odreivanje GCMS
ACETILOVANJE TAURINA ZA ION PAR EKSTRAKCIJU
Primjer: smjea kiseline i baze. Podesiti pH vodene faze pri kome e jedna
supstanca potpuno prei u molekulski oblik, a druga u ionski. U sluaju
ekstrakcije baze organskim rastvaraem potrebno je da se pH vodene faze
povea za najmanje 3 pH jedinice u odnosu na pKa baze, dok u sluaju
ekstrakcije kiseline organskim rastvarace pH vodene faze se smanjuje za 3 pH
jedinice.
Ljekovite supstance (uzorak) nerastvorne u vodi potrebno je prevesti u jonski
oblik ili u soli i estre koji su rastvorljivi u vodi!
Mehanizam
S1 - voda + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara
S1 - voda + acetonitril + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara
S1 - voda + metanol + pufer a S2 - organski nepolaran rastvara
Uslov: molekulski oblik ljekovite supstance = jonski oblici

Mehanizam
S1 voda a S2 - organski nepolaran rastvara + kiselina
S1 voda a S2 - organski nepolaran rastvara + baza
Uslov: molekulski oblik ljekovite supstance = soli ili estri

IZVOENJE TENO-TENE EKSTRAKCIJE

Pomou lijevka za odvajanje: esto su potrebna 3 lijevka.
PRIMJER: EKSTRAKCIJA FENOBARBITONA IZ TABLETA - FENOBARBITON-NA
Odmjeri se odreena koliina spraenih fenobarbiton tableta, kvantitativno
prenese u lijevak za odvajanje br.1., doda 50ml vode i 10 ml HCl. HCl e istisnuti
fenobarbiton iz soli i potisnuti ga u organski sloj etar. Doda se 50ml etera i
muka uz povremeno otvaranje zatvaraa kako bi se ispustile pare etera. Ostavi
se da stoji. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ispusti u lijevak 2. Na vodeni sloj se
doda ponovo eter i postupak ekstrakcije ponovi isputajui vodeni sloj u lijevak 3,
a etarski u lijevak 1. Vodeni sloj u lijevku 3 se tretira eterom i vri ekstrakcija.
Eterski sloj se prebaci u lijevak 1, a vodeni u lijevak 2. Skupljeni eterski ekstrakti
se isperu sa vodom 2- 3 puta i eterski sloj prenese u suhu istu porculansku

zdjelu, doda bezvodni Na2SO4, i upari do suha. Sadraj fenobarbitona se odredi

nekom pogodnom analitikom metodom (gravimetrijski, UV-VIS, HPLC itd. )

Ekstrakcija u lijevku za odvajanje: Ekstraktant: tei od vode kako bi se

isputao sloj sa ekstrahovanom supstancom - manja mogunost oneienja i
gubitaka
Ekstrakcija centrifugiranjem: Ekstraktant: laki od vode.
RAZDVAJANJE SLOJEVA I UKLANJANJE RASTVARAA : Razdvajanje slojeva: u
lijevku za odvajanje, centrifugiranjem, dekantovanjem nakon zamrzavanja
vodenog sloja ili aspiracijom vakumom pomou Pasterove pipete, injiciranjem
kristalizacije ili taloenjem. Uklanjanje rastvaraa: suenje organskog rastvaraa,
uparavanje, zagrijavanje i destilacija

Kristalizacija vodenog rastvora bakar sulfata: Isparavanjem vode iz rastvora,

dolazi do formiranja plavih kristala CuSO4. CuSO4 je razdvojen od rastvaraa iz
homogenog vodenog rastvora.
OTKLANJANJE RASTVARAA UPARAVANJEM:
-

rastvara se svede na mali volumen ili potpuno ukloni (za daljnju analizu
HPLC.
Aparat: rotirajui evaporator ujedno regenerie rastvara
na vodenom ili pjeanom kupatilu uz termostat ne smije doi do kljuanja
i prskanja -dodaju se staklene kuglice
Ne smije doi do lijepljenja supstance na staklene zidove suda u kome se
uparava (dodatak amil alkohola, 2% etanola ili 5% propilen glikola)

EKSTRAKCIJA ALKALOIDA
Ekstrakacija rastvaraima: teno-tena ekstrakcija alkaloida

EKSTRAKCIJA IZ TABLETA I KAPSULA

Najbolja je ekstrakcija sa H2O. Komponente podloge: laktoza, polimerni eeri,
celuloza su takoer rastvorljive u vodi (ne ometaju HPLC analizu, nemaju UV
apsorpciju). Metanol i etanol rastvaraju i mnoge organske komponente.
Lubrikansi (Mg - stearat, stearinska kis., polietilenglikol ine 1-2% tabletnog
punjenja mala mogunost interferencije, takoe nemaju hromofore
Sredstva za oblaganje su do 3% tabletne mase, rastvorljivi u vodi, ali nemaju
hromofore (polimerni eeri, hidroksipropilmetilceluloza)
Sredstva za bojenje organometalne boje i metalni oksidi apsorbuju u UV/VIS, ali
se ne rastvaraju u vodi i mogu biti otklonjeni filtriranjem
Kapsule omotai kapsula se odbacuju prije ekstrakcije

SUSPENZIJE I RASTVORI
Boje - prirodni pigmenti kao to su hlorofil, karotenoidi, antocijani se teko
uklanjaju i za njih je preporuena SPE- ionske izmjene za uklanjanje kationskih i
anionskih boja, ili se koristi smjea rastvaraa razliite polarnosti npr: smjea
vode i organskih rastvaraa. Boje ostaju u vodi.
Konzervansi i antioksidansi kao to su fenoli, kvaternerni amini benzalkonijum
hlorid imaju hromofore i mogu da interferiraju u UV oblasti sa analitom, potrebno
razdvajanje. Polietilenglikol surfaktant ne ometa UV apsorpciju.
KREME I MASTI
Na i K soli masnih kiselina, trigliceridi, kationski surfaktanti i neionskib
surfaktanti su komponente masti i krema. One nemaju hromofore, ali mogu da
zaprljaju RP-HPLC kolonu (lo pik). Trigliceridi i ostale lipofilne komponente se
mogu ekstrahovati metanolom ili smjeom MeOH/ heksan. U heksanu e ostati
vie lipofilne komponente.
EKSTRAKCIJA SMJESOM ORGANSKIH RASTVARAA
Koristi se za ekstrakciju analita iz uljanih ekscipijenasa kao to je ekstrakcija
steroida iz krema za HPLC analizu ili vitamina E iz kozmetikih krema
Smjesa rastvaraa: Metanol/ heksan; voda/ etanol/ heksan; ACN/ heksan
Postupak: krema se obino disperguje zagrijevanjem u heksanu i analit
ekstrahuje jednakim zapreminama metanola, dok se uljani ekscipijens zadrava u
heksanu. U ekstrakciji neophodno koristiti interni standard (IS) radi poveanja
preciznosti ekstrakcije
Primjeri - kortikosteroidi u kremama: hidrokortizon acetat krema, fluocinolon
krema i beklometazon krema.

8b vrsto tena ekstrakcija (SPE)

Selektivna ekstrakcija analita i preiavanje uzorka

Priprema uzorka za HPLC, GC, RIA,UV i VIS, itd.
Prekoncentrisanje rastvora uzorka

Prednosti SPE nad tenotenom ekstrakcijom :

-

Bolja Recovery vrijednost: ali se preporuuje korienje internog standarda;

Dostupni rastvarai za ispiranje
Minimalno isparavanje bolja stabilnost za labilne komponente
Bezbjednija metoda zbog manje upotrebe organskih rastvaraa
Ne stvaraju se emulzije sa vodenim rastvorima koje je teko ekstrahovati
Lako se moe automatizovati, vie uzoraka analizirati istovremeno, male
zapremine uzorka
Prekoncentrisanje uzorka

Dva koncepta izolovanja analita

a) proputanje analita
b) zadravanje analita

Izvoenje SPE - 4-5 koraka ekstrakcije:

1. Kondicioniranje sorbensa, ispiranje
2. Adsorpcija uzorka
3-4. Ispiranje interferirajuih komponenti
5. Eluiranje uzorka sa kolone

Kondicioniranje (ispiranje) sorbensa :

A) bez kondicioniranja
B) djelimino kondicionirana
C) sasvim kondicionirana

Vrste sorbensa :
1. Revezno fazni: R: (CH3)2 C18H37,

C18H37,

(CH3)2, C2H5

.Stiren divinilbenzenski polimerni gelovi. Upotreba: za nepolarne komponente

Ekstrakcija na lipofilnim sorbensima
Bazne komponente: Nakon ispiranja alkalnim puferom, vodom (metanolom);
Bazne komponente se adsorbuju iz vodenih uzoraka podeavanjem baznog pH;
Eluiranje kiselim puferom ili metanolom.
Primjer: Oralna suspenzija hlorpromazina / bazne komponente. Sadri:
Hlorpromazin, Metilparaben, neutralnu hidrofilnu boju, Nalaktatni pufer, lipofilni
korigens ukusa. U 5ml uzoraka doda se 0.5ml amonijanog pufera pH 9.5.
Kondicioniranje sorbensa: amonijanim puferom. Hlorpromazin se nalazi u formi
slobodne baze i adsorbuje se na ODS (C18) SPE adsorbens. Kisele
komponente:Ispiranje sorbensa: razblaenom kiselinom, vodom (metanolom).
Kisele komponente se adsorbuju iz vodenih uzoraka podeavanjem kiselog pH.
Eluiranje: metanolom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom ili alkalnim puferom
Neutralne komponente: Mogu biti ekstrahovane bez kontrolisanja pH. Ispiranje
sorbensa: r. kiselinom, alkalnim puferom (uklanjanje ionizabilnih supstanci) ili
smjeom metanol/voda. Eluiranje: MeOH, C2H5OH, CHCl3
2. Normalno fazni: R: (CH2)3 NH2, (CH3)2 (CH2)3 CN,
(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH

Upotreba: za polarne komponente.

Ekstrakcija na polarnim sorbensima
Sorbens se kondicionira sa rastvaraem koji e biti koriten kao eluent (polaran).
Uzorak je rastvoren u rastvarau koji je slabije polaran od eluenta ili nepolaran.
Ispiranje sorbenta: metilen hlorid. Eluiranje baznog polarnog analita: metanol/
kiseli pufer. Eluiranje kiselog polarnog analita: metanol/ bazni pufer.
3. Jonoizmjenjivake (JI) smole
Punila: Neorganska (silikagel) ili organska visokomolekularni polimeri (stirenske i
akrilne smole)
Kationski izmjenjivai:
-

Sulfonske kiseline (Jaki Kationski Izmjenjivai)

Karbonske kiseline (Slabi Kationski Izmjenjivai)

Anionski izmjenjivai
-

Kvaternerna amonijumova jedinjenja (Jaki Anionski Izmjenjivai)

Primarni, sekundarni i tercijarni amini (Slabi Anionski Izmjenjivai)

Ekstrakcija na anionskim izmjenjivaima

Kondicioniranje: ispiranjem puferom pH bliskog uzorku (0.010.1M) koji sadri
ione: C2H5COO, CH3COO, F (lahko izmjenjivi). Uzorak: Kiseli rastvor uzorka (pH
12 jedinice iznad pKa analita)

Ekstrakcija meticilina
Moe se ekstrahovati na jakim anionskim i slabim anionskim izmjenjivaima jer je
relativno jaka kiselina. Ispiranje sorbensa: pufer, deionizovana voda, organski
rastvara. Uzorak: Rastvor u puferu (pH 3.84.8). Eluiranje: pufer koji sadri
suprotan ion u visokoj koncentraciji Cl ion koji kompetitivno istiskuje metacilin;
(1MNaCl ili citrat).
Ekstrakcija na kationskim izmjenjivaima
Kondicioniranje: ispiranjem puferom pH bliskog uzorku (0.010.1M) koji sadri
ione: K, Na, NH4+ (lahko izmenljivi sa kationom smole). Uzorak: Rastvor uzorka u
puferu (pH 12 jedinice ispod pKa analita)
Ekstrakcija adrenalina
Ispiranje sorbensa: pufer, deionizovana voda, organski rastvara. Uzorak: rastvor
u puferu NH4Cl (pH 8.3). Eluiranje: pufer koji sadri suprotan ion NH4 + u visokoj
koncentraciji; (1M NH4Cl) ili za lipofilnije supstance: metanol ili etanol.

Sorbensi vezanih faza :

-

Monofunkcionalna reverzno fazna (RP) silika

Povrina silike + Monohlordimetiloktilsilan -> C8 sorbens, modifikovana

povrina silike
Za polarnije analite sa baznim grupama !
-

Trifunkcionalna reverzno fazna (RP) silika

Povrina silike
+
modifikovana povrina silike

Trihloroktilsilan ->

C8 sorbens,

Za kiseli pH analita !
-

"END Capped" sorbensi :

Trimetilhlorsilan

Heksametildisilazan

Hidrofobna povrina, smanjena mogunost sekundarnih interakcija !

Za poveanje selektivnosti kod ekstrakcije sloenih uzoraka koriste se:
Kombinovani sorbensi. Polimerni sorbensi. : polimeri mono- i trifunkcionalnih
silika, stiren-divinilbenzena (vea ukupna povrina, vei kapacitet, ak i za
polarne supstance, hidrofobnije su i slue za RP i JI, stabilni u irem opsegu pH )

9 UVOD U ANALITIKU

Analitika lijekova pitanja :

-

identitet i istoa aktivne tvari koja se koristi za pripremu ljekovitog oblika?

identitet i istoa pomonih tvari u ljekovitom obliku?
oneienja u samoj aktivnoj tvari?
pKa, podioni koeficijent, topljivost i stabilnost aktivne tvari?
identitet aktivne tvari u gotovom lijeku?
sadraj aktivne tvari u dozirnom obliku?
oneienja u farmaceutskom dozirnom obliku?
stabilnost aktivne tvari u gotovom lijeku?
brzina oslobaanja aktivne tvari iz ljekovitog oblika?
koncentracija lijeka u biolokim tekuinama?
kvalitet lijeka u prometu s obzirom na kvalitativni i kvantitativni sastav
deklariran u postupku dobivanja odobrenja za stavljanje gotovog lijeka u
promet?

Ispitivanje lijekova
Djelotvornost = klinika ispitivanja
Nekodljivost = toksikoloko-farmakoloka ispitivanja

kvalitet = kemijska analiticka ispitivanja, fizika analiticka ispitivanja , bioloka

analiticka ispitivanja , farmaceutsko-tehnoloka svojstva (Odobrenje za stavljanje
lijeka u promet (registracija lijeka))
Analitika ispitivanja lijekova
-

identifikacija, ispitivanje istoe i odreivanje sadraja farmaceutskih

sirovina
ispitivanje stabilnosti farmaceutskih dozirnih oblika
ispitivanje oslobaanja aktivnih tvari iz ljekovitih oblika
otkrivanje i odreivanje oneienja nastalih tijekom sinteze kao i
razgradnih produkata
odreivanje koncentracije lijekova i njihovih metabolita u biolokim
tekuinama
provjera kvalitete lijekova u prometu

Uloga analitike lijekova : proizvodnja lijekova, konrola kvalitete lijekova,

istraivanje i razvoj lijekova.
Pristup u analizi lijekova : Postavljanje problema, dizajniranje eksperimenta,
izvoenje eksperimenta, analiza dobivenih podataka (kalibracija instrumenta,
standardizacija reagensa sakupljanje podataka ) , rjeenje problema.
Izovenje eksperimenta se sastoji od :
-

postavljanje kriterija osjetljivost, selektivnost, tanost, preciznost, trokovi i

brzina analize
izbor analitike metode
strategija uzorkovanja
definiranje interferencija

Lijekovi mogu biti:

-

kemijskog porijekla: elementi, tvari dobivene kemijskom sintezom, prirodne

kemijske tvari
biljnog porijekla: biljke i njihove izluevine, ekstrakti biljnih tvari
ivotinjskog porijekla: mikroorganizmi, genski modificirani organizmi,
ivotinjska tkiva, dijelovi i ekstrakti organa, toksini
ljudskog porijekla krv i proizvodi iz krvi, plazma, enzimi i hormoni iz
placente i urina
ljekovite tvari
gotovi lijekovi
galenski pripravci
magistralni pripravci
bioloki lijekovi (imunoloki) : cjepiva, serumi, toksini, alergeni, lijekovi iz
ljudske krvi ili plazme, lijekovi dobiveni rekombinantnom DNA
tehnologijom, monoklonska antitijela, enzimi, hormoni
biljne droge

Analitika metodologija
-

Analitika tehnika : fizikalna i kemijska naela koja se koriste u istraivanju

analita ( AAS, atomizacija, apsorpcija svjetla

Analitika metoda : primjena tehnike za analizu odreenog analita u

odreenom matriksu
Analitiki postupak : napisane smjernice kako primijeniti metodu na
odreeni uzorak, ukljuujui uzorkovanje i validaciju rezultata

Farmaceutski uzorak -> uzorkovanje -> priprema uzorka -> mjerenje ->
iraunavanje rezultata -> procjena pouzdanosti rezultata ->Analitika informacija
o ispitivanom uzorku.
Razvoj novih analitikih metoda :
istraivanje i razvoj lijekova : Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
originalni i generiki lijekovi
postupak registracije lijeka
Analitike metode za kontrolu lijekova: kontrola kvalitete lijekova, slubene
metode definirane u farmakopeji, provjera kvalitete prema drugim meunarodno
priznatim normama.

Kvalitet gotovog lijeka - Farmaceutska industrija

Kvalitet magistralnog ili galenskog pripravka - Laboratorij za provjeru kvaliteta
galenskih pripravaka i identifikaciju ljekovitih tvari

Analitika ispitivanja lijekova

Potvrda identiteta :
-

spektroskopske metode: IR, UV, NMR, MS

kromatografske metode: TLC, HPLC, GC
odreivanje fizikih konstanti: talite, taka vrenja, specifino optiko
zakretanje polarizovane svjetlosti, relativna gustoa, indeks refrakcije,
viskoznost
kemijske reakcije identifikacije

Ispitivanje profila istoe :

-

kromatografske metode: HPLC, TLC, GC

spektroskopske metode: UV, AAS
elektroforeza
odreivanje fizikih konstanti: specifino optiko zakretanje polarizovane
svjetlosti, specifina apsorbancija, pH
odreivanje udjela vode
ispitivanja graninih vrijednosti

gravimetrijska ispitivanja istoe

Odreivanje sadraja:
-

klasine titracijske metode analize

instrumentalne metode: UV, HPLC, GC
mikrobioloka analiza i imunokemijske metode

Kvalitaivna analiza lijekova :

-

ispitivanja fizikih svojstava

potvrda identiteta
kemijske reakcije identifikacije
ispitivanja istoe (polukvantitativan karakter)

Kvantitativna analiza lijekova :

-

odreivanje sadraja aktivne tvari

odreivanje sadraja pomonih tvari
odreivanje izvjesnih primjesa: oneienja, vlaga, kristalna voda,
rezidualna otapala

Pristup analizi ovisi o tome da li se radi o ljekovitoj tvari u istom obliku (bulk
form) ili ljekovitoj tvari u farmaceutskim dozirnim oblicima ili biolokim
tekuinama
Provjera kvaliteta :
-

polazne sirovine za izradu lijekova

meuproizvodi u izradi lijekova
gotovi lijekovi
pakovni materijal lijekova
reagensi i poredbene tvari za ispitivanje lijekova

9b STANDARDNE SUPSTANCE
Standardne supstance su materijali dobro utvrenih i ovjerenih (certificiranih)
svojstava. Upotrebljavaju se u odreenim ispitivanjima i odreivanjima kako bi se
postigla tanost i reproducibilnost analitikih rezultata.
Vrste standarda :
-

primarni : izraen i certificiran u ovlatenom nacionalnom laboratoriju ili

meunarodno poznatoj instituciji(npr. National Institute for Standards and
Technology in the United States EDQM laboratory
sekundarni : izraen usporedbom svojstava s primarnim standardom u
posebno ovlatenim laboratorijim. Ima certifikat analize proizvoaa (npr.
Fluka, Sigma-Aldrich)
radni : razvijen u bilo kojem laboratoriju za vlastitu upotrebu i usporeen s
primarnim ili sekundarnim standardom.

Primjena kemijskih standardnih supstanci Evropske farmakopeje :

potvrda identiteta: IR spektrofotometrija i kromatografske metode

ispitivanje istoe u odreivanju specifinih oneienja: kromatografske
metode
odreivanje sadraja: UV spektrofotometrija, HPLC i GC, mikrobioloko
ispitivanje prikladnosti sistema: kromatografske metode, elektroforeza
kalibracija instrumenata

Ispitivanja kemijskih standardnih supstanci :

-

ovisno o namjeni standardne supstance propisuju se potrebna ispitivanja i

kvalitet
za svrhe identifikacije : kontrola kvaliteta standardne supstance u
Laboratoriju evropske farmakopejei certifikat analiza od proizvoaa
za odreivanja sadraja ili kalibraciju: nekoliko saradnikih laboratorija
ispitaju predloenu tvar koristei razliite tehnike kako bi bili sigurni da je
prikladna

Kvalitet standardnih supstanci :

-

potvrda o ispravnosti (certifikat) ugledne ustanove

kvalitet treba biti primjeren odreenoj namjeni u ispitivanju i kontroli
kvaliteta lijekova
homogene i stabilne
lahko dostupne i prihvatljive cijene
uvaju se u zapeaenim ampulama ili bocama sa sigurnosnim
zatvaraima.

Bioloki poredbeni preparati :

-

poznate bioloke aktivnosti

sva bioloka ispitivanja provode se paralelno s odgovarajuim poredbenim
materijalom

Identifikacija + ispitivanje homogenosti ili istoe + odreivanje bioloke

aktivnosti

Odreivanje bioloke aktivnosti : osiguravaju ujednaenu aktivnost lijekova ije

vrijednosti ne mogu biti izraene kao kemijske ili fizike veliine. Primjer :
BIOLOGICAL TESTS TEST FOR BACTERIAL ENDOTOXINS
Reagensi :
-

reagensi analitikog stepena istoe

ime i formula reagensa: registarski broj Chemical Abstract Service (CAS
broj)
priprema otopine reagensa
otopine za jednokratnu upotrebu opisane su u pojedinoj monografiji
u propisu monografije uz ime reagensa stoji oznaka R
broj uz oznaku R (R1, R2, ...) oznaava reagens koji se prema propisu
priprema iz pripadajueg reagensa R

Primjeri : Feri hlorid, 2-Butanol, Fuksin

9c Oneiena u lijekovima
Oneienje je bilo koji sastojak ljekovite tvari koji nema definisan kemijski entitet
kao ljekovitu tvar. Zahtjevi kvaliteta lijeka definiu prihvatljive granice za
oneienja koja se dozvoljavaju u roku trajanja farmaceutskog proizvoda. U
interesu javnog zdravlja broj ispitivanja i postavljene granice oneienja trebaju
biti :
-

smanjene tako da odgovaraju farmaceutskim zahtjevima

izbjei pretjerano ienje

Vanost ispitivanja istoe farmaceutskih tvari :

-

potencijalne aktivnosti i neeljeni uinci oneienja

razvoj sofisticiranih analitikih tehnika
sloeniji zahtjevi zakonske regulative

Izvor oneienja :
-

oneienja u polaznim sirovinama

nusprodukti i meuprodukti u proizvodnom postupku
produkti razgradnje lijeka koji nastaju tokom uvanja i/ili djelovanjem
svjetla, temperature, pH ili vode
produkti koji nastaju reakcijom s pomonim tvarima ili pakovnim
materijalom
usput ekstrahirane tvari iz prirodnih produkata

Posebna panja !!!

-

oneienja s toksinim svojstvima

fakrmakoloki aktivna oneienja

oneienja koja mijenjaju aktivnost i djeluju na stabilnost same ljekovite

tvari
oneienja koja utiu na analitike rezultate

KONTROLA ONEIENJA u skladu sa ICH smjernicama:

-

Oneienja u novim aktivnim supstancama (ICH, dio Q3A)

Oneienja u novim farmaceutskim proizvodima (ICH, dio Q3B)

Organska oneienja : prihvatljive granice navedene u ICH dokumentu

Anorganska oneienja : granice ovise o namjeni ispitivanog materijala, koliini i
nainu doziranja
Rezidualna otapala: zaostale, hlapljive, organske hemikalije koje se koriste ili
nastaju u postupku proizvodnje.
Nova oneienja : mogu se pronai u poznatoj tvari uslijed izmjene postupka
proizvodnje
VRSTE ONEIENJA
1. Specificirana oneienja (specified impurities)
- poznata (stvarna) oneienja
- organska oneienja prisutna u koliini veoj od 0.1 %
- dnevna doza aktivne tvari > 2 g -> prag 0.05%
- oneienja koja imaju farmakoloki uinak (razina nia od 0.1%)
identificirana oneienja
-

karakterizirana hemijska struktura

neidentificirana oneienja
-

definirana iskljuivo kvalitativnim analitikim svojstvima (npr.

kromatografsko vrijeme zadravanja)
moe ga biti do 0.1%

Definirani pragovi oneienja ne odnose se na:

pomone tvari
bioloke i biotehnoloke proizvode
Peptide
Oligonukleotide
Radiofarmaceutike
fermentacijske i polusintetske proizvode
biljne proizvode
produkte iz biljnih i ivotinjskih izvora

Srodne tvari (related substances)

Poznata oneienja, esto srodne strukture, mogu biti identificirana ili
neidentificirana. Poglavlje Ispitivanja u monografijama organskih spojeva
ispitivanja organskih oneienja :
kvantitativne metode - LC, GC, CE
TLC
UV-Vis
ljekovite tvari pod patentnom zatitom - lista oneienja ne mora biti publicirana
potrebne informacije dostupne su kod proizvoaa.

2. Druga oneienja koja se mogu otkriti (other detectable impurities)

- potencijalna oneienja
- nisu detektovana niti u jednom ispitivanom uzorku tokom izrade monografije,
ali su ograniena -ispitivanjima u Ph.Eur.
- mogu nastati u proizvodnom postupku ili stajanjem mogu, ili ne moraju,
trenutno biti prisutni u ljekovitoj tvari.
Primjeri : Ciprofloksacin hidroklorid, Alfakalcidol