GENSKO SPREMENJENE

ČLOVEŠKE CELICE:

ZAUSTAVIMO SEPSO
Skupina
 Modificiranje sistemov v
sesalskih celicah
– Primerjava s prokarionti: več podobnosti
kot razlik

– Slabosti: bolj kompleksne, bolj počasne in

dražje

– Priložnosti: razumevanje kompleksnih

sistemov, možen razvoj medicinskih
aplikacij
 Kaj je sepsa?
– Na leto prizadene 750.000 ljudi v EU –
številke v ZDA so približno enake

– V enem od petih primerov se konča s

smrtjo

– Med 10 najbolj pogostimi vzroki smrti v

ZDA
 Kaj je sepsa?
– Pretiran vnetni odziv,
ki ga sproži patogen

– Vsesplošno
razširjena aktivacija
vnetnih in infekcija vnetni procesi
kolaguacijskih poti
 Kaj je sepsa?
– Pride do kritične
odpovedi organov

– Bolezenske znake
povzroči pretiran
odziv gostitelja na infekcija vnetni procesi

infekcijo in ne toliko
sama prisotnost
patogena
Tollu podobni receptorji (TLR)
prepoznajo patogen
– Glavni senzorji nespecifičnega imunskega
odgovora

Molekule TLR:
– 11 različnih membranskih receptorjev pri
človeku
– Prepoznavajo različne molekule značilne
za patogene
TLRs in njihovi agonisti
 PAMP
TLR TLR TLR

TAB2
IRAK1Kinase
IRAK1Kinase
IRAK4Kinase

DD DD
P P P
MyD88

MyD88
TRAF6 TRAF6
TRAF6 P P
TAK1 TAK1
P P
TAB1 TAB1
P

P P
TAB2 TAB2
P P
TAK1TRAF6 TRAF6TAK1
IKKβ IKKα P P
TAB1 TAB1
IKKγ MEKK3 MEKK3

IκBα Ubc13 Ubc13

Uev1A Uev1A
NFκB
P65

TNFα
IL-1
COX2... nucleus
NFκB
P65/50
“Vse poti vodijo v MyD88”

MyD88
 Naš projekt
Osnovni koncept:
Delna inhibicija
pretiranega celičnega
odziva.
Izvedba:
V sesalske celice
vstaviti konstrukt s
povratno zanko –
inhibitorjem (dnMyD88),
ki bo za določen čas
zavrl signalizacijo TLR
signalne poti
Zaporedje
PEST

PEST PEST

Gene Expression
 Matematični model

Poenostavljen model TLR signalizacije

Model z dodano povratno zanko (MyD88)
 Cytoplasmic NF-κB

Inflammatory mediators

Nuclear NF-κB
Običajen odziv celic ob infekciji

Inflammatory mediators

Cytoplasmic NF-κB

Nuclear NF-κB
Odziv celic z vstavljeno povratno zanko ob ponovljeni stimulaciji
 Naše BioKocke
Registrska številka Ime
BBa_J52008 rluc
BBa_J52010 NFκB
BBa_J52011 dnMyD88-linker-rLuc
BBa_J52012 rluc-linker-PEST191
BBa_J52013 dnMyD88-linker-rluc-linker-PEST191
BBa_J52014 NFκB+dnMyD88-linker-rLuc
BBa_J52016 eukaryotic terminator
BBa_J52017 eukaryotic terminator vector
BBa_J52018 NFκB+rLuc
BBa_J52019 dnTRAF6
BBa_J52021 dnTRAF6-linker-GFP
BBa_J52022 NFκB+dnTRAF6-linker-GFP
BBa_J52023 NFκB+rLuc-linker-PEST191
BBa_J52024 NFκB+dnMyD88-linker-rLuc-linker-PEST191
BBa_J52026 dnMyD88-linker-GFP
BBa_J52027 NFκB+dnMyD88-linker-GFP
BBa_J52028 GFP-PEST191
BBa_J52029 NFκB+GFP-PEST191
BBa_J52034 CMV
BBa_J52035 dnMyD88
BBa_J52036 NFκB+dnMyD88
BBa_J52038 CMV-rLuc
BBa_J52039 CMV+rLuc-linker-PEST191
BBa_J52040 CMV+GFP-PEST191
BBa_J52642 GFP
BBa_J52648 CMV+GFP
 Sestavljanje BioKock
– Priprava zapisov za
fuzijske poroteine s PCR
(overlap extension)
– Vnos v vektorje iz zbirke
BioKock, ki vsebujejo
zapis za domeno ccdB
– Priprava modificiranega
vektorja s trajno
vključenim
terminatorjem
– Priprava končnih
konstruktov s
standardizirano tehniko
sestavljanja BioKock
 Transfekcija

Celična linija HEK293

- Ne izražajo TLR
- Imajo ohranjene
signalne poti
 Metode
Detekcijski sistemi za
merjenje odziva celic:
- ELISA
- Pretočna citometrija
- Luciferase Assay
- Mikroskopija
ELISA – detekcija prostega NF-κB

peroxidase

NF-κB

biotin

streptavidin
ELISA - rezultati
Pretočna citometrija – detekcija
fosforilirane kinaze ERK
 Detekcija
aktivacije transkripcije z
luciferaznim testom
Dvojni luciferazni test
Dva različna luciferazna reporterska encima
– Eksperimentalni reporter (NF-κB-fLuc)
– Konstitutivni reporterski gen (CMV-rLuc)
 Pospešena
razgradnja proteinov z dodanim
zaporedjem PEST
Inducibilno izražanje proteinov pod
kontrolo promotorja NF-kB
 Zakaj ni inhibicije ?

X
MyD88
DD Reporterska domena na

luc
C-koncu dnMyD88
prepreči interakcijo s TIR-

MyD88
domeno TLR

Če je to res, potem bi moralo delovati brez C

terminalne fuzije?
DA! Povratna zanka deluje!
 Zaključek

• Princip princip BioKock smo uspešno prenesli tudi

na sesalske celice.

• Uspešno smo uvedli sistem povratne zanke, ki

omejuje celično aktivacijo ob inflamatornem procesu.

• Naš konstrukt oponašajo naravni mehanizem

tolerance, le da se aktivira dosti hitreje

• Poenostavljen model TLR signaliziranja zajame vse

osnovne značilnosti signalne kinetike.
 Delo za jutri

• Skrajševanje življenjske dobe inhibitorja z uvedbo

zaporedja PEST na njegov N-konec

• Konstrukcija vektorjev za stabilno transfekcijo

(dodatna rezistenca za celične linije).